PT810829E - Composicoes de aminoacidos e sua utilizacao em nutricao clinica - Google Patents

Description

- 1 - DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES DE AMINOÁCIDOS E SUA UTILIZAÇÃO EM NUTRIÇÃO CLÍNICA" O presente invento está relacionado com a utilização de aminoácidos específicos na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva que pode ser administrada terapeuticamente a doentes que sofram de uma larga variedade de doenças e estados de morbidez. WO-A-9305780 descreve formulações nutritivas totais parentéricas (TPN), essencialmente sem arginina, para a prevenção ou inibição da hipotensão sistémica induzida por um modificador da resposta biológica ou por sepsia bacteriana. As formulações TNP consistem basicamente numa mistura de 15 ou mais aminoácidos, glucose e dextrose e, facultativamente, micronutrientes, suplementos de vitaminas e sais essenciais. EP-A-0614616 descreve formulações entéricas que são especifica-mente projectadas para o tratamento de doentes com doenças de fígado. As formulações entéricas contêm i.a. uma mistura de 168 aminoácidos na forma livre de aminoácido cristalino. US-A-4988724 descreve formulações parentéricas que incluem 8 aminoácidos essenciais juntamente com pelo menos um aminoácido não essencial e uma quantidade muito pequena de arginina para usar em doentes na detecção de doença maligna recorrente. -2-

Surpreendentemente encontrou-se agora que, iníer alia, a glicina é adequada para minimizar e/ou prevenir os efeitos metabólicos de uma larga gama de doenças e traumas ou outros estados de morbidez induzidos por níveis elevados de TNF.

Face aos efeitos atrás referidos, são proporcionadas composições farmacêuticas, formulações e dietas compreendendo glicina assim como métodos para a utilização de glicina. Para usar nas composições, formulações, dietas e métodos do invento, a glicina é convenientemente empregue na forma de aminoácido livre, na forma de precursores de glicina, em particular alanina ou serina, igualmente na forma de aminoácido livre, na forma de sal fisiologicamente aceitável dos referidos aminoácidos, ou na forma de misturas dos referidos aminoácidos e/ou seus sais fisiologicamente aceitáveis. A glicina é preferencialmente usada na forma de aminoácido livre, na forma de sal fisiologicamente aceitável ou na forma de uma mistura de glicina na forna de aminoácido livre com glicina na forma de sal fisiologicamente aceitável; mais preferencialmente glicina na forma de aminoácido livre. O termo "aminoácido do invento", como aqui é usado, refere-se a glicina, alanina e/ou serina, na forma de aminoácido livre e/ou na forma de sal fisiologicamente aceitável.

Assim, o invento proporciona a utilização de pelo menos um aminoácido seleccionado do grupo constituído por glicina, alanina e serina, ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva para administração entérica, para a diminuição dos níveis de factor de necrose tumoral (TNF) em doentes em que os referidos níveis são elevados relativamente aos que medeiam a homeostasia fisiológica e a inflamação local. Tal diminuição dos níveis de TNF pode i.a. ser conseguida através da inibição ou diminuição de: (i) Produção do factor de necrose tumoral (TNF) pelas células do tipo macrófago; (ii) libertação de TNF pelas células do tipo macrófago; e/ou (iii) ligação de TNF aos receptores de TNF.

Por "elevado relativamente aos que medeiam a homeostase e inflamação local" quer-se significar uma quantidade de TNF que é mais do que o mínimo requerido para regular o ritmo circadiano da temperatura do corpo, cono e apetite ou o mínimo requerido para exercer efeitos de autocrina e paracrina em células na vizinhança daquelas em que o TNF é produzido ou secretado, estando ausentes efeitos inflamatórios sistémicos em zonas afastadas de tais células. O invento proporciona ainda adicionalmente a utilização de pelo menos um aminoácido, seleccionado a partir do grupo contituído por glicina, alanina e serina, ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamente ou formulação nutritiva para prevenir ou diminuir a produção, mediada por TNF em células do tipo macrófago, de pelo menos uma proteína seleccionada entre interleucina 1, interleucina 2, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 10, selectina de células endoteliais, plaquetas e leucócitos, antigénio 1 associado à função dos leucócitos, antigénio 4 de activação muito tardia, moléculas de adesão intercelular, factor-4 de plaquetas, proteína de atracção/activação de neutrófilos, Sialil-Lewis-X, peptídeos induzidos por interferão gama, proteínas inflamatórias alfa e beta de macrófagos, atraente de neutrófilos derivado de epitélio, proteína quimiotática 2 de granulócitos, proteína quimiotática 1 de monócitos, molécula de adesão 1 das células vasculares e antigénio 3 da função de linfócitos. -4-

Enquanto a utilização de acordo com o invento está relacionada, particularmente, com as células do tipo macrófago localizadas no sangue (monócitos ou fagócitos mononucleados), fígado (células de Kupffer), sistema nervoso (células da microglia), sistema digestivo (mesentério/intestino), coração, rim e osso (macrófagos derivados da medula óssea), todas as células que produzem, ligam ou libertam TNF são alvos para os aminoácidos do invento. Em particular prevê-se que a produção, libertação ou ligação de TNF a macrófagos, derivados ou localizados no pulmão, serão afectadas pela administração ao doente do medicamento ou formulação de acordo com o invento. O invento também proporciona um método para reduzir o risco de morte após choque endotóxico e/ou destruição por hipoxia-reperfusão, em particular, trauma (politrauma, queimadura e doentes de pós-operatório, assim como doentes sépticos) compreendendo administração de quantidades eficazes de um aminoácido do invento. O choque endotóxico e a destruição por hipoxia-reperfusão são ambos condições que podem resultar na morte do doente e que envolvem níveis elevados de TNF. O invento proporciona ainda a utilização de pelo menos um aminoácido, seleccionado do grupo constituído por glicina, alanina e serina, ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva, para a prevenção ou redução do risco de doença do fígado devido ao consumo excessivo de álcool e perturbações intestinais e pancreáticas resultante do mesmo, em doentes necessitados de tal tratamento. Para este fim a utilização de glicina e/ou serina ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis é preferida e sendo particularmente preferida a utilização de glicina ou seus sais fisiologicamente aceitáveis. O invento proporciona ainda a utilização de pelo menos um -5- aminoácido, seleccionado do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva para a prevenção ou redução da toxicidade causada por etanol em doentes necessitados de tal tratamento. Para esta indicação a utilização de glicina e/ou serina ou seus sais fisiologicamente aceitáveis é preferida e é particularmente preferida a utilização de glicina ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. O invento também proporciona a utilização de pelo menos um aminoácido, seleccionado do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva para a eliminação de etanol do estômago antes de entrar na circulação sistémica em doentes necessitados de tal tratamento. O invento também proporciona a utilização de um aminoácido como aditivo de alimentos, bebidas leves, vitaminas ou preparações farmacêuticas para o tratamento de toxicidade causada por etanol e um método para a prevenção de toxicidade devida a etanol, empregando uma quantidade eficaz de um aminoácido do invento.

Prefere-se que o medicamento ou formulação seja administrado ao doente numa quantidade tal que o aminoácido do invento diminua os níveis de TNF no sistema circulatório abaixo de 250 pg/ml ( ±10%), particularmente no caso de doentes traumatizados sofrendo de queimaduras graves (segundo ou terceiro grau), nos quais poderá haver alguma dispersão de endotoxinas bacterianas na circulação geral na ausência de manifestações clínicas claras de sepsia. Prefere-se que o aminoácido do invento diminua os níveis de TNF no sistema circulatório abaixo de 80 pg/ml (± 10%) e, é ainda mais preferido, que os níveis de TNF sejam diminuídos para valores inferiores a 20 pg/ml (± 10%). Os familiarizados com a matéria sabem que tais níveis podem ser detectados, em particular, via ensaios imunossorventes ligados a enzimas ou radioimunoensaios. O presente invento também proporciona a utilização de pelo menos um aminoácido, seleccionado do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva para a prevenção ou diminuição da rejeição de enxertos induzida por TNF. O enxerto pode estar associado a qualquer orgão, mas os benefícios mais profundos para o doente serão observados no caso de transplante ou cirúrgia de injecção associada ao pulmão, coração, fígado, intestino/me-sentério e rim.

No caso de o medicamento ou formulação se destinar a ser administrado a doentes transplantados, pode, vantajosamente, compreender pelo menos um dos seguintes compostos: anticorpos neutralizantes induzidos contra TNF, receptores solúveis de TNF ou seus derivados ou partes, e imunossupres-sores polipeptídicos cíclicos. Um exemplo de um imunossupressor polipeptídico cíclico bem conhecido, adequado para a inclusão no medicamento, é a ciclosporina, ou um seu derivado eficaz. Um receptor solúvel de TNF particularmente adequado compreende uma construção de proteína de fusão solúvel dimérica sintética, que combina dois receptores de TNF p60 com a porção Fc de uma molécula de IgG. Esta construção de proteína de fusão possui maior afinidade e é um inibidor superior da bioactividade de TNF relativamente aos receptores TNF monoméricos nativos (p80 ou p60) ou anticorpos anti-TNF. A formulação nutritiva ou medicamento poderá ser administrada profilaticamente, e.g. no pré-operatório, na fase aguda, e.g. no pós-operatório, ou em ambos os casos.

-7- S323SS A formulação nutritiva ou medicamento pode ser administrado ao doente entericamente ou parentericamente. A via de administração entérica é preferida, particularmente para tratamento subsequente ou profilático; são particularmente contempladas as vias de administração entérica oral, nasal e/ou tubo de alimentação. O medicamento ou formulação é convenientemente administrado na forma de um líquido aquoso. Assim, o medicamento ou formulação, numa forma adequada para aplicação entérica, será preferencialmente na forma aquosa ou de pó, pelo que o pó é convenientemente adicionado a água antes de ser usado. Para usar no tubo de alimentação, a quantidade de água a ser adicionada dependerá, inter alia, das necessidades de fluidos dos doentes e do estado dos mesmos. Será apreciado que, para o tratamento agudo, a via de aplicação parentética é a preferida. A via de aplicação parentérica é, por exemplo, também indicada sempre que o objectivo seja controlar os efeitos de endotoxemia crónica. O medicamento ou formulação pode ser assim formulado de forma a libertar no doente entre 1 e 80 g do aminoácido do doente em cada 24 horas. A quantidade de medicamento ou formulação a ser administrada depende, em larga medida, das necessidades específicas do doente. Tais quantidades diárias de aminoácido do invento são adequadas ao tratamento tendo em vista os efeitos pretendidos, assim como para profiláxia/pré-tratamento. No caso de o medicamento ou formulação compreender um único aminoácido do invento (na configuração L), poderá ser administrado ao doente numa quantidade tal que a concentração daquele aminoácido no plasma do doente seja aumentada para 0,5 a 2,0 mM, preferencialmente entre 1,0 e 2,0 mM. Se bem que possam ser previstas concentrações superiores a estas, espera-se que efeitos clínicos significativos sejam obtidos se a concentração do ácido for aumentada, como consequência da administração da formulação ou medicamento, de forma a manter-se na gama de 1,2 a 1,5 mM. Nos doentes traumáticos hipercatabólicos pode ainda ser benéfico aumentar a glicina, serina ou alanina do plasma para cerca de 0,2 a 0,3 mM que corresponde aos de níveis de glicina do plasma de indivíduos saudáveis. O aminoácido mais preferido do invento, para incorporação no medicamento ou formulação, para usar de acordo com o invento é glicina ou um seu sal fisiologicamente aceitável.

De um modo geral, é indicado usar um aminoácido do invento em combinação com um ou mais dos seguintes componentes: (i) ácidos gordos polinsaturados ómega-3 (PUFAs) misturados com PUF As ómega-6; (ii) L-arginina ou outros compostos fisiologicamente aceitáveis associados com a síntese de poliaminas, ou suas misturas; e (iii) uma fonte de nucleobases.

Prefere-se a utilização de um medicamento ou formulação nutritiva compreendendo um aminoácido do invento em combinação com arginina ou outros compostos fisiologicamente aceitáveis associados com a síntese de poliaminas tais como omitina. É também preferida a formulação de um medicamento ou formulação nutritiva compreendendo um aminoácido do invento, arginina ou omitina e ácidos gordos polinsaturados (PUFAs) ómega-3.

As fontes de nucleobases adequadas para usar em combinação com os aminoácidos do invento compreendem ou consistem em nucleobases, nucleósidos, nucleótidos, RNA e DNA naturais, seus equivalentes e/ou misturas, compreendendo um ou mais destes compostos. -9-

As nucleobases naturais incluem as purinas adenina e guanina, assim como as pirimidinas citosina, timina e uracilo. Quando a fonte de nucleobase está na forma de nucleobase livre, esta é preferencialmente uracilo.

Os nucleósidos naturais incluem os nucleósidos de ribose adenosina, guanosina, uridina e citidina e os nucleósidos de desoxirribose desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina e desoxicitidina.

Os nucleótidos naturais incluem ésteres de fosfato de nucleósidos naturais, tais como monofosfato de adenilato (AMP), guanilato (GMP), uridilato (UMP), citidilato (CMP), desoxitimidilato (dTMP), desoxicitidilato (dCMP) e difosfatos e trifosfatos de nucleósidos naturais tais como ADP e ATP.

Prefere-se uma fonte de nucleobase pura, como seja levedura. No entanto, podem ser igualmente usadas outras fontes tais como carne e similares. Preferencialmente a fonte de nucleobases é RNA.

Assim, o invento proporciona medicamentos ou formulações nutritivas compreendendo quantidades eficazes de: (a) um aminoácido do invento (componente (a)) em associação com um ou mais componentes seleccionados entre (b) PUF As ómega-3 misturados com PUF As ómega-6 (componente m (c) L-arginina ou outros compostos fisiologicamente aceitáveis associados com a síntese de poliaminas, ou suas misturas (componente (c)); e - 10- (d) uma fonte de nucleobase (componente (d)), em que o componente (a) e facultativamente o componente (c) são apenas aminoácidos no medicamento ou formulação nutritiva, que são adicionados como aminoácidos livres ou na forma de sal fisiologicamente aceitável.

Os referidos medicamentos e formulações nutritivas são daqui em diante designadas "dietas do invento". A dosagem deverá ser tal que os medicamentos ou formulações nutritivas sejam eficazes na diminuição dos níveis de factor de necrose tumoral (TNF) em doentes, nos quais os referidos níveis estão elevados relativamente aos que medeiam a homeostasia fisiológica e inflamação local.

Uma unidade de dosagem de tal medicamento ou formulação nutritiva, preferencialmente, compreende 1,5 a 80 partes por peso do componente (a) em associação com as seguintes quantidades de um ou mais componentes seleccionados entre (b) a (d): 0,1 a 20 partes por peso do componente (b), 3 a 4 partes por peso do componente (c) e 0,1 a 4,0 partes por peso do componente (d). É particularmente preferida uma dosagem unitária que compreenda 1,5 a 80 partes por peso do componente (a) em associação com as seguintes quantidades de um ou mais dos componentes seleccionados entre (b) a (d): 2 a 5 partes por peso do componente (b), 7,5 a 20 partes por peso do componente (c) e 1,7 a 2,0 partes por peso do componente (d). A quantidade dos componentes (a) a (d), administrados diariamente, corresponderá convenientemente a 1,5 a 80 g para o componente (a), 0,1 a 20g, preferencialmente 2 a 5 g, para o componente (b), 3 a 40 g, preferencialmente 7,5 a 20 g, para o componente (c) e 0,1 a 4,0 g, preferencialmente 1,7 a 2,0 g, para o componente (d). - 11 -

Relativamente ao componente (d) a dosagem acima está indicada para RNA, DNA, nucleósidos ou nucleótidos. Para as nucleobases uma unidade de peso de nucleobases é considerada como sendo equivalente a 2,5 - 3,0 unidades de peso de RNA, DNA, nucleósidos ou nucleótidos.

Sempre que são usados os medicamentos ou formulações nutritivas compreendendo um aminoácido do invento em combinação com um ou mais dos componentes atrás referidos (b), (c) e (d), tais medicamentos ou formulações nutritivas compreenderão convenientemente numa dosagem unitária (a) 1,5 a 80 partes por peso de um ou mais aminoácidos seleccionados do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, na forma livre ou na forma de sal fisiologicamente aceitável, ou suas misturas, em combinação com um ou mais compostos seleccionados entre o grupo consistindo em (b) 2 a 5 partes por peso de ácidos gordos polinsaturados ómega-3; (c) 7,5 a 20 partes por peso de L-arginina ou L-omitina, ou suas misturas; e (d) 1,7 a 2,0 partes por peso de RNA.

Os medicamentos ou formulações nutritivas preferidas compreendem numa dosagem unitária: (a) entre 1,5 e 80 partes por peso de um aminoácido seleccionado do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, na forma livre ou na forma de sal fisiologicamente aceitável, ou suas misturas, em associação com (c) 3 a 40 partes por peso, preferencialmente 7,5 a 20 partes por peso, de arginina ou uma quantidade equivalente de um ou mais de outros compostos fisiologicamente aceitáveis associados com a síntese de poliaminas, ou uma quantidade equivalente de uma mistura de arginina com tais compostos.

Mais preferencialmente os medicamentos ou formulações nutritivas do invento compreendem o componente (a) em combinação com o componente (c) numa proporção de peso de 1:2 a 4:1, sendo particularmente preferido uma proporção de peso de 1:1 a 2:1.

Outros medicamentos ou formulações nutritivas preferidos compreendem numa dosagem unitária: (a) entre 1,5 a 80 partes por peso de um aminoácido seleccionado do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, na forma livre ou na forma de sal fisiologicamente aceitável, ou suas misturas, em associação com (b) 0,1 a 20 partes por peso, preferencialmente 2 a 5 partes por peso, de PUF As ómega-3; e (c) 3 a 40 partes por peso, preferencialmente 7,5 a 20 partes por peso, de arginina ou uma quantidade equivalente de um ou mais de outros compostos fisiologicamente aceitáveis associados com a síntese de poliaminas, ou uma quantidade equivalente de uma mistura de arginina com tais compostos.

Por conveniência os PUFAs ómega-3 são protegidos contra a peroxidação.

São do conhecimento dos familiarizados com a matéria métodos fisiologicamente aceitáveis de protecção de PUF As ómega-3 contra a peroxidação. Eles incluem micro-encapsulação fisiologicamente aceitável de PUF As ómega-3 e a utilização de anti-oxidantes fisiologicamente aceitáveis. O amido é um exemplo típico dos agentes de micro-encapsulação fisiologicamente aceitáveis adequados para usar no presente invento. A micro-encapsulação pode ser realizada de modo conhecido per se. As micro-cápsulas podem ser revestidas de modo conhecido per se, através de agentes de revestimento fisiologicamente aceitáveis tais como goma arábica.

Exemplos típicos de antioxidantes adequados para usar no método do invento incluem vitaminas antioxidantes tais como Vitamina C, Vitamina E ou suas misturas. A quantidade de antioxidante adicionada deverá ser suficiente para evitar a peroxidação dos PUF As ómega-3. Tais quantidades podem ser facilmente calculadas. Em geral, por conveniência, quaisquer antioxidantes empregues para evitar a peroxidação, serão empregues em excesso. Será apreciado que a presença de qualquer outro agente administrado em associação com os PUFAs ómega-3 podem necessitar de um ajustamento da quantidade de anti-oxidante a ser empregue.

Os PUFAs ómega-3 podem ser empregues numa forma adequada ao fornecimento fisiológico de PUFAs ómega-3, e.g., na forma de ácido livre, na forma de triglicérido, ou na forma de fontes naturais fisiologicamente aceitáveis dos PUFAs ómega-3. Tais fontes naturais incluem óleo de linhaça e óleos de peixe tais como óleo de savelha, óleo de salmão, óleo de cavala, óleo de atum, óleo de fígado de bacalhau e óleo de anchova. As referidas fontes naturais, em particular, os óleos de peixe, compreendem quantidades substanciais de ácidos gordos ómega-3. Sempre que os PUF As ómega-3 são empregues na forma de triglicérido, os referidos triglicéridos podem compreender ésteres com outros ácidos gordos fisioloficamente aceitáveis. PUF As ómega-3 preferidos incluem o ácido eicosapentanóico (EPA) e docosa-hexanóico (DHA), na forma de ácido livre, na forma de triglicérido ou na forma de fontes naturais tendo um teor elevado de EPA e/ou DHA.

Quando os aminoácidos do invento são administrados na forma de um medicamento, tal medicamento compreenderá entre 1 a 99 g do aminoácido do invento por 100 g.

Em geral, obtem-se efeitos favoráveis, quando da administração de dietas do invento na forma de uma fórmula de dieta, a qual pode, dependendo das circunstâncias, ser uma fórmula de dieta completa (i.e. uma dieta que forneça essencialmente toda a energia, aminoácidos, vitaminas, minerais e micronutrientes necessários) ou um suplemento de dieta. A dieta será convenientemente tomada na forma líquida aquosa. Assim, uma fórmula de dieta pode compreender uma fonte de açúcares, lípidos (fonte de gordura) e proteína (fonte de azoto), e pelo menos um aminoácido seleccionado do grupo constituído por glicina, L-alanina e L-serina, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, caracterizados por o ácido ou sal estar presente na fórmula da dieta numa quantidade de cerca de 0,5 a 10 g por 100 g. A fórmula da dieta conterá ainda outros componentes nutritivos tais como vitaminas, minerais, micronutrientes, fibras (preferencialmente fibras solúveis).

Exemplos de fontes de azoto adequadas incluem proteínas nutricionalmente aceitáveis tais como sementes de soja ou suas proteínas derivadas, caseinatos, e/ou hidrolisatos de proteína. As fontes de açúcar adequadas incluem açúcares tais como maldotextrinas. Exemplos de fontes de gordura adequadas incluem triglicéridos, assim como diglicéridos e monoglicéridos.

Exemplos de vitaminas adequadas à incorporação no medicamento ou formulação do invento incluem Vitamina E, Vitamina A, Vitamina D, Vitamina K, ácido fólico, tiamina, riboflavina, Vitamina B1? B2, B6 e B12, niacina, biotina e ácido pantoténico na forma nutricionalmente aceitável.

Exemplos de elementos minerais e de micronutrientes adequados à incorporação no medicamento ou formulação incluem sódio, potássio, cálcio, fósforo, magnésio, manganês, cobre, zinco, ferro, selénio, crómio e molibdénio na forma nutricionalmente aceitável.

Em particular, o medicamento ou formulação, compreenderá preferencialmente beta-caroteno (Vitamina A), Vitamina E, Vitamina C, tiamina, Vitamina B12, colina, selénio e zinco na forma nutricionalmente aceitável. O termo "fibra solúvel" como aqui é usado refere-se a fibras que são capazes de sofrer fermentação substancial no cólon para dar como produto final ácidos gordos de cadeia curta. Exemplos de fibras solúveis adequadas incluem pectina, goma de guar, goma de alfarroba, goma de xantano, as quais podem ser facultativamente hidrolisadas. Para os adultos a quantidade total de fibra solúvel por dia residirá convenientemente na gama entre 3 e 30 g.

Será apreciado que os PUF As ómega-3 podem ser administrados em quantidades superiores às indicadas atrás, e que tais quantidades mais elevadas não inibirão, em geral, o efeito pretendido ou provocarão efeitos secundários indesejáveis. - 16-

Compostos particularmente adequados para usar como componente (c) na formulação do invento incluem L-arginina e L-omitina, mais preferencialmente L-arginina. O componente (c) pode ser empregue na forma livre, forma de sal fisiologicamente aceitável, e.g. na forma de um sal com ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido fumárico, ácido adípico ou ácido láctico ou na forma de pequeno peptídeo. Preferencialmente é empregue L-arginina na forma livre. O termo pequeno peptídeo como aqui é usado refere-se a peptídeos tendo entre 2 e 6, preferencialmente entre 2 e 4 aminoácidos.

Conforme já indicado, os PUF As ómega-3 serão convenientemente administrados na forma de óleos de peixe, protegidos ou não contra a peroxidação. Tais óleos de peixe também compreendem PUF As ómega-6.

Os PUF As ómega-6 também possuem um efeito favorável na resposta imune e na resistência à infecção quando da cirúrgia. Assim, as dietas do invento convenientemente compreenderão PUF As ómega-6.

Para fins do presente invento os PUF As ómega-6 podem estar na forma de ácido livre ou numa forma adequada ao fornecimento fisiológico de PUF As ómega-6, e.g., na forma de triglicérido. Exemplos de PUF As ómega-6, particularmente adequados para usar de acordo como invento, incluem ácido linoleico e ácido araquidónico, sendo mais preferido o ácido linoleico. São conhecidos exemplos de fontes adequadas de PUF As ómega-6. Elas incluem óleos de peixe e óleos vegetais. Exemplos de fontes adequadas de PUF As ómega-6 tendo um teor elevado em ácido linoleico, incluem óleo de açafroa, óleo de girassol, óleo de soja, óleo de algodoeiro e óleo de amendoim. A administração de uma dose diária de PUF As ómega-6 na gama de 1,5 a 5,0 g, em geral, será suficiente para se conseguir um efeito favorável. Uma dose unitária do medicamento ou formulação nutritiva pode ainda conter 1,5 a 5 partes por peso de PUF As ómega-6.

Para além dos componentes (b), (c) e (d) e dos PUF As ómega-6, podem ser adicionados outros componentes às dietas do invento e podem ter um efeito benéfico na actividade do aminoácido do invento. Um exemplo de tais componentes benéficos são os PUFAs ómega-9. Os óleos de peixe são uma fonte natural preferida de tais misturas de ácidos gordos. Por uma questão de sabor, entre outras, os óleos de peixe, nas formas de aplicação oral, preferencialmente são usados na forma encapsulada.

Sempre que a fórmula da dieta do invento se destine a ser usada como suplemento nutritivo (e.g. tratamento pré-operatório), a quantidade de energia fornecida não deverá ser demasiado excessiva, de modo a não suprimir desnecessariamente o apetite dos doentes. Por conveniência, o suplemento deverá compreender fontes energéticas numa quantidade que forneça 600 a 1000 Kcal/dia. Para usar como fórmula completa de dieta (e.g. para tratamento pós-operatório, tratamento de trauma), por conveniência as dietas do invento fornecerão entre 600 e 1500 Kcal/dia. A contribuição da fonte de azoto, fonte de carbono e fonte lípidica para as calorias diárias totais poderá variar dentro de gamas largas. Nas formulações preferidas do invento a fonte de açúcar proporciona 40 a 70% da energia total e a fonte de azoto e de ácidos gordos fornecerão 15 a 30% da energia total fornecida pelas formulações. Para usar como dieta completa, a dieta do invento será convenientemente administrada na forma líquida em volumes na gama de 500 ml a 3000 ml. Para usar como suplemento, a administração poderá ser na forma de pós ou na forma líquida. - 18-

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As condições ou doenças em que os doentes possuem níveis elevados de TNF que podem ser tratados de acordo com o invento incluem os seguintes; artrite, metástases, doenças pulmonares tais como síndrome de distrofia respiratória no adulto (ARDS), doenças inflamatórias do intestino tais como colite ulcerativa e doença de Crohn, doença das artérias coronárias, cirrose do fígado- induzida por álcool ou vírus, sepsia, incluindo choque endotóxico, danos causados por hipoxia-reperfusão, o síndrome da perda de peso observado na SIDA e em doentes com cancro, hepatite, angiogénse patológica, tratamentos tais como radiação e quimioterapia que - por exemplo - prejudicam a medula óssea, rejeição de orgãos, trauma, perturbação cardíaca pós-isquémica, úlceras, estados degenerativos tais como doença dos neurónios motores e esclerose múltipla que estão associados ao sistema nervoso; danos cerebrais e inflamação, pancreatite, insuficiência renal, diabetes, choque, asma e infecção. Conseguem-se resultados especialmente bons no tratamento de sepsia, choque endotóxico, infecção e danos causados por hipoxia-reperfusão, particularmente de choque endotóxico e sepsia. Também são conseguidos resultados particularmente bons no tratamento de doenças inflamatórias do intestino, sepsia, doenças crónicas do fígado, angiogénese patológica, arteriosclerose e trauma. As infecções podem ser infecções de feridas, empiemas, bacterémias, abcessos, septicémias e similares. Podem ser causadas por uma variedade de agentes infecciosos, incluindo bactérias, vírus, parasitas, fungos e endotoxinas. De um modo geral, o tratamento com o aminoácido do invento é indicado para doentes em quem os níveis de TNF poderão ser/são, pelo menos transitoriamente, elevados acima dos níveis que medeiam a homeostasia fisiológica e a inflamação local. Tais doentes incluem e.g. pacintes com trauma (politrauma, queimaduras, grandes cirúrgias), doentes com síndrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS); doentes sépticos; doentes com síndrome de distrofia respiratória de adultos (ARDS); doentes com insuficiência hepática aguda em quem não é possível qualquer pré-tratamento mas para quem se pretende um efeito agudo; doentes com risco de infecção tais como os doentes que têm uma menor resistência devido a imunossupressão, doentes sujeitos a radioterapia e/ou quimioterapia, doentes que sofrem de diabetes melitos, devido a subnutrição em termos proteicos, doentes com cirurgia de cancro gastrointestinal, doentes com cirurgia cardíaca, doentes sujeitos a transplantes, doentes tendo um risco aumentado de doença do fígado devido ao consumo excessivo de álcool e doentes que estejam infectados com o vírus da imunodeficiência humana; e doentes antes e depois de grandes processos operatórios, i.e. qualquer processo operatório que requeira anestesia geral como seja uma cirúrgia de derivação cardíaca e cirurgia grande do tracto gastrointestinal superior. A administração de um medicamento ou formulação nutritiva contendo um aminoácido do invento em combinação com um componente (c) é particularmente indicado para o tratamento de osteoporose. A surpreendente actividade farmacológica da glicina, ou do aminoácido do invento respectivamente, na diminuição dos níveis de TNF em doentes cujos referidos níveis estão elevados acima dos que medeiam a homeostasis fisiológica e a inflamação local é útil, por permitir i.a. minimizar os efeitos de endotoxemia, danos causados por hipoxia-reperfusão e infecção e para reduzir os riscos de choque endotóxico e sepsia, e assim reduzir ou evitar o risco de mortalidade.

Os aminoácidos do invento e especialmente as dietas do invento são, conforme já descrito, particularmente úteis no tratamento de doentes envolvidos em cirúrgia. Tal pré-tratamento será mais eficaz quando da administração da dieta do invento na forma de um suplemento. O suplemento será vantajosamente administrado durante um período de 3 dias ou mais. Em -20- geral, um pré-tratamento começando 3 a 6 dias antes da cirúrgia, e durante o referido período de 3-6 dias será suficiente para se atingir o efeito pretendido. Para pré-tratamento ou com fins profiláticos a administração de um suplemento contendo entre 1,5 e 80 g de aminoácido do invento em associação com 2 a 5 g do Componente (b) (PUFAs ómega-3) e/ou com o Componente (c) fornecendo entre 7,5 e 20 g de L-arginina ou L-omitina por dia, dará em geral o efeito pretendido.

Tal suplemento, pode e preferencialmente conterará uma quantidade do componente (d), PUF As ómega-6 ou outros componentes como descrito atrás. O suplemento convenientemente será administrado, na forma de doses unitárias adequadas para administração do suplemento, 3 a 4 vezes por dia. Sempre que as dietas do invento compreendam fontes energéticas, é adequado não fornecer mais de 1500 Kcal/dia. Para além desta limitação relativamente ao fornecimento de energia, os suplementos de dieta do invento para diminuição dos níveis de TNF podem e serão convenientemente fornecidos na forma de fórmulas de dieta completas como descrito atrás.

Sempre que seja necessário o tratamento agudo de doentes após exposição excessiva a álcool, o aminoácido do invento convenientemente será administrado parentericamente. As formas de administração típica adequadas a tal tratamento agudo são e.g. as soluções aquosas descritas abaixo.

Sempre que se deseje minimizar a entrada de álcool em circulação, através da eliminação do álcool no estômago induzida pela glicina, o aminoácido do invento será convenientemente fornecido numa forma de administração oral convencional, como sejam grânulos, comprimidos, cápsulas, líquidos (incluindo sopas e bebidas tais como bebidas leves, saciadores de sede), pós, fórmulas de dieta, etc. Quando formulados numa forma de formulação fisiologicamente aceitável como seja uma forma de cápsula ou de comprimido, tais formulações conterão convenientemente 0,2 a 90% por peso, preferencialmente entre 30 e 50% por peso de um aminoácido do invento. Em geral, a eliminação satisfatória de álcool do estômago é conseguida quando da administração de uma quantidade total dentro da gama de 0,01 a 5,0 g de um ou mais dos aminoácidos seleccionados do grupo constituido por glicina, alanina e serina, na forma livre e/ou na forma de sal fisiologicamente aceitável por Kg de peso de corpo. A administração é convenientemente por via oral e antes da ingestão de álcool.

As formas de de formulação farmacologicamente aceitáveis para administração oral compreenderão ainda diluentes, veículos, vitaminas, especiarias, pigmentos e/ou outros adjuvantes farmacologicamente aceitáveis conhecidos dos familiarizados com a matéria como sendo adequados para incorporação em tal formulação.

As dietas e formulações do invento podem ser obtidas de modo conhecido per se, e.g. através da mistura de ingredientes.

Formulações típicas adequadas para usar de acordo com o invento e em particular para o tratamento de doentes tendo um maior risco de doenças hepáticas devido ao consumo excessivo de álcool incluem soluções aquosas consistindo essencialmente em 0,1% a 90% por peso de pelo menos um aminoácido seleccionado do grupo constituido por glicina, alanina e serina, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. O aminoácido do invento pode estar presente numa forma de solução concentrada numa quantidade entre 15 e 90% (por peso da solução). As soluções concentradas são adequadas para diluição nas formas de aplicação ou para usar em tratamento agudo. As formas de aplicação, tendo um teor mais baixo (e.g. 0,1 a 5%) do aminoácido do invento, serão em geral indicadas para fins profiláticos; as formas concentradas da solução, tendo um teor mais elevado (e.g. 5% a 40% por peso) do aminoácido do invento, serão em geral mais adequadas para o tratamento agudo.

Outras formulações adequadas para inclusão no medicamento ou formulação do invento, em particular para aplicação parentérica, incluem soluções de infusão tais como solução de Ringer para injecção, cristaloides, colóides ou outros substitutos do plasma, em associação ou enriquecidos com cerca de 0,1 a 5,0 g por litro de solução de infusão de glicina, serina e/ou alanina. A solução de Ringer para injecção é uma solução estéril, contendo entre 3,23 a 3,54 g de sódio (equivalente a 8,2 a 9,0 g de cloreto de sódio), entre 0,149 e 0,165 de potássio (equivalente a 0,285 a 0,315 g de cloreto de potássio), de 0,082 a 0,098 g de cálcio (equivalente a 0,3 a 0,36 g de cloreto de cálcio, na forma de CaCl2.2H20), de 5,23 a 5,80 g de cloreto (como NaCl, KC1 e CaCl2.2H20) e água em quantidade suficiente para dar 1000 ml de solução. A solução de Ringer para injecção com lactato é uma solução estéril contendo entre 2,85 e 3,15 g de sódio, como cloreto e lactato), de 0,141 a 0,173 g de potássio (equivalente a 0,27a a 0,33 g de cloreto de potássio), de 0,049 a 0,060 g de cálcio (equivalente a 0,18g a 0,22 g de CaCl2.2H20), de 2,31 a 2,61 g de lactato, de 3,68 a 4,08 g de cloreto (como NaCl, KC1 e CaCl2.2H20) e água em quantidade suficiente para dar 1000 ml de solução.

Os termos cristaloides e colóides relativamente à terapia com fluidos são conhecidos. Eles incluem substitutos do plasma tais como Haemaccel (baseado em poligelina) e Gelofusine (baseado em gelatina). O invento será ainda melhor compreendido como referência à descrição específica que se segue. -23- EXEMPLO 1

Efeitos da glicina dietética na sobrevivência e destruição do fígado no rato

Ratos macho Sprague-Dawley (200-250 g) foram alimentados, ad libitum, com uma dieta em pó contendo 20% por peso de caseína (dieta testemunha) ou 5% por peso de glicina e 15% por peso de caseína (dieta de glicina) durante 3 dias antes da injecção com LPS. Os ratos foram então injectados com lipopolissacárido (LPS; 10, 20 e 30 mg/Kg respectivamente) na veia da cauda e a mortalidade avaliada 24 horas após a injecção. Se os ratos sobrevivem 24 horas, eles são considerados livres de perigo uma vez que não se observa mortalidade posterior.

RESULTADOS a) A dieta de 5% de glicina oferece uma protecção de 100% contra uma dose de LPS de 10 mg/Kg comparado com uma mortalidade 50% no grupo testemunha, com uma significância no nível de p<0,05. Numa dose de LPS de 20 mg/Kg observa-se uma mortalidade de 30% com uma dieta de 5% de glicina e uma mortalidade de 70% com a dieta testemunha. Numa dose de 30 mg/Kg de LPS a mortalidade aumentou para 90% nos animais tratados com glicina e para 100% nas testemunhas. b) Nos sobreviventes, mediu-se a enzima do fígado AST (aspartato-aminotransferase; uma transaminase) como uma indicação do grau de destruição do fígado. O nível de AST é marcadamente e significativamente reduzido nos ratos alimentados com glicina (de 2000IU/1 nos ratos alimentados não tratados com uma dose de LPS de 10 mg/Kg). -24- c) Numa série experimental paralela, avaliou-se o efeito da dieta de glicina nos níveis de factor de necrose tumoral (TNF). O TNF do soro foi medido por ELISA. Após injecção de 10 mg/Kg de LPS, o TNF do soro aumentou rapidamente nos ratos alimentados com a dieta testemunha para valores de aproximadamente 6000 pg/ml, 60 min após injecção, antes do abaixamento dos valores normais. Este aumento é significativamente suprimido (em pelo menos 50%; p<0,05) em ratos alimentados com uma dieta de 5% de glicina, pelo que o pico é antigido 150 min após injecção. d) As amostras de fígado e pulmão para histologia foram retiradas 24 hr após injecção de LPS (10 mg/Kg) e coradas com hematoxilina-eosina. Os ratos alimentados com a dieta testemunha apresentam muitas áreas necróticas e infiltração de neutrófilos no fígado e edema intersticial marcado com infiltração de neutrófilos no pulmão. Os ratos alimentados com dieta de glicina apresentam menos necrose no fígado e menos edema pulmonar do que os ratos alimentados com a dieta testemunha. e) A concentração de glicina no soro foi determinada por HPLC em dois grupos de ratos alimentados com dieta testemunha e com dieta de glicina respectivamente, e a cada um dos grupos foi dada uma injecção de LPS (10 mg/Kg i.v. na veia da cauda). Um rato alimentado com uma dieta de glicina sem tratamento com LPS apresenta uma concentração de glicina marcadamente mais alta (1892 μΜ) do que os ratos alimentados com uma dieta testemunha (150 μΜ) e sem injecção de LPS. Os ratos alimentados com uma dieta de glicina mantêm a concentração elevada de glicina (17271515 μΜ) 6 hr após a injecção de LPS; os ratos alimentados com uma dieta testemunha possuem 6 hr após a injecção de LPS uma concentração de glicina sérica de 278 μΜ. -25- EXEMPLO 2

Efeito da glicina na destruição causada por reperfusão num modelo de perfusão do fígado de baixo fluxo-refluxo

MÉTODOS

Animais usados- Ratos macho Sprague-Dawlwy pesando entre 180 e 210 g e alimentados com uma dieta de Purina. Os ratos fizeram um jejum de 24 horas antes da cirurgia.

Perfusão do fígado. Os ratos foram anestesiados com pentobarbital de sódio (50 mg) antes da cirúrgia e os fígados foram removidos cirurgicamente e perfundidos através de uma cânula inserida na veia porta com tampão bicarbonato Krebs-Henseleit (pH 7,4, 37°C), saturado com uma mistura de oxigénio-dióxido de carbono (95:5) num sistema não recirculante (Krebs-Henseleit, 1932). Após cirúrgia, os fígados foram perfundidos a fluxos de cerca de 1 ml/g/min durante 75 minutos (fluxo baixo). Subsequentemente, os fígados foram perfundidos as fluxos normais (4 ml/g/min) durante 40 minutos (refluxo). A glicina foi dissolvida em tampão bicarbonato Krebs-Henseleit (pH 7,4, 37°C) e introduzida no fígado continuamente começando 10 minutos antes do refluxo a velocidades que resultam em concentrações finais variando entre 0,06 e 2 mM.

Desidrogenase de lactato (LDH). A actividade de LDH no perfusato foi determinada usando técnicas enzimáticas convencionais (Bergmeyer, 1988). Três ml de perfusato foram bem misturados com um reagente contendo 15% de ácido tricloroacético, 0,375% de ácido tiobarbitúrico e ácido clorídrico 0,25N e aquecidos durante 15 minutos num banho de água fervente. Após arrefecimento, as amostras foram centrifugadas a 1000 g durante 10 -26- minutos e determinada a absorvância do sobrenadante a 535 nm. As taxas de libertação de LDH estão expressas por grama de peso seco de fígado por hora.

Tempo de distribuição de azul tripano e processos histológicos.

Para avaliar a microcirculação e morte celular no fígado, fez.-se uma infusão do fígado com azul tripano no final de todas as experiências numa concentração final de 0,2 mM (Belinsky et al., 1984). Registou-se o tempo necessário para a superfície do fígado ficar uniformemente azul escura. O excesso de corante foi removido por perfusão com tampão Krebs-Henseleit durante mais 10 minutos. Subsequenetemente, os fígados foram perfundidos com paraformaldeído a 1% durante 10 minutos e o tecido fixado foi embebido em parafina e processado para microscopia óptica. As secções foram coradas apenas com eosina, um corante citoplasmático, de forma a que o azul tripano pudesse ser identificado facilmente no núcleo das células danificadas.

Todos os núcleos de células do parênquima, numa zona de um raio de cinco células a partir das regiões periportais ou pericentrais, foram identificados como positivos ou negativos para o azul tripano. A percentagem de coloração foi calculada a partir do número de núcleos corados divididos pelo número total de células em qualquer região determinada.

Análise estatística. O teste t de Student ou ANOVA foi usado sempre que adequado. As diferenças são consideradas significativas quando o valor de p é inferiro a 0,05.

RESULTADOS

Efeitos da glicina na destruição hepatocelular num modelo de perfusão de baixo fluxo e refluxo. Durante o período de baixo fluxo, a libertação de LDH é mínima (cerca de 1 Ul/g/h a 75 minutos). No entanto, quando o fluxo é aumentado para 4 ml/g/min, a libertação de LDH aumenta gradualmente, atingindo um novo estado de equilíbrio em cerca de 30 minutos. A libertação máxima de LDH durante o período de reperfusão é de cerca de 35 Ul/g/h nas testemunhas, mas é reduzida significativamente pelo tratamento com glicina numa forma dependente de dose. Quando a concentração de glicina é aumentada para 2 mM, a libertação de LDH é reduzida para cerca de 5UI/g/h; ocorrem decréscimos de metade do valor máximo com glicina 180 μΜ. A tomada de azul tripano indica perda irreversível da viabilidade celular no lóbulo do fígado. O refluxo durante 40 minutos após 75 minutos de hipoxia de baixo fluxo provoca a morte de 30% das células do parênquima em regiões pericentrais, mas afecta apenas cerca de 2% das células em regiões periportais previamente normóxicas. A infusão de glicina (2 mM) diminui a morte celular nas áreas pericentrais para 9%. Concluindo, a destruição causada pela reperfusão, que ocorre quando o oxigénio é reintroduzido em regiões pericentrais previamente anóxicas dos lóbulos do fígado, é claramente reduzida pela infusão aguda de glicina numa forma dependente de dose.

Efeitos da glicina na distribuição do azul tripano. O tempo de distribuição do azul tripano, um indicador da microcirculação hepática, é ligeiramente mas significativamente inferior nos fígados infundidos com glicina do que nas testemunhas (cerca de 190 segundos, no fígado tratado com glicina e 225 segundos nas testemunhas, respectivamente, p<0,05, n=5) quando o azul tripano é infundido no fígado 5 minutos após a reperfusão. No entanto, os valores são reduzidos dramaticamente pela glicina numa forma dependente de dose quando o azul tripano é infundido ao fim de 40 minutos de reperfusão. Demora -28- cerca de 460 segundos até o azul tripano se distribuir igualmente pelas testemunhas, enquanto que os valores são reduzidos para cerca de 250 segundos quando a glicina 2mM é infundida. A concentração que causa um decréscimo de metade do valor máximo no tempo de distribuição do azul tripano é também cerca de 180 μΜ. A glicina minimiza a libertação de LDH e inibe a morte celular quase completamente durante a reperfusão numa forma dependente de dose. A glicina tem, assim, fortes efeitos citoprotectores contra os danos causados por reperfusão num modelo de perfusão do fígado de baixo fluxo, refluxo em rato. O tempo de distribuição do azul tripano é reduzido pela glicina numa forma dependente de dose, com metade do efeito máximo semelhante ao efeito citoprotector da glicina (180 μΜ). Uma vez que o tempo de distribuição do azul tripano pode ser influenciado não só pelas perturbações da microcirculação hepática mas também pela destruição das células hepáticas, o tempo de distribuição do azul tripano é medido após apenas 5 minutos de refluxo, quando a destruição causada por reperfusão é mínima. Este valor é também reduzido significativamente pela glicina mas num grau menor, indicando uma melhoria da microcirculação hepática.

Outros mecanismos possíveis relacionados com a anoxia e destruição causada por reperfusão, como seja a depleção de ATP e a alteração da função mitcocondrial foram também estudados. A produção de bílis, um processo altamente dependente de energia, não é afectada pela glicina, indicando que a glicina não minimiza a depleção de ATP e a tomada de oxigénio, um indicador da função mitocondrial, também não é alterada pela glicina. Concluindo, a glicina -29- aumenta a microcirculação hepática e protege contra a destruição causada pela reperfusão dependente de oxigénio. EXEMPLO 3

Efeito do pré-tratamento com glicina na mortalidade após isquémia hepática parcial/reperfusão e iniecção de LPS

Após 3 dias de alimentação com a dieta testemunha e com a dieta de glicina, os ratos foram sujeitos a isquémia hepática parcial durante 90 minutos sob anestesia com metoxiflurano. Uma dose subletal de LPS (5 mg/Kg) foi injectada na veia da cauda 6 horas após reperfusão.

RESULTADOS

Todos os ratos testemunha sem injecção de LPS sobreviveram durante 24 horas após 90 min de isquémia hepática parcial/reperfusão (n=4). Todos os ratos alimentados com dieta testemunha e com isquémia hepática parcial/reperfusão morrem dentro de 24 horas após a injecção de LPS (subletal) (n=4). O pré-tratamento de ratos com uma dieta de glicina aumenta marcadamente a sobrevivência (5 ratos em 6 sobrevivem) nas mesmas condições (90 min. de isquémia hepática parcial/reperfusão e dada a injecção de LPS) durante o período de observação (24 horas a partir do tempo da injecção); p < 0,05com o teste de Fischer). -30- EXEMPLO 4

Efeitos da glicina incluída na dieta na destruição do fígado induzida por álcool. 4.1 Materiais e métodos a. Animais Cânulas intragástricas foram inseridas como descrito por Tsukamoto e French, em ratos macho Wistar, pesando 300 a 320 g cada. As cânulas foram inseridas subcutaneamente na face dorsal do pescoço e ligadas a bombas de infusão por meio de um sistema móvel de catéter de mola permitindo a mobilidade completa dos ratos nas gaiolas metabólicas. Os animais foram sujeitos a infusão contínua com uma dieta líquida com alto teor de gordura contendo etanol durante 4 semanas. Todos os animais receberam cuidados de acordo com as linhas de conduta institucionais. b. Dieta

Usou-se uma dieta líquida descrita por Thompson e Reitz. Ela contem óleo de milho como gordura (37% das calorias totais), proteína (23%), açúcares (5%), minerais e vitaminas, mais etanol ou maltose-dextrina isocalórica (35%), daqui em diante designada dieta testemunha líquida. Adicionou-se glicina (2 a 5 % por peso) à dieta testemunha líquida; tais dietas são daqui em diante referidas como dieta líquida de 2% de glicina e dieta líquida de 5% de glicina, respectivamente. -31 - c. Colheita de urina e ensaio do etanol A concentração de etanol na urina, a qual é representativa dos níveis de etanol no sangue foram medidos diariamente. Os ratos foram alojados em gaiolas metabólicas que separam a urina das fezes e a urina foi colhida durante 24 horas em garrafas contendo óleo mineral para evitar a evaporação. Diariamente às 09.00 h, as garrafas de colheita de urina foram mudadas e uma amostra de 1 ml foi guardada a -20°C num microtubo para posterior análise do etanol. A concentração de etanol foi determinada medindo a absorvância a 360 nm resultante da redução de NAD+ em NADH pela desidrogenase de álcool. d. Colheita de sangue e aminotransferase de aspartato (AST)

Colheu-se sangue através da veia da cauda uma vez por semana e centrifugou-se. O soro foi guardado a -20°C num microtubo até ser testado para AST por processos enzimáticos convencionais. Também se testou sangue total (100 μΐ) para etanol, como descrito abaixo, e o sangue da veia porta hepática foi também colhido quando a biópsia do fígado foi realizada na 2a e 4a semana de tratamento com etanol. e. Ensaio do etanol no ar expirado, sangue periférico e portal, fezes e conteúdo do estômago

Para determinar as concentrações de etanol na respiração, os ratos foram forçados a respirar para uma câmara fechada aquecida (37°C) durante 20 seg. e colheu-se 1 ml de ar expirado com uma seringa estanque para gases. As concentrações de etanol foram analisadas por cromatografia gasosa (GC). O etanol no sangue periférico e portal foi também testado por CG. Misturou-se sangue (100 μΐ) com 900 μΐ de água destilada num frasco fechado, incubou-se durante 30 min. a 37°C e 1 ml da fase gasosa foi colhido e testado por CG. As fezes dos ratos foram colhidas directamente do ânus, homogeneizadas em água destilada e incubadas e analisadas como descrito atrás para o sangue. O conteúdo do estômago foi também colhido, quando os ratos foram mortos à 4a semana de tratamento com etanol, e analisado como descrito para o sangue. f. Medição da concentração de glicina no sangue

Após 4 semanas de tratamento com etanol, 500 μΐ de plasma foi colhido e guardado a -80°C para determinação da concentração de glicina no sangue por HPLC. A análise quantitativa de glicina no plasma heparinizado foi realizada usando o método de PICP-TAG (Waters, Milford, MA). As amostras de plasma foram primeiro hidrolisadas com HC1 e depois derivatizadas com fenilisotiocianato (PITC) para produzir aminoácidos com feniltiocarbamilo (PTC). Os aminoácidos, incluindo glicina, foram determinados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) em fase reversa com um gradiente automático. g. Avaliação patológica

Os ratos foram sujeitos a biópsia do fígado e autópsia após 2 e 4 semanas de tratamento com etanol. Os fígados foram fixados com formalina, embebidos em parafina e corados com hematoxilina e eosina para avaliar esteatose, inflamação e necrose. A patologia do fígado foi classificada como descrito por Nanji et al. como se segue: esteatose (a percentagem de células do fígado contendo gordura): <25% = 1+; <50% = 2+; <75% = 3+, >75% = 4+; inflamação e necrose: 1 foco por campo de baixa potência = 1+; 2 ou mais = 2+. h. Estatística

Usou-se, conforme adequado, ANOVA ou o teste t de Student para -33- determinar a signifícância estatística. Para comparação das avaliações patológicas, usou-se ANOVA de Kruskal-Wallis para as qualificações. Um valor de p inferior a 0,05 foi seleccionado, antes do estudo, como o nível de signifícância.

4.2 RESULTADOS

Os pesos do corpo dos ratos alimentados com uma dieta testemunha líquida, a dieta líquida com glicina e a dieta líquida com 5% de glicina, no decurso deste estudo tiveram uma tendência para diminuir durante a primeira semana. Os pesos do corpo depois estabilizaram e mantiveram-se constantes durante as 3 semanas seguintes de tratamento com etanol. Não houve diferenças significativas no peso do corpo entre os grupos estudados. A ingestão de etanol foi crescendo progressivamente para 9 a 10 g/Kg/dia durante a primeira semana após cirurgia. A ingestão era de 10 a 13 g/Kg/dia durante as semanas 2-4 e não houve diferenças significativas entre os grupos. A concentração de glicina no plasma após 4 semanas de tratamento foi de 779±66 pmol/l nos ratos que receberam a dieta líquida contendo 5% de glicina, e foi de 198+16 pmol/l nos ratos alimentados com etanol.

Determinaram-se curvas representativas das concentrações diárias de álcool na urina em ratos alimentados com a dieta testemunha líquida e com as dietas líquidas com glicina. Os níveis de álcool flutuaram numa forma cíclica entre perto de zero e mais de 300 g/dl em ratos alimentados com a dieta testemunha líquida, mesmo apesar do etanol ser introduzido continuamente. Em ratos alimentados com uma das dietas ricas em glicina, as concentrações de álcool eram muito baixas mas ainda cíclicas. As concentrações médias de álcool na urina foram reduzidas significativamente numa forma dependente de dose; uma redução de 50% da concentração média de álcool na urina foi obtida quando da alimentação com a dieta líquida com 2% de glicina, uma redução de 70% foi conseguida com a dieta líquida com 5% de glicina. A AST sérica em ratos alimentados com a dieta testemunha líquida aumentou gradualmente com o tempo de exposição e atingiu um nível de 183 IU/1 após 4 semanas (valor testemunha de 70 IU/1). Este aumento foi atenuado significativamente pelos tratamentos com glicina em todos os pontos do estudo. Após 4 semanas de tratamento, o nível sérico de AST era de 66 UI/1 em ratos tratados com 2% de glicina alimentados com a dieta líquida com 2% de glicina e foi de 100 UI/1 no grupo alimentado com a dieta líquida com 5% de glicina.

Nos ratos alimentados com a dieta testemunha líquida, observou-se uma ligeira esteatose após apenas 2 semanas de tratamento. Após 4 semanas de tratamento com a referida dieta líquida testemunha, alterações óbvias de gordura não eram aparentes nos ratos testemunha, não tratados com etanol. Nos ratos alimentados com dieta líquida com 2% de glicina e 5% de glicina, as alterações de gordura foram atenuadas e a necrose e inflamação foram quase totalmente ausentes. As reduções de esteatose e necrose foram estatisticamente significativas após alimentação com as dietas líquidas de glicina; observou-se apenas uma tendência para a redução da inflamação após alimentação com as dietas líquidas de glicina devido à variabilidade.

Eventualmente, o teor de álcool no estômago nos ratos tratados com glicina foram também reduzidos dramaticamente. Assim, é claro que a glicina reduz a concentração de etanol no estômago, possivelmente por efeitos no metabolismo do etanol. •η<ΝΌ+1 TABELA 1

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Composições entéricas

Nas composições que se seguem MM significa "mistura mineral", SM significa "micronutriente" e VM significa "mistura de vitaminas". A composição destas três misturas é a seguinte: MM

Ingredientes Maltodextrinas Citrato/fosfato de potássio Dicitrato de magnésio Cloreto de cálcio Citrato/cloreto de sódio Ácido cítrico Tartrato de colina VM Ingredientes Maltodextrinas Ascorbato de sódio Vitamina E-Ac. 50% Niacinamida Vitamina A-Acetato Ca-D-Pantotenato Vitamina K.,, 1% Vitamina B12 0,1% Vitamina D3 Vitamina B6 Vitamina B., Vitamina B2 t Acido fólico Biotina g/lQQ-g 34,40 34,608,208,00 9,00 3,50 2,30 g/100g 43,44 35.00 16.00 1,55 1,20 0,98 0,71 0,30 0,28 0,20 0,17 0,15 0,02 0,01 -37- SM Ingredientes g/lOOg Maltodextrinas 47,79 Molibdénio-levedura 18,00 Crómio-levedura 9,20 Sulfato de zinco 7,00 Selénio-levedura 7,00 Sulfato de ferro (II) 6,92 Gluconato de cobre (II) 2,24 Sulfato de manganês (II) 1,12 Fluoreto de sódio 0,70 Iodeto de potássio 0,03 Composição contendo glicina Ingredientes g/lOOg Agua 77,40 Maltodextrinas 10,10 Caseinatos de Na/Ca 4,60 Glicina 3,00 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Óleo de palma 2,33 Óleo de girassol 0,26 Emulsionante Nathin E 0.13 100,00 -38-

Composição contendo glicina e arginina

Ingredientes g/100g Água 77,40

Maltodextrinas 8,93

Caseinatos de Na/Ca 4,60

Glicina 3,00

Arginina 1,17 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Óleo de palma 2,36 Óleo de girassol 0,23

Emulsionante Nathin E 0,13 100,00

Composição contendo glicina e óleo de peixe (ácidos gordos ω-3)

Ingredientes g/lOOg Água 77,40

Maltodextrinas 10,10

Caseinatos de Na/Ca 4,60

Glicina 3,00 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Óleo de palma 1,32 Óleo de girassol 0,23

Emulsionante Nathin E 0,13 Óleo de peixe EPAX 3000 TG 1,04 100,00

Composição contendo glicina e RNA

Ingredientes g/lOOg Agua 77,40 Maltodextrinas 9,96 Caseinatos de Na/Ca 4,60 Glicina 3,00 RNA de extracto de levedura 0,14 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Óleo de palma 2,33 r Oleo de girassol 0,26 Emulsionante Nathin E 0.13 100,00 Composição contendo glicina, arginina e óleo de peixe (ácidos gordos ω-3) Ingredientes g/lOOg r Agua 77,40 Maltodextrinas 8,93 Caseinatos de Na/Ca 4,60 Glicina 3,00 Arginina 1,17 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Oleo de palma 1,32 r Oleo de girassol 0,23 Emulsionante Nathin E 0,13 Óleo de peixe EPAX 3000 TG 1.04 100,00 -40-

Composição contendo glicina, arginina e RN A

Ingredientes g/lOOg Água 77,40

Maltodextrinas 8,79

Caseinatos de Na/Ca 4,60

Glicina 3,00

Arginina 1,17 RNA de extracto de levedura 0,14 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Óleo de palma 2,33 Óleo de girassol 0,26

Emulsionante Nathin E 0,13 100,00

Composição contendo glicina, RNA e óleo de peixe (ácidos gordos ω-3)

Ingredientes g/lOOg Água 77,40

Maltodextrinas 9,96

Caseinatos de Na/Ca 4,60

Glicina 3,00 RNA de extracto de levedura 0,14 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Óleo de palma 1,32 Óleo de girassol 0,23

Emulsionante Nathin E 0,13 Óleo de peixe EPAX 3000 TG 1.04 100,00 -41 -

Composição contendo glicina, arginina, RNA e óleo de peixe (ácidos gordos ω-3) Ingredientes g/lOOg Agua 77,40 Maltodextrinas 8,79 Caseinatos de Na/Ca 4,60 Glicina 3,00 Arginina 1,17 RNA de extracto de levedura 0,14 MM 2,00 SM 0,05 VM 0,10 β-caroteno 0,03 Lípidos: Óleo de palma 1,32 r Oleo de girassol 0,23 Emulsionante Nathin E 0,13 Óleo de peixe EPAX 3000 TG 1.04 100,00

Conforme já estabelecido atrás, o óleo de peixe é uma fonte natural de PUF As ómega-3, enquanto que o óleo de girassol é uma fonte natural de PUF As ómega-6.

Se bem que o invento tenha sido exemplificado com referência à capacidade da glicina para suprimir um aumento de TNF e assim minimizar os efeitos das destruição causada por choque endotóxico e reperfusão isquémica em ratos, os familiarizados com a matéria tendo acesso à presente descrição poderão avaliar que o invento abrange outros aspectos para além dos especificamente descritos. Por exemplo, o invento ainda proporciona a utilização de pelo menos um aminoácido ou seu precursor, seleccionado do grupo constituído por glicina, -42- alanina e serina, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, para potenciar sinergisticamente os efeitos imunossupressivos dos polipeptídeos cíclicos imunossupressores, anticorpos neutralizantes que tenham sido induzidos contra TNF ou receptores solúveis de TNF. Tal utilização poderá também proporcionar um efeito de segurança relativamente ao imunossupressor, o qual poderá ser por exemplo ciclosporina ou FK-506. Ainda, os doentes que sofram de uma grande variedade de doenças e/ou condições poderão beneficiar da administração do medicamento ou formulação do invento. Tais doenças e estados incluem: osteoporose; artrite, metástases;

Lisboa, 8 de Junho de 2000

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JORGE CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de pelo menos um aminoácido seleccionado do grupo constituído por glicina, alanina e serina, ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis, na preparação de um medicamento ou formulação nutritiva para administração entérica, para a diminuição dos níveis de factor de necrose tumoral (TNF) em doentes cujos referidos níveis são elevados relativamente aos que medeiam a homeostasia fisiológica e a inflamação local.
2. 2. A utilização de acordo com a reivindicação I, em que tal diminuição dos níveis de TNF é conseguida através da inibição ou diminuição de: (i) produção do factor de necrose tumoral (TNF) pelas células do tipo macrófago; (ii) libertação de TNF pelas células do tipo macrófago; e/ou (iii) ligação de TNF aos receptores de TNF.
3. 3. A utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para a prevenção ou redução do risco de doença do fígado causada por consumo excessivo de álcool e perturbações intestinais e pancreáticas resultantes do mesmo.
4. 4. A utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para a prevenção ou diminuição da rejeição de enxertos induzida por TNF.
5. 5. A utilização de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 para o tratamento de uma doença ou estado seleccionado entre o grupo que se segue constituído por: osteoporose; artritre; metástases; doenças do -2- pulmão incluindo síndrome de distrofia respiratória de adultos (ARDS); doenças oinflamatórias do intestino, incluindo colite ulcerativa, e doença de Crohn; doença das artérias coronária; cirrose do fígado induzida por álcool ou virai; sepsia, incluindo choque endotóxico; destruição causada por hipoxia-reperfusão; síndrome de perda de peso observado em AIDS e doentes com cancro; hepatite; nefrite; angiogénese patológica; síndromes pós-tratamento após tratamento com radiação ou quimioterapia, incluindo medula óssea lesada; rejeição de orgãos; trauma; lesões cardíacas pós-isquémicas; úlceras; estados degenerativos tais como doença dos neurónios motores e esclerose múltipla que estão associados com o sistema nervoso; lesões cerebrais e inflamação; pancreatite; insuficiência renal; diabetes; choque; asma; infecção; doenças crónicas do fígado e arteriosclerose.
6. 6. A utilização de acordo com a reivindicação 5 para a minimi-zação dos efeitos de endotoxemia, lesões provocadas por hipoxia-reperfusão e infecção.
7. 7. A utilização de acordo com a reivindicação 6 para a redução ou prevenção do risco de mortalidade através da redução dos riscos de choque endotóxico e sepsia.
8. 8. Um medicamento ou formulação nutritiva compreendendo quantidades eficazes de: (a) um ou mais aminoácidos seleccionados do grupo constituído por glicina, alanina e serina, na forma livre ou na forma de sal fisiologicamente aceitável, ou suas misturas (componente (a)) em associação com um ou mais componentes seleccionados entre (b) PUF As ómega-3 misturados com PUF As ómega-6 (componente (b)); -3- (c) L-arginina ou outros compostos fisiologicamente aceitáveis associados com a síntese de poliaminas, ou suas misturas (componente (c)); e (d) uma fonte de nucleobase (componente (d)), em que o componente (a) e facultativamente o componente (c) são apenas aminoácidos no medicamento ou formulação nutritiva, que são adicionados como aminoácidos livres ou na forma de sal fisiologicamente aceitável.
9. 9. O medicamento ou formulação nutritiva de acordo com a reivindicação 8 compreendendo, numa dosagem unitária, (a) 1,5 a 80 partes por peso de um ou mais aminoácidos seleccionados do grupo consistindo em glicina, alanina e serina, na forma livre ou na forma de sal fisiologicamente aceitável, ou suas misturas, em combinação com um ou mais compostos seleccionados entre o grupo consistindo em (b) 2 a 5 partes por peso de ácidos gordos polinsaturados ómega-3; (c) 7,5 a 20 partes por peso de L-arginina ou L-omitina, ou suas misturas; e (d) 1,7 a 2,0 partes por peso de RNA.
10. 10. O medicamento ou formulação nutritiva de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9 compreendendo o componente (a) em combinação com o componente (c).
11. 11. O medicamento ou formulação nutritiva de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9 compreendendo o componente (a) em combinação com os componentes (b) e (c).
12. 12. O medicamento ou formulação nutritiva de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9 compreendendo o componente (a) em combinação com os componentes (b), (c), e (d). -4-
13. 13. O medicamento ou formulação nutritiva de acordo com a reivindicação 8 que é uma fórmula de dieta compreendendo uma fonte de açúcares, lípidos (fonte de gordura) e proteína (fonte de azoto) e preferencialmente também um ou mais componentes seleccionados entre vitaminas, minerais, micronutrientes e fibras (preferencialmente fibras solúveis), em que o componente (a) está presente numa quantidade de 0,5 a lOg por 100 g de fórmula de dieta. Lisboa, 8 de Junho de 2000

    JORGE CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 USBOA