CZ278917B6

CZ278917B6 - Composition for the protection of rabies virus

Info

Publication number: CZ278917B6
Application number: CS922927A
Authority: CZ
Inventors: Ladislav Mvdr Csc Dedek; Vladimir Mvdr Csc Vrzal
Original assignee: Bioveta
Priority date: 1992-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 1994-08-17
Also published as: SK292792A3; SK278719B6; CZ292792A3

Description

Vynález se týká kompozice k ochraně vzteklinového viru k produkci vakcíny proti vzteklině k orální imunizaci lišek. Orálně aplikované vakcíny jsou úspěšné používány k tlumení vztekliny v populaci volné žijících zvířat. Imunita lišek proti vzteklině omezuje šíření vzteklinového viru v liščí populaci, a tím brání šíření nákazy na jiná zvířata. Výskyt vztekliny u volně žijících zvířat je problémem také v České republice. V roce 1991 bylo na území republiky diagnostikováno onemocnění vzteklinou v 1 154 případech. Vzteklinový virus byl prokázán u 1 140 lišek au 8 druhů volně žijících zvířat. Lišky se podílejí 95 % na všech případech výskytu vztekliny u zvířat. Zlepšení nákazové situace u lišek snižuje riziko infekce člověka. Redukce počtu potřebných vakcinací lidí vede ke snížení nákladů a počtu postvakcinačních reakcí u lidí, které jsou po použití vzteklinových vakcín známé.

Dosavadní stav techniky

K zajištění účinné orální imunizace lišek je třeba zabránit poklesu titru vzteklinového viru ve vakcíně, která je kladena do volné přírody. Vakcína je představována plastikovou kapslí naplněnou vakcinačním virem s ochranným médiem, zakrytou hliníkovou fólií. Kapsle s virem je obalena vhodnou návnadovou hmotou, která je atraktivní pro lišky. Při požírání dojde k prokousnutí plastikové kapsle a k výtoku vakcinačního viru do sousta návnadové hmoty, která kontaminuje ústní dutinu virem, který pronikne do krevního' oběhu a vede k vytvoření imunity. Vyrobená vakcína se skladuje v zamraženém stavu při teplotě -20 až -30 °C. Vakcinace se provádí tak, že se vakcína klade do přírody v množství 16 dávek vakcíny na km². Cílem je dosáhnout co nejvyššího počtu imunních lišek, čehož je dosahováno dvojí vakcinací v průběhu kalendářního roku. První termín vakcinace je koncem dubna, druhý počátkem října. V těchto ročních obdobích se teploty zpravidla pohybují od 0° do 20 °C. Za těchto klimatických podmínek je třeba zajistit minimální pokles titru ve vakcíně, a tím co nejvyšší účinnost vakcíny a vakcinace. Vakcinační dávka musí obsahovat minimálně v 1 ml 10⁷'⁰ PFU (plakotvorných jednotek). K dosažení uvedených parametrů je nutno virus ve vakcíně vhodným způsobem stabilizovat. Ke stabilizaci je možno použít různých látek.

Čištěný kaseinový hydrolyzát je použitelný ke stabilizaci vzteklinového viru (Baer G.M., Winkler E.G., US Patent 4 014 991 z 29.3.1977, Int. Cl², A61K 39/28.

Použití hydrolyzované želatiny a sorbitu v koncentraci 3,57% vede k ochraně virových antigenů (Abitz W. , Morf D. , DE 28 16 349 AI Z 14.4.1978, Int. Cl², A61K 39/16.

Směs hydrolyzované želatiny, disacharidů, L-glutamové kyseliny a L-Argininu chrání virové suspenze (Mc Aleer W.J., Markus H.Z., US Patent 4 338 335 Z 30.7.1980, Int. Cl³, A61K 39/12), Mc

-1CZ 278917 B6

Aleer W. J. , Markus H.Z., EP O 028 563 Z 28.10.1980, Int. Cl³, A61K 39/12.

TRIS pufr v koncentraci 0,03 až 0,08 M stabilizuje virovou suspenzi (Blades J.E., EP 0 049 296 AI z 2.10.1982, Int. Cl³, A61K 39/205).

Vzteklinový virus ve vakcině k orální imunizaci lišek je možno stabilizovat přidáním 5 až 10 % vaječného žloutku (Steck F., EP 0 100 752 A2 z 2.8.1983 Int. Cl³, A61K 39/205) nebo směsí 10 % vaječného žloutku s bovinním sérovým albuminem (Schneider L.G., DE 35 26 889 AL Z 26.7.1985, Int. Cl³, A61K 39/205).

Cílem řešení bylo připravit vhodnou kompozici k ochraně vzteklinového viru pro vakcínu k orální vakcinaci lišek, která zajistí jeho ochranu při dlouhodobém skladování po vyrobení v teplotách -20° až -30 °C a po vyložení vakcíny pro lišky při teplotách od -5° do 20 °C po dobu 14 dnů.

Podstata technického řešení

Podstata vynálezu spočívá v tom, že kompozice obsahující krystalický kolagen, 2,4,6-TRIS(dimethylaminomethyl)fenol, glutamát draselný, kyselinu ethylendiaminotetraoctovou, zvířecí inaktivované sérum bez protilátek proti vzteklinovému viru v destilované vodě při styku se vzteklinovým vakcinačním virem brání ztrátě jeho biologické aktivity. Krátkodobě při teplotě -5 °C až +20 “nebo dlouhodobě při teplotě -20 °C až - 60 °C. Biologická aktivita vzteklinového viru je rozhodující pro zajištění vakcinačního efektu u volně žijících lišek. Vakcína uložena v návnadové hmotě se klade do volné přírody koncem dubna a počátkem října, kdy teplota může kolísat od -10 do +25 °C. Nechráněný virus za těchto podmínek je snadno inaktivovatelný, a tím je ohrožena účinnost vakcíny. Z těchto důvodů se používají různé látky, které omezují snížení biologické aktivity viru vztekliny ve vakcině pro orální imunizaci lišek. Po pozření návnady, ve které je uložena tobolka obsahující vakcinační virus s kompozicí, dochází k porušení tobolky zuby, virus se dostane do návnadové hmoty. Kousáním návnadové hmoty dochází ke kontaminaci orální dutiny lišky virem vztekliny, který proniká do krevního oběhu. V organizmu lišky dochází k tvorbě protilátek proti viru vztekliny, které ji chrání před onemocněním. Pro přípravu kompozice se používá 0,5 až 10 % hmot. krystalického kolagenu, 0,7 až 1,5 % hmot. 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)fenolu, 0,1 až 0,8 % hmot, glutamátu draselného, 0,1 až 1,8 % hmot, kyseliny ethylendiaminotetraoctové, 2 až 10 % hmot, zvířecího inaktivovaného séra prostého protilátek viru vztekliny v destilované vodě. Kompozice se mísí s vakcinačním virem v poměru 1 díl viru s 0,5 až 2 díly kompozice.

-2CZ 278917 B6

Příklad provedení

Příklad 1

Kompozice se připraví z následujících komponent:

Krystalický kolagen 200,0 g 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)fenol 100,0 g Glutamát draselný 50,0 g Kyselina ethylendiaminotetraoctová 60,0 g Bovinní sérum inaktivované 400,0 g

Destilovaná voda ad

000,0 g

Po rozpuštění komponent se upraví pH na 7,6 až 7,9 a provede se sterilizace roztoku filtrací, bezprostředně před plněním se smíchá 1 díl kompozice s 1 dílem vzteklinového viru. Směs se rozplní, zamrazí a obalí návnadovou hmotou.

Příklad 2

Roztok krystalického kolagenu 12%

Roztok 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)fenol 5 %

Roztok dlutamátu draselného 9%

Roztok kyseliny ethylendiaminotetraoctové 8%

Sérum koňské inaktivované

5	000	ml
2	000	ml
	900	ml
2	000	ml
	100	ml

K přípravě roztoků se použije deionizovaná sterilní apyrogenní voda. Po rozpuštění jednotlivých komponent se tyto postupně smíchají, směs se inaktivuje 2 hodiny při 58 °C, upraví se pH na 7,6 až 7,9. Kompozice se vychladí. Vychlazená kompozice se smísí v poměru 1,3 dílu viru a 1 díl kompozice.

Příklad 3

Roztok krystalického kolagenu 2%

Roztok 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)fenol 4 %

Roztok glutamátu draselného 6%

Roztok kyseliny ethylendiaminotetraoctové 5%

Sérum koňské inaktivované

5	000	ml
2	000	ml
	900	ml
2	000	ml
1	000	ml

K přípravě roztoků se použije deionizovaná sterilní apyrogenní voda. Po rozpuštění jednotlivých komponent se tyto postupně smíchají a upraví se pH na 7,6 až 7,9. Kompozice se vychladí a smísí se v poměru 2 díly viru a 1 díl kompozice.

-3CZ 278917 B6

Průmyslová využitelnost

Příznivý vliv kompozice na titr viru vztekliny při teplotě 5 °C se projevil snížením poklesu titru viru lOOx. Výsledky jsou v následující tabulce. Pro zajištění 100% ochrany lišek je třeba, aby ve vakcinační dávce byl minimální titr 10^5,9/ml (Lawson K.F. a jiní 1989, Can.J.Vet.Res. 53, 438 - 444).

Vliv kompozice na titr viru v průběhu skladování

Doba skladování		Virus s kompozicí		Virus bez kompozice
	Titr viru log₁₀ PFU v ml Skladovací teplota		Titr viru log₁₀ Skladovací	PFU v ml teplota
			-20 °C	+5 C	+20 °C	-20 ’C	+5 °C	+20 °C
0 4 7 10 14 1 3 6	dny dnů dnů dnů měs. měs. měs.		7.3 7.4 7,0 7,3 7,3 7,0 7,0	7,3 7,1 7,0 6,5 6,0	7,3 6,8 6,2 6,0 5,5	7,3 7,3 7,0 7,3 7,3 6,5 6,0	7,3 6,8 6,0 5,0 4,0	7,3 6.5 5.5 4,0 3,0

Pokles titru viru v průběhu skladování při teplotě -60 °C.

Doba skladování při -60 °C v měsících	0	2	3	4	5	7	8
Zjištěný titr logiO	7,4	7,5	7,1	7,0	6,9	6,9	6,7

Po prvním kladení vakcíny k orální imunizaci lišek proti vzteklině byl tetracyklin (markér) prokázán v kostech u 79 % vyšetřovaných lišek. U těchto lišek byly protilátky prokázány v 84 % případů. Distribuce hladin protilátek podle titrů nebo podle počtu mezinárodních jednotek (I.U.) v 1 ml ukazuje na dobré přežívaní viru ve vakcíně, a tím na dobrou protilátkovou odpověď po požití návnady. Výsledky jsou v následující tabulce.

Zjištěný titr protilátek	20	60	180	520
Průměrný titr protilátek I.U. v ml	1,3	2,1	2,7	3,5
% zvířat s daným titrem protilátek	54	36	8	2

Claims

Kompozice k ochraně vzteklinového viru, vyznačuj ία i se tím, že obsahuje 0,5 až 10 hmot, procent krystalického kolagenu, 0,7 až 1,5 hmot, procent 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)fenolu, 0,1 až 0,8 hmot, procent glutamátu draselného, 0,1 až 1,8 hmot, procent kyseliny ethylendiaminotetraoctové, 2 až 10 hmot.procent zvířecího inaktivovaného séra prostého protilátek proti viru vztekliny v destilované vodě.