CZ261493A3 - Pharmacologically active compounds, process of their preparation and pharmaceutical preparations in which they are comprised - Google Patents

Description

Farmakologicky účinné sloučeniny, způsob jejich přípravy a farmaceutické kompozice tyto sloučeniny obsahující Oblast techniky

Vynález se týká sloučenin, které jsou použitelné jako inhibitory uvolňování cytokinů a činidla antagonizující účinky__

IL-1.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nových sloučenin obecného ^ligA' j.v/Jycicí gvao vzorce I

S 6 |1X 9 0 ί Ol^OQ

i 5 6 8 9 ¹

ve kterém a Rg jsou stejné nebo odlišné a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo skupinu alkyl-COO-, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy,

R₅ znamená hydroxy-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až uhlíkové atomy nebo skupinu alkyl-COO-, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, jedna ze skupin -a-b- nebo -d-e- znamená -CHR^-CHRg- a druhá z těchto skupin znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CR₇=CRg, ve které R_? a R_g jsou stejné nebo odlišné á znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo skupinu alkyl-COO, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až uhlíkové atomy, c znamená skupinu CH-OH nebo skupinu C=0 a

-f-g- znamená skupinu -CH₂-CH₂- nebo cis- nebo trans-konf .iguraci skupiny -CH=CH-, s výhradou spočívající v tom, že když znamená atom vodíku, Rg znamená hydroxy-skupinu a -f-g- znamená transkonf iguraci skupiny -CH=CH-, potom

1) Rg neznamená hydroxy-skupinu, když -a-b- znamená -CH₂-CH₂“, c znamená C=0 a -d-e- znamená -CH₂~CH₂-, nebo

2) Rg neznamená methoxy-skupinu, když -a-b- znamená -CH₂~CH₂- nebo cis-konfiguraci skupiny -CH=CH- a c znamená C=O nebo CH-OH a -d-e- znamená -CHOH-CHOH-, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo ve formě fyziologicky hydrolyzovatelného a fyziologicky přijatelného esteru, přičemž asymetrický uhlík označený hvězdičkou a atomy a nebo/ a b nebo d nebo/a e v případě, že jsou asymetrickými uhlíkovými atomy, mají R- nebo S-konfiguraci nebo uvedené sloučeniny zahrnují libovolnou směs jejich optických izomerů.

Výhodně R^ a Rg jsou stejné nebo odlišné a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, skupinu MeO- nebo skupinu Me-COO-. Rg výhodně znamená hydroxy-skupinu, skupinu MeO- nebo skupinu MeCOO-. Výhodněji R^ znamená atom vodíku nebo skupinu MeO-, Rg znamená MeO-a Rg znamená hydroxy-skupinu nebo skupinu MeO- a Rg znamená hydroxy-skupinu nebo skupinu MeO-.

Skupina -a-b- výhodně znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CR?^z=CRg'-, ve které R^' a Rg' jsou stejné nebo odlišné a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, skupinu MeOnebo skupinu Me-COO-. Výhodněji skupina -a-b- znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-.

Výhodně skupina -d-e- znamená -CHR?'-CHRg^z-, kde R^' a Rg‘ mají výše uvedené významy. Výhodněji skupina -d-e- znamená

-CH₂-CH2“ nebo zejména -CHOH-CHOH-, přičemž v uvedených skupinách mohou být hydroxyskupiny ve volné nebo chráněné formě.

Skupina -f-g- nejvýhodněji znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-.

Výhodně mají všechny asymetrické uhlíky sloučenin podle vynálezu konfiguraci S.

Zvláštní provedení vynálezu zahrnuje sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém R^ zname_s_^ná atom vodíku nebo methoxy-skupinu, znamená methoxy-skupinu, Rg znamená hydroxy-skupinu, skupina -a-b- znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, c znamená CHOH nebo C=0, skupina -d-e- znamená -CHOH-CHOH- a skupina -f-g- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, s výhradou spočívající v tom, že když -a-b- znamená cis-konfiguraci skupiny -CH=CH-, potom R^ znamená methoxy-skupinu a c znamená C=0, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo ve formě fyziologicky hydrolyzovatelného a akceptovatelného esteru.

Obecný vzorec i”, který odpovídá obecnému vzorci I, ve kterém R^ a znamenají methoxy-skupinu, Rg znamená hydroxyskupinu, skupina -a-b- znamená cis-konfiguraci skupiny -CH=CH-, c znamená C=0, skupina -d-e- znamená -CHOH-CHOH-, skupina -f-g- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH- a všechny asymetrické uhlíkové atomy označené hvězdičkou mají konfiguraci S,

představuje chemickou strukturu, která byla připsána novému metabolitu, který byl označen kódem 87-250904-F1 a který má následující charakteristiky:

bílé jehličky (ze směsi methanolu a vody v poměru 1:1), teplota tání: 173-174 °C, /alfa/j?⁵ -43,6° (-methanol, c=0,76), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy): m/e = 393 (MH ), infračervené spektrum (KBr): viz obr.1, protonové nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCl^, 360MHz za použití TMS jako vnitřního standardu): viz obr.2, rozpustnost: téměř nerozpustný ve vodě, snadno rozpustný v methanolu, dimethylsulfoxidu a chloroformu, vysokotlaká kapalinová chromatografie:

sloupec: LiChrospher 100 RP-8 (5/um)(LiChroCART 125-4,

Merck), mobilní fáze: směs acetonitrilu,vody a kyseliny orthofosforečné v objemovém poměru 350:650:0,175, průtok: 1,0 ml/min, detekce: UV 210 nm, retenční doba: 3,8 min.

Sloučeniny obecného vzorce' I jsou novými sloučeninami, které patří do stejné skupiny sloučenin jako zearalenone, který je sloučeninou obecného vzorce II

ve kterém R^ = R^ = R^ = R^ = H, -a-b- = -CI^-Cí^- a c = C=O. O zearalenonu je známo, že má anabolické účinky. Sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém znamená methylovou skupinu,

R₂ = R-j= OH, R^ = H, -a-b- = -CH₂~CH₂- nebo cis-konfigurace skupiny -CH=CH- a c = C=0 nebo CH-OH, byly popsané Ellestad-em a kol. v J.Org.Chem.43 2339 (1978), kde se o nich uvádí, že ne mají žádnou zvláště zajímavou účinnost, přičemž se předpokládá, že za neúčinnost těchto sloučenin zodpovídá přítomnost feno lově etherové skupiny (tj. methoxy-skupiny na benzenovém kruhu)

Vzhledem k výše popsané specifikaci je překvapující, že sloučeniny obecného vzorce I mají farmakologickou účinnost.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou rovněž blízké sloučenině označované jako radicicol a mající obecný vzorec III

(III) ve kterém R znamená atom vodíku. Rovněž je známa odpovídající methoxy-sloučenina, ve které R znamená methylovou skupinu.

Uvedený radicicol, který je metabolitem mikroorganismu Monosporium bonorden, je znám svými antibiotickými vlastnostmi /Delmotte, Nátuře 171 344 (1953)/.

S překvapením bylo nyní nově nalezeno, že výše popsané sloučeniny, totiž nové sloučeniny obecného vzorce I, radicicol,

O-methylradicicol a zearalenonové deriváty, popsané Ellestadem a kol. mají inhibiční účinek na uvolňování cytokinů, přičemž zejména inhibují uvolňování IL-1, IL-6 a TNF-alfa, a také půδ sobí jako funkční antagonisté IL-1.

Sloučenina obecného vzorce i' může být připravena kultivací produkčního mikrobiálního kmene na živné půdě. Výhodnými mikroorganismy jsou kmeny pyknidiálních hub nedokonalých, zejména kmen F/87-250904, který produktuje metabolit 87-250904-F1.

Tento kmen byl izolován z neidentifikovaného lišejníku, nalezeného v Jižní Africe, a živá kultura tohoto kmenu byla 6. listopadu 1991 uložena ve sbírce kultur, akceptované Budapeštskou smlouvou, ARS Patent Culture Collection, US Dept. of Agriculture, Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, kde jí bylo přiděleno referenční číslo NRRL 18919. Tato kultura může být rovněž získána u firmy Sandoz Ltd., Basilej, Švýcarsko.

Uvedený fungální kmen NRRL 18919 roste na většině obvyklých fungálních agarových půdách, jakou je například agar se 2 % sladového extraktu. Teplotní kultivační rozmezí přibližně činí 5 až 37 °C, přičemž optimální kultivační teplota se pohybuje od asi 24 do asi 32 °C. Kmen NRRL 18919 vytvoří na agaru se 2 % sladového extraktu v Petriho miskách po 10 dnech inkubace při teplotě 27 °C kolonie mají průměr 25 až 35 mm. Tyto kolonie mají hnědé, zelenavě černé až černé zbarvení a skrovně rozvinuté vzdušné mycelium. Za těchto podmínek se netvoří žádné výrazně rozptýlitelné pigmenty.

Pyknidy kmene NRRL 18919 mají rozmanitý tvar a velikost. Spadají sem piknidy s velikostí asi 10/um, mající kulovitý až hruškovitý tvar a jediné ostiolum, ale i nepravidelný tvar, ale také pyknidy s velikostí až 600/Um, včetně pyknidiálních komplexů, mající několik ostioli. Vnější pyknidiální stěny jsou tvořeny hnědými buňkami. Konidie jsou sklovitě průhledné, bezpřepážkové, tyčinkovité, ledvinovité až jitrnicovité, mnohdy zaškrce né a mají velikost 3,0 - 5,5 x 1,0 - 1,7/um. Tyto konidie. jsou tvořeny v pyknidách štíhlými fialidy a schromažůují se vně ostiola v bělavé hmotě. Kmen NRRL 18919 nejlépe vyhovuje rodu

Phoma Sace. a velmi dobře odpovídá popisu Phoma cava Schulzer.

Uvedený nový kmen NRRL 18919 může být kultivován při vhodné teplotě na různých kultivačních půdách za použití příslušných živin a minerálních látek ve formě aerobní povrchové nebo imerzní kultury. Vynález rovněž poskytuje fermentační směsi které se získají kultivací fungálního kmene produkujícího metabolit 87-250904-F1, zejména kultivací kmene NRRL 18919. Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I, jehož podstata spočívá v tom, že se kultivuje fungální kmen produkující metabolit 87-250904-F1, načež se vytvořený metabolit 87-250904-F1 izoluje z kultivačního prostředí.

Kmen NRRL 18919 může odbourávat škrob a keratin, neodbouráva však, nebo odbourává pouze ve velmi omezené míře celulózu a chitin.

Fermentační prostředí by mělo obsahovat využitelný zdroj uhlíku a případně minerální soli a růstové faktory, přičemž všechny tyto látky mohou být přidány ve formě velmi dobře definovaných produktů nebo jako komplexní směsi, jaké se nacházejí v biologických produktech různého původu.

Za účelem přípravy nového metabolitů 87-250904-F1 mohou být rovněž použity kmeny, které jsou získané selekcí nebo mutací působením ultrafialového světla, rentgenového záření nebo použitím jiných prostředků, například chemických mutagenů.

Jakmile se v kultivačním prostředí nahromadí dostatečné množství metabolitů, může být tento metabolit zahuštěn a izolován konvenčním způsobem, například extrakcí a následnými chromatografíckými postupy.

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém -a-b- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, mohou být připraveny z odpovídajících sloučenin, ve kterých -a-b- znamená cis-konfigura8 ci skupiny -CH=CH-, izomeraci za mírně alkalických podmínek, například v roztoku pyridinu, vhodně po dobu 12 až 48 hodin při teplotách mezi 0 a 80 °C, výhodně při teplotě asi 50 °C.

Sloučeniny obecného vzorce I mohou být rovněž připraveny úplnou nebo částečnou chemickou syntézou za použití konvenčních syntézních postupů.

Dalším předmětem vynálezu je takto způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém c znamená skupinu CHOH, jehož podstata spočívá v tom, že se cyklizuje sloučenina obecného vzorce IV

ve kterém R^, R^, Rg, -a-b-, -d-e- a -f-g- mají výše uvedený význam s výjimkou spočívající v tom, že jakékoliv substituenty OH na -a-b- nebo -d-e- jsou ve vhodně chráněné formě, a R^ zna mená atom vodíku nebo ochrannou skupinu hydroxy-funkce, načež se odstraní jakékoliv ochranné skupiny hydroxy-funkce.

Sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém c znamená C=O, mohou být připraveny z cyklizovaného produktu oxidací skupiny CHOH ve významu obecného symbolu c.

Sloučeniny obecného vzorce IV, ve kterém -f-g- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, mohou být připraveny reakcí sloučenin obecných vzorců V a VI

ve kterých R^, R^, Rg, R., ₁, -a-b-, -d-e- a -f-g- mají výše uvedené významy pro obecný vzorec IV a R^ a R^ znamenají ochranné skupiny hydroxy-funkce, a následným odstraněním ochranných skupi R₁₂ a R_n.

Sloučeniny obecného vzorce VI mohou být připraveny reakcí hydroxy-chráněného analogu 4-hydroxybut-1-inu s hex-1-en5-onem, částečnou nebo úplnou redukcí acetylenové vazby a případně zavedením ochranné skupiny hydroxy-funkce R-j ₁ ·

Sloučeniny obecného vzorce IV, ve kterém -f-g- znamená -CH2-CH2-z mohou být připraveny reakcí sloučenin obecných vzorců VII a VIII

(VII) (VIII) ve kterých R^, R^, ^Rg _a ^R-|2 výše uvedené významy pro obecné vzorce IV a V a R^ znamená ochrannou skupinu hydroxy-funkce, částečnou nebo úplnou redukcí acetylenové vazby a případně odstraněním ochranných skupin hydroxy funkce.

Sloučeniny obecného vzorce VII mohou být připraveny reakcí výše uvedené sloučeniny obecného vzorce V s hydroxy-chráněným analogem 6-hydroxyhex-1-enu, redukcí alkylenové vazby odpovídající f-g v obecném vzorci I, odstraněním ochranné skupiny z koncové hydroxyskupiny na bočním řetězci s šesti uhlíkovými atomy a oxidací této hydroxyskupiny na aldehydovou skupinu.

Výše popsané způsoby mohou být provedeny za použití konvenčních syntézních postupů, činidel a podmínek, například za použití postupů, které jsou popsány v dále zařazených příkladech provedení.

Výhodnými sloučeninami, ve kterých a-b znamená transkonfiguraci skupiny -CH=CH-, jsou sloučeniny dále uvedených vzorců I, X a XI :

1

Výhodnými sloučeninami, figuraci skupiny -CH=CH-, jsou ve kterých a-b znamená cis-konsloučeniny vzorců i', XII a XIII

(XIII)

Sloučeniny podle vynálezu mají farmakologické vlastnosti. Zejména působí jako inhibitory cytokinů, přičemž nejen že inhibují uvolňování IL-1, IL-6 a TNF-alfa, ale působí také jako funkční antagonisté IL-1, jak je to zřejmé z následujících testů in vitro a in vivo.

1) Uvolňování cytokinů z buněk THP-1

Buněčná řada THP-1 je obecně dostupná. Tato buněčná řada je popsána Tsuchiya-em a kol. v Int. J. Cancer 26 171-176 (1980) 900/Ul buněk THP-1 (0,5 x 10θ buněk) společně se 100 jednotkami gama-interferonu v 0,0 ml živné půdy RPMI 1640 (obsahující 2 mM L-glutaminu a 5 % tepelně aktivovaného fetálního telecího séra) se rozpipetuje do 24-jamkových kultivačních ploten. Potom se přidá 100/Ul testované sloučeniny. Po 3 hodinách při teplotě 37 °C a pod atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu se přidá 10/Ul lipopolysacharidu (500/Ug/ml) a v inkubaci se pokračuje po dobu dalších 40 hodin. Do testu jsou rovněž zahrnuty příslušné kontrolní pokusy (bez a se stimulem, rozpouštědlo ). Kultivační prostředí se potom odstraní a vyčiří odstředěním při 1000 g po dobu 10 minut'. Do jamek se přidá 1,0 ml 0,01% digitoninu za účelem lyže buněk, které se rozmělní roztíráním skleněnou tyčinkou na konci opatřenou pryžovým nástavcem a potom ponechají při teplotě 4 °C po dobu 10 minut. Bezprostředně potom se provede laktát-dehydrogenázové stanovení a vzor ky se uskladní při teplotě -10 °C až do okamžiku, kdy budou provedena další stanovení. Stanovení zahrnují: IL-1beta (kultivační prostředí a lyzát), IL-6 (kultivační prostředí), TNF-alfa (kultivační prostředí), PGE2 (kultivační prostředí a lyzát), laktát-dehydrogenáza (LDH) (kultivační prostředí a lyzát) a DNA (lyzáty). Stanovení IL-1beta, IL-6 a TNF-alfa se provedou za použití komerčně dostupných souprav ELISA (Cistron), PGE2 se měří za použití standardního testu RIA a DNA se stanoví fluorimetricky za použití činidla DAPI ( 4 ', 6-diamid.ino-2-fenylindol. 2HC1).

Při tomto testu je zjištěno, že sloučeniny podle vyná13 lezu inhibují uvolňování IL-1beta, 11-6, TNF-alfa a PGE2 při koncentraci asi 0,001 až 10/UM. Naproti tomu hladiny DNA zůstávají v podstatě neovlivněny a uvedené sloučeniny jsou netoxické, poněvaž uvolňování LHD zůstává nezměněno.

2) Uvolňování cytokinů z lidských monocytů

a) Lidské monocyty

Jednojaderné buňky se získají z krve zdravých dobrovolníků odstředěním a kultivací na miskách s tkáňovou kulturou v přítomnosti různých koncentrací testované sloučeniny /Schnyder a kol., Agent and Actions, 30, 350-362 (1990)/. Neadherující lymfocyty se po 4 hodinách odstraní několikanásobným promytím. Potom se přidají:čerstvé kultivační prostředí, testovaná sloučenina a LPS (10/Ug/ml) jako stimulant a monocyty se inkubují po dobu dalšího dne. Sloučené kultivační prostředí se zředí 1:10 čerstvým kultivačním prostředím a přidá ke slévajícím se králičím chondrocytům. Po dalších dvou dnech se stanoví v kultivačním prostředí s chondrocyty metallo-proteinázová (MP) aktivita. Toto stanovení je popsáno níže. Při tomto testovacím postupu jsou sloučeniny podle vynálezu účinné při potlačení uvolňování monokinů při koncentraci řádově asi 0,001 až 10/uM.

b) Stanovení IL-1 chondrocytovým testem

Purifikovaný IL-1, rekombinantní lidský IL-1-beta (rhlL1) nebo kondicionované kultivační prostředí izolované ze stimulovaných lidských monocytů, myší makrofágy nebo myší buněčná řada P388D^, spůsobují charakteristické změny v sekrečním spektru chondrocytů. Zejména se indukuje latentní metalloproteináza (MP), zatímco dochází k redukci sekrece plasminogenového aktivátoru. Vlastnosti metalloproteinázy nebo stromelysinu byly detailně popsány /Chin a kol., J.Biol. Chem. 260, 12367-12376 (1985)/, stejně jako vlastnosti plasminogenového aktivátoru /Schnyder a kol., Analyt.Biochem.200, 156-162,1992/. Křivky dávka-odezva, získané za použití purifikovaného nebo rekombinantního IL-1 a neutralizace protilátkou k lidskému monocytnímu IL-1 ukázaly, že tento systém může být použit jako specifické a citlivé bio-stanovení pro IL-1. Stimulace sekrece latentní metalloproteinázy králičími artikulárními chondrocyty je relativ ně IL-1-specifická, zatímco IL-2, TNF-alfa, rekombinantní lidský interferon-alfa a -gama, phorbolmyristát-acetát, Concanavalin A, prostaglandin typu E a indomethacin se zde neuplatňují /Schny der a Payne, Brit.J.Rheumatol.24 (dod. 1 ), 1 28-1 32( 1985); Schnyder a kol., J. Immunol.138, 496-503(1987)/.

Chondrocyty se izolují a kultivují postupem popsaným Evequoz-em a kol., v Biochem.J.219, 667-677(1984)/. Stručně lze tento postup charakterizovat následovně. Chondrocyty se uvolní z plátků distální stehenní artikulární chrupavky samice albinního králíka (tělesná hmotnost asi 1,2 kg, Nový Zéland) působením proteináz. Promyté buňky se kultivují na 48-jamkové kultivační plotně v kultivačním prostředí DMEM, obohaceném 1 % antibiotik, 2 mM glutaminu a 10 % tepelně aktivovaného fetálního telecího séra. Po dosažení slévání buněk se buňky inkubují s 20/Ul vzorky testovacího kultivačního prostředí pro bio-stanovení IL-1 a doplní na objem 300/Ul Iscove-modifikovaným Dulbecco-kultivačním prostředím. Po 48 hodinách se oddělí supernatanty a tyto supernatanty se odstředí a zpracují pro biochemickou analýzu.

c) Biochemické stanovení

Metalloproteináza (MP) se stanovuje kineticky za použití 96-jamkové plotny Twinreader (Flow Laboratories AG) spojené s osobním počítačem. Pro stanovení MP se použije syntetický substrát pro vertebrální kolagenázu Ac-Pro-Leu-Gly-S-Leu-LeuGly-C^H- /Weingarten a Feder, Anal. Biochem. 1 47,437-440 ( 1 985 )/. 50/Ul latentní MP se aktivuje SO^ul trypsinu (120/ug/ml v 50 mM PIPES, pH 6,8 s obsahem 20 mM chloridu vápenatého) po dobu 30 minut při teplotě 37 °C, načež se aktivita veškeré serin-pro15 teinázy potlačí přidáním 150/Ul sójového trypsinového inhibitoru (SBTI·, 166/ug/ml ve výše uvedeném pufru). 50/Ul alikvot aktivované MP se potom smísí se lOO^ul reagenčního roztoku (2,5 mM kyselina 5,5^z-dithio-bis-2-nitrobenzoová, DTNB, 100/Ug/ml SBTI, 20 mM CaCl₂ ve výše uvedeném pufru) a směs se udržuje po dobu 10 minut při okolní teplotě za účelem zreagování všech volných SH-skupin. Reakce se potom nastartuje přidáním 100/Ul substrátového roztoku (1,25 mM v pufru obsahujícím 100/Ug/ml SBTI), načež se jedenáctkrát v intervalech jedné minuty měří změny absorbance při 414 nm.

3) Funkční antagonizující účinky vůči IL-1

Testovací postup popsaný v odstavci 2) se opakuje s výjimkou spočívající v tom, že se namísto přidání lidských monocytů k chondrocytové kultuře přidá samotný IL-1 (rekombinantní lidský IL-1beta, Sandoz) v koncentraci 1 ng/ml. Po dvou dnech se stanoví MP-aktivita v kultivačním prostředí s chondrocyty. Sloučeniny podle vynálezu jsou účinné jako funkční antagonisté IL-1 při koncentraci 1 až 30 nM.

4) Horečka indukovaná LPS

Myším samečkům Tuttlingen SD (tělesná hmotnost 150-160 g) se injikuje suspenze LPS (Sigma, No.L-5886, 100/Ug/5 ml glukózového roztoku/kg, subkutánně). Po dvou hodinách se pokusným zvířatům změří tělesná teplota za použití rektální termistorové sondy, spojené s dálkovým teploměrem ELLAB. Po 4 hodinách se podá testovaná sloučenina. Po dvou hodinách (6 hodin po podání LPS) se teplota změří znovu. Vzrůst teploty ve skupině kontrolních zvířat je vzat za 100 %, přičemž vzrůst teploty ve skupině ošetřených zvířat se vyjádří v procentech vzhledem k této 100% hodnotě. ED₅₀ je dávka testované sloučeniny, která způsobí 50% inhibici vzrůstu teploty ve skupině kontrolních pokusných zvířat. Pro sloučeniny podle vynálezu byla při tomto testu stanovena hodnota pohybující se od asi 0,1 do asi 1 mg/kg.

5) Karagenanem indukovaný edém krysí tlapky

Při tomto testu se použijí skupiny po pěti krysích samečcích OFA s tělesnou hmotností 150 až 170 g. Testovaná sloučenina se podává perorálně ve formě suspenze ve fyziologickém roztoku obsahujícím 0,5 % tragantu a to jednu hodinu před injekcí karagenanu. Karagenan je podán (0,1 ml 1% suspenze ve fyziologickém roztoku) subplantární injekcí do jedné ze zadních tlapek. Otok tlapky se měří pomocí antiflogometru podle Kempera a Amelma. Bezprostředně po injekci se odečte kontrolní údaj a otok se měří po 3 a 5 hodinách. Vypočte se průměr z naměřených hodnot otoku po 3 a 5 hodinách a od získané hodnoty se odečte uvedený kontrolní údaj. Hodnoty otoku naměřené pro ošetřená pokusná zvířata se vyjádří v procentech vzhledem k uvedené hodnotě získané pro skupinu neošetřených kontrolních pokusných zvířat. Εϋ,-θ je dávka způsobující 50% inhibici karagenanem indukovaného otoku po 3 hodinách. Při tomto testu byly pro sloučeniny podle vynálezu naměřeny hodnoty Εϋ^θ pohybující se od asi 0,1 do asi 1 mg/kg.

Sloučeniny podle vynálezu jsou proto indikovány pro léčení poruch, které souvisí s nadbytečným uvolňováním cytokinů, zejména s uvolňováním IL-1beta, například pro léčení širokého spektra zánětových stavů a chorob, jakými jsou revmatoidní artritida, osteoartritida, septické rány, lupénka, ateroskleróza, zánětová střevní onemocnění, Crohnova choroba a astma.

V rámci výše uvedeného použití se dávkování sloučenin podle vynálezu bude měnit v závislosti na způsobu podání, konkrétní nemoci nebo konkrétním stavu, které mají být léčeny. Obvykle se však uspokojivých výsledků dosáhne při dávkách od asi 0,1 do asi 20 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta, výhodně od 0,5 do 5 mg/kg. Bylo stanoveno, že sloučenina obecného vzorce i' má hodnotu ΙΟ^θ při testu THP-1 (koncentrace sloučeniny, která z 50 % inhibuje uvolňování IL-1beta) 0,06/UM. Tato sloučenina může být proto podávána v denní dávce od 8 mg do 2 g perorálně větším savcům, například lidem.

Předmětem vynálezu je proto také způsob léčení chorob s etiologií sdruženou s nadměrným uvolňováním cytokinů, zejména s uvolňováním IL-1beta, nebo zahrnující takové nadměrné uvolňování, jakými jsou revmatoidní artritida, osteoartritida, septické rány, lupénka, ateroskleróza, zánětové střevní onemocnění, Crohnova nemoc a astma, u pacienta, který takové léčení potřebuje, jehož podstata spočívá v tom, že se uvedenému pacientovi podá účinné množství

a) sloučeniny obecného vzorce I, který byl definován výše, nebo

b) sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu,

R₂ a R^ znamenají atom vodíku hydroxy-skupinu,

R4 znamená atom vodíku nebo methoxy-skupinu,

-a-b- znamená -CH₂-CH₂~ nebo -CH=CH- a c znamená C=0 nebo CH-OH (jiné než sloučeniny obecného vzorce I) nebo

c) sloučeniny obecného vzorce III, ve kterém R znamená atom vodíku nebo methylovou skupinu, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo fyziologicky hydrolyzovatelného a přijatelného esteru.

Předmětem vynálezu je také sloučenina obecného vzorce II, ve kterém

R.j znamená methylovou skupinu,

R₂ a R^ znamenají atom vodíku nebo hydroxy-skupinu,

R4 znamená atom vodíku nebo methoxy-skupinu,

-a-b- znamená -CH₂~CH₂- nebo cis-konfigurací skupiny -CH=CH- a c znamená C=0 nebo CH-OH, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo fyziologicky hydrolyzovatelného a přijatelného esteru, pro použití jako léčivo, například pro použití při léčení některé z výše uvedených chorob.

být aplikovány

Sloučeniny podle vynálezu mohou 11ibovolným z obvyklých způsobů podání, zejména nasálně, enterálně, výhodně perorálně, například ve formě tablet nebo kapslí, nebo parenterálně, například ve formě injikovatelných roztoků nebo suspenzí nebo ve formě čípků. Jednotkové dávkovači formy například obsahují asi 2 mg až 1 g sloučeniny podle vynálezu. Předmětem vynálezu je také farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce II, který byl definován výše v odstavci b), v kombinaci s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem. Takové kompozice mohou být připraveny konvenčním způsobem.

Výhodnými sloučeninami pro farmaceutické použití jsou sloučeniny obecných vzorců i', I, X, XI, XII a XIII.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, které však mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Příklad fermentace

Zárodečná kultura kmene NRRL 18919 se zaočkuje do 2 1 Erlenmeyrovy baňky obsahující 1 litr sterilního kapalného kultivačního prostředí obsahujícího 2 % sladového exktraktu a 0,4 % kvasničného extraktu v deionizované vodě. Tato Erlenmeyerova baňka se potom inkubuje v rotační třepačce při 200 otáčkách za minutu a teplotě 24 °C po dobu tří dnů a slouží jako předkultura pro 50 1 fermentací. Tato fermentace se provede v 75 1 fermentoru obsahujícím 50 1 sterilního kapalného prostředí obsahujícího 1 % sladového extraktu a 0,4 % kvasničného extrak19 tu v deionizované vodě. V průběhu fermentace se udržuje konstantní teplota 25 °C, rychlost míchání 50 otáček za minutu, aerace 50 1/min a přetlak 0,05 MPa. Tato fermentace předkultury trvá pouze jeden den, načež se předkultura použije k zaočkování finální fermentace provedene ve velkem mtítku. Tato produkční kultivace se provádí v 5000 1 fermentoru obsahujícím 3000 1 sterilního kapalného prostředí, tvořeného 20 g/1 glukózy/ 2 g/1 sójového proteinu, 2 g/1 sladového extraktu, 2 g/1 kvasničného extraktu, 2 g/1 Kí^PO^ a 2 g/1 MgSO₄ v deionizované vodě. Ještě před zaočkováním se v malém množství methanolu rozpustí Cyclosporin A (1 mg/1) a získaný roztok se přidá do fermentoru. V průběhu této produkční fermentace se udržuje konstantní teplota 25 °C, rychlost míchání 25 otáček za minutu, aerace 3000 1/minutu a přetlak 0,05 MPa. Nadbytečnému pěnění se zabrání regulovaným přídavkem odpěňovadla. Tvorba sloučeniny podle vynálezu se sleduje vysokotlakovou kapalinovou chromatografií, přičemž izolace požadovaného metabolitu se provede v okamžiku jeho nejvyššího obsahu ve fermentačním prostředí.

Příklad 2

Izolace metabolitu

Mycelium se oddělí od kultivační břečky a supernatant (2800 1) se extrahuje 2800 1 ethylacetátu. Mycelium se zavede do odpadu a ethylacetátový roztok se odpaří k suchu za vakua při teplotě 45-50 °C. Požadovaná sloučenina může být získána přímo krystalizací z extrakčního zbytku a to rozpuštěním extrakčního zbytku (asi 1 kg) v 5 1 methanolu při teplotě 60 °C, náhlým ochlazením získaného roztoku a následným udržováním roztoku při okolní teplotě po dobu 20 hodin. Získané krystaly (asi 250 g) se oddělí filtrací, opětovně rozpustí v methanolu při teplotě 75 °Č a rekrystalizují přes noc při teplotě -25 °C. Získané krystaly se podtlakově odfiltrují, promyjí chladným methanolem a vysuší za vakua. Požadovaný /3S-(3R*,5Z,8R*,9R*,11E)/

3,4,9,10-tetrahydro-8,9,16-trihydroxy-13,14-dimethoxy-3-methy11H/2/-benzoxacyklotetradecin-1,7/8H/dion se získá ve formě bílých jehliček, majících následující vlastnosti:

teplota tání: 170-172 °C, /alfa/pQ = -43,1° (c=0,49 v methanolu)

Příklad 3

Příprava sloučeniny I

Sloučenina vzorce I,/3S-(3R*,5E,8R*,9R*,11E)/3,4,9,10-tetrahydro-8,9,16-trihydroxy-13,14-dimethoxy-3-methyl/1H-2-benzoxycyklotetra-decin-1,7(8H)-dion, se připraví následujícím způsobem.

Produkt z příkladu 2 (1 g) se rozpustí ve 100 ml pyridinu a roztok se míchá pod atmosférou argonu po dobu 24 hodin při teplotě 50 °C. Získaný žlutý roztok se zahustí za vakua a zbytek se vyjme ethylacetátem a vytřepe s 1N kyselinou vinnou. Organická fáze se oddělí, promyje solankou, vysuší nad síranem sodným a odpaří. Pevný zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití mobilní fáze tvořené ethylacetátem, přičemž se získá sloučenina vzorce I.

Teplota tání: 171-173 °C, nukleární magnetickorezonanční spektrum:

(CDC1₃) 1,47(d,3H),

2,25-2,85(m,4H),

3,60(s,3H),

3,89(s,3H),

4,17(m,1H),

4,65(d,1H),

5,40(m,1H),

5,93(m,1H),

6,45(s,1H),

6,47(d,1H),

6,6 3(dd,1 Η),

7,00(dt,1Η),

11,21(s,1Η) ppm.

Příklad 4

Příprava sloučeniny vzorce X

Postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 3, se získá sloučenina vzorce X, tj. /3S-(3R*,5E,8R*, 9R%1IE)/-3,4,9,10-tetrahydro-8,9,16-trihydroxy-14-methoxy-3methyl-1H-2-benzoxacyklotetradecin-1,7(8H)-dion.

Teplota tání: 154-159 °C.

Příklad 5

Příprava sloučeniny vzorce XI

Postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 3,se připraví sloučenina vzorce XI, tj. /3S-(3R^r,5E,8R*, 9R*^-, 11E) /-3,4,9,10-tetrahydro-8,9-dihydroxy-13,14,1 6-trimethoxy-3-methyl-1H-2-benzoxacyklotetradecin-1,7(8H)-dion ve formě pěny mající následující nukleární magnetickorezonanční spektrum: (CDCip 1,4(d,3H),

2.2- 3,0(m,5H),

3,61(s,3H),

3,78(s,3H),

3,83(s,3H),

3,7-4,15(m,2H),

4,75(d,3H),

2.2- 3,0(m,1H),

6,15(d,1H),

6,31(d,1H),

6,38(s,1H),

7,85(m,1H) ppm.

Příklad 6

Příprava sloučeniny vzorce XIII

a) Pent-1-en-5-on

K suspenzi 43 g pyridiniumchlorchromátu v dichlormethanu se při okolní teplotě přidá 10 g (100 mmolu) 5-hydroxypent-1-enu ve 100 ml dichlormethanu. Po 1 hodině a 30 minutách se přidá diethylether, suspenze se Zfiltruje na silikagelu, pevný zbytek se několikrát promyje diethyletherem, který se rovněž zfiltruje přes silikagel, a etherové frakce se sloučí a pomalu odpaří, přičemž se získá 7 g surového pent-1-en-5-onu.

b) 4-Trimethylsiloxyhex-1-in

Směs 8,1 g 4-hydroxyhex-1-inu, 16 g terc.butyldimethylsilylchloridu a 7,2 g imidazolu ve 100 ml acetonitrilu se míchá přes noc při okolní teplotě, načež se přidá diethylether a suspenze se zfiltruje přes silikagel. Filtrát se odpaří a zbytek se destiluje za vakua získaného vodní vývěvou při teplotě 70 °C, přičemž se získá 17,8 g (93 %) požadovaného produktu.

c) 2-Trimethylsiloxy-7-hydroxyundeka-4-in-10-en

K roztoku 13,8 g produktu ze stupně b) ve 20 ml tetrahydro furanu se po kapkách přidá při teplotě -78 °C roztok (37 ml) butyllithia a získaná směs se míchá při teplotě -78 °C po dobu jedné hodiny a 30 minut. Potom se pomalu přidá roztok 6,0 g aldehydového produktu ze stupně a) v 10 ml tetrahydrofuranu a směs se míchá při teplotě -78 °C po dobu jedné hodiny, načež se ponechá ohřát na okolní teplotu. Přidá se voda a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická fáze se vysuší, zfiltruje a odpaří, přičemž se získá 13,1 g (72 %) požadovaného produktu v surové formě.

d) 2-Trimethylsilyloxy-7-hydroxyundeka-cis-4,10-dien

K roztoku 10,1 g produktu ze stupně c) ve 300 ml pyridinu se přidá 1 g 10% paladia na BaSO^ a tato směs se hydrogenuje při okolní teplotě. Po 24 hodinách se spotřebuje 420. ml vodíku a po dalších 24 hodinách se spotřebuje 720 ml vodíku. Hydrogenační směs se potom podtlakově zfiltruje přes prostředek Hyflo za účelem odstranění hydrogenačního katalyzátoru, načež se filtrát zahustí, rozpustí v ethylacetátu, promyje 10% roztokem kyseliny citrónové a nasyceným roztokem solanky, vysuší nad síranem sodným a zahustí. V této fází však chromatografie na tenké vrstvě ukazuje, že bylo reakcí konvertováno pouze 15 % výchozího materiálu. Produkt se proto znovu rozpustí ve 300 ml pyridinu, k získanému roztoku se přidá 1,5 g 10% paladia na síranu barnatém a směs se hydrogenuje za míchání při okolní teplotě. Nyní bylo zjištěno, že již po 6 hodinách bylo spotřebováno 700 ml vodíku. Chromatografií na tenké vrstvě bylo zjištěno, že množství získaného produktu (10,2 g)představuje 90% konverzi výchozí látky.

e) 2-Trimethylsiloxy-7-/(2-methoxy)ethoxy/methoxyundeka-cis4,10-dien g sloučeniny ze stupně d) se rozpustí v 80 ml dichlormethanu a to za míchání a při okolní teplotě, načež se k získanému roztoku v průběhu jedné minuty po kapkách přidá

8,5 ml diisopropylethylaminu a potom ještě v průběhu 10 minut a rovněž po kapkách 5,7 ml 1-chlormethyl-2-methylglykolu ve 20 ml dichlormethanu. Po dvou hodinách je průběh reakce úplný, což bylo stanoveno chromatografií na tenké vrstvě. Reakčni směs se potom promyje 10% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a nasycenou solankou, načež se vysuší nad síranem sodným a zahustí, přičemž se získá 14 g požadovaného produktu v surové formě. Produkt se přečistí chromatograficky na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a diethyletheru v objemovém pomě24 ru 8:1, přičemž se požadovaný produkt získá ve výtěžku 10,5 g (83 %).

f) Sloučenina obecného vzorce IV, ve kterém znamená atom vodíku, Rg a Rg znamenají skupinu MeO, -a-b- znamená ciskonfiguraci skupiny -CH=CH-, -d-e- znamená a

-f-g- znamená trans -CH=CH90 ml triethylaminu se míchá pod atmosférou argonu, načež se přidá 7,5 g sloučeniny obecného vzorce V, ve kterém R^ znamená atom vodíku, Rg a Rg znamenají skupinu MeO a R^ znamená methylovou skupinu, a potom 10,8 g sloučeniny získané ve výše uvedeném stupni e), 0,104 g octanu paladnatého, 0,564 g tri-otolylfosfinu a 3,9 g octanu stříbrného. Tato směs se za míchání zahřeje na olejové lázni na teplotu 80 °C a po 60 hodinách zahřívání na tuto teplotu se přidá další 0,104 g podíl octanu paladnatého a 0,564 g tri-o-tolylfosfinu a v reakci se pokračuje ještě po dobu 48 hodin, kdy je podle analýzy provedené chromatografií na tenké vrstvě reakce ukončena. Reakční směs se zahustí, zpracuje ethylacetátem a zbaví nerozpuštěného podílu podtlakovou filtrací přes filtrační prostředek Hyflo. Filtrát se zahustí a meziprodukt tvořený trimethylsiloxy-sloučeninou (R^ ^zndmend methylovou skupinu) se přečistí chromatograficky na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 4:1, přičemž se získá asi 14 g přečištěného produktu.

5,1 g hydroxidu sodného se rozpustí v 50 ml dimethylsulfoxidu a 30 ml vody, k získanému roztoku se přidá 7,44 g výše uvedeného meziproduktu a získaná směs se zahřívá na teplotu 100 °C po dobu 4 hodin za míchání na olejové lázni. Směs se potom ochladí, zředí vodou, 3 krát promyje etherem, ochladí na ledu a pH směsi se nastaví na hodnotu 3 2N kyselinou chlorovodíkovou. Produkt se potom třikrát extrahuje ethylacetátem, dva krát promyje nasycenou solankou, vysuší nad síranem sodným, zahustí a vysuší za vysokého vakua, přičemž se získá 6 g požadovaného produktu.

Hmotové spektrum: m/z: 453 (MH+), 348(60), 329(100), 285(60), 207(60).

g) Sloučenina vzorce XIII

5,4 g produktu ze stupně f) se přidá k 3,5 1 tetrahydrofuranu při okolní teplotě a za míchání, načež se přidá ještě

18,7 ml diethylazodikarboxylátu a 31,3 g trifenylfosfinu a směs se zahřívá na teplotu 50 °C na olejové lázni a ponechá se přes noc reagovat. Reakční směs se zahustí a zbytek se přečistí za použití dvou sloupců aluminy a eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 2:1. Z frakcí 1-6 z prvního sloupce a frakcí 7-20 z druhého sloupce se dohromady získá 5 g surového produktu, který se dále chromatografický čistí na silikagelu, přičemž se získá 3,2 g (62 %) čistého pryskyřičného meziproduktu, což je produkt obecného vzorce XIII, ve kterém c je v CH-OCH^-O-CH^-CH^-OCH,-chráněné formě.

Tento meziprodukt se převede na další meziprodukt, ve kterém c znamená CHOH, působením kyselinou. 5,2 g výše uvedeného meziproduktu se rozpustí ve 12' ml tetrahydrofuranu, k roztoku se přidá 10 ml 1N kyseliny chlorovodíkové a směs se míchá při teplotě 45 °C po dobu 24 hodin, načež se třikrát extrahuje ethylacetátem a promyje nasycenou solankou a roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Ethylacetátové fáze se vysuší nad síranem sodným a přečistí chromatografický na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu, přičemž se získá asi 3,4 g lepkavého dalšího meziproduktu.

ml dichlormethanu se míchají při okolní teplotě, přidá se 76/Ul oxalylchloridu, směs se ochladí na teplotu -60 °C, načež se k ochlazené směsi přidá roztok 0,13 ml dimethylsulfoxidu v 1 ml dichlormethanu. Tento přídavek se provádí po kapkách a v průběhu 3 minut. Ze směsi se ponechá po dobu 3 minut vyvíjet plyn, načež se ke směsi v průběhu 5 minut po kapkách přidá roztok 280 mg výše uvedeného dalšího meziproduktu ve 3 ml di26 chlormethanu, přičemž se tvoří sraženina. Reakční směs se míchá ještě po dobu dalších 15 minut, načež se přidá 0,56 ml triethylaminu v průběhu 5 minut za vysrážení pastovitého produktu, který se ponechá zcela vyloučit při okolní teplotě. Tento pastovitý produkt se potom extrahuje dichlormethanem, organické fáze se dvakrát promyjí 10% kyselinou citrónovou a dvakrát nasycenou solankou, načež se vysuší nad síranem sodným, zahustí a přečistí chromatograficky na silikagelu za použití elučního činidla tvořeného dichlormethanem, přičemž se získá produkt vzorce XIII v čisté formě. Tento čistý produkt má následující charakteristiky: teplota tání: 159 °C, hmotové spektrum: m/z 344(M+), 217(80), 189(60), 178(100),95(60)

Příklad 7

Příprava sloučeniny vzorce XII

a) Analog sloučeniny vzorce XII, ve kterém c znamená CH-OCH^-Och₂-ch₂-och₃

Ke 20 ml diethyletheru se přidá 2,9 g jodu a 0,55 g hořčíku a směs se míchá až do ukončení exotermní reakce a vymizení hnědého zbarvení. 11 g získaného roztoku se pomocí inkekční stříkačky po kapkách během 10 minut přidá k roztoku 1,64 g prvního meziproduktu ze stupně g) příkladu 6 v benzenu. Vyloučí se žlutá sraženina a směs se na olejové lázni a za míchání zahřeje na teplotu 80 °C, načež se při této teplotě míchá po dobu jedné hodiny a třiceti minut a potom ještě přes noc při okolní teplotě. Produkt se potom dvakrát extrahuje ethylacetátem, promyje hydrogenuhličitanem sodným a nasycenou solankou, vysuší nad síranem sodným, zahustí a chromatograficky přečistí na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 7:3, přičemž se získá 1,6 g požadovaného produktu v čisté formě.

b) Analog sloučeniny vzorce XII, ve kterém c znamená CHOH

510 mg produktu ze stupně a) tohoto příkladu se rozpustí ve 12 ml tetrahydrofuranu, načež se k získanému roztoku přidá 10 ml 1N kyseliny chlorovodíkové a směs se míchá při teplotě 45 °C po dobu 24 hodin. Reakční směs se třikrát extrahuje ethylacetátem a promyje nasycenou solankou a vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Ethylacetátové fáze se vysuší nad síranem sodným, zahustí a přečistí chromatograficky na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:1, přičemž se získá 330 mg lepkavého požadovaného produktu.

Hmotové spektrum: m/z 332(M+), 314(10), 203(75), 190(55),164(60)

c) Sloučenina vzorce XII

280 mg produktu ze stupně b) se rozpustí v 10 ml dichlormethanu a to za míchání a při okolní teplotě, načež se k získanému roztoku přidá 475 mg pyridiniumdichromátu a směs se míchá přes noc při okolní teplotě. Potom se přidá dalších 158 mg pyridiniumdichromátu a směs se opětovně míchá přes noc a po dalších 24 hodin při okolní teplotě. Získaný roztok se oddělí od pevných vedlejších produktů filtrací přes filtrační prostředek Hyflo a přečistí chromatograficky za použití elučního činidla tvořeného dichlormethanem, přičemž se získá požadovaný produkt v čisté formě.

Teplota tání: 137 °C, hmotové spektrum: m/z 330(M+), 312(20), 202(100), 175(75).

Příklad 8

Sloučenina vzorce I, ve kterém R^ znamená atom vodíku, R^ a Rg znamenají skupinu OMe, -a-b- znamená cis-CH=CH~, c znamená C=0 a -d-e- a -f-g- znamenají -CH2-CH2“

a) 4-Dimethyl-terc.butylsilyloxypent-1-in

17,8 g (+)-4-pentin-2-olu se rozpustí ve 150 ml acetonitrilu a to za míchání a při okolní teplotě, načež se k získanému roztoku přidá 15,8 g imidazolu a potom ještě 35 g dimethylterc.butylsilylchloridu, přičemž dojde k exoterní reakci a všech ny reakční složky přejdou nejdříve do roztoku, avšak bezprostředně potom se vyloučí sraženina. Reakční směs se míchá přes noc při okolní teplotě, načež se podtlakově zfiltruje a kapalná frakce se zahustí. Přidá se další 2,9 g podíl imidazolu a 6,3 g dimethyl-terc.butylsilylchloridu. Po třech hodinách se reakční směs znovu podtlakově zfiltruje a kapalná frakce se zahustí a frakčně destiluje. Požadovaný produkt je v prvních třech frakcích, které se sloučí. Produkt se přečistí destilací za sníženého tlaku (1,6 kPa) při teplotě 64-68 °C.

b) Produkt vzorce VII, ve kterém R^ znamená atom vodíku, Rg a Rg znamenají OMe a R^ znamená methylovou skupinu

14,6 g odpovídající sloučeniny vzorce V, 14,6 g produktu ze stupně a) tohoto příkladu, 0,3 g octanu paladnatého,

1,1 g tri-o-tolylfosfinu a 7,6 g octanu stříbrného se přidá k 60 ml tetrahydrofuranu a směs se na olejové lázní zahřívá za míchání na teplotu 70 °C. Po 48 hodinách, kdy je reakce podle chromatografie na tenké vrstvě ukončena asi ze 70 %, se přidá další 0,3 g podíl octanu paladnatého a 1,1 g tri-o-tolylfosfinu a směs se zahřívá přes víkend na teplotu 70 °C. Reakční směs se potom podtlakově zfiltruje přes filtrační prostředek Hyflo, zahustí za hlubokého vakua a přečistí chromatograficky na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 4:1, přičemž se získá první meziprodukt, tj. analog odpovídající sloučeniny vzorce VII, ve kterém Rg znamená skupinu OMe, Rg znamená skupinu OMe, R^ znamená atom vodíku, R^ znamená methylovou skupinu a aldehydovou skupinou bočního řetězce s šesti uhlíkovými atomy je skupina OH chráněná dimethyl-terc.butylsilylovou skupinou.

6,7 g tohoto prvního meziproduktu se rozpustí ve 100 ml methanolu a k získanému roztoku se přidá 500 mg 10% paladia na uhlí ve funkci hydrogenačniho katalyzátoru, načež se tato směs hydrogenuje za míchání po dobu 48 hodin (po prvních 24 hodinách se spotřebuje 350 ml vodíku). Hydrogenační směs se potom podtlakově zfiltruje přes filtrační prostředek Hyflo a zahustí. V tomto stádium bylo nukleární magnetickorezonanční spektroskopií stanoveno, že dvojná vazba bočního řetězce obsahujícího 6 uhlíkových atomů je zredukována pouze ze 30 %. Reakčni produkt se proto opětovně vyjme 150 ml methanolu, přidá se 500 mg 10% paladiového katalyzátoru na uhlí a směs se hydrogenuje přes víkend při okolní teplotě. Získaná hydrogenační směs se podtlakově zfiltruje přes filtrační prostředek Hyflo a zahustí, načež se druhý meziprodukt, tj. analog odpovídající sloučeniny vzorce VII, ve kterém je aldehydová skupina bočního řetězce obsahujícího 6 uhlíkových atomů nahražena hydroxy-skupinou, oddělí od odpovídající siloxychráněné sloučeniny chromatograficky na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 2:1, přičemž se získá ve výtěžku 4,9 g.

K 30 ml míchaného dichlormethanu při okolní teplotě se přidá 1,2 ml oxalylchloridu, směs se ochladí na teplotu -60 °C, načež se k ní po kapkách a v průběhu 5 minut přidá 1,9 ml dimethylsulf oxidu v 7 ml dichlormethanu. Získaná směs se míchá po dobu dalších 3 minut, načež se k ní po kapkách a v průběhu 10 minut přidá roztok 3,5 g druhého meziproduktu z tohoto příkladu ve 20 ml dichlormethanu. Vyloučí se sraženina a směs se míchá po dobu dalších 20 minut, načež se zahustí a k takto zahuštěné směsi se v průběhu 5 minut přidá 8,2 ml triethylaminu. Vyloučí se hutná pastovitá sraženina, která se ponechá zcela vyloučit v průběhu 1,5 hodiny při okolní teplotě. Pevný produkt se extrahuje dichlormethanem, dvakrát promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, jednou nasycenou solankou a jednou roztokem hydrogenuhličitanu sodného, přičemž se získá 3,6 g požadovaného produktu ve formě gumy.

c) Produkt vzorce IV, ve kterém R^ znamená atom vodíku, R_g a Rg znamenají skupinu OMe, -a-b- znamená cis-CH=CH-, -d-e- a -f-gznamenají -CH₂-CH₂~ a R₁₁ znamená atom vodíku

0,39 g produktu ze stupně a) tohoto příkladu se pod atmosférou dusíku přidá k 5 ml tetrahydrofuranu, načež se ke směsi přidá po kapkách v průběhu 2 minut a při teplotě -70 °C 1,2 ml butyllithia. Po jedné hodině se po kapkách a v průběhu 5 minut přidá roztok 0,5 g finálního produktu ze stupně b) tohoto příkladu ve 4 ml tetrahydrofuranu a získaná směs se míchá při teplotě -70 °C po dobu 1,5 hodiny, načež se ponechá ohřát na okolní teplotu. Chromatografií na tenké vrstvě bylo zjištěno, že v tomto stádiu je již reakce ukončena. Za chlazení ledem se produkt promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, třikrát extrahuje ethylacetátem, promyje nasycenou solankou a roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysuší nad síranem sodným a zahustí, přičemž se získá 0,87 g pryskyřičného prvního meziproduktu, tvořeného analogem odpovídající sloučeniny vzorce IV, ve kterém je skupina COOH ve formě methoxy-esterové skupiny, vazba odpovídající vazbě -a-b- sloučeniny vzorce I je acetylenovou vazbou a hydroxy-skupina na uhlíkovém atomu Ο^θ bočního řetězce je chráněna terc.butylsilylovou skupinou.

3,1 g tohoto prvního meziproduktu se rozpustí v-50 ml pyridinu, k získanému roztoku se přidá 200 mg 10% paladia na síranu barnatém a směs se hydrogenuje při okolní teplotě za použi tí magnetického míchadla. Po 4 hodinách je spotřebováno více než teoreticky potřebné množství vodíku (240 ml). Odebere se vzorek získaného produktu, který se zahustí, vyjme dichlormethanem a promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, přičemž se v tomto stádiu zjistí nukleární magnetickorezonanční spektroskopií, že reakce je ukončena. Produkt se oddělí od hydrogenačního katalyzátoru podtlakovou filtrací přes filtrační prostředek Hyflo, zahustí, vyjme ethylacetátem, promyje nasycenou solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí, přičemž se získá 3,05 g pryskyřičného druhého meziproduktu, tvořeného analogem prvního meziproduktu z tohoto stupně, ve kterém vazba odpovídající vaz31 bě -a-b-sloučeniny vzorce I je cis-CH=CH-.

Postupem, který je analogický s postupem popsaným ve stupni f) příkladu 6, se druhý meziprodukt z tohoto stupně převede na požadovaný produkt.

Hmotové spektrum: m/z 367(MH+), 349(40), 331(100), 305(90), 191(100).

d) Sloučenina vzorce I, ve které R₄ znamená atom vodíku, Rg a Rg znamenají skupinu OMe, -a-b- znamená -CH=CH-, c znamená C=O a -d-e- a -f-g- znamenají -CH₂~CH₂1,7 g finálního produktu z výše uvedeného stupně c) se rozpustí za míchání v 1,8 1 acetonitrilu a k získanému roztoku se přidá 5,9 g 2-chlorpyridinjodidu a 6,5 ml triethylaminu, načež se směs zahřívá přes víkend na olejové lázni za míchání na teplotu 50 °C. Produkt se potom zahustí, vyjme ethylacetátem, promyje 10% roztokem kyseliny citrónové, roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasycenou solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí, přičemž se získá 1,6 g surového meziproduktu (tj. analogu nadepsaného produktu, ve' kterém c znamená skupinu CHOH) ve formě hnědé pryskyřice. Tento surový produkt se chromatograficky přečistí na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 3:2, přičemž se k rozpuštění meziproduktu použije dichlormethan.

Ke 2 ml dichlormethanu se při okolní teplotě přidá 5yUl oxalylchloridu, získaná směs se ochladí na teplotu -70 °C a k takto ochlazené směsi se po kapkách, za míchání a v průběhu 3 minut přidá 93/Ul dimethylsulfoxidu v 1 ml dichlormethanu.

Směs se potom míchá po dobu dalších 5 minut, načež se k ní přidá po kapkách a v průběhu 5 minut roztok 0,2 g meziproduktu z tohoto stupně. Vyloučí se sraženina a směs se míchá po dobu dalších 15 minut, načež se k ní po kapkách a v průběhu 5 minut přidá 0,4 ml triethylaminu a směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 70 °C, načež se ponechá ohřát v průběhu jedné ho32 diny na okolní teplotu. Získaná reakčni směs se zředí dichlormethanem, dvakrát promyje 10% roztokem kyseliny citrónové a jednou promyje nasycenou solankou, vysuší nad síranem sodným, zahustí a přečistí chromatograficky na silikagelu a po rekrystalizaci se získá asi 100 mg čistého produktu.

Teplota tání: 110 °C.

Příklad 9

Sloučenina vzorce I, ve kterém a Rg znamenají atom vodíku,

Rg znamená skupinu OMe, -a-b- znamená trans-CH=CH-, c znamená C=O a -d-e- a -f-g- znamenají mg hořčíku se míchá s 1 ml diethyletheru, načež se k míchané směsi přidá 1 ml benzenu a 0,18 jodu a temně hnědé zbarvení po 1,5 hodiny vymizí. Kapalná fáze získané směsi se přidá k roztoku 50 mg finálního produktu z příkladu 6 ve 2 ml benzenu, přičemž se vyloučí sraženina. Směs se míchá po dobu 2,5 hodiny při teplotě 60 °C, produkt se vyjme ethylacetátem, promyje 1N vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasycenou solankou, vysuší nad síranem sodným, zahustí a přečistí chromatograficky na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí toluenu a methanolu v objemovém poměru 98:2. Produkt se dále přečistí na sloupci silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí hexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 3:2, přičemž se získá asi 30 mg čisté požadované látky ve formě oleje.

Hmotové spektrum: m/z 333(MH+), 315(80), 265(100), 177(90).

Příklad 10

Sloučenina vzorce I, ve kterém R₄ znamená atom vodíku, Rg a Rg znamenají skupinu OMe, -a-b- znamená -CH=CH-, c znamená C=O a -d-e- a -f-g- znamenají -CH2~CH2~

Postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 3 a 9, se požadovaný produkt připraví z odpovídajícího produktu, ve kterém -a-b- znamená cis-CH=CH-, tj. z finálního produktu z příkladu 8, isomeraci vazby -a-b-. Požadovaný produkt se získá ve formě oleje.

Hmotové spektrum: m/z 346(M+), 205(50), 191(100), 178(40), 152(40), 95(55).

Claims (18)

1. NÁROKY

   1. Sloučenina obecného vzorce I r₄ ve kterém

   R^ a Rg jsou stejné nebo odlišné' a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo skupinu alkyl-COO-, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy,

   Rg znamená hydroxy-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo skupinu alkyl-COO-, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, jedna ze skupin -a-b- nebo -d-e- znamená -CHR^-CHRg- a druhá z těchto skupin znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CR_?=CR₈-, přičemž R? a Rg jsou stejné nebo odlišné a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, alkoxy-skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo skupinu alkyl-COO-, ve které alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové' atomy, c znamená CH-OH nebo C=0 a

   -f-g- znamená -CH₂-CH₂- nebo cis- nebo trans-konfiguraci sku35 piny -CH=CH-, s výhradou spočívající v tom, že když znamená atom vodíku,

   Rg znamená hydroxy-skupinu a -f-g- znamená trans-konfigurací skupiny-CH=CH-, potom 1 ) Rg neznamená hydroxy-skupinu, když -a-b- znamená -CH₂~CH₂-, c znamená C=0 a -d-e- znamená -CH₂-CH₂~, nebo 2) Rg neznamená methoxy-skupinu, když -a-b- znamená -CH₂-CH₂“ nebo cis-konfigurací skupiny -CH=CH- a c znamená C=0 nebo CH-OH a -d-e- znamená -CHOH-CHOH-, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo ve formě fyziologicky hydrolyzovatelného a fyziologicky přijatelného esteru, přičemž asymetrický uhlíkový atom označený hvězdičkou a atomy a nebo/a b nebo d. nebo/a e v případě, že jsou asymetrickými uhlíkovými atomy, mají konfiguraci R nebo S nebo sloučenina zahrnuje libovolnou směs jejích optických isomerů.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, ve které

   R^ a Rg jsou stejné nebo odlišné a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, methoxy-skupinu nebo methyl-COO-skupinu,

   Rg znamená hydroxy-skupinu, methoxy-skupinu nebo methylCOO-skupinu,

   -a-b- znamená cis- nebo trans-konfigurací skupiny -CR^^,=CRg-, ve které R₇' a R_g' jsou stejné nebo odlišné a znamenají atom vodíku, hydroxy-skupinu, methoxy-skupinu nebo methyl-COO-skupinu a

   -d-e- znamená skupinu -CHR^ '-CHRgve které R-?' a Ηθ mají výše uvedený význam.
3. 3. Sloučenina podle nároku 2, ve které

   R₄ znamená atom vodíku nebo methoxy-skupinu,

   Rg znamená methoxy-skupinu,

   R_r znamená hydroxy-skupinu nebo methoxy-skupinu, ·

   O

   -a-b- znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-,

   -d-e- znamená -CH₂~CH₂- nebo -CHOH-CHOH- a

   -f-g- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-.
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, ve které

   R₄ znamená atom vodíku nebo methoxy-skupinu,

   Rg znamená methoxy-skupinu,

   Rg znamená hydroxy-skupinu,

   -a-b- znamená cis- nebo trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, c znamená skupinu CHOH nebo C=0,

   -d-e- znamená -CHOH-CHOH- a

   -f-g- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, s výhradou spočívající v tom, že když -a-b- znamená cis-konfiguraci skupiny -CH=CH-, potom R^ znamená methoxy-skupinu a c znamená C=0, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo ve formě fyziologicky hydrolyzovatelného a fyziologicky přijatelného esteru.
5. 5. Sloučenina podle některého z předcházejících nároků, ve které -a-b- znamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-.
6. 6. Sloučenina podle některého z předcházejících nároků, ve které všechny asymetrické uhlíkové atomy mají konfiguraci

   S.
7. 7. Sloučenina výše definovaného obecného vzorce ΐ',Ι, X,

   XI, XII nebo XIII.
8. 8. Způsob přípravy sloučeniny vzorce l', vyznačený t í m , že se kultivuje fungální kmen produkující metabolit 87-250904-F1, načež se vytvořený metabolit 87-250904-F1 izoluje.
9. 9. Způsob podle nároku 8,vyznačený tím, že fungálním kmenem produkujícím metabolit 87-250904-F1 je kmen

   NRRL 18919.
10. 10. Čistá kultura fungálního kmene NRRL 18919.
11. 11. Fermentační směs, která se získá kultivací fungálního kmene NRRL 18919.
12. 12. Způsob přípravy sloučeniny vzorce I, ve které -a-bznamená trans-konfiguraci skupiny -CH=CH-, vyznačený tím, že se za mírných alkalických podmínek isomeruje odpovídající cis-isomer.
13. 13. Způsob přípravy sloučeniny vzorce I, ve kterém c znamená CHOH, vyznačený tím, že se cyklizuje sloučenina vzorce IV

    R.

    (IV) ve kterém R₄, R^, R_g, -a-b-, -d-e- a -f-g- mají významy uvedené v nároku 1 s výjimkou spočívající v tom, že libovolné OH-substituenty na -a-b- nebo -d-e- jsou ve vhodně chráněné formě a znamená atom vodíku nebo ochrannou skupiny hydroxy-funkce, načež se odstraní libovolné ochranné skupiny hydroxy- funkce .
14. 14. Způsob přípravy sloučeniny vzorce I, ve kterém c znamená C=O, vyznačený tím, že se oxiduje skupina CHOH obecného symbolu c sloučeniny vzorce I, ve kterém c znamená skupinu CHOH.
15. 15. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 jako léčivo prc léčení poruch majících etiologii související s nadměrným uvolňováním cytokinú, zejména s uvolňováním IL-lbeta, nebo zahrnující takové nadměrné uvolňování, jakými jsou revmatoidní artritida, osteoartritida, septické rány, lupénka, ateroskleróza, zánětové střevní onemocnění, Crohnova nemoc a astma.
16. 16. Sloučenina obecného vzorce II (ΐΠ nad

    S V i A a vy o

    7 6 Λ .? 0

    I ve kterém ’

    3 t _x d

    R, znamená methylovou skupinu, I ¹ , , . r H * ř ?! ''

    R₂ a Rg znamenají atom· vodíku nebo hydroxy-skupinu, ;

    R₄ znamená atom vodíku nebo methoxy-skupinu, Ž <

    -a-b- znamená -CHg-CHg- nebo cis-konfiguraci skupiny -CH=CHa c znamená OO nebo CH-OH, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo ve formě fyziologicky hydrolyzovatelného a fyziologicky přijatelného esteru, oro použití jako léčivo.
17. 17. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku i.
18. 18. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje sloučeninu obecného vzorce II, uvedeného v nároku 16, ve kterém

    R.) znamená methylovou skupinu,

    R₂ a R^ znamenají atom vodíku nebo hydroxy-skupinu,

    R^ znamená atom vodíku nebo methoxy-skupinu,

    -a-b- znamená -CH₂~CH₂- nebo cis-konfiguraci skupiny -CH=CHc znamená C=0 nebo CH-OH, ve volné formě nebo ve formě soli s bází nebo ve formě fyziolo gicky hydrolýzovatelného nebo fyziologicky přijatelného esteru