CZ266797A3 - Použití glycinu, jeho prekurzorů a solí k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro snižování hladin TNF a léčivo, které tyto aminokyseliny obsahuje - Google Patents

Description

Použití glycinu, jeho prekurzox a nebo nutriční formulace pro snižovaní retivo, které tyto aminokyseliny obsahuje

Oblast techniky

Vynález se týká použití konkrétních aminokyselin k přípravě léčiva nebo nutriční formulace, které lze terapeuticky podávat pacientům trpícím řadou onemocnění’ a chorobných stavů.

Podstata vynálezu

S překvapením bylo zjištěno, že, mimo jiné, je glycin schopen minimalizovat metabolické účinky řady onemocnění a traumatických nebo jiných chorobných stavů vyvolané zvýšenými hladinami faktoru nádorové nekrosy (tumor necrosis factor, TNF) nebo/a těmto účinkům zabraňovat.

Vzhledem k výše uvedeným účinkům jsou zde popsány farmaceutické prostředky, formulace a strava obsahující glycin, jakož i způsoby použití glycinu. Pro použití v prostředcích, formulacích, stravě a způsobech podle vynálezu se glycin účelně využívá ve formě volné aminokyseliny, ve formě prekursorů glycinu, zejména alaninu nebo šeřinu, rovněž ve formě volné aminokyseliny, ve formě fyziologicky přijatelných solí uvedených aminokyselin nebo ve formě směsí uvedených aminokyselin nebo/a jejich fyziologicky přijatelných“ solí. Glycin se výhodně používá ve formě volné aminokyseliny, formě fyziologicky přijatelné soli nebo ve formě směsi glycinu ve formě volné aminokyseliny s glycinem ve formě fyziologicky přijatelné soli. Nejvýhodněji je glycin ve formě volné aminokyseliny.

Termín aminokyselina podle vynálezu, jak je zde užíván, označuje glycin, alanin nebo/a serin, ve formě volné aminokyseliny nebo/a ve formě fyziologicky přijatelné soli.

Vynález tudíž popisuje použití alespoň jedné aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro snižování hladin TNF (tumor necrosis factor, faktor nádorové nekrosy) u pacientů, u kterých jsou tyto hladiny zvýšené nad hladiny, které zprostředkovávají fyziologickou homeostázu a lokální zánět. Takového snižování hladin TNF může být mimo jiné dosaženo inhibici nebo snížením:

(i) produkce TNF (tumor necrosis factor, faktor nádorové nekrosy) buňkami makrofágového typu, (ii) uvolňování TNF z buněk makrofágového typu, nebo/a (iii) vazby TNF na receptory TNF.

Termínem zvýšené nad hladiny, které zprostředkovávají fyziologickou homeostázu a lokální zánět se míní takové množství TNF, které je větší než minimum nutné k regulaci cirkadiánního rytmu tělesné teploty, spánku a chuti k jídlu nebo než minimum nutné k vyvolání autokrinních a parakrinních účinků v buňkách sousedících s buňkami, ve kterých je TNF produkován nebo ze kterých je sekretován, bez systémových zánětlivých účinků v místech vzdálených od takových buněk.

Vynález dále popisuje použití alespoň jedné aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a j ej ich fyziologicky při j atelné soli , k pří pravě.,., léčiva ...nebo nutriční formulace pro prevenci nebo snižování buňkami makrofágového typu indukované - TNF zprostředkované - produkce alespoň jednoho proteinu vybraného ze skupiny zahrnující interleukin 1, interleukin 2, interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, endoteliální, destičkový a leukocytový selektin, s leukocytovou funkcí související antigen 1, velmi pozdní aktivační antigen 4, intercelulární adhezní molekuly, ί

destičkový faktor 4, neutrofilový atraktant/aktivační protein, Sialyl-Lewis-X, gamma-interferonem indukované peptidy, makrofágové zánětlivé proteiny alfa a beta, z epitelu pocházející neutrofilový atraktant, granulocytový chemotaktický protein 2, monocytový chemotaktický protein 1, vaskulární buněčnou adhezní molekulu 1 a lymfocytový funkční antigen 3.

Ačkoli se použití podle vynálezu týká zejména těchto buněk makrofágového typu, které se vyskytují v krvi (monocyty nebo jednojaderné fagocyty), játrech (Kupfferovy buňky), nervovém systému (mikrogliální buňky), trávicím systému (mesenteriu a střevech), srdci, ledvinách a kostech (makrofágy odvozené od kostních buněk), jsou cílem pro aminokyseliny podle vynálezu všechny buněk které produkují, vážou nebo uvolňují TNF. Zejména se předpokládá, že se podáním léčiva nebo formulace podle vynálezu pacientovi ovlivní produkce TNF z plic pocházejících nebo v plicích lokalizovaných makrofágů, uvolňování TNF z těchto makrofágů nebo vázání TNF na tyto makrofágy.

Vynález rovněž popisuje způsob snížení rizika smrti po endotoxickém šoku nebo/a hypoxickém-reperfuzním zranění, zejména při úrazech (u polytraumatických pacientů, pacientů s popáleninami a pacientů po operacích, jakož i septických pacientů), který zahrnuje podání účinných množství aminokyseliny podle vynálezu. Jak endotoxický šok tak hypoxické-reperfuzní zranění jsou stavy, které mohou mít za následek smrt pacienta a na kterých se podílejí zvýšené hladiny TNF.

Vynález dále popisuje použití alespoňjeďňé aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro prevenci nebo snižování rizika onemocnění jater v důsledku nadměrné konzumace alkoholu a střevních a pankreatických poruch, které jsou jeho následkem, u pacientů potřebujících takové ošetření. Pro tuto indikaci je výhodné použití glycinu nebo/a šeřinu nebo jejich fyziologicky přijatelných solí, a zejména výhodné je použití glycinu nebo jeho fyziologicky přijatelných solí.

Vynález ještě dále popisuje použití alespoň jedné aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro prevenci nebo snižování toxicity ethanolu u pacientů, kteří takové ošetření potřebují. Pro tuto indikaci je výhodné použití glycinu nebo/a šeřinu nebo jejich fyziologicky přijatelných solí, a zejména výhodné je použití glycinu nebo jeho fyziologicky přijatelných solí .

Vynález rovněž popisuje použití alespoň jedné aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro eliminaci ethanolu z žaludku předtím, než se dostane do systémového krevního oběhu, u pacientů potřebujících takové ošetření.

Vynález rovněž zahrnuje použití aminokyseliny podle vynálezu jako aditiva do potravin, nealkoholických nápojů, vitaminů nebo farmaceutických přípravků pro léčení ethanolové toxicity a způsobu prevence ethanolové toxicity za použití účinného množství aminokyseliny podle vynálezu.

Léčivo nebo formulace se pacientovi výhodně podává v takovém množství, že aminokyselina podle vynálezu snižuje hladiny TNF v oběhovém systému pod 250 pg/ml (+ 10 %) , zejména__v případě _ zraněných pacientů trpících těžkými popáleninami (druhého nebo třetího stupně), u kterých mohlo dojít k určitému proniknutí bakteriálních endotoxinů do celkového oběhu, bez zřejmých klinických projevů sepse. Výhodnější je, pokud aminokyselina podle vynálezu snižuje hladiny TNF v oběhovém systému pod 80 pg/ml (+ 10 %), a ještě výhodnější je, pokud jsou hladiny TNF snižovány pod 20 pg/ml (± 10 %) . Odborníkovi je dobře známo, jako lze tyto hladiny detekovat, zejména pomocí známých imunosorbčních testů používajících enzymů (ELISA-testů) a radioimunologických testů.

Vynález rovněž popisuje použití alespoň jedné aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro prevenci nebo snižování TNF indukovaného (akturiálního) odmítnutí alloštěpů. Tento alloštěp může souviset s libovolným orgánem, ale největší přínos pro pacienta je pozorován v případě transplantace nebo injekční chirurgie související s plícemi, srdcem, játry, střevy/mesenteriem a ledvinami.

V případě, že se má léčivo nebo formulace podávat pacientovi, u kterého byla provedena transplantace, může výhodně dále obsahovat alespoň jednu z následujících sloučenin: neutralizující protilátky vytvořené proti TNF, rozpustné receptory TNF nebo jejich deriváty nebo jejich části, a cyklická polypeptidová imunosupresiva. Příkladem dobře známého cyklického polypeptidového imunosupresiva vhodného pro začlenění do tohoto léčiva je cyklosporin, nebo jeho účinný derivát. Mezi zejména vhodné rozpustné receptory TNF patří syntetický dimerní rozpustný fuzní proteinový konstrukt, který kombinuje dva receptory TNF p60 s částí Fc molekuly IgG. Tento fúzní proteinový konstrukt vykazuje vysokou afinitu a je lepším inhibitorem biologické aktivity TNF než jsou přirozené monomerní receptory TNF (p80 nebo p60) nebo protilátky proti TNF.

Nutriční formulaci nebo léčivo podle vynálezu lze podávat buď profylakticky, například před operací, nebo v akutní fázi, například po operaci, nebo provádět obě tato podávání.

Tuto nutriční formulaci nebo léčivo lze podávat pacientovi enterálně nebo parenterálně. Výhodný je enterální způsob podání, zejména při následném nebo profylaktickém ošetřeni; předpokládanými způsoby enterálního podání jsou zejména orální podání, nasální podání nebo/a výživa sondou. Léčivo nebo formulace podle vynálezu se účelně podává ve formě vodné kapaliny. V souladu s tím je toto léčivo nebo formulace ve formě vhodné pro enterální aplikaci výhodně ve vodné formě nebo ve formě prášku, přičemž prášek se před použitím účelně přidá do vody. Pro použití k výživě sondou bude množství vody, které je třeba přidat, záviset mimo jiné na pacientově potřebě kapaliny a na jeho stavu. Je třeba vzít v úvahu/ že pro akutní bšebrení j~e výhodný parenterální způsob aplikace. Parenterální způsob podání je indikován rovněž například v případě, že cílem je kontrolovat účinky chronické endotoxemie.

Léčiva nebo formulace podle vynálezu mohou být formulovány tak, aby se pacientovi podalo od 1 do 80 g aminokyseliny podle vynálezu za 24 hodin. Množství léčiva nebo formulace, které je třeeba podat, závisí ve velké míře na pacientových konkrétních potřebách. Takovéto denní dávky aminokyseliny podle vynálezu jsou vhodné pro ošetření daných účinků jakož i pro profylaxi či předošetření. V případě, že dané léčivo nebo formulace obsahuje jedinou aminokyselinu podle vynálezu (v L-konfiguraci), lze aplikaci pacientovi provádět v takovém množství, že se koncentrace této aminokyseliny v pacientově plazmě zvýší na mezi 0,5 a 2,0 mM, výhodně mezi 1,0 a 2,0 mM. Ačkoli se počítá i s vyššími koncentracemi, předpokládá se, že podstatných klinických účinků -se dosáhne pokud se koncentrace kyseliny zvýší v důsledku podání formulace nebo léčiva podle vynálezu tak, že leží v rozmezí od 1,2 do 1,5 mM. U traumatických, hyperkatabolických pacientů může být dokonce užitečné zvýšit hladiny glycinu, šeřinu nebo alaninu v plazmě na přibližně 0,2 až 0,3 mM, což odpovídá hladinám glycinu v plazmě zdravých jedinců.

Nejvýhodnější aminokyselinou podle vynálezu pro začlenění do léčiva nebo formulace pro použití podle vynálezu je glycin nebo jeho fyziologicky přijatelná sůl.

Obecně se doporučuje použití aminokyseliny podle vynálezu v kombinaci s jednou nebo více z následujících složek:

(i) omega-3-polynenasycenými mastnými kyselinami, pokud je to žádoucí ve směsi s omega-6-polynenasycenými mastnými kyselinami, (ii) L-argininem nebo jinými fyziologicky přijatelnými sloučeninami souvisejícími se syntézou polyaminů, nebo jejich směsmi, a (iii) zdrojem nukleových bází.

Výhodné je použití léčiva nebo nutriční formulace obsahující aminokyselinu podle vynálezu v kombinaci s argininem. nebo jinými fyziologicky přijatelnými sloučeninami souvisejícími se syntézou polyaminů, jako je ornithin. Výhodné je rovněž použití léčiva nebo nutriční formulace obsahující aminokyselinu podle vynálezu, arginin nebo ornithin a omega-3-polynenasycené mastné kyseliny.

Mezi zdroje nukleových bází vhodné pro použití v kombinaci s aminokyselinami podle vynálezu patří, nebo je tvoří, přirozené nukleové báze, nukleosidy, nukleotidy, RNA, DNA, jejich ekvivalenty nebo/a směsi obsahující jednu nebo více z těchto sloučenin.

—Mez i přirozené nukleové báze patří’ puřiny adenin'⁴¹ a guanin, jakož i pyrimidiny cytosin, thymin a uráčil. Pokud je zdroj nukleových bází ve formě volných nukleových bází, je jím výhodně uráčil.

Mezi přirozené nukleosidy patří nukleosidy na bázi ribosy, adenosin, guanosin, uridin a cytidin, a nukleosidy na bázi deoxyribosy, deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxythymidin a deoxycytidin.

Mezi přirozené nukleotidy patří estery přirozených nukleosidů s kyselinou fosforečnou, jako jsou monofosfáty, adenylát (AMP), guanylát (GMP), uridylát (UMP), cytidylát (CMP), deoxythymidylát (dTMP), deoxycytidylát (dCMP), a difosfáty a trifosfáty přirozených nukleosidů, jako je ADP a ATP.

Výhodný je purifikovaný zdroj nukleových' bází, jako j-sou—kvasinky-__Lze—nicméně_použit_i_jiné_zdroje,_j_ako_j_e masto a podobně. Výhodně je zdrojem nukleových bází RNA.

V souladu s tím vynález popisuje léčiva nebo nutriční formulace obsahující účinná množství:

(a) aminokyseliny podle vynálezu (složky (a)), v.kombinaci s jednou nebo více složkami vybranými ze skupiny zahrnuj ící (b) omega-3-polynenasycené mastné kyseliny, pokud je to žádoucí ve směsi s omega-δ-polynenasycenými mastnými kyselinami (složka (b)), (c) L-arginin nebo jiné fyziologicky přijatelné sloučeniny související se syntézou polyaminů, nebo jejich směsi (složka (c)), a (d) zdroj nukleových bází (složka (d)).

Taková léčiva a nutriční formulace jsou zde dále označována strava podle vynálezu.

Dávkování by mělo být takové, aby tato léčiva nebo nutriční formulace účinně snižovala hladiny TNF (faktoru nádorové nekrosy) u pacientů, u nichž jsou tyto hladiny zvýšené nad hladiny, které zprostředkovávají fyziologickou homeostázu a lokální zánět.

Jedna jednotková dávka takového léčiva nebo nutriční formulace výhodně obsahuje 1,5 až 80 hmotnostních dílů složky (a) v kombinaci s následujícími množstvími jedné nebo více složek vybraných ze skupiny zahrnující složky (b) až (d): 0,1 až 20 hmotnostními díly složky (b), 3 až 40 hmotnostními díly složky (c) a 0,1 až 4,0 hmotnostními díly složky (d). Zejména výhodně jedna jednotková dávka obsahuje 1,5 až 80 hmotnostních dílů složky (a) v kombinaci s následujícími množstvími jedné nebo více složek vybraných ze skupiny zahrnující složky (b) až (d): 2 až'5 hmotnostními díly složky -(bj——7~5—až—2 0—hmobnos-bn-í-mi—d-í-l-y—s-l-o-ž-k-y—(-cj—a—1-,-7—až—2,-0 hmotnostními díly složky (d).

Denně podávané množství složek (a) až (d) účelně odpovídá 1,5 až 80 g složky (a) , 0,1 až 20 g, výhodné 2 až 5 g složky (b) , 3 až 40 g, výhodně 7,5 až 20 g složky (c) a 0,1 až 4,0 g, výhodně 1,7 až 2,0 g složky (d).

Pokud jde o složku (d) , je výše uvedené dávkování uvedeno pro RNA, DNA, nukleosídy nebo nukleotidy. V případě nukleových bází se jedna hmotnostní jednotka nukleových bází považuje za ekvivalent 2,5 až 3,0 hmotnostních jednotek RNA, DNA, nukleosidů nebo nukleotidů.

Pokud se použijí léčiva nebo obsahující aminokyselinu podle vynálezu nebo více z výše uvedených složek (b) , taková léčiva nebo nutriční formulace dávce účelně:

nutriční formulace v kombinaci s jednou (c) a (d) , obsahují v jedné jednotkové (a) 1,5 až . _ 8 0___hmotnostních _ dílů____. j edné______nebo _ více aminokyselin vybraných ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli, nebo. jejich směsi, v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami vybranými ze skupiny zahrnující (b) 2 až 5 hmotnostních dílů omega-3-polynenasycených

- 10. mastných kyselin, (c) 7,5 až 20 hmotnostních dílů L-argininu nebo L-ornithinu, nebo jejich směsi, a (d) 1,7 až 2,0 hmotnostních dílů RNA.

Výhodná léčiva nebo nutriční formulace obsahují v jedné jednotkové dávce:

(a) 1,5 až 80 hmotnostních dílů aminokyseliny vybrané ze _skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli, nebo jejich směsi, v kombinaci s (b) .3 až 40 hmotnostními díly, výhodně 7,5 až 20 hmotnostními díly, argininu, nebo ekvivalentním množstvím jedné nebo více jiných fyziologicky přijatelných sloučenin souvisejících se syntézou polyaminů, nebo ekvivalentním množstvím směsi argininu s takovými sloučeninami.

Ještě výhodněji léčiva nebo nutriční· formulace podle vynálezu obsahují složku (a) v kombinaci se složkou (c) v hmotnostním poměru 1 : 2 až 4 : 1, zejména výhodně v hmotnostním poměru 1 : 1 až 2 : 1.

Další výhodná léčiva nebo nutriční formulace obsahují v jedné jednotkové dávce:

(a) 1,5 až 80 hmotnostních dílů aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli, nebo

	jejich směsi,	v kombinaci s
(b)	0,1 až 20	hmotnostními díly, výhodně	2 až 5
	hmotnostními	díly, omega-3-polynenasycených	mastných
	kyselin, a
(c)	3 až 40 hmotnostními díly, výhodně 7,5 až 20	hmotnost-

nimi díly, argininu, nebo ekvivalentním množstvím jedné nebo více jiných fyziologicky přijatelných sloučenin souvisejících se syntézou polyaminů, nebo ekvivalentním množstvím směsi argininu s takovými sloučeninami.

Omega-3-polynenasycené mastné kyseliny jsou účelně chráněny proti peroxidaci.

Fyziologicky přijatelné způsoby chránění omega-3-polynenasycených mastných kyselin proti peroxidaci jsou v oboru známé. Patří mezi ně fyziologicky přijatelná mikroenkapsulace omega-.3—po-l-ynen-a-sye-en-ý-eh—ma-s-t-n-ýeh—ky-sei-i-n—a—pou-ž-i-t-í—fy-z-i-c-l-o— gicky přijatelných antioxidantů.

Typickým příkladem látky vhodné pro použití jako fyziologicky přijatelného činidla pro mikroenkapsulaci je škrob. Mikroenkapsulaci lze provést o sobě známým způsobem. Mikroenkapsulované částice lze potáhnout o sobě známým způsobem fyziologicky přijatelnými činidly, jako je arabská guma.

Mezi typické příklady antioxidantů vhodných pro použiti ve způsobu podle vynálezu patří antioxidační vitaminy, jako je vitamin C, vitamin E nebo jejich směsi.

Množství přidávaného antioxidantů by mělo být dostačující pro zabránění peroxidaci omega-3-polynenasycených mastných kyselin. Taková množství lze snadno vypočítat. Obecně se pro zjednodušení libovolné antioxidanty používané pro zabránění peroxidaci používají v nadbytku. Je třeba vzít v úvahu, že v důsledku přítomnosti libovolného dalšího činidla podávaného v kombinaci s omega-3-polynenasycenými mastnými kyselínámi může být nutné upravit používané množství antioxidantů.

Omega-3-polynenasycené mastné kyseliny lze používat ve formě vhodné pro fyziologický přísun omega-3-polynenasycených mastných kyselin, například ve formě volné kyseliny, ve formě triglyceridu, nebo ve formě fyziologicky přijatelných přírodních zdrojů omega-3-polynenasycených mastných kyselin. Mezi takové přírodní zdroje patří lněný olej a rybí oleje, jako je olej ze sleďovité ryby Brevortia tyrannus, lososový olej, makrelový olej, olej z tuňáka, rybí tuk a ančovičkový olej. Tyto přírodní zdroje, zejména rybí oleje, obsahují podstatná množství omega-3-mastných kyselin. Pokud jsou omega-3-polynenasycené mastné kyseliny používány ve formě triglyceridu, mohou uvedené triglyceridy zahrnovat estery s jinými fyziologicky přijatelnými mastnými kyselinami. Mezi výhodné omega-3-polynenasycené mastné kyseliny patří eikosapentaenová kyselina (EPA) a dokosahexaenová kyselina (DHA), ve—formě—volrné—kyseT-i-ny-;—ve—formě brú-g-tyce-ridu—nebo—ve—formě přírodních zdrojů obsahujících eikosapentaenovou kyselinu nebo/a dokosahexaenovou kyselinu.

Pokud se aminokyseliny podle vynálezu podávají ve formě léčiva, obsahuje takové léčivo od 1 do 99 g aminokyseliny podle vynálezu na 100 g.

Obecně se příznivých účinků dosáhne pokud se strava podle vynálezu podává ve formě předepisované stravy, kterou může být v závislosti na okolnostech kompletní předepisovaná strava (t.j. strava dodávající v podstatě všechnu nutnou energii, aminokyseliny, vitaminy, minerály a stopové prvky) nebo doplněk stravy. Tato strava se účelně používá ve formě vodné kapaliny. V souladu s tím může předepisovaná strava obsahovat zdroj glycidů, lipidy (zdroj tuku) a protein (zdroj dusíku), a alespoň jednu aminokyselinu vybranou ze skupiny zahrnující glycin, L-alanin a L-serin a jejich fyziologicky přijatelné soli, přičemž je tato kyselina nebo její sůl přítomná v předepisované stravě v množství zhruba 0,5 až 10 g na 100 g. Předepisovaná strava výhodně dále obsahuje další nutričně výhodné složky, jako jsou vitaminy, minérály, stopové prvky a vláknina (výhodně rozpustná vláknina).

Mezi příklady vhodných zdrojů dusíku patří nutričně přijatelné proteiny, jako jsou proteiny získané ze sojových bobů nebo syrovátky, kaseináty nebo/a proteinové hydrolyzáty. Mezi vhodné zdroje glycidů patří cukry, jako jsou maltodex13 triny. Mezi příklady vhodných zdrojů tuku patři triglyceridy, jakož i di- a monoglyceridy.

Mezi příklady vitaminů vhodných pro začlenění do léčiva nebo formulace podle vynálezu patří vitamin E, vitamin A, vitamin D, vitamin K, kyselina listová, thiamin, riboflavin, vitamin B_lř B₂, B₆ a B₁₂, niacin, biotin a kyselina pantotenová v nutričně přijatelné formě.

Mezi příklady minerálních prvků a stopových prvků vhodných_pro_začlenění_do_Léčiva._nebo_formulace_podle vynálezu patří sodík, draslík, vápník, fosfor, hořčík, mangan, měď, zinek, železo, selen, chrom a molybden v nutričně přijatelné formě.

Léčivo nebo formulace podle vynálezu výhodně obsahuje zejména beta-karoten (vitamin A), vitamin E, vitamin C, thiamin, vitamin B₁₂, cholin, selen a zinek v nutričně přijatelné formě.

Termín rozpustná vláknina, jak je zde používán, označuje vlákninu, u které může probíhat podstatná fermentace v tlustém střevě, jejímž konečným produktem jsou mastné kyseliny s krátkým řetězcem. Mezi příklady vhodné rozpustné vlákniny patří pektin, guarová klovatina, rohovníková klovatina a xanthan, popřípadě v hydrolyzované formě. Pro dospělé pacienty leží celkové množství rozpustně vlákniny na den účelně v rozmezí od 3 do 30 g.

Je třeba vzít v úvahu, že omega-3-polynenasycené mastné kyseliny 1 žé’ podávat ve vyšš ích množ s tví ch než jaká jsou uvedena výše, a že taková vyšší množství obecně nezhorší požadovaný účinek nebo nevyvolají nežádoucí vedlejší účinky.

Mezi sloučeniny zejména vhodné pro použití jako složka (c) ve formulaci podle vynálezu patří L-arginin a L-ornithin, nejvýhodněji L-arginin. Složka (c) může být použita ve volné formě, ve formě fyziologicky přijatelné soli, například ve formě soli s kyselinou fosforečnou, kyselinou citrónovou, kyselinou vinnou, kyselinou fumarovou, kyselinou adipovou nebo kyselinou mléčnou, nebo ve formě malých peptidů. Výhodně se použije L-arginin ve volné formě.

Termín malé peptidy, jak je zde používán, označuje peptidy obsahující 2 až 6, výhodně 2 až 4 aminokyseliny.

Jak již bylo uvedeno, omega-3-polynenasycené mastné kyseliny se účelně podávájí ve formě rybích olejů, chráněných nebo nechráněných proti peroxidaci. Takové rybí oleje rovněž obsahují omega-6-polynenasycené mastné kyseliny.

Omega-6-polynenasycené mastné kyseliny mají rovněž příznivý účinek na imunitní odpověď a na rezistenci vůči infekci po chirurgickém zákroku. V souladu s tím strava podle vynálezu účelně dále obsahuje omega-6-polynenasycené mastné kyseliny.

Pro účely vynálezu mohou být omega-6-polynenasycené mastné kyseliny ve formě volné kyseliny nebo ve formě vhodné pro fyziologický přísun omega-6-polynenasycených mastných kyselin, například ve formě triglyceridu. Mezi příklady omega-6-polynenasycených mastných kyselin zejména vhodných pro použití podle vynálezu patří kyselina linoleová a kyselina arachidonová, přičemž nejvýhodnější je kyselina linoleová. Příklady vhodných zdrojů omega-6-polynenasycených mastných kyselin jsou v oboru známé. Patří mezi ně rybí oleje a rostlinné oleje. Mezi příklady zdrojů omega-6-polynenasycených mastných kyselin s vysokým obsahem kyseliny linoleové patří saflorový olej, slunečnicový olej, sojový olej, bavlníkový olej a kukuřičný olej.

Pro dosažení příznivého účinku obecně dostačuje podávání denního množství omega-6-polynenasycených mastných kyselin v rozmezí od 1,5 do 5,0 g. Jedna jednotková dávka léčiva nebo nutriční formulace definované výše může v souladu s tím dále obsahovat 1,5 až 5 hmotnostních dílů omega-6-poly15 nenasycených mastných kyselin.

Kromě složek (b) , (c) a (d) a omega-6-polynenasycených mastných kyselin lze do stravy podle vynálezu přidávat další složky, které mohou mít příznivý vliv na účinnost aminokyseliny podle vynálezu. Příkladem takových příznivých složek jsou omega-9-polynenasycené mastně kyseliny. Výhodnými přírodními zdroji takových směsi mastných kyselin jsou rybí oleje. Z ..důvodů chuti a jiných důvodů se rybí oleje v orálních aplikačních formách výhodně používají v enkapsulované formě.

Pokud je předepisovaná strava podle vynálezu určena pro použití jako nutriční doplněk (například při předoperačním ošetřeni), nemělo by být množství energie, které je jejím prostřednictvím dodávané, příliš veliké, aby se zbytečně nepotlačila pacientova chuť k jídlu. Tento doplněk by měl účelně obsahovat zdroje energie v množství dodávajícím 2500 až 4200 kJ/den. Pro použití jako kompletní předepisovaná strava (například při pooperačnim ošetření, ošetřeni úrazů) strava podle vynálezu účelně dodává 2500 až 6300 kJ/den. Podíl zdroje dusíku, zdroje glycidů a zdroje lipidů na celkové denní kalorické hodnotě se může pohybovat v širokých rozmezích. Ve výhodných formulacích podle vynálezu zdroj glycidů poskytuje 40 až 70 % celkové dodávané energie a zdroj dusíku a zdroj mastných kyselin poskytuji každý 15 až 30 % celkové energie dodávané formulaci. Pro použití jako kompletní strava se strava podle vynálezu účelěn podává ve formě vodné kapaliny v objemech v rozmezí od 500 mi do 3000 ml. Při použití jako doplňku stravy lze podání provádět ve formě prášku nebo kapaliny.

Mezi stavy nebo onemocnění, při kterých jsou u pacientů zvýšené hladiny TNF, a které lze léčit podle vynálezu, patří následující stavy a onemocnění: osteoporosa; arthritida; metastázy; plicní onemocnění jako je syndrom respirační tísně dospělců (adult respirátory distress syndrome, ARDS);

zánětlivá onemocnění střev jako je ulcerativni kolitida a

Crohnova nemoc; onemocnění koronárních arterií; cirhosa jater - vyvolaná alkoholem nebo virově; sepse, včetně endotoxického šoku; hypoxické reperfuzní zranění; syndrom chřadnutí pozorovaný u pacientů s AIDS a rakovinou;

hepatitida; nefritida; patologická angiogenese; léčení jako je ozařování nebo chemoterapie, která - například - poškozují kostní dřeň; odmítnutí orgánů; zranění (trauma); poischemické zranění srdce; vředy; degenerativní stavy, jako je onemocnění motorických-neuronů-nebo-roztroušená sklerosa, které__ souvisejí s nervovým systémem; zranění a záněty mozku; pankreatitida; selhání ledvin; diabetes; mrtvice; astma a infekce. Zejména dobrých výsledků lze dosáhnout při léčení sepse, endotoxického šoku, infekce a hypoxického reperfuzního zranění, zejména endotoxického šoku a sepse. Zejména dobrých výsledků lze rovněž dosáhnout při léčení zánětlivých onemocnění střev, sepse, chornických onemocnění jater, patologické angiogenese, arteriosklerosy a zranění. Infekcemi mohou být infekce poranění, empyemy, bakteriemie, abscesy, septicemie a podobně. Mohou být způsobeny řadou infekčních činitelů, včetně bakterií, virů, parazitů, hub a endotoxinů.

Obecně je ošetření aminokyselinou podle vynálezu indikováno pro pacienty, u kterých mohu být nebo jsou hladiny TNF alespoň přechodně zvýšeny nad hladiny, které zprostředkovávají fyziologickou homeostázu a lokální zánět. Mezi takové pacienty patří například zranění pacienti (polytrauma, popáleniny, významné chirurgické zákroky); pacienti se syndromem systémové zánětlivé odpovědi (systemic infíammátóry response syndrome, SIRS); septičtí pacienti;

syndromem respirační tísně dospělců (adult pacienti se respirátory distress syndrome, ARĎS); pacienti s akutním selháním jater, u kterých není možné předošetření, účinek; pacienti ohrožení infekcí, sníženou rezistencí v důsledku ale je požadován silný jako jsou pacienti se imunosuprese; pacienti podrobovaní ozařování nebo/a chemoterapii, pacienti trpící

- 17 diabetes mellitus či proteinovou podvýživou, pacienti podrobení operaci gastrointestinální rakoviny, pacienti podrobení kardiochirurgii, pacienti podrobení transplantacím, pacienti se zvýšeným rizikem onemocnění jater v důsledku nadměrné konzumace alkoholu a pacienti trpící infekcemi typu viru lidské imunodeficience (HIV); a pacienti před významnými operačními zákroky, t.j. libovolnými operačními zákroky, kterě vyžadují celkovou anestezii, jako je srdeční bypass a významné operace horní části gastrointestinálního traktu, a po—těchto—záhrooí-chcPodávání léčiva nebo nutriční formulace obsahující aminokyselinu podle vynálezu v kombinaci se složkou (c) je zejména indikováno pro léčení osteoporosy.

Překvapující farmakologická účinnost glycinu, respektive aminokyseliny podle vynálezu, při snižování hladin TNF u pacientů, u kterých jsou tyto hladiny zvýšené nad hladiny, které zprostředkovávají fyziologickou homeostázu a lokální zánět, je vhodná v tom, že umožňuje mimo jiné minimalizovat vlivy endotoxemie, hypoxického-reperfuzního zranění a infekce a snižovat rizika endotoxického šoku a sepse, a tím snižovat riziko úmrtí nebo toto riziko vyloučit.

Aminokyseliny podle vynálezu a zejména stravy podle vynálezu jsou, jak již bylo uvedeno výše, zejména vhodné pro ošetření pacientů, u kterých má být proveden chirurgický zákrok. Takovéto předošetřeni je nejúčinnějš£, pokud se strava podle vynálezu podává ve formě doplňku. Tento doplněk se výhodně podává po dobu 3 dnů nebo déle. Obecně je pro dosažení požadovaného účinku dostačující předošetřeni začínající 3 až 6 dnů před chirurgickým zákrokem a probíhající po uvedenou dobu 3 až 6 dnů. Pro účely před- ošetřeni nebo profylaxe obecně poskytuje požadovaný účinek podání doplňku obsahujícího od 1,5 g do 80 g aminokyseliny podle vynálezu v kombinaci s 2 až 5 g složky (b) (omega-3-polynenasycené mastné kyseliny) nebo/a se složkou (c) poskytující 7,5 až g L-argininu nebo L-ornithinu na den.

Takový doplněk může rovněž obsahovat, a výhodně obsahuje, účinné množství složky (d) , omega-6-polynenasycených mastných kyselin a dalších složek, jak jsou uvedeny výše.

Tento doplněk se účelně podává ve formě jednotkových dávek vhodných pro podání doplňku třikrát až čtyřikrát denně. Pokud strava podle vynálezu obsahuje zdroje energie, je vhodné nedodávat více než 6300 kJ/den. Kromě tohoto omezení pokud.^-j^_de^—o^—pří^-s un^-ene rgře^-mohou^-býti a^— účeTně^-j~soui dopTňky potravy podle vynálezu pro snižování hladin TNF účelně dodávány ve formě kompletní předepisované stravy, jak je popsáno výše.

Pokud je nutné akutní ošetření pacientů po nadměrném vystavení ethanolu, podává se aminokyselina podle vynálezu účelně parenterálně. Typickými aplikačními formami vhodnými pro takovéto akutní ošetření jsou například vodné roztoky popsané níže.

Pokud je žádoucí minimalizovat příjem alkoholu krví pomocí glycinem indukované eliminace alkoholu v žaludku, používá se aminokyselina podle vynálezu účelně v běžné orální aplikační formě, jako jsou granule, tablety, kapsle, kapaliny (včetně polévek a nápojů jako jsou nealkoholické nápoje a nápoje hasící žízeň, prášky, předepisovaná strava atd.. . Pokud jsou takové formulace formulovány jako fyziologicky přijatelné formulace, jako ve formě kapslí nebo tablet, obsahují účelně 0,2 až 90 % hmot., výhodně 30 až 50 % hmot., aminokyseliny podle vynálezu. Obecně se uspokojivé eliminace alkoholu (ethanolu) z žaludku dosáhne při podání celkového množství 0,01 až 5,0 g jedné nebo více aminokyselin vybraných ze souboru zahrnujícího glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo/a ve formě fyziologicky přijatelné soli, na kg tělesné hmotnosti. Podání se provede účelně orálně a před příjmem alkoholu.

Typické farmakologicky přijatelné formulace pro orální podání dále obsahuji farmakologicky přijatelná ředidla, nosiče, vitaminy, koření, pigmenty nebo/a další pomocné látky, o kterých je odborníkovi známo, že jsou vhodné pro začlenění do takové formulace.

Stravu a formulace podle vynálezu lze získat o sobě známým způsobem, například smícháním jednotlivých složek.

Mezi typické formulace vhodné pro použití podle vynálezu,—a—zej-mén-^a—pro—ošePřené—pae-i-en-t-ů—se—z-výšeným—r-i-z-i-kem onemocnění jater v důsledku nadměrné konzumace alkoholu, patří vodné roztoky tvořené v podstatě z 0,1 % až 90 % hmot. alespoň jednou aminokyselinou vybranou ze souboru zahrnujícího glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, přičemž zbytek tvoří destilovaná voda. Aminokyselina podle vynálezu může být přítomná ve formě koncentrovaného roztoku v množství tvořícím 15 až 90 % hmot. roztoku. Koncentrované roztoky jsou vhodné pro ředění na aplikační formy nebo pro použití při akutním ošetření. Pro profylaktické účely jsou obecně indikovány aplikační formy s nižším obsahem (například 0,1 až 5 %) aminokyseliny podle vynálezu. Pro akutní ošetření jsou obecně vhodnější koncentrované formy roztoku s vyšším obsahem (například 5 % až 40 % hmot.) aminokyseliny podle vynálezu.

Mezi další formulace vhodné pro zahrnutí do léčiv nebo formulací podle vynálezu, zejména pro parenterální podání, patří infuzní roztoky jako je Ringerův injekční roztok, laktátovaný Řingerův injekční roztok, krystaloidy, koloidy nebo jiné substituty plazmy, v kombinaci se, nebo obohacené, zhruba 0,1 aš 5,0 g glycinu, šeřinu nebo/a alaninu na litr infuzního roztoku. Ringerův injekční roztok je sterilní roztok obsahující od 3,23 do 3,54 g sodíku (což odpovídá 8,2 až 9,0 g chloridu sodného), od 0,149 do 0,165 g draslíku (což odpovídá 0,285 až 0,315 g chloridu draselného), od 0,082 do 0,098 g vápníku (což odpovídá 0,3 až 0,36 g chloridu vápenatého, ve formě dihydrátu chloridu vápenatého), od 5,23 g do 5,80 g chloridového aniontu (jako chloridu sodného, chloridu draselného a dihydrátu chloridu vápenatého) a vodu v dostatečném množství pro získání 1000 ml roztoku. Laktátovaný Ringerův injekční roztok je sterilní roztok obsahující od 2,85 g do 3,15 g sodíku (ve formě chloridu a laktátu) , od 0,141 do 0,173 g draslíku (což odpovídá 0,27 až 0,33 g chloridu draselného), od 0,049 do 0,060 g vápníku (což odpovídá 0,18 až 0,22 g dihydrátu chloridu vápenatého), od 2~73'1 g do “276T~g ialkbabdveho aniontu; od 37 68 do 4y08 g chloridového aniontu (jako chloridu sodného, chloridu draselného a dihydrátu chloridu vápenatého) a vodu v dostatečném množství pro získání 1000 ml roztoku.

Termíny krystaloidy a koloidy jsou v souvislosti s fluidní terapií v oboru známé. Patří mezi ně substituty plazmy, jako je haemaccel (na bázi polygelinu) a gelofusin (na bázi želatiny).

Vynález ilustrují následující příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Účinky ve stravě podávaného glycinu na přežití a poškození jater u krys

Samci krys Sprague-Dawley o hmotnosti 200 až 250 g se krmí ad libitum práškovou stravou obsahující 20 % hmot.

kaseínu (kontrolní strava) nebo 5 % hmot. glycinu a 15 % hmot. kaseínu (glycinová strava) po dobu 3 dnů před injekcí lipopolysacharidu. Poté se krysám přes ocasní žílu injikuje lipopolysacharid (LPS) v množství 10, 20 respektive mg/kg a 24 hodin po injekci se stanoví mortalita. Pokud krysy přežijí 24 hodin, má se za to, že jsou mimo nebezpečí, protože není pozorována pozdní mortalita.

Výsledky:

a) Strava obsahující 5 % glycinu poskytuje 100% ochranu proti LPS v dávce 10 mg/kg, ve srovnání s 50% mortalitou v kontrolní skupině na hladině významnosti p < 0,05. Při dávce LPS 20 mg/kg je při podávání stravy obsahující 5 % glycinu pozorována 30% mortalita, a při podávání kontrolní stravy 70% mortalita. Při dávce LPS 30 mg/kg se mortalita zvýšila na -9-0_%—u—zvúřat—ošetřených glycinem—a—na—1-0-0—%—u—konzroiních zvířat.

b) U přeživších zvířat se měří jaterní enzym AST (aspartát-aminotransferasa; transaminasa) , jako indikátor poškození jater. Hladina AST je zřetelně a významně snížena u krys ošetřených glycinem (z 2000 IU/1 u glycinem neošetřených krys, kterým byl podán LPS v dávce 10 mg/kg).

c) V paralelních experimentech se stanoví účinek glycinové stravy na TNF. Sérový TNF byl měřen ELISA-testem. Po injekci LPS v dávce 10 mg/kg u krys, kterým byla podávána kontrolní strava, hladina sérového TNF prudce vzrostla na hodnoty přes 6000 pg/ml, 60 minut po injekci, před snížením na kontrolní hodnoty. Toto zvýšení je podstatně potlačeno u krys, kterým byla podávána strava obsahující 5 % glycinu (alespoň o 50 %, p < 0,05), přičemž maxima je dosaženo 150 minut po injekci.

d) 24 hodin po injekci LPS (v dávce 10 mg/kg) se odeberou vzorky jater a plic pro histologické zhodnocení, a obarví se hemátoxy1in-eosinem. Krysy krmené kontrolní szravou vykazuj i mnoho nekrotických oblastí a infiltraci neutrofilů v játrech a výrazné intersticiální edémy s infiltrací neutrofilů v plicích. Krysy krmené stravou obsahující glycin vykazují méně nekrotických změn v játrech a méně plicních edémů než krysy krmené kontrolní stravou.

e) U dvou skupin krys, které byly krmeny kontrolní stravou respektive stravou obsahující glycin, kde byla oběma skupinám aplikována injekce LPS (v dávce 10 mg/kg intravenosně do ocasní žíly), se stanoví pomocí HPLC (vysokotlaké kapalinové chromatografie) koncentrace sérového glycinu. Krysy krmené stravou obsahující glycin, kterým nebyl aplikován LPS, vykazují nápadně vyšší koncentraci glycinu (1892 μΜ) než krysy krmené kontrolní stravou, kterým nebyl injikován LPS (150 μΜ) . Krysy krmené stravou obsahující glycin si udržují vysokou koncentraci glycinu (1727 ± 515 μΜ) 6 hodin po -i-nýek-oi—LPS-^—Krysy—krmené k-ontro-ln-í—s-feravou—vyka-z-uj-í—6 hodin pro injekci LPS koncentraci glycinu v séru 278 μΜ.

Příklad 2

Účinky glycinu na reperfuzní zranění v perfuzním modelu s nízkým přítokem a obnoveným přítokem na játrech

Použitá zvířata: Samci krys Sprague-Dawley o hmotnosti 180 až 210 g, krmení stravou Purina. Krysy se nechají hladovět po dobu 24 hodin před operací.

Perfuze jater: Krysy se před operací anestetizují 50 mg natrium-pentobarbitalu, chirurgicky se vyjmou játra a perfundují se pomocí hadičky vložené do portální žíly Krebs-Henseleitovým hydrogenuhličitanovým pufrem o pH 7,4 a teplotě 37° C nasyceným směsí kyslíku a oxidu uhličitého v poměru 95 : 5 v nerecirkulujícím systému (Krebs-Henseleit, 1932). Po operaci se játra perfundují s nízkou rychlostí přítoku kolem 1 ml/g/min po dobu 75 minut (nízký přítok). Následně se játra perfundují s normální rychlostí přítoku, tedy 4 ml/g/min, po dobu 40 minut (obnovený přítok). V Krebs-Henseleitově hydrogenuhličitanovém pufru o pH 7,4 a teplotě 37° C se rozpustí glycin a provádí se jeho kontinuální infuze do jater, počínaje 10 minut před obnoveným přítokem, rychlostí kterou se dosáhne výsledných koncentrací v rozmezí od 0,06 do 2 mM.

Test na laktát-dehydrogenasu (LDH): Aktivita laktát-dehydrogenasy (LDH) v perfuzátu se stanoví za použití standardních enzymových technik (Bergmeyer, 1988). 3 ml perfuzátu se důkladně smíchají s reakčním činidlem obsahujícím 15 % kyseliny trichloroctové, 0,375 % kyseliny thiobarbiturové a kyselinu chlorovodíkovou v 0,25N koncentraci, a směs se zahřívá po dobu 15 minut ve vroucí vodní lázni. Po ochlazení se vzorky centrifugují při 1000 g po dobu 10 minut a při 535 nm se stanoví absorbance supernatantu. Rychlost uvolňováni—iďDH—s-e-^vyj-ádři—na—gram—v-l-hké_hmo-tno.sti_j.ater_za_hodinu^_

Distribuční doba trypanové modři a histologické postupy: Pro stanovení mikrocirkulace a odumírání buněk v játrech se na konci všech experimentů provede infuze trypanové modři do jater na konečné koncentrace 0,2 mM (Belinsky a kol., 1984). Zaznamenává se doba, za kterou je povrch jater rovnoměrně tmavě modrý. Nadbytečné barvivo se odstraní perfuzí Krebs-Henseleitovým pufrem po dobu dalších 10 minut. Následně se játra perfunduji 1% paraformaldehydem po dobu 10 minut a fixovaná tkáň se umístí do parafinu a připraví se pro světelnou mikroskopii. Řezy jsou barveny pouze eosinem, cytoplazmatickým barvivém, takže lze v játrech poškozených buněk snadno identifikovat trypanovou modř.

U všech jader parenchymatických buněk v zóně o poloměru 5 buněk bud' z periportálních nebo pericentrálních oblastí se stanoví, zda jsou pozitivní nebo negativní na trypanovou modř. Z počtu obarvených jader se vydělením celkovým počtem buněk v libovolné dané oblasti vypočítá procento obarvení.

Statistická analýza: Podle konkrétního případu se použije Studentův t-test nebo ANOVA-test. Rozdíly jsou považovány za významné pokud hodnota p činí méně než 0,05.

Výsledky:

Účinky glycinu na hepatocelulární poškození v perfuzním modelu s nízkým přítokem a obnoveným přítokem: Během období nízkého přítoku je uvolňování LDH minimální (kolem 1 IU/g/h po dobu 75 minut). Při zvýšení rychlosti přítoku na 4 ml/g/min se však uvolňování LDH postupně zvyšuje a nových stabilních hodnot se dosáhne zhruba za 30 minut. Maximální uvolňování LDH během reperfuzní doby činí u kontrol kolem 35 IU/g/h, ale je podstatně sníženo ošetřením glycinem, a to v závislosti na dávce. Pokud je koncentrace glycinu zvýšena na 2 mM, je uvolňování LDH sníženo na kolem 5 IU/g/h, k polovině maximálního snížení dochází při koncentraci glycinu i-8-Θ—μ-Μ----- Příjem trypanové modři znamená ireverzibilní ztrátu životaschopnosti buněk v lalůčku jater. Obnovený přítok po dobu 40 minut následující 75-minutovou nízkopřítokovou hypoxii způsobuje odumření zhruba 30 % parenchymatických buněk v pericentrálních oblastech, ale ovlivňuje pouze zhruba 2 % buněk v dříve normoxických periportálních oblastech. Infuze glycinu (v koncentraci 2 mM) snižuje odumření buněk v pericentrálních oblastech na 9 %. Z toho vyplývá, že reperfuzní zranění, ke kterému dochází pokud je do dříve anoxických pericentrálních oblastí lalůčků jater znovu zaveden kyslík, je jasně omezeno akutní infuzí glycinu, a to v závislosti na dávce.

Účinky glycinu na distribuci trypanové modři: Doba distribuce trypanové modři, jako indikátor hepatické mikrocirkuláce, je mírně, ale významně nižší u jater, u kterých byla provedena infuze glycinem, než u kontrol (zhruba 190 sekund u jater o..še hře ných.. glycinem a 225 sekund u _kontrol, p < 0,05, n = 5) , pokud se infuze trypanové modři do jater provede 5 minut po reperfuzi. Nicméně tyto hodnoty jsou glycinem výrazně sníženy, a to v závislosti na dávce, pokud se infuze trypanové modři provede na konci 40-minutové reperfuze. Pro dosažení rovnoměrné distribuce trypanové modři u kontrol je potřeba zhruba 460 sekund, zatímco pokud je provedena infuze glycinu (2 mM) , jsou tyto hodnoty sníženy na zhruba 250 sekund. Koncentrace, která způsobovala polovinu maximálního snížení doby distribuce trypanové modři je rovněž zhruba 180 μΜ.

Glycin minimalizuje téměř úplně uvolňování LDH a odumírání buněk během reperfuze, a to v závislosti na dávce. V souladu s tím tedy glycin vykazuje silné cytoprotektivní účinky proti reperfuznímu zranění u krys v perfuzním modelu s nízkým, přítokem a obnoveným přítokem na játrech,

---—Doba—distribuce—trypanové—modři—je—snižována—glycinem způsobem závislým na dávce, přičemž poloviny maximálního účinku je dosaženo při podobné hodnotě jako cytoprotektivního účinku glycinu (180 μΜ) . Jelikož doba distribuce trypanové modři může být ovlivněna nejen poruchami hepatické mikrocirkulace, ale rovněž zraněním hepatické buňky, je doba distribuce trypanové modři měřena po pouze 5 minutách obnoveného přítok, kdy je reperfuzní zranění minimální. Tato hodnota je rovněž podstatně snižována glycinem, ale v menším rozsahu, což svědčí o zlepšené hepatické mikrocirkulaci.

Byly zkoumány rovněž další možné mechanismy související s anoxií a reperfuzním zraněním, jako je vyčerpání ATP a změna mitochondriální funkce. Tvorba žluči, proces velmi závislý na energii, není glycinem ovlivněna, což svědčí o tom že glycin neminimalizuje vyčerpání ATP, a příjem kyslíku, indikátor mitochondriální funkce, glycinem rovněž není změněn. Závěr zní, že glycin zlepšuje hepatickou mikrocirkulaci a chrání před reperfuzním zraněním závislým na kyslíku.

Příklad 3

Účinek předošetření glycinem na mortalitu po částečné hepatické ischemii a reperfuzi a injekci LPS

Po 3 dnech krmení kontrolní stravou respektive stravou obsahující glycin se krysy v methoxyfluranové anestezii podrobí částečné hepatické ischemií po dobu 90 minut. 6 hodin po reperfuzi je do ocasní žíly injikována subletální dávka LPS (5 mg/kg).

Výsledky: Všechny kontrolní krysy bez injekce LPS přežily 24 hodin po 90-minutové částečné hepatické ischemii a reperfuzi (kontrolní krysy byly 4) . Všechny krysy krmené kontrolní stravou, u kterých byla provedena 90-minutová částečná hepatická ischemie a reperfuze zemřely během 24 hodin po injekci subletální dávky LPS (v této skupině byly 4 krysy).

Předošetření krys stravou obsahující glycin za stejných podmínek (90-minutová částečná hepatická ischemie a reperfuze, a injekce LPS) výrazně zlepšilo přežití (přežilo 5 krys ze 6) během doby pozorování, která činila 24 hodin od doby injekce (ve Fisherově testu je p < 0,05).

Příklad 4

Účinky giycinu podávaného ve stravě na alkoholem vyvolané zranění jater

4.1 Materiály a metody

a. Zvířata

Do samců krys Wistar o hmotnosti 300 až 320 g byly zavedeny nitrožaludeční kanyly, jak popsali Tsukamoto a French. Kanyly byly vedeny subkutánně na dorzální stranu krku a napojeny na infuzní pumpy pomocí pružinového připojovacího zařízení a otočného kloubu, aby byla umožněna úplná pohyblivost krys v metabolických klecích. Zvířatům byla po dobu až 4 týdnů kontinuálně infuzi podávána kapalná strava s vysokým obsahem tuku, obsahující ethanol. Se všemi bylo humánně zacházeno v souladu se směrnicemi.

zvířaty

b. Strava

Byla použita kapalná strava, kterou popsali Thompson a Reitz. Obsahovala kukuřičný olej jako tuk (37 % celkové kalorické hodnoty), protein (23 %), glycidy (5 %), minerály a vitaminy, plus ethanol nebo isokalorický maltodextrin (35 %) - dále je označována tekutá kontrolní strava. Ke kapalné kontrolní stravě byl přidán glycin v množství 2 nebo 5 % hmot. tyto stravy, jsou dále označovány jako tekutá strava obsahující 2 % glycinu respektive tekutá strava obsahující 5 % glycinu.

c. Shromažďování moči a testování ethanolu

Denně byly měřeny koncentrace ethanolu v moči, které jsou reprezentativní pro hladiny alkoholu v krvi. Krysy byly umístěny v metabolických klecích, kde byla oddělována moč od výkalů, a moč byla shromažďována po dobu 24 hodin v lahvích obsahujících pro zabránění vypařování minerální olej. Každý den v 9:00 hodin byly lahve, ve kterých byla shromažďována moč, vyměněny, a vzorek o objemu 1 ml byl skladován při teplotě -20° C v mikrozkumavce pro pozdější analýzu ethanolu. Koncentrace ethanolu byla stanovena měřením absorbance při 360 nm, která je důsledkem redukce NAD⁺ na NADH alkohol-dehydrogenasou.

d. Odběr krve a test na aspartát-aminotransferasu (AST)

Krev byla odebírána ocasní žílou jednou týdně a centrifugována. Sérum bylo skladováno při teplotě -20° C v mikrozkumavce do doby, kdy byl proveden tesť na AST pomocí standardních enzymatických postupů. U 100 μΐ kompletní krve byl rovněž proveden test na ethanol, jak je popsáno níže, a při provádění biopsie jater po dvou a čtyřech týdnech aplikace ethanolu byla rovněž odebrána krev z branky jaterní (portální krev).

e. Stanovení ethanolu ve vydechovaných plynech, periferní a portální krvi, výkalech a obsahu žaludku

Pro stanovení koncentrací ethanolu ve vydechovaných plynech byly krysy přinuceny dýchat po dobu 20 sekund do uzavřené vyhřáté komory (o teplotě 37° C) a 1 ml vydechovaných plynů byl odebrán injekční stříkačkou neprostupnou pro plyny. Koncentrace ethanolu byly analyzovány plynovou chromatograf ií. Ethanol v periferní a portální krvi byl analyzován rovněž plynovou chromatografií. 100. μΐ krve bylo v uzavřené baňce smícháno s 900 μΐ destilované vody, inkubováno po dobu 30 minut při teplotě 37° C a 1 ml plynné fáze byl odebrán a analyzován plynovou chromatografií. Výkaly krys byly izolovány přímo z řiti, homogenizovány v destilované vodě a inkubovány a analyzovány jak je popsáno výše pro krev. Když byly krysy po čtyřech týdnech aplikace ethanolu usmrceny, byly odebrány rovněž obsahy žaludku, které byly analyzovány jak je popsáno výše pro krev.

f. Měření koncentrace glycinu v krvi

Po 4 týdnech aplikace ethanolu bylo odebráno 500 μΐ plazmy a odebraná plazma byla skladována při teplotě -80° C pro stanovení koncentrace glycinu v krvi pomocí HPLC (vysokotlaké kapalinové chromatografie). Kvantitativní analýza glycinu v heparinizované plazmě byla provedena za použití metody PICP-TAG (Waters, Milford, MA, USA) . Vzorky plazmy byly nejprve hydrolyzovány kyselinou chlorovodíkovou, a poté derivatizovány fenylisothiokyanátem (PITC) za vzniku fenylthiokarbamylsubstituovaných (PTC) aminokyselin. Aminokyseliny včetně glycinu byly stanevény vysokotlakoukapalinovou chromatograf ií s obrácenými fázemi s automatickým gradientem.

g. Patologické vyhodnocení

Krysy byly po dvou a čtyřech týdnech aplikace ethanolu podrobeny biopsii jater a autopsii. Játra byla fixována formaldehydem, uložena do parafinu a obarvena hematoxylinem a eosinem pro stanovení steatosy, zánětu a nekrosy. Patologické změny jater byly ohodnoceny následovně, jak popsali Nanji a kol.: steatosa (procento jaterních buněk obsahujících tuk): <25 % = 1+, <50 % = 2 + , <75 % = 3 + , >75 % = 4 + ; zánět a nekrosa: 1 ohnisko na pole při malém zvětšení = 1+, 2 nebo více ohnisek = 2+.

h. Statistika

Pro stanovení statistické významnosti byl podle konkrétního případu použit ANOVA-test nebo Studentův t-test. Pro srcvnánípato 1 ogického.. hodnoceηi byl použit Kruskal-Wallisův ANOVA-test pro pořadí. Jako hladina významnosti byla před prováděním testů stanovena hodnota p menší než 0,05.

4.2 Výsledky

Tělesné hmotnosti krys krmených tekutou kontrolní stravou, tekutou stravou obsahující 2 % glycinu a tekutou stravou obsahující 5 % glycinu měly v průběhu testu sklon se během prvního týdne snižovat. Tělesné hmotnosti se poté stabilizovaly a byly během následujících tří týdnů aplikace ethanolu konstantní. Mezi zkoumanými skupinami nebyly významné rozdíly v tělesné hmotnosti.

Příjem ethanolu byl během prvního týdne po operaci postupně zvyšován na 9 až 10 g/kg/den. Příjem byl během týdnů 2 až 4 mezi 10 a 13 g/kg/den, a mezi skupinami nebyly významné rozdíly. Koncentrace glycinu v plazmě po čtyřech týdnech aplikace činidla 779 ± 66 μιηοΐ/ΐ u krys, kterým byla podávána tekutá strava obsahující 5 % glycinu, a činila 198 + 16 μιηοΐ/ΐ u krys krmených ethanolem.

Byly vytvořeny reprezentativní diagramy denních koncentrací alkoholu v moči pro krysy krmené tekutou kontrolní stravou a tekutými stravami obsahujícími glycin. Hladiny alkoholu u krys krmených tekutou kontrolní stravou cyklicky kolísají od hodnot blízkých nule do hodnot vyšších než 300 mg/dl, ačkoli ethanol byl infuzí podáván kontinuálně. U krys krmených jednou z tekutých strav obsahujících glycin byly koncentrace alkoholu velmi nízké, ale stále byly cyklické. Průměrné koncentrace alkoholu v moči byly podstatně sníženy, a to v závislosti na dávce. Při krmení tekutou stravou obsahující 2 % glycinu byly průměrné koncentrace alkoholu v moči sníženy o 50 %, a při krmeni tekutou stravou obsahující 5 % glycinu byly sníženy o 70 %.

Hladiná AST (aspartát-aminotransferasy) v séru u krys krmených tekutou kontrolní stravou postupně během doby aplikace ethanolu stoupala, a po 4 týdnech dosáhla hladiny 183 IU/1 (kontrolní hodnota 70 IU/1) . Toto zvýšení bylo významně zeslabeno v průběhu celého testu aplikací glycinu v obou koncentracích. Po čtyřech týdnech ošetření činila hladina AST v séru u krys krmených tekutou stravou obsahující 2 % glycinu 66 IU/1 a u skupiny krmené tekutou stravou obsahující 5 % glycinu činila 100' IU/1.

U krys krmených tekutou kontrolní stravou byla po pouze, dvou týdnech ošetření pozorována mírná steatosa. Po čtyřech týdnech ošetření uvedenou tekutou kontrolní stravou nebyly u kontrolních krys, kterým nebyl aplikován ethanol, zjevné zřejmé tukové změny. U krys krmených tekutou stravou obsahující 2 % či 5 % glycinu byly tyto tukové změny omezeny a k nekrose a zánětu téměř vůbec nedocházelo. Snížení steatosy a nekrosy bylo po krmení tekutými stravami obsahujícími glycin statisticky významné. Po krmení tekutými -Stravami,·.- obsahuj ícími glycin byl, v důsledku variability, pozorován pouze sklon ke snížení zánětu.

Obsah alkoholu v žaludečním obsahu u krys, kterým byl podáván glycin, byl rovněž výrazně snížen. Je tudíž jasné, že glycin snižuje koncentraci ethanolu v žaludku, možná ovlivněním metabolismu ethanolu.

r4

Tabulka ί ι—I Φ Ό Ο ε

>φ >

ο

-C υ

β φ

β

IX ι

Ο

4-1

-Ο--ε ro ω

E-t >

Xi

Ο '(ϋ m

X 14 > ο ι—I

Ο β

tc

X

4-1 φ

Φ

Ο

Φ

L

4J β

ω υ

β ο

Φ β

β β

= ·Η- ·=υ >ι-H tn φ

β

-1—1 >υ 'ti

β	761 ± 625	26 ± 41*
obsah	$ β ι—Η C0 >Ν
				*
	Ή		ιη	*
	β		k£)	κ
	ι—1	Φ		Γ-
	'φ	ι—1	+1
	4-1	Ή		+1
	β	>Ν	C
	Ο		LT)	ο
	a		ω	Η
>
φ
ÍM
14				*
			1_Γ)	*
	Ή			ΓΊ
	β	Φ		γΗ
	ω	ι—1	+1
	Φ	Ή		+1
	ο	>Ν	σ\
	υ		σ>	(Η
			γΗ	CN
				*
	δ		kO	*
	14	Τ-f	*
		φ		00
	TS	β 0	+1	+1
	X	Ν >	11
			CN	CN
oč	CN
ε	φ		CM	-Κ *
	rS		γ—1	ιη
	dopolec		84 ±	. cn +1 kO
		ι—1	CN
				*
r-t			21	r—1 γ—1
03			+1	+1
'c			CN	LD
			00	i—i
váné ;!			12	* * = *
O X	£		+1
0	rH		00	+1
Φ	a
			γΗ	ιη
					β
					β
				+	•Η
	Ή				υ
	β		1-1	I-1	>1
X	φ		0	0	γΗ
O	>β		β	β	σ>
ω	4-1		π5	cd
«β	Φ		X	X	ο\°
04	>ω		4-1	4-1
Ν	Ο		Φ	Φ	LO

α, υ

I—ι β Λ Φ 4-1

Φ

τ) β

φ tn φ

β ο

>

ο β

ι—I (X β

'Φ >

ο

Ν

I-1 (0 β

φ β

4->

>υ ο

ίλ β

ε 'φ > ο 14 ι—I φ υ β

'φ β

Ή π< Λ Π5 ο

Ό ε ο 'Φ ω >ι

14 Λ
	φ
		14
£	14	ι—1
'Π5	β
β	0	X
X	Ν	Ο
Φ	>	Ό
Ό Ο		0
	Ή
>1 ι—Η η	14 Ο •Η 4J Π5	β Ό β Φ X
	ε	β
β	κΉ	Φ
14	Ν	4-1
τ)	β	ω
β	φ
rH		+1
Φ
>Ν	β	β
	'φ	>φ
η	>	ε
Π5	0	-β
ω	Ν	β
X	κΝ	a
ο	ι—1
Φ	0
φ	β	14
φ	φ
		ΓΊ
>
φ	γ—}
β	>1	β
14	X!	φ
		>β
	-Η	Ό
>1	>υ	'Φ
	ο	•ΓΊ
Π5	ε	>1
14	>1	>
'>Ί
>	14	* β
β	0
	0	ω
	Ν >	ΤΊ
β	Λ!
Γ~'1	Ή	Ό
04	•Η	Φ
	M-J	|—1
'Φ	Φ	ω
β	β	'>1
φ	m	>
>	0
0	4-1	•
X	Φ	σι
Ο	ε
Φ	0	β
Ό	β	14
	χ
>	ο

* ρ < 0,05; ** ρ < 0,01; *** ρ < 0,001; pro srovnání hodnot získaných u krys krmených stravou obsahující ethanol a krys krmených stravou obsahující ethanol + glycin pomocí Studentova t-testu. é

Příklad 5

Prostředky pro enterální podání

V následujících prostředcích zkratka SM označuje směs obsahující minerály, SSP označuje směs obsahující stopové prvky a SV směs obsahující vitaminy. Složení těchto tří směsí je následující:

-SM

Složky	g/lOOg
maltodextriny	34,40
citrát/fosfát draselný	34,60
citrát hořečnatý	8,20
chlorid vápenatý	8, 00
citrát/chlorid sodný	9,00
kyselina citrónová	3,50
cholin-tartrát	2,30
SSP
Složky	cr/lOOcf
maltodextriny	47,79
kvasinky obsahující molybden	18,00
kvasinky obsahující chrom	9,20
síran zinečnatý	7,00
kvasinky obsahující selen	7,00
síran železnatý -	6,92
glukonát mědnatý	2,24
síran manganatý	1,12
fluorid sodný	0,70
jodid draselný	0,03

SV

Složky maltodextriny natrium-askorbát

50% acetát vitaminu E niacinamid acetát vitaminu A kaleium-D-pantotenát

1% vitamin K_x

0,1% vitamin B₁₂ vitamin D₃ vitamin B_s vitamin B_x vitamin B₂ kyselina listová biotin

Prostředek obsahující glycin

Složky voda maltodextriny natrium/kalcium-kaseináty glycin

SM . .

SSP

SV β-káro ten ,=====....- =-. lipidy: palmový olej slunečnicový olej emulgátor Nathin E q/l00cr

43,44 35,00 16,00

1,55 1,20 0, 98 0,71 0,30 0,28 0,20 0,17 0,15 0, 02 0,01 o/l00cr

77,40 10,10

4,60 3,00 .2,00 0,05 0,10 0,03

2,33

0,26

0,13

100,00

Prostředek obsahující glycin a arginin

Složky q/lOOq

voda	77,40
maltodextriny	8,93
natrium/kalcium-kaseináty	4,60
glycin	3,00
arginin	1,17
SM	. 2,00
SSP	0,05
SV	0,10
β-karoten	0,03
lipidy:
palmový olej	2,36
slunečnicový olej	0,23
emulgátor Nathin E	0,13

100,00

Prostředek obsahující glycin a rybí olej (omega-3-mastné kyseliny)

Složky q/lOOg voda 77,40 maltodextriny 10,10 natrium/kalcium-kaseináty 4,60 glycin 3,00 SM 2,00 SSP ’ 0,05 SV„ __ Ό ,10 β-karoten 0,03 lipidy:

palmový olej 1,32 slunečnicový olej 0,23 emulgátor Nathin E 0,13 rybí olej EPAX 3 000 TG 1,04

100,00

Prostředek obsahující glycin a

Složky voda maltodextriny natrium/kalcium-kaseináty glycin

RNA z kvasničného extraktu SM

SSP

SV β-karoten palmový olej slunečnicový olej emulgátor Nathin E

Prostředek obsahující glycin, mastné kyseliny)

Složky voda maltodextriny natrium/kalcium-kaseináty glycin arginin SM

SSP

SV β-karoten lipidy:

palmový olej slunečnicový olej emulgátor Nathin E rybí olej EPAX 3000 TG

RNA c/l00q

77,40 9,96 4,60 3,00 0,14 2,00

0,05 _

0,03 2,33 0,26 0,13

100,00 arginin a rybí olej (omega-3c/lOOc

77,40

8,93

4,60

3,00 i,¹⁷

2,00

0,05

0,10 .________......

0,03

1,32 0,23 0,13 1,04

100,00

Prostředek obsahující glycin,

Složky voda maltodextriny natrium/kalcium-kaseináty glycin arginin

RNA z kvasničného extraktu SM

SSP

SV β-karoten lipidy: palmový olej slunečnicový olej emulgátor Nathin E

Prostředek obsahující glycin, kyseliny)

Složky voda maltodextriny natrium/kalcium-kaseináty glycin

RNA z kvasničného extraktu , SM _____________

SSP

SV β-karoten lipidy: palmový olej slunečnicový olej emulgátor Nathin E arginin a RNA cr/lOOcr

77,40 8,79

4,60 3,00 1,17 0,14 2,00 0,05 0,10 0,03

2,3 3 0., 26 0,13

100,00

RNA a rybí olej (omega-3-mastné g/lOOcr

77,40 9, 96

4,60 3,00 0,14 2,00 .

0,05

0,10

0,03

1,32

0,23

0,13 rybí olej EPAX 3000 TG 1.04

100,00

Prostředek obsahující glycin, arginin, RNA a rybí olej (omega-3-mastné kyseliny)

Složky cf/l00cr voda 77,40 maltodextriny 8,79 natrium/kalcium-kaseináty 4,60 glycin 3,00 arginin 1,17 RNA z kvasničného extraktu 0,14 SM 2,00 SSP 0,05 SV 0,10 β-karoten 0,03 lipidy:

palmový olej 1,32 slunečnicový olej 0,23 emulgátor Nathin E 0,13 rybí olej EPAX 3000 TG 1,04

100,00

Jak již bylo uvedeno výše, je rybí olej přírodním zdrojem omega-3-polynenasycených mastných kyselin, zatímco slunečnicový olej je přírodním zdrojem omega-6-polynenasycených mastných kyselin.

Ačkoli byly příklady provedení vynálezu zaměřeny na schopnost giycinu potlačovat zvyšování hladiny TNF a tím minimalizovat účinky endotoxického šoku a ischemického reperfuzního zranění u krys, je odborníkovi na základě poznatků uvedených v popisu zřejmé, že vynález zahrnuje další aspekty, kromě těch, které byly konkrétně popsány. Vynález například dále zahrnuje použití alespoň jedné aminokyseliny - nebo jejího prekurzoru - vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin a jejich fyziologicky přijatelné soli, k synergickému zesílení imunosupresivních účinků cyklických polypeptidových imunosupresiv, neutralizujících protilátek vytvořených proti TNF nebo rozpustných receptorů TNF. Takovéto použití může rovněž zvyšovat bezpečnost pokud jde o imunosupresiva, kterými může být například cyklosporin nebo FK-506.

Kromě toho může být podání léčiva nebo formulace podle vynálezu prospěšné pro pacienty, kteří trpí rozsáhlou řadou onemocnění nebo/a stavů. Mezi taková onemocnění a stavy patří: osteoporosa; arthritida; metastázy; plicní onemocnění jako je syndrom respirační tísně dospělců (adult respirátory distress syndrome, ARDS); zánětlivá onemocnění střev jako je ulcerativní kolitida a Crohnova nemoc; onemocnění koronárních arterií; cirhosa jater - vyvolaná alkoholem nebo virově; sepse, včetně endotoxického šoku; syndrom chřadnutí pozorovaný u pacientů s AIDS a rakovinou; hepatitida; nefritida; patologická angiogenese; léčení jako je ozařování a chemoterapie, která - například - poškozují kostní dřeň; odmítnutí orgánů; zranění (trauma); poischemické zranění srdce; vředy; degenerativní stavy, jako je onemocnění motorických neuronů a roztroušená sklerosa, které souvisejí s nervovým systémem; zranění a záněty mozku; pankreatitida; selhání ledvin; diabetes; mrtvice a astma.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití alespoň jedné aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro snižování hladin TNF, faktoru nádorové nekrosy, u pacientů, u kterých jsou tyto hladiny zvýšené nad hladiny, které zprostředkovávají fyziologickou homeostázu a lokální zánět.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde je uvedeného snižování hladin TNF dosaženo inhibici nebo snížením (i) produkce TNF buňkami makrofágového typu, (ii) uvolňování TNF z buněk makrofágového typu, nebo/a (iii) vazby TNF na receptory TNF.
3. 3. Použití alespoň jedné aminokyseliny, nebo jejího prekurzoru, vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro prevenci nebo snižování rizika onemocnění jater v důsledku nadměrné konzumace alkoholu a střevních a pankreatických poruch, které jsou jeho následkem, u pacientů, kteří takové ošetření potřebuj i .
4. 4. Použití alespoň jedné aminokyseliny, nebo jejího prekurzoru, vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro prevenci nebo snižování toxicity ethanolu u pacientů, kteří takové ošetření potřebují.
5. 5. Použití alespoň jedné aminokyseliny, nebo jejího prekurzoru, vybrané ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, a jejich fyziologicky přijatelné soli, k přípravě léčiva nebo nutriční formulace pro eliminaci ethanolu z žaludku předtím, než se dostane do systémového krevního oběhu, u pacientů potřebujících takové ošetření.
6. 6. Léčivo, vyznačující se tím, že je tvoří v podstatě destilovaná voda a 0,1 až 90 % hmot. jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě farmako1ogicxy při j ate1né soli ,—nebo - jejich-směsi.----------------------------
7. 7. Infuzní tekutina, vyznačující se tím, že obsahuje na litr této infuzní tekutiny od 0,1 do 5,0 g jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě farmakologicky přijatelné soli, nebo jejich směsi.
8. 8. Léčivo nebo nutriční formulace, vyznačuj i cí se tím, že obsahuje účinná množství (a) jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě farmakologicky přijatelné soli, nebo jejich směsi, v kombinaci s jednou nebo více složkami vybranými ze skupiny zahrnující (b) omega-3-polynenasycené mastné kyseliny, pokud je to žádoucí ve směsi s omega-6-pólyněnasyčenými mastnými kyselinami, (c) . L-arginin nebo jiné fyziologicky přijatelné sloučeniny související se syntézou polyaminů, nebo jejich směsi, a (d) zdroj nukleových bází.
9. 9. Léčivo nebo nutriční formulace podle nároku 8, vyznačující se tím, že v jedné jednotkové dávce obsahuje (a) 1,5 až 80 hmotnostních dílů jedné nebo více aminokyselin vybraných ze skupiny zahrnující glycin, alanin a serin, ve volné formě nebo ve formě fyziologicky přijatelné soli, nebo jejich směsi, v kombinaci s jednou nebo více sloučeninami vybranými ze skupiny—z a hrnu j i ci - -------------------------------------------------------(b) 2 až 5 hmotnostních dílů omega-3-polynenasycených mastných kyselin, (c) 7,5 až 20 hmotnostních dílů L-argininu nebo L-ornithinu, nebo jejich směsi, a (d) 1,7 až 2,0 hmotnostních dílů RNA.
10. 10. Léčivo nebo nutriční formulace podle, nároku 8 nebo

    9, vyznačující se tím, že obsahuje složku (a) v kombinaci se složkou (c).
11. 11. Léčivo nebo nutriční formulace podle nároku 8 nebo

    9, vyznačující se tím, že obsahuje složku (a) v kombinaci se složkami (b) a (c).
12. 12. Léčivo nebo nutriční formulace podle nároku 8 nebo

    9, vyznačující se tím, že obsahuje složku (a) v kombinaci se složkami (b) , (c) a (d) .