CZ259096A3

CZ259096A3 - Polynucleotide, method of provoking immune response and vaccine

Info

Publication number: CZ259096A3
Application number: CZ962590A
Authority: CZ
Inventors: Margaret A Liu; John W Shiver; Helen C Perry
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-03
Publication date: 1997-05-14
Also published as: AU696148B2; AU1938595A; SK113496A3; KR970701782A; IL112820A0; CA2184345C; JPH09510097A; NZ282313A; HU9602435D0; WO1995024485A2; NO963738L; NO963738D0; AU734690B2; CA2184345A1; AU9519398A; EP0749484A1; HUT75549A; CN1147834A; FI963513A0; JP3967374B2

Description

Oblast techniky

Vynález se týká polynukleotidů, způsobu vyvolání imunitní odpovědi a vakcíny proti virům, zejména proti virům s vysokou frekvencí mutací.

Dosavadní stav techniky

Jedním z hlavních problémů při výrobě vakcín proti virům, zvláště proti virům s vysokou frekvencí mutací, jako je HIV a proti nimž je žádoucí dosáhnout vyvolání ochranné odpovědi imunitního systému je různost obalových bílkovin virů u různých kmenů nebo izolátů takových virů. Vzhledem k tomu, že cytotoxické T-lymfocyty, CTL u myší i u člověka jsou schopné rozeznávat epitopy odvozené od konzervovaných vnitřních bílkovin virů a mohou tedy být důležité pro vyvolání imunitní odpovědi proti viru, byly vyvíjeny snahy získat CTL-vakcíny, které vyvolávají heterologní ochranu proti různým kmenům virů.

CD8⁺CTL zabíjí buňky, infikované virem v případě, že jejich buněčné receptory T rozeznají virové peptidy, spojené s molekulami MHC skupina I. Tyto peptidy jsou odvozeny od endogenně syňtetizovaných virových bílkovin. To znamená, že rozeznáním epitopů z konzervovaných virových bílkovin je možno dosáhnout zkřížené ochrany pomocí CTL. Peptidy, schopné spojení s MHC skupiny 1 pro rozpoznání CTL pocházejí z bílkovin, které jsou přítomné nebo procházejí cytoplasmou nebo endoplasmatickým retikulem. Ěxogenní bílkoviny, které vstupují do zpracování v endosomech (jako je tomu v případě antigenů v molekulách MHC skupiny li) obvykle nejsou účinné při vyvolání CD8⁺CTL-odpovědi.

Při snaze vyvolat CTL-odpověď, byly užity vektory pro replikaci k získání bílkovinného antigenu v buňkách nebo byly do cytosolu zaváděny peptidy. Tyto přístupy mají své omezení, které může vést až k omezení využití těchto látek jako vakcín. Vektory pro retroviry jsou omezeny, pokud jde o velikost a strukturu polypeptidů, u nichž může dojít k expresi ve formě složených bílkovin při zachování replikace rekombinantního viru. Mimoto může být účinnost vektorů, například vaccinia pro následující imunizaci nepříznivá vzhledem k tomu, že vzniká imunitní odpověď proti samotnému vektoru. Je zřejmé, že použití virových vektorů a modifikovaných pathogenů v sobě nese riziko, které může zabránit použití těchto látek u člověka, jak již bylo uvedeno v publikacích R. R. Redfield a další, New Engl. J. Med., 316, 673, 1987 a L. Mascola a další, Arch. Intern, Med., 149, 1569, 1989. Mimoto je výběr peptidových epitopů závislý na struktuře antigenu MHC u různých jednotlivců a peptidové vakcíny tedy mohou mít omezenou účinnost vzhledem k různosti haplotypů MHC u běžné populace.

V publikaci Benvenisty N., a Reshef L., PNAS 83, 9551 až 9555, 1986 se prokazuje, že v případě DNA, vysrážené chlo ridem vápenatým může dojít k expresi po zavedení do myší intraperitonálně (i.p.), nitrožilně (i.v.) nebo nitrosvalově (i.m.). Po nitrosvalové injekci vektorů pro expresi DNA u myši dochází k příjmu DNA svalovými buňkami a k expresi bílkoviny, pro niž je kódem DNA, uložená do vektoru, jak bylo popsáno v publikaci J. A. Wolff a další, Science 247, 1465, 1990, G. Ascadi a další, Nátuře 352, 815, 1991. Plasmidy byly udržovány episomálně a nedocházelo k jejich replikaci. K trvalé expresi docházelo také po nitrosvalové injekci do kosterních svalů krys, ryb a primátů a do srdečního svalu krys. Technika použití nukleových kyselin k léčebným účelům byla popsána v přihlášce WO 90/11092 (4. října

1990), v níž se popisuje použití čistých polynukleotidů pro očkování obratlovců.

Pro úspěch tohoto postupu není nezbytné, aby imunizace byla prováděna nitrosvalově. V publikaci Tang a další, Nátuře, 356, 152 - 154, 1992 se uvádí, že při uložení zlatých mikroprojektilů, opatřených povlakem kódové DNA pro růstový hormon skotu BGH do pokožky myší došlo k produkci protilátek proti BGH u těchto myší. Dále v publikaci Furth a další, Anal. Biochem., 205, 365 - 368, 1992 prokazují, že je možno použít injekčního zařízení pro transfekci kůže, svalů, tuků a dalších tkání savců u živých živočichů. Postupy pro zavádění nukleových kyselin byly v poslední době shrnuty v publikaci Friedman T., Science, 244, 1275 - 1281, 1989. V publikaci Robinson a další, Abatracts of Papers Presented at the 1992 meeting on Modern Approaches to New Vaccines, Including Prevention of AIDS, Cold Spring Harbor, str. 92, se popisuje, že při i.m., i.p. a i.v. podání DNA chřipky ptáků kuřatům dojde k ochraně proti smrtelné infekci. V publikaci se však neuvádí, které geny chřipkového viru ptáků byly použity. Mimoto bylo možno prokázat pouze H7' specifickou imunitní odpověď. Možnosti vyvolání zkřížené ochrany proti jiným kmenům se publikace netýká. Nitrožilní injekce komplexu DNA a kationtových liposomů a její účinky se popisují v publikaci Zhu a další, Science, 261, 209 až 211, 9. července 1993 a také ve WO 93/24640, 9. prosince 1993 a uvádí se, že dochází k systemické expresi klonovaného trangenického komplexu. V poslední době se v publikaci Ulmer a další, Science, 259, 1745 - 1749, 1993 popisuje heterologní ochrana proti infekci chřipkovým virem, které bylo dosaženo vstřiknutím kódové DNA pro bílkoviny chřipkového viru.

Vynález se snaží řešit potřebu získání specifických léčebných a profylaktických látek, schopných vyvolat požadovanou imunitní odpověď proti různým antigenům pathogenních organismů a proti nádorovým antigenům. Zvláštní důležitost 'při tomto přístupu má schopnost vyvolat imunitní odpověď T-buněk, která může zabránit infekci nebo onemocnění kmenem virů, které jsou heterologní vzhledem ke kmeni, z nějž byl získán gen pro antigen. To je významné zvláště v případě HVI vzhledem k tomu, že u tohoto viru rychle dochází k mutacím a bylo již identifikováno velké množství virulentních izolátů, například v publikaci LaRosa a další, Science, 249, 032 - 935, 1990 se popisuje 245 různých izolátů viru HIV.

Vzhledem k uvedené proměnlivosti antigenů byly vyvíjeny snahy vyvolat tvorbu CTL imunizací pomocí peptidů. V publikaci Takahaschi a další, Science, 255, 333 - 336, 1992 se popisuje vyvolání tvorby široce zkříženě reaktivních cytotoxických T-buněk, které rozpoznávají HIV determinantu obalu, gpl60. Popisuje se rovněž obtížnost dosažení skutečně zkřížené CTL-odpovědi a uvádí se,že pravděpodobně existuje dichotomie mezi reaktivní CTL-odpovědi a mezi restimulací T-buněk, která musí probíhat za velmi omezených podmínek . a také pokud jde o vyvolání efektorové funkce z již stimulovaných CTL včetně cytotoxicity.

Publikace’Wang a další, P.N.A.S. USA, 90, 4156 - 4160, květe, 1993 uvádí vyvolání imunitní odpovědi u myší proti HIV nitrožilním naočkováním klonovaného nesestřiženého genu genomu HIV. Úroveň dosažené imunitní odpovědi byla nízká, v systému bylo využito částí promotoru z dlouhého koncového opakování LTR viru nádorů myší mléčné žlázy MMTV a části promotoru a terminátoru opičího viru 40, SV40. Je známo, že pomocí SV40 je možno transformovat buňky, pravděpodobně integrací do DNA hostitelských buněk. Z tohoto důvodu je systém podle publikace Wanga a dalších, pravděpodobně nevhodný pro použití u člověka. Mimoto konstrukce DNA podle uvedené publikace obsahuje v podstatě část genomu HIV ve formě kódového řetězce Tat/REV-gpl60-Tat/REV, jak je znázorněno na obr. 1. Jak bude dále podrobněji vysvětleno, jde o suboptimální systém pro získání vysoké úrovně exprese gp!60. Jedna z nevýhod spočívá v tom, že bylo prokázáno, že exprese Tat hraje určitou úlohu při prograsi Kaposiho sarkomu podle Y. N. Vaishav a F. W. Wong-Staal, An. Rev. Biochem., 1991.

V mezinárodní patentové přihlášce č. W093/17706 se popisuje způsob vakcinace proti viru, při němž se částice nosiče opatří povlakem konstrukce viru a tyto částice se pak vpraví do živočišných buněk. V případě HIV bylo navrhováno použití v podstatě celého genomu bez dlouhé koncové opakující se části. Tento postup může znamenat pro příjemce značné riziko. Konstrukce HIV by obecně měly obsahovat méně než 50 % genomu HIV, aby byla zajištěna bezpečnost vak cíny. Je tedy zřejmé, že přetrvává řada problémů a stále ' ještě není možno přenosem genu nebo jeho části získat použitelnou vakcínu proti HIV u člověka.

Vynález využívá známých postupů pro zavedení polynukleotidů do živých tkání k vyvolání exprese bílkovin. Vynález získává imunogen pro zavedení HIV a jiných bílkovin do postupu, při němž dochází ke zpracování antigenu za vzniku CTL a protilátek, specifických proti HIV. Materiál je specifický jako vakcína pro vyvolání buněčné i humorální imunitní odpovědi proti HIV pro dosažení neutralizace HIV. Vynález se snaží vyřešit některé problémy konstrukce polynukleotidových imunogenních látek, které po zavedení do živočišného organismu řídí účinnou expresi bílkovin a epitopů HIV tak, aby byla vyřešena rizika, spojená s těmito postupy. Získané imunitní odpovědi jsou účinné, pokud jde o rozpoznávání HIV, inhibici replikace HIV a identifikaci a zničení buněk, infikovaných HIV a je možno dosáhnout zkřížené reaktivity proti různým kmenům HIV. Vynález tedy poskytuje použitelnou imunogenní látku proti HIV. Vynález také navrhuje polynukleotidové konstrukce, při jejichž použití je možno in vivo v jediné buňce dosáhnout současné exprese více než jednoho produktu viru. To je možno prokázat při použití systému pro expresi genu HIV, v němž exprese prvního genu je závislá na současné expresi druhého produktu genu v téže buňce. Na základě dosažení této současné exprese in vivo je pravděpodobně pomocí tohoto typu polynukleotidové konstrukce možno dosáhnout současné exprese mnoha kombinací produktů genů včetně virových antigenů, odlišných od antigenů HIV, antigenů, spojených se zhoubnými nádory a produktů imunomodulačních nebo imunostimulačních genů.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří nukleové kyseliny včetně konstrukcí DNA a transkriptů RNA, schopné vyvolat koordinovanou expresi dvou nebo tří cistronů po přímém zavedení do živočišných tkání. V jednom z možných provedení se dosahuje koordinované exprese dvou kódových cistronů pro bílkoviny HIV za vyvolání HlV-specifické imunitní odpovědi proti více než jednomu produktu genu. Je možno dosáhnout tvorby cytotoxických T-lymfocytů, CTL, specifických pro virové antigeny a odpovídajících různým kmenům HIV a tvorby protilátek, které jsou obvyklé specifické pro určitý kmen. Tvorba CTL tohoto typu in vivo obvykle vyžaduje endogenní expresi antigenů, jak k tomu dochází například v případě infekce virem. Aby bylo možno vyvolat tvorbu virového antigenů k ovlivnění imunitního systému bez omezení, k němuž dochází při přívodu peptidů nebo virového vektoru se postupuje tak, že se kódové polynukleotidy pro bílkoviny HIV přímo zavádějí do tkání obratlovců in vivo, dosáhne se příjmu polynukleotidů do buněk příslušné tkáně a kódové bílkoviny, produkované a zpracované touto tkání pak ovlivní imunitní systém. U myší dochází při užití tohoto postupu ke tvorbě CTL a protilátek, specifických pro HIV. Podobných výsledků je možno dosáhnout i u primátů. Výsledků se dosahuje použitím polynukleotidů s obsahem dvou nebo tří cistronů při současné expresi kódových genů HIV, přičemž produkty imunostimulaČních genů zahrnují GM-CSF, interleukiny, interferon a bílkoviny B7, které jsou pomocnými stimulačními látkami pro T-buňky. Způsoby a polynukleotidy podle vynálezu je možno použít pro koordinovanou expresi jakýchkoliv dvou nebo tří genů in vivo. Různá provedení vynálezu tedy zahrnují koordinovanou expresi virových antigenů a imunostimulaČních produktů genů stejně jako koordinovanou expresi nádorových antigenů a imunostimulaČních genů.

Vynález bude podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

' Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je schematicky znázorněn genom HIV.

Na obr. 2 je schematicky znázorněna polynukleotidová konstrukce podl-e vynálezu, při jejímž použití je možno dosáhnout in vivo v jedné buňce koordinované exprese až tří produktů genu, pro nějž jsou kódem cistrony I, II a III. Úseky A a B představují řídící sekvence včetně signálu pro ukončení transkripce a promotorů nebo míst pro vstup pro vnitřní ribosomy, IRES.

Na obr. 3 je schematicky znázorněna imunogenní konstrukce polynukleotidů obalu HIV, obsahující promotor trans8 kripce CMV- intA, donor v místě 5-sestřihu, HIV gpl6O .(znázorněn je gpl2O, gp41 a prvek pro odpověď na REV, RRE) a místo pro vstup do vnitrního ribosomu, IRES, dále cistron REV, terminátor transkripce BGH a gen pro označení odolností proti neomycinu pod řízením prokaryotického promotoru transkripce.

Na obr. 4 je podrobně schematicky znázorněna konstrukce polynukleotidového imunogenu se dvěma cistrony HIV, env a gag, znázorněny jsou také specifické řídící prvky.

Na obr. 5 je znázorněna analýza Western blot pro expresi. gpl6O, vyvolanou polynukleotidovým imunogenem HIV.

Je přesně znázorněna současná exprese více než jednoho produktu genu z jediné polynukleotidové konstrukce v jediné buňce. Polynukleotid, který je kódem pro samotný gpl6O (obr. 5B, čtvrtá dráha zleva) nevyvolává expresi prokazatel ného gpl6O, avšak v případě přidání REV současnou pomocnou transfekcí konstrukcí, obsahující pouze kód pro REV dojde k dobré expresi gpl6O (obr. 5A, čtvrtá dráha zleva). Při použití konstrukce genomu tat/REV/env dochází k expresi ' gpl6O pouze na nízké úrovni v přítomnosti i v nepřítomnosti REV (obr. 5A a 5B, třetí dráha). Avšak při použití konstruk ce se dvěma cistrony, gpl6O/IRES/REV dochází k masivní expresi gpl6O (obr. 5A a 5B, pátá dráha zleva). K nejmasivnější expresi dochází při použití konstrukce se dvěma cistrony gpl6O/IRES/REV s donorem sestřihu SD pro zakončení 5”-kódového řetězce pro gpl6O (obr. 5A a 5B, šestá dráha zprava). Vzhledem k tomu, že není možno dosáhnout zvýšení exprese po přidání dalšího REV (obr. 5A), je zřejmé, že účinnost systému není závislá na dosažené úrovni exprese cistronu REV.

Na obr. 6 je znázorněna sekvence VIJ.

Na obr. 7 je znázorněna sekvence VIJneo.

Na obr. 8 je znázorněna sekvence CMVintABGH.

Na.obr. 9 jsou znázorněny cytotoxické T-lymfocyty, jejichž tvorba byla vyvolána u opic rhesus jako odpověď na vakcinaci polynukleotidovou konstrukcí VIJ-SIV-p28, nezávislou na REV. Část SIV-p28 je ekvivalentní p24 gag z HIV.

Je tedy zřejmé, že je možno vyvolat tvorbu CTL, specifických pro skupinu specifických antigenů použitím polynukleotidové konstrukce s obsahem kódu pro gag.

Na obr. 10 je znázorněna tvorba cytotoxických T-lymfocytů po vakcinaci nukleotidovou kyselinou vaccinia-SIVp28. Je zřejmé, že podobný typ CTL je možno vyvolat podáním polynukleotidů s kódem pro gag z obr. 9 ve srovnání s antigenem pro replikaci (vaccinia), u nějž dochází k expresi téhož antigenu (popsáno v publikaci Shen L. a další, Science, 252, 440 - 443, 1991.

Na obr. 11 je znázorněna sekvence vektoru VIR.

Na obr. 12 je znázorněna tvorba protilátek, vyvolaných podáním VlJns-tPA-gpl20 ve dvou dávkách, v každé dávce bylo podáno 200 mikrogramů/myš.

Na obr. Γ3 je znázorněna neutralizace viru HIV-1 (MN) sérem z afrických opic, očkovaných podáním VlJns-tPA-gpl20 (MN) DNA. Obr. 13A a 13B uvádějí snížení produkce bílkoviny p24 gag u buněk C8166, infikovaných HIV-1 (MN) po působení uvedeného ředění sér opic po vakcinaci podáním DNA VlJns-tPA-gpl20. Údaje byly získány po 10 dnech ve tkáňové kultuře po naočkování virem (ΤΟΙΏ^θ na vzorek).

Na obr. 14 jsou znázorněny výsledky, týkající se T-buněk myší po vakcinaci VlJns-tPA-gpl20, je zřejmá dlouhodobá odpověď T-lymfocytů, specifická pro antigen. Imunizovaným myším bylo podáno 1,6 mikrogramů vakcíny DNA dvakrát, měsíců' před usmrcením. T-buňky ze sleziny byly pěstovány in vitro spolu s rekombinantní bílkovinou gpl20 v dávkce 5 mikrogramů/ml. Pak byla pozorována proliferace T-buněk, specifických pro gpl20. Stimulační index je poměr H-thymidinu, včleněného do buněk pro T-buňky po působení gpl20 ve srovnání s T-buňkami bez antigenu a je označen SI.

Na obr. 15 je znázorněna sekrece cytokinu pomocnými buňkami TH¹ z myší, očkovaných VlJns-tPA-gpl20 DNA. Supernatanty buněčných kultur ze vzorků z obr. 13 byly sledovány na sekreci interferonu gamma a interleukinu 4, IL-4 po působení rgpl20. Imunizované myši produkovaly velké množství interferonu gamma a velmi nízké množství IL-4, což znamená, že touto vakcínou byla vyvolána odpověď pomocných T-buněk, TH¹. U kontrolních myší bylo možno pozorovat velmi nízkou sekreci interferonu, hodnoty pro IL-4 jsou na úrovni základních hodnot.

Na obr. 15 je znázorněna účinnost cytotoxických T-lymfocytů CTL proti pgl20 u myší, očkovaných VlJns-tPA-gpl20 DNA. U dvou myší (2006 a 2008) bylo možno pozorovat pro CTL omezenou účinnost MHCI, specifickou pro peptid gpl20 (P18) po vakcinaci gpl2O DNA. Žádnou účinnost nebylo možno u těchto myší pozorovat v nepřítomnosti P18, totéž platí pro kontrolní myši, které vůbec nebyly očkovány.

Na obr. 16 je znázorněna účinnost CTL proti gpl60 u opic thesus, očkovaných VlJns-gpl6O/IRES/rev a VlJns-tPA-gpl20 DNA. Kultury T-lymfocytů za všech čtyř opic po očkování těmito vakcínami vykazovaly MHCI-omezené usmrcováním autologních cílových buněk po působení vaccinia-gpl60.

Žádnou CTL-účinnost nebylo možno pozorovat u čtyř kontrolních ópic rhesus, které byly imunizovány vakcínou VIJns bez zařazeného genu.

Nukleové kyseliny včetně konstrukcí DNA a transkriptů RNA schopných vyvolat koordinovanou expresi dvou nebo tří cistronů po přímém zavedení do živočišné tkáně jsou hlavní součástí podstaty vynálezu. V jednom z možných provedení je možno dosáhnout koordinované exprese dvou kódových cistronů pro bílkoviny HIV a vyvolat tak specifickou imunitní odpověď proti více než jednomu produktu genu HIV. Je možno vytvořit cytotoxické T-lymfocyty, CTL, specifické pro virové antigeny, odpovídající různým kmenům viru imunodeficience u člověka,

HIV a mimoto je možno vytvořit protilátky, které jsou obecně specifické pro určitý kmen. Ke tvorbě CTL in vivo je obvykle zapotřebí dosáhnout endogenní exprese antigenu, tak jak tomu je v případě infekce virem. Aby bylo možno získat virový antigen, jehož přítomnost je nutní k vyvolání reakce imunitního systému, a to bez nutnosti přímého podání peptidu nebo použití virového vektoru, je možno přivádět do tkání obratlovců in vivo přímo kódové polynukleotidy pro bílkoviny HIV, které se dostávají do buněk příslušných tkání, kde dochází k produkci kódových bílkovin a jejich zpracování s následnou reakcí imunitního systému na přítomnost těchto bílkovin.

U myší bylo možno tímto způsobem vyvolat tvorbu CTL a protilátek, specifických pro HIV. Obdobných výsledků bylo dosaženo také u primátů. Byly při tom použity nukleové kyseliny se dvěma nebo třemi kódovými cistrony za současné exprese produktů genů HIV, mimoto bylo současně dosaženo také exprese produktů imunostimulačního genu, například GM-CSF, interleukinů, interferonu a bílkovin B7, které působí jako pomocné stimulační látky pro T-buňky. Způsob podle vynálezu a polynukleotidy podle vynálezu je obecně možno využít k dosažení exprese jakýchkoliv dvou nebo tří genů koordinovaně in vivo. Může například jít o produkty virových antigenu a imunostimulačního genu nebo o koordinovanou expresi nádorového antigenu a imunostimulačního genu.

Polynukleotidy podle vynálezu po přímém přivedení do organismu obratlovců in vivo včetně savců, například primátů a člověka vyvolají expresi bílkoviny jejichž kódové řetězce obsahují.

Uvedené polynukleotidy jsou nukleové kyseliny, obsahující základní řídící prvky, které po uložení do živé buňky obratlovců řídí buněčný metabolismus tak, že dochází k produkci translačních produktů, pro něž jsou kódem geny, obsažené v polynukleotidu.

V jednom z možných provedení vynálezu je polynukleotidem polydeoxyribonukleová kyselina, obsahující geny HIV, operativně spojené s promotorem transkripce. V jiném z možných provedení obsahuje polynukleotidová vakcína polyribonukleovou kyselinu s obsahem kódových genů HIV, schopných translace orgány eukaryotických buněk, jako jsou ribosomy, tRNA a jiné translační faktory. V případě, že bílkovina, pro niž.je polynukleotid kódovým řetězcem se v živočišném organismu vyskytuje pouze za pathologických podmínek, to znamená, že běží o heterologní bílkoviny, například o bílko‘ vinu HIV, který je příčinou syndromu AIDS, dochází k aktivaci imunitního systému živočicha a ke vzniku ochranné imunitní odpovědi. Vzhledem k tomu, že exogenní bílkoviny jsou produkovány vlastními tkáněmi živočišného organismu, jsou bílkoviny po expresi zpracovány hlavním systémem histokompatibility, MHC· způsobem, který je analogický způsobu, k němuž dochází při skutečné infekci odpovídajícím organismem HIV. Výsledkem je vyvolání imunitní odpovědi proti odpovídajícímu pathogennímu organismu.

Vynález se tedy týká nukleových- kyselin, při jejichž uložení do biologického systému dochází k expresi bílkovin a epitopů HIV. Vyvolaná tvorba protilátek je specifická pro bílkovinu HIV, k jejíž expresi došlo a současně neutralizuje HIV. Mimoto dochází ke tvorbě cytotoxických T-lymfocytů, které specificky rozpoznávají a ničí buňky, infikované HIV. Podstatu vynálezu tvoří rovněž polynukleotidy, při jejichž použití je možno dosáhnout účinné exprese viru imunodeficience opic, SIV in vivo. Tato možnost je velmi důležitá vzhledem'k tomu, že jediným živočišným modelem, který je skutečně blízký lidskému onemocnění AIDS je onemocnění primátů, vyvolané SIV. To znamená, že účinnost získaných imunogenů jako vakcín je možno prokázat analogickými účinky, získanými in vivo při využití polynukleotidových imunogenů pro HIV a SIV.

Vynález je možno uskutečnit v celé řadě provedení, vznikajících běžnými úpravami. Je například možno použít různé promotory transkripce, terminátory, vektory nebo specifické řetězce genů na základě obecného postupu, který tvoří součást podstaty vynálezu.

Součástí podstaty vynálezu je způsob, při němž při zavedení polynukleotidů do tkáně savců dochází in vivo v jediné buňce k současné expresi dvou nebo většího počtu různých, od sebe odlišných produktů genu. Tento postup je možno ilustrovat na modelu HIV, u nějž je možno dosáhnout po uložení polynukleotidů do tkáně savce in vivo současné exprese produktů více než jednoho genu. K této produkci dochází za velmi omezených podmínek vzhledem k tomu, že některé geny HIV obsahují řetězec, známý pod názvem prvek, odpovídající na REV, RRE. U těchto genů nedochází k účinné expresi, pokud není v buněčném materiálu současně přítomen další gen HIV, známý pod názvem REV. Tento fenomen je popisován jako závislost na REV.

Pavlakis a Felber popsali v mezinárodní patentové přihlášce WO 93/20212 způsob odstranění sekvencí, které mohou vyvolat nestálost transkriptu, přičemž tímto způsobem je současně možno dosáhnout alespoň určité nezávislosti některých genů HIV na REV. Postup nemusí být použitelný pro všechny takové geny, je náročný na čas a může vyžadovat mnohočetné modifikace '-genu. Mimoto může při odstranění závislosti genu na REV dojít ke snížení úrovně exprese a ke snížení schopnosti genu vyvolat odpověď imunitního systému.

Vynález tedy přináší odlišné řešení, které nevyžaduje mnohočetné úpravy genů HIV, závislých na REV, aby bylo možno dosáhnout nezávislosti na REV. Mimoto je možno způsob podle vynálezu použít při expresi genů, závislých na REV i expresi genů, které jsou na REV nezávislé. Postup, popsaný pro expresi genů, závislých na REV je použitelný jako systém k dosažení současné exprese produktu více než jednoho genu v jediné buňce in vivo. To znamená, že způsob podle vynálezu a popsané polynukleotidové konstrukce je možno využít ve všech případech, v nichž je žádoucí dosáhnout u daných buněk in vivo současné exprese produktu více než jednoho genu.

Jeden z případů, které budou dále uvedeny, je současná exprese imunogenního epitopu a sloučeniny ze skupiny B7, jde o rozpoznávací prvky T-buněk. V poslední době bylo v publikaci Steven Edgington, Biotechnology, 11, 1117 - 1119, 1993 podáno shrnutí koordinační úlohy B7 a hlavního komplexu histokompatibility MHC v epitopech na povrchu buněk, produkujících antigen v aktivovaných CD8⁺ CTL při eliminaci nádorů. Jakmile molekula MHC na povrchu buňky, produkující antigen, APC obsahuje epitop pro receptor T-buněk, působí B7 po expresi na povrchu téže ATC jako druhý signál při vazbě na CTLA-4 nebo CD28. Výsledkem je rychlé dělení pomocných T-buněk CD4⁺, tento signál pak nutí T-buňky CD8⁺ k prolifera ci a k ničení APC. To znamená, že průkaz účinné exprese a vzniku imunitní odpovědi proti genu HIV, závislému na REV s obsahem RRE koordinovanou expresí genu pro REV současně prokazuje, že je možno dosáhnout koordinované exprese více než jednoho genu uložením polynukleotidu s kódovými řetězci dvou nebo i tří cistronů, které jsou definovány jako řetězec nukleové kyseliny, který nese informaci pro tvorbu polypeptidového řetězce.

Vzhledem k tomu, že řada použití předmětu vynálezu se týká vakcinace proti virovým onemocněním, uvádějí se získané polynukleotidy často také jako polynukleotidové vakcíny, PNV. Tím nemá být vyloučeno další odlišné použití těchto polynukleotidů, zejména stimulace imunitního systému a použití k protinádorové léčbě.

V jednom z možných provedení vynálezu dochází k uložení genu HIV pro určitý produkt do vektoru pro expresi. Tento vektor obsahuje promotor transkripce, rozpoznatelný RNA-polymerázou eukaryotických buněk a terminátor transkripce na konci kódové sekvence genu HIV. Ve výhodném provedení se jako promotor užije promotor cytomegaloviru se sekvencí intronu A, CMV-intA, přesto že je zřejmé, že je možno použít ještě celou řadu známých promotorů, například ' promotory pro imunoglobulin nebo jiné promotory pro eukaryotické geny. Výhodným terminátorem transkripce je terminátor růstového hormonu Skotu. Kombinace CMVintA a BGH-terminátoru (obr. 8, řetězec č. 13) je zvláště výhodná. Mimoto, pro snzší přípravu polynukleotidů pro prokaryotické buňky se s výhodou užije^- k označení gen pro odolnost proti antibiotikům, který se uloží ve vektoru pro expresi pod transkripčním řízením prokaryotického promotoru, takže v eukaryotických buňkách nedochází k expresi antibiotika. Je možno použít geny pro odolnost proti ampicilinu nebo proti neomycinu a jiné geny, přijatelné z farmaceutického hlediska pro odolnost proti antibiotikům. Ve výhodném provedení se užije gen pro odolnost proti neomycinu. Mimoto je výhodné pro dosažení vysoké produkce polynukleotidů fermentací s tím rozdílem, že jediné místo působení restrikčního enzymu Kpnl v poloze 2114 vektoru VIJ-neo bylo konstrukčně změněno na jediné místo působení enzymu Sfil. Výskyt míst působení Sfil v DNA lidského genomu je velmi nízký, přibližně jedno takové místo na 100 000 baží. To znamená, že takový vektor umožní přesné sledování integrace vektoru a jeho exprese v DNA hostitele jednoduše tak, že se získaná DNA štěpí enzymem Sfil. V dalším možném provedení se jako vektor užije VIR. V tomto vektoru se co největší množství nepodstat ných sekvencí DNA odstraní, čímž vznikne vysoce kompaktní vektor. Tento vektor je derivátem vektoru VIJns, jak je zřej mé z obr. 11 (řetězec č. 100). Tento vektor dovoluje použití delších uložení částí a optimalizuje příjem vektorů do buněk v případě, že se do okolní tkáně uloží konstrukce, obsahující kódové geny pro specifický chřipkový virus. Na obr. 11 jsou části VIJneo z obr. 7, které byly vypuštěny znázorněny jako mezera a uložený řetězec je vytištěn silněji, avšak číslování VIJneo zůstává beze změny. Uvedené modifikace vektoru a postupy pro tuto modifikaci je možno uskutečnit známými postupy v oboru. Výsledný produkt, přestože je získán známým způsobem, je zvláště cenný při využití pro svrchu uvedené účely.

Při jednom provedení vynálezu dochází k uložení kódových genů HIV gpl60, gpl20, gag a další ze známých laboratorních kmenů HIV, například SF2, IIIB nebo MN, pro něž je již známa řada podstatných údajů. Při použití konstrukcí je pak možno prokázat, že je například možno chránit šimpanze před smrtelnou dávkou viru HIV IIIB tak, že se nejprve podá monoklonální protilátka, specifická pro smyčku V3 viru HIV IIIB a popsaná v Emini a další, Nátuře, 355,

727 - 730, 1992, nebo se provede očkování rekombinantním gpl20, nikoliv gpl60 podle Berman a další, Nátuře 345,

822 - 825, 1990. Je zřejmé, že je možno přepokládat, že při použití těch genů kmenů HIV-2, které mají analogickou funkci jako odpovídající geny HIV-1, je možno očekávat vznik analogické imunitní odpovědi, jaká byla popsána pro konstrukce HIV-1. Postupy pro klonování a manipulace k získání těchto genů jsou v oboru dobře známy.

V poslední době bylo zjištěno, že vyvolání imunitní dopovědi proti laboratorně adaptovaným kmenům HIV nemusí znamenat, že dojde také k neutralizaci primárních izolátů HIV z nemocných, jak bylo popsáno například v Cohen J., Science 262, 980 - 981, 1993. V dalším provedení vynálezu je tedy možno zařadit do polynukleotidové imunogenní konstrukce geny z virulentních, primárních izolátů HIV z nemocných osob. Toho je možno dosáhnout tak, že se připraví kopie cDNA virových genů a pak se jednotlivé geny podrobí subklonování v polynukleotidové imunogenní konstrukci. Sekvence pro řadu genů mnoha kmenů HIV jsou nyní dostupné v GENBANK a mimoto jsou primární izoláty HIV získatelné z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID, tato instituce má smlouvu s firmou Quality Biological. Inc., (7581 Lindbergh Drive, Gaithesburg, Myryland 20879), tak, • aby tyto kmeny byly skutečně dostupné. Tytéž kmeny jsou nyní rovněž dostupné od World Health Organization, WHO (Network for HIV Isolation and Characterization, Vaccine Development Unit, Office of Research, Global Program on AIDS, CH-1211 Ženeva 27, Švýcarsko). Je tedy zřejmé, že možným využitím vynáLezu je získání systému pro zkoušky a analýzy in vivo i in vitro tak, aby bylo mošno prokázat korelace odlišnosti sekvencí HIV se serologickou neutralizací HIV a také zjistit další existující parametry. Izolaci a klonování těchto různých genů je možno uskutečnit známým způsobem. Vynález tedy poskytuje postupy pro systematickou identifikaci jmenů HIV a sekvencí pro výrobu očkovacích látek. Zařazením genů z primárních izolátů kmenů HIV může vytvořit imunogenní konstrukci, vyvolávající imunitní odpovědi proti klinickým izolátům viru, čehož až dosud nebylo možno dosáhnout. Mimoto v případě, že dojde ke změně virulentního izolátu, je možno imunogenní konstrukci odpovídajícím způsobem modifikovat v případě potřeby.

Aby bylo udrženo stálé názvosloví, budou polynukleotidové imunogenní konstrukce popsány dále uvedeným způsobem. Nejprve bude uveden název vektoru, pak kmen HIV, příslušný gen a nakonec přídatné prvky. To znamená, že konstrukce, v níž je gen gpl6O z kmene MN klonován ve vektoru pro expresi VIJneo, bude tato konstrukce označena VlJneo-MN-gpl60. Přídatné prvky, které jsou ke konstrukci přidány, budou dále podrobněji popsány. Je samozřejmé, že v případě, že se kmen viru změní, může být změněn i gen, který je optimální pro uložení do konstrukce. Avšak, jak bude dále uvedeno, vzhledem k tomu, že budou vyvolány i odpovědi ve formě tvorby cytotoxických lymfocytů, schopných ochrany proti heterologním kmenům, bude variabilita kmene méně kritická ve srovnání s vakcínami, které obsahují celý virus nebo jeho polypeptidovou podjednotku. Mimoto vzhledem k tomu, že je do konstrukce snadno možno zařadit jiný gen, je tuto úpravu možno běžně provést postupy, známými v oboru.

Aby bylo možno podstatu vynálezu úplně popsat, je nejprve zapotřebí uvést některé informace o viru HIV. Virus lidské imunodeficience má genom ribonukleové kyseliny, RNA, jehož struktura je znázorněna na obr. 1. Tento genom RNA je zapotřebí podrobit reverzní transkripci známými postupy k získání kopie cDNA pro klonování a manipulaci svrchu uvedenými postupy. Na každém konci genomu se nachází dlouhý opakující se řetězec, který působí jako promotor. Mezi těmito koncovými řetězci se nachází v různých čtecích rámcích gag-pol-env jako hlavní genové řetězce: gag je specifický antigen, pol je gen pro reverzní transkriptázu nebo polymerázu a mimoto je tato oblast také kódovou oblastí v jiném čtecím rámci pro virovou proteázu, která zajištuje posttranslační zpracování, například gpl6O na gpl2O a gp41, env je kódový řetězec pro obalovou bílkovinu, vif je faktor pro infektivitu virionu, REV je regulátor pro expresi bílkoviny virionu, neg je negativní regulační faktor, vpu je faktor produktivity virionu u, tat je transaktivátor transkripce a vpr je virová bílkovina r. Funkce každého z těchto prvnů již byla popsána například v publikaci AIDS 89, A Practical Synopsis of the V. International Conference,

4. až 9. června 1989, Montreal, A Philadelphia Sciences Group Publication, z této publikace byl upraven také obr. 1.

V jednom z možných provedení vynálezu se kódový gen pro bílkovinu HIV nebo SIV přímo váže na promotor transkripce. Gen env je kódem pro velkou bílkovinu, vázanou na membránu, gpI60, která se posttranslačním zpracováním mění na gp41 'a gpl2O. Gen pro gpl2O může být uložen pod řízením promotoru pro expresi z cytomegaloviru. Avšak gpl2O není vázán na membránu a z tohoto důvodu může být tato bílkovina z buňky vyloučena. Vzhledem k tomu, že HIV má tendenci přetrvávat v infikované buňce dlouho v klidovém stavu je žá. doučí, aby byla vyvolána také imunitní reakce proti epitopům HIV, které jsou vázány na buněčný materiál. Tohoto cíle je možno dosáhnout dosažením exprese epitopu gpl60, spojeného s buněčnou membránou in vivo tak, aby došlo k vyvolání reakce imunitního systému. Avšak exprese gpl6O je v nepřítomnosti REV snížena vzhledem k tomu, že se z jádra neuvolní nesestřižené geny. Aby bylo možno tomuto systému porozumět, je zapotřebí podrobněji popsat životní cyklus HIV.

Při životním cyklu HIV dochází po infekci hostitelské buňky k reverzní transkripci RNA-genomu HIV do provirové DNA, která je integrována do DNA genomu’ hostitele jako homogenní transkripční jednotka. LTR obsahuje promotor pro zajištění transkripce genu HIV ve směru 5 až 3 (gag, pol, env) za vzniku nesestřiženého transkriptu celého genomu. Nesestřižené funkce transkriptu ve formě mRNA, z níž dochází k translaci gag a pol při omezeném sestřihu, který je nutno zajistit pro translaci kódových řetězců pro env mohou z'ajistit požadovaný výsledek. Aby bylo možno zajistit expresi produktu regulačního genu REV, musí dojít k více než jednomu sestřihu vzhledem k tomu, že, jak je zřejmé z obr. 1, sekvence REV a env se překrývají. Aby bylo možno dosáhnout transkripce env, je nurno zastavit transkripci REV a obráceně. Mimoto je však přítomnost REV nutná pro vylučování nesestřižené RNA z jádra. Aby tedy bylo možno zajistit uvedeným způsobem funkci REV, musí být v transkriptu přítomen prvek, odpovídající na REV, to znamená RRE, jak bylo popsáno v publikaci Malim a další, Nátuře, 338,

254 - 257, 1989.

V polynukleotidové vakcíně podle vynálezu je obvyklý sestřih některých genů HIV omezen za získání zcela sestřižených genů (to znamená, že je nutno zajistit úplné otevřené čtecí rámce pro požadovaný produkt genu bez nutnosti změn v otevřeném čtecím rámci nebo bez nutnosti změn vyloučit nekódové oblasti, je zřejmé, že při sestřihu určitého genu dochází k určitým změnám v délce sekvence, to je však přijatelné v případě, že se získá funkční kódová sekvence). V jednom z možných provedení tedy dochází k úplnému sestřihu kódového řetězce gpl6O a k sestřihu sekvence REV, takže není zapotřebí dosáhnout dočasné exprese produktu těch to genů. Mimoto se využije exprese , regulované REV k optimalizaci exprese produktů imunogenních genů, jejichž exprese je závislá na REV.

Aby bylo možno zajistit funkci' REV při vylučování transkriptů z jádra do cytoplasmů, je zapotřebí kromě přítomnosti prvku RRE, závislého na přítomnosti REV v transkriptu ještě přítomností alespoň jednoho místa sestřihu na 5'-straně genu, obsahujícího RRE (Lu a další, P.N.A.S., USA 87, 7598 - 7602, říjen 1990 a Chang a Sharp, Cell, 59, 789 - 795, 1. prosince 1989). Vynález navrhuje konstrukci polynukleotidů, v nichž je kódový řetězec pro REV zařazen v tomtéž vektoru pro expresi jako gen, k jehož expresi má dojít, takže je možno dosáhnout současné exprese REV a genu, závislého na REV bez nutnosti jakéhokoliv sestřihu.

Ve výhodném provedení vynálezu je tedy možno uložit geny HIV bezprostředně ve směru exprese od promotoru transkripce, například promotoru CMV a kódový řetězec REV po sestřihu se uloží směrem k zakončení 3' , rovněž po směru exprese od první kódové sekvence. Pořadí genů je samozřejmě možno zaměnit. Může však být výhodné uložit cistron pro imunogen HIV do bezprostřední blízkosti promotoru transkripce, aby bylo možno zajistit, že všechny získané transkripty budou obsahovat kódovou sekvenci celého cistronu.

Jeden z postupů pro dosažení současné exprese genů je založen na transfekci buněk v kultuře při použití různých vektorů pro expresi různých genů. V případě genu, závislého na REV by mohlo být dosaženo tímto způsobem pro, dukce látek, pro něž je kódovou sekvencí REV. Tento postup však není pro účely vynálezu zcela optimální, přestože rovněž spadá do oboru vynálezu. Existuje totoiž malá pravděpodobnost současné transfekce jediné buňky in vivo k dosažení přítomnosti REV pro vysokou úroveň exprese genu pro imunogenní produkt HIV, závislého na REV. Další možný postup spo čivá v tom, že se do daného vektoru zařadí několik promotorů, z nichž každý řídí expresi odlišného genu. Toto řešení je možno využít při provádění způsobu podle vynálezu. V takovém provedení bude výhodné, aby různé promotory a geny pod jejich řízením byly uloženy v opačném smyslu. Avšak, vzhledem k tomu, že existuje kompetitivní interference mezi promotory v takovém vektoru, není ani toto provedení zcela optimální.

V publikacích Ghattas a další, Mol. a Cell. Biol.,

Γ1, č. 12, 5848 - 5859, prosinec 1991, Kaufaman a další, Nuc. Acids Res., 19, č. 16, 4485 - 4490, 1991 a Davies,

J. Virol, 66, č. 4, 1924 - 1932, duben 1992 se popisuje vnitřní místo pro vstup do ribosomu, IRES ve viru encephalomyocarditidy, EMCV, a to v jeho vedoucím řetězci.

Uvádí se také systém, v němž je možno využít promotor proti směru exprese k zahájení transkripce mRNA se dvěma cistrony při dosažení dobré exprese obou 5 i 3 otevřených čtecích rámců v případě, že se IRES uloží mezi oba geny. V publikaci Chen a další, J. Viral., 67, 2142 - 2145, 1993, se uvádí systém, v němž byla užita 5 -nepřenášená oblast NTR z viru vesiculárního onemocnění vepřů SVDV pro konstrukci viru se dvěma cistrony pro současnou expresi dvou genů z jediného transkriptu vektoru infekčního viru.

Bylo prokázáno, že při konstrukci nukleové kyseliny, která obsahuje gen HIV s obsahem prvku, závislého na HIV, RRE, vnitřní místo pro vstup do ribosomu, IRES a kódovou sekvenci REV je možno dosáhnout účinné exprese REV i produktu genu, závislého na REV. Toto provedení podle vynálezu je možno lépe osvětlit v souvislosti s obr. 2 a 3. Na obr. 2 je znázorněno obecnější provedení, na obr. 3 specifické provedení vynálezu, při němž se v souvislosti se svrchu uvedeným názvoslovím využívá VlJns-gpl60(RRE)-IRES-REV. Kmen HIV, z něhož je odvozen gen pro imunogen HIV není pro ilustrativní účely rozhodující, rozhodující je skutečnost, že jakákoliv exprese henu, závislého na REV je v takovém případě účinná, takže může dojít k vyvolání imunitní odpovědi proti produktům REV i genu, závislého na REV. Podle provedení, které je znázorněno na obr. 3, se užije svrchu popsaný vektor VIJns. Vektor obsahuje promotor CMVintA a terminátor BGH a také prokaryotický počátek replikace, tak, aby bylo možno usnadnit produkci polynukleotidové vakcíny HIV ve velkém měřítku fermentací bakterií, transformovaných takovou konstrukcí, při použití· známých postupů. V případě této konstrukce nedochází k replikaci v eukaryotických tkáních vzhledem k nepřítomnosti eukaryotického počátku replikace. Konstrukce obsahuje místo možného dalšího sestřihu v určité vzdálenosti od přírodně se vyskytujícího místa sestřihu rev/tat (rev/tat SD), které je uloženo bezprostředně před genem HIV. Kódová sekvence gag/pol/env obsahuje nebo je následována sekvencí RRE, závislou na REV, která po tvorbě transkriptu zajistí potřebné signály pro vazbu REV a pro vycestování mRNA, závislé na REV z jádra. Mimoto obsahuje konstrukce sekvence pro opětné zahájení translace v místě IRES, takže dochází k účinné translaci kódové sekvence REV, uložené po směru exprese. Tímto způsobem dochází k produkci látek, pro něž je kódovou sekvencí gen REV ve smyslu cis na tomtéž polynukleotidu jako v případě produktu genu, závislého na REV.

Při dalším rozvíjení vynálezu je možno do PNV zařadit třetí cistron. V úvahu padají například geny pro imunostimulační bílkoviny, jako antigen B7, obsahující bílkovinu buněčného povrchu, faktor, stimulující kolonie lidských granulocytů a monocytů (GM-CSF), a také geny pro cytokiny, například interleukin a interferon, v úvahu padá rovněž pou. žití promotorů a zesilovačů transkripce, specifických pro určité tkáně. V případě uložení genu B7 nebo GM-CSF ve smyslu cis zařazením IRES za REV a před gen B7, uložením druhého promotoru v tom'též vektoru, například dvou cistronů pro gen HIV, závislý na REV, nebo zařazením konstrukce IRES-REV nebo ve smyslu trans při použití oddělené konstrukce je možno dosáhnout ještě rozšířeného použití systému REV a genů, závislých na REV. Obecný imunostimulační účinek produktů těchto genů může být dostatečný, i když je získán ve smyslu trans pro zvýšení imunitní odpovědi proti genu HIV, který je kódovou sekvencí pro imunogen podle vynálzu. Je výhodné, zejména v případě B7, aby v B7 byly obsaženy tytéž epitopy HIV jako molekula MHC-I. Současná přítomnost antigenního epitopu a B7 ještě dále zaručuje aktivaci T-buněk. Cytokiny, zvláště IL-12, modifikující humorální nebo buněčnou imunitní odpověď (Alfonso a další, Science, 263, 235 - 237, 1994) se současně podávají nitrožilně při podávání PNV, nebo je možno je zařadit do PNV jako třetí cistron a tím zajistit místní produkci interleukinu. Geny pro tyto imunostimulační a imunoregulační bílkoviny jsou známé, jako GM-CSF (Shaw a Kamen, Cell, 46, 659 - 667, 1986), interleukin-12 (Wolf S. a další, J. Immunol., 146, 3074 - 3081, 1991),

B7 (Gordon a další, J. Immunol., 143, 2714 - 2722, 1989), stejně jako pro klony a sekvence novějších členů skupiny bílkoviny B7, které byly popsány například v publikaci Azuma M. a další, Nátuře, 366, 76 - 79, 1993 a Freeman G. a další, Science, 262, 909 - 911, 1993 a je také možno je snadno klonovat a zařadit do PNV podle vynálezu při použit: známých postupů. S výhodou se pro tyto účely použití lidské geny, tak, aby imunitní odpověď proti těmto bílkovinám byla co nejmenší a aby bílkoviny, k jejichž expresi dochází, mohly splnit svoji imunomodulační a imunostimulační funkci. V případě, že geny HIV jsou nezávislé nebo se sta• ly nezávislými na REV, je možno cistron REV úplně odstranit a je možno zkonstruovat druhý kódový cistron pro gen ze skupiny B7 a třetí kódový cistron pro produkt ještě dal šího genu, například pro IL-12.

Použití promotorů nebo zesilovačů transkripce, specifických pro tkáně, například zesilovač pro svalovou kreatinkinázu MCK je žádoucí v případě, že má dojít k omezení exprese polynukleotidů na určitý typ tkáně. Například myocyty jsou velmi diferencované buňky, které se již nedědí. Integrace cizorodé DNA do chromosomů. vyžaduje dělení buněk a syntézu bílkovin. To znamená, že je výhodné omezit expre si bílkoviny na nedělící se buňky, například právě na myo25 cyty. Použití promotorů CMV je však vhodné pro dosažení exprese v mnoha tkáních, do nichž se přivádí PNV.

V různých provedeních vynálezu, která budou dále podrobně j-i.popsána, se zásadně užívá základního, svrchu uvedeného schématu. Je však samozřejmé, že je možno použít i určité běžné odchylky od uvedené základní konstrukce.

Podstatu vynálezu tvoří polynukleotidové imunogeny HIV se dvěma nebo třemi cistrony, jako polynukleotidové vakcíny, PNV, použitelné k vyvolání humorální imunity a zkřížené imunity buněk pro různé kmeny virů. Systém je využitelný pro jakékoliv dva nebo tři cistrony, odvozené od HIV nebo zcela odlišné, všude tam, kde je požadována současná exprese produktů různých genů v jediné buňce. Dvojí humorální i buněčná imunitní odpověď, kterou je podle vynálezu možno vyvolat, je však zvláště významná při inhibici infekce HIV s ohledem na to, že existuje vysoká schopnost mutace HIV v infikované populaci. Aby bylo možno připravit účinnou ochrannou vakcínu proti HIV, je žádoucí nejprve vyvolat protilátky, například proti gpl60 (env je konzer' vován přibližně v 80 % různých kmenů HIV-1, kmeny skupiny B, která se převážně vyskytuje v USA), který je základním neutralizačním cílem na viru HIV a současně vyvolat tvorbu cytotoxických T-buněk, které reagují na konzervované části gpl60 a také na vnitřní virové bílkoviny, pro něž je kódovou sekvencí gag. Byla připravena vakcína proti HIV s obsahem genů gpl60 z běžných laboratorních kmenů, z převažujících izolátorů viru z infikované populace a také z mutací gpl60, které byly cíleně vyvolány k demaskování epitopů, společných pro větší počet kmenů a mimoto z dalších reprezentativních genů HIV, například genu gag, který je konzervován v izolátech HIV až z 95 %. Mimoto byly připraveny také obdobné materiály SIV, aby byl získán živočišný model pro zkoušky PNV proti HIV, při nichž je možno primáty s výjimkou člověka imunizovat a pak vyvolat pokusnou infekci a sledovat její postup.

Téměř všichni HlV-seropozitivní nemocní, kteří ještě nedosáhli stadia imunodeficience mají v krevním oběhu CTL proti gag, přibližně u 60 % těchto nemocných je možno prokázat CTL se zkříženou účinností specificky proti gpl60. Množství specifických CTL u infikovaných nemocných, kteří již dospěli do stadia onemocnění, které se označuje jako AIDS, je však daleko nižší, což prokazuje význam možností podle vynálezu pro vyvolání zkřížené odpovědi CTL proti různým kmenům. Vzhledem k tomu, že pozdní exprese genu HIV je závislá na REV, jsou vektory pro vakcinaci podle vynálezu s obsahem gpl60 a gag konstruovány tak, aby docházelo také k produkci REV, který je konzervován přibližně v 90 % tak, aby došlo k usnadnění exprese genů, závislých na REV. Další příznivou okolností je, že dochází rovněž k imunitní odpovědi proti REV. Výhoda spočívá v tom, že REV se produkuje ve velmém množství velmi záhy po infekci buněk a řadu hodin před syntézou pozdních produktů genu, čímž vzniká dříve příležitost vyvolat vakcínou reakci T-buněk včetně CTL a pomocných T-buněk.

V dalším provedení podle vynálezu je možno připravit směsnou vakcínu, která obsahuje řadu odlišných konstrukcí genů HIV, závislých na REV, čímž se vyvolá kromě tvorby protilátek a CTL ještě reakce proti REV, mimoto vzniká také reakce proti imunogennímu HIV, závislému na REV. Podle tohoto provedení se smísí jeden kódový polynukleotid gp!60, následovaný druhým cistronem REV a třetím cistronem B7 v konstrukci s jediným promotorem a dvěma sekvencemi IRES s dalším kódovým polynukleotidem pro produkt genu gag, REV a B7 nebo jiným produktem imunomodulačního nebo imunostimulačního genu, jako IL-12 nebo GM-CSF. Tímto způsobem je možno jednou nebo několika injekčními dávkami polynukleotidu vyvolat imunitní reakci proti několika příbuzným imunogenům HIV. Je také možno smísit polynukleotid s genem, nezávislým na REV, například podle WO 93/20212, s B7 a dalším imunomodulačním nebo omunostímulačním genu, jako IL-12 nebo GM-CSF a další konstrukci, která obsahuje dva nebo tři cistrony a zvláště gen, závislý nebo nezávislý na REV a odlišný od předchozího genu. Dále je možno připravit celou řadu konstrukcí se dvěma nebo třemi cistrony s kódovými řetězci pro antigen HIV nebo jiné antigeny a tyto konstrukce mísit za získání multivalentní polynukleotidové vakcíny.

Imunitní reakce, vyvolaná konstrukcemi podle vynálezu s obsahem env, REV a gag již byla prokázána u myší, králíků a primátů. Sledováním produkce protilátek proti env u myší bylo potvrzeno, že taková konstrukce skutečně vyvolává imunitní reakci, což znamená, že vysoký podíl očkovaných zvířat vytvářel protilátky. Myši jsou také nejednodušším živočišným modelem pro zkoušky na vyvolání tvorby CTL takovou konstrukcí a jsou tedy často užívány ke zjištění, zda určitá konstrukce může vyvolat tvorbu CTL. Myší buněč' né linie však nejsou vhodné pro funkce REV nebo tat. Toto pozorování bylo provedeno v souvislosti s pozdní expresí genů HIV v přítomnosti LTR a existují jen některé údaje o tom, že heterologní promotory mohou umožnit funkci REV V myších buněčných kulturách. Králíci a opice (rhesus, šimpanz a Afričan- Green) jsou dalšími vhodnými živočichy pro vyhodnocení tvorby protilátek u větších živočichů, odlišných od hlodavců. Tito živočichové jsou také výhodnější než myši pro neutralizaci pomocí antisér vzhledem k vysokým hladinám endogenních neutralizačních látek proti retrovirům v séru myší. Získané údaje prokazují, že je možno dosáhnout vakcínami podle vynálezu dostatečné imunitní reakce pro ochranu těchto živočichů při pokusech na šimpanzech s použitím kmene HIV ΙΙΊΒ. V poslední době se často užívá označení stupně ochrany, který byl dříve označen jako sterilizační imunita, což znamenalo úplnou ochranu proti HIV infekci, nyní se však uvádí pouze jako dosažení prevence v případě této choroby. Tento výsledek se ověřuje řadou zkoušek, například snížením titru viru v krevním séru, měřeno účinností reverzní transkriptázy HIV, infekčnosti vzorků séra, zkouškou ELISA při použití p24 nebo jiného antigenu HIV v krevním séru, zvýšením koncentrace CD4+ T-buněk a prodlouženou dobou přežívání, jak je uvedeno napři klad v publikaci Cohen J., Science, 262, 1820 - 1821, 1993, kde je diskutováno také stanovení účinnosti vakcín proti HIV. Imunogenní vakcíny proti vynálezu rovněž dávají vznik neutralizační imunitní odpovědi proti infekčním klinickým izolátům HIV.

Imunologie

A. Tvorba protilátek proti env

1. gpl60 a gpl20

Ke stanovení, zda vektory, při jejichž použití dochází k expresi vylučovaného gpl20 nebo gpl60, vázaného na membránu jsou účinné k vyvolání tvorby protilátek, specifických proti env, byla užita zkouška ELISA. Počáteční charakterizace exprese env po podání vakcinačních vektorů podle vynálezu in vitro byla provedena tak, že byl uskutečněn imunoblot materiálu z rozrušených buněk po transfek ci gp!60. Tyto údaje potvrzují expresi a umožní její kvantitativní stanovení po použití monoklonálních protilátek proti gp41 a gpl20 tak, že je možno zviditelnit expresi gpl60 u buněk po transfekci. V jednom z možných provedení vynálezu se používá gpl60 jako výhodnější než gpl20 z následujících důvodů:

1. vektor s obsahem gp!2O má nekonstantní imunogenitu u myší a vyvolával jen malou nebo žádnou reakci při použití u opic Afričan Green,

2. při použití gpl6O vzniká další neutralizační protilátka a CTL-epitopy vzhledem k přidání přibližně 190 zbytků aminokyselin po zařazení gp41,

3. exprese gpl60 je podobnější expresi env viru, pokud jde o soustavu tetrameru a o celkové utváření a

4. bylo prokázáno, že stejně jako při použití konstrukcí chřipkového viru HA, vázaného na membránu, je možno vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek u myší, fretek a primátů, odlišných od člověka (Ulmer a další, Science, 259, 1745 - 1749, 1993, Montgomery D. a dalěí, DNA and Cell Biol., 12, 777 - 783, 1993), přičemž tvorba protilátek proti gpl60 je masivnější než proti gpl20

Volba typu env, popřípadě směsi fragmentů env se provádí na základě pokusů, které budou dále uvedeny.

2. Výskyt a rozsah neutralizační účinnosti

Byly provedeny zkoušky s antiséry králíků a opic a bylo prokázáno, že tato positivní antiséra při zkoušce ELISA neutralizují homologní i heterologní kmeny HIV.

3. Protilátky, které neutralizují nebo nejsou schopné neutralizovat V3

Hlavním cílem PNV proti env je vyvolat tvorbu protilátek s širokou neutralizační schopností. V poslední době bylo prokázáno, že protilátky proti smyčce V3 jsou velmi specifické, pokud jde o jednotlivé kmeny a protilátky byly tedy použity k definování jednotlivých kmenů.

a) Protilátky, které nejsou schopné neutralizovat smyčku V3 primárně rozpoznávají diskontinuální strukturní epitopy gpl20, které jsou odpovědné za vazbu CD4. Protilátky proti této oblasti jsou polyklonální a často vytvářejí zkříženou neutralizaci pravděpodobně k omezenému množství mutací této oblasti vzhledem k tomu, že je zapotřebí, aby se virus vázal na buněčný vazný řetězec. Zkoušky in vitro byly použity k blokování vazby gpl20 na CD4, imobilizovaný sérem imunizovaných zvířat na plotnách s 96 vyhloubeními.

Při druhé zkoušce in vitro byla přímo sledována vazba protilátky na syntetické peptidy, odpovídající vybraným oblastem V3 a imobilizovaným na plastické hmotě. Tyto zkoušky jsou kompatibilní s antiséry z jakéhokoliv živočišného typu a napomáhají definovat typy neutralizačních protilátek, které vznikají po podání vakcíny podle vynálezu a mimoto poskytují korelaci neutralizace viru in vitro.

b) gp41 obsahuje nejméně jednu hlavní neutralizační determinantu, která odpovídá vysoce konzervovanému lineárnímu epitopu, který je rozpoznáván široce nautralizující monoklonální protilátkou 2F5 (dodávána Viral Testing Systems • Cor., Texas Commerce Tower, 600 Travis Street, Suitě 4750, Houston, TX 77002-3005, USA nebo Waldheim Pharmazeutika GmbH, Boltzmangasse 11, A-1091 Vídeň, Rakousko) a mimoto obsahuje ještě další potenciální místa včetně dobře konzervované oblasti složeného peptidu na N-zakončení gp41. Kromě detekce protilátek proti gp41 svrchu uvedeným immunoblotem je možno užít ještě test in vitro na protilátky, schopné se vázat na syntetické peptidy, odpovídající těmto oblastem a immobilizované na plastické hmotě.

4. Vývoj tvorby protilátek

U nemocných, kteří jsou HlV-seropositivní se vyvíjí tvorba neutralizačních protilátek od protilátek převážně proti smyčce V3 až do protilátek s širší neutralizační schopností proti epitopům oblasti gpl2O, tak jak, bylo popsáno v předchozím odstavci, včetně epitopů gp41. Tyto typy vytvořených protilátek byly sledovány v průběhu času po očkování nemocných.

B. Reaktivita T-buněk proti env, REV, nef a gag

1. Vznik reakce CTL

Virové bílkoviny, které jsou syntetizovány uvnitř buněk dávají vznik MHC I-omezené reakci CTL. Každá z uvedených bílkovin vyvolá u seropozitovních nemocných tvorbu CTL. Totéž platí pro vakcíny podle vynálezu i u myší. Informace, získané na různých myších kmenech mohou udávat směr dalším výzkumům, jak tomu bylo například v případě chřipkového viru, tak jak je uvedeno v publikaci (Jlmer a ' další, Science, 259, 1745 - 1749, 1993. U myší Balb/c bylo například identifikováno několik epitopů pro HlV-bílkoviny env, REV, nef a gag, což usnadnilo tvorbu CTL v kultuře a zkoušky na cytotoxicitu. Mimoto je výhodné používat syngenické nádorové linie, například myší mastocytom P815 pro transfekci -těmito geny k získání cílů pro CTL a také pro specifickou opětnou stimulaci antigenem in vitro. Postupy pro definování imunogenních látek, schopných vyvolat MHC-I-omezenou odpověď CTL jsou známé (Calin-Laurens a další, Vaccine, 11,(9), 974 - 978, 1993 a zvláště Eriksson a další, Vaccine, 11(8), 859 - 865, 1-993. Postupuje se tak, že se identifikují epitopy pro aktivaci T-buněk na gpl20 HIV, čímž bylo nalezeno u primátů několik oblastí, včetně aminokyselin 142 až 192, 296 až 343, 367 až 400 a 410 až 453 v gp!20, tyto oblasti vyvolávaly proliferaci lymfocytů.

Mimoto bylo možno prokázat tento účinek ještě pro oblasti 248 až 269 a 270 až 295. Bylo rovněž prokázáno, že také •peptid, obsahující aminokyseliny 152 až 176 vyvolává tvorbu neutralizačních protilátek proti HIV). Tyto postupy je možno použít také k identifikaci imunogenních epitopů pro jejich' zařazení do PNV podle vynálezu. Je samozřejmé, že je rovněž možno použít celé kódové geny pro gpl60, gpl20, proteázu nebo gag. Další souhrnné informace o těchto postupech byly uvedeny například v publikacích Shirai a další, J. Immunol, 148, 1657 - 1667, 1992, Choppin a další,

J. Immunol., 147, 569 - 574, 1991, Choppin a další, J. Immunol., 147, 575 - 583, 1991, a Berzofsky a další, J. Clin. Invest., 88, 876 - 884, 1991. Je pravděpodobné, že efektorová funkce T-buněk je spojena se zralým fenotypem T-buněk, zejména pokud jde o cytotoxicitu, sekreci cytokinu pro aktivaci B-buněk a pro vyvolání tvorby nebo pro stimulaci makrofágů a neutrofilů.

2. Měření aktivity pomocných T-buněk

Kultury slezinných buněk očkovaných živočichů byly podrobeny zkouškám na specifické antigeny přidáním rekombinantní bílkoviny nebo peptidového epitopu. Aktivace T-buněk takovými antigeny v přítomnosti slezinných buněk, v nichž se antigen nachází, APC, se sleduje na základě proliferace těchto kultur nebo podle produkce cytokinů. Podle této produkce je pak možno klasifikovat odpověď pomocných T-buněk jako odpověď typu 1 nebo 2. Vzhledem k tomu, že převážná T_H2-odpověď je zřejmě v souladu s nedostatkem buněčné imunity u seropositivních nemocných, u nichž je aktivita imunitního systému již omezena, je možno definovat typ odpovědi po podání PNV u nemocných a měnit tak výslednou imunitní odpověď.

3. Hypersensitivita opožděného typu DTH

DTH proti virovému antigenu po i.d. injekci je ukazatelem buněčné, primárně MHC II-omezené imunity. Vzhledem k tomu·, že se běžně dodávají rekombinantní HIV bílkoviny a syntetické peptidy pro známé epitopy, je možno u očkovaných obratlovců při použití těchto reakčních činidel snadno stanovit odpověď typu DTH a tak získat in vivo další ukazatel, zda došlo k vyvolání buněčné imunity.

Ochrana

Na základě svrchu uvedených imunologických zkoušek je možno předpovídat, zda vakcína podle vynálezu určitého typu bude účinná při infekci virulentním HIV i u obratlovců. Zkoušky tohoto typu byly provedeny na modelu šimpanzů, infikovaných HIV IIIB po dostatečném očkování těchto zvířat konstrukcí PNV nebo směsí takových konstrukcí s obsahem gpl6O, gag, nef a REV z kmene IIIB. Tento kmen je velmi vhodný pro tyto zkoušky vzhledem k tomu, že již byl u šimpanzů určen titr letální dávky tohoto kmene. Tytéž zkoušky je však možno provádět také při použití jakéhokoliv jiného kmene HIV a epitopů, specifických nebo heterologních vzhledem k danému kmenu. Dalším modelem pro vakcinaci je myš scid-hu PBL. Na tomto modelu je možno zkoušet účinnost na imunitní systém lidských lymfocytů po podání vakcíny a následné podání HIV. Systém je výhodný z tohot důvodu, že je možno jej snadno upravit na použití jakéhokoliv kmene HIV a je možno prokázat ochranu i proti infekci větším počtem kmenů najednou nebo při infekci primárních izolátů HIV z jednotlivých nemocných. Třetím použitelným modelem jsou hybridní viry HIV/SIV (SHIV), z nichž některé, jak bylo v poslední době prokázáno, jsou infekční pro opice rhesus a dávají vznik imunodeficienci, která končí uhynutím zvířete, jak bylo popsáno v Li J. a další, J. AIDS, 5, 639 - 646,

1992. Očkování opice rhesus konstrukcemi polynukleotidové vakcíny podle vynálezu chrání tato zvířata proti následné infekci smrtelnými dávkami SHIV.

Shrnutí informací o konstrukci PNV

HIV a jiné geny se s výhodou uloží do vektoru pro expresi, který je optimálně konstruován pro polynukleotidovou vakcinaci. Pro použití pro účely vynálezu je možno volit několik vektorů. Postupuje se tak, že se v podstatě všechny části DNA, které nejsou zcela nezbytné odstraní, takže zůstávají podstatné prvky, jako promotor transkripce, imunogenní epitopy a popřípadě přídatné cistrony s kódovými řetězci genů pro zvýšení nebo úpravu imunitní odpovědi s jejich vlastními promotory nebo IRES, terminátor transkripce, bakteriální počátek replikace a geny pro odolnost proti antibiotikům, jak již bylo dříve popsáno a znázorněno například na obr. 2. Je zřejmé, že uložení RNA po její transkripci in vitro k získání mRNA tvoří rovněž integrální součást vynálezu. K tomuto účelu je žádoucí použít jako promotor transkripce účinný promotor RNA-polymerázy, například T7 nebo SP6 a uskutečnit transkripci s linearizovanou DNA jako matricí. Tyto postupy jsou v oboru známé.

Exprese pozdních genů HIV, například env a gag je závislá na REV a k jejímu vzniku je zapotřebí, aby byl v trans kriptu přítomen prvek RRE, závislý na REV. Formu gpl2O, která je vylučována, je možno získat i v nepřítomnosti REV tak, že se vedoucí peptid gpl20 nahradí heterologním vedoucím řetězcem, například z tPA (aktivátor plasminogenu z tkání) a s výhodou vedoucím peptidem, například vedoucím peptidem pro imunoglobuliny savců. V případě konstrukce podle vynálezu byl uložen chimérní gen tPA-gpl2O do VIJns, který zajistí účinnou expresi vylučovaného gpl2O u buněk po transfekci, byla použita buněčná linie lidského rhabdomyosarkomu RD. Byl také zkonstruován vektor VIJns se dvěma cistrony na bázi IRES, který obsahoval gpl6O s RRE a také REV, tímto způsobem bylo možno účinně zajistit expresi gp!6O u buněčných linií po transfekci, šlo o kmen 293 z buněčné linie lidských embryonálních ledvin a o RD. Při použití jediného cistronu gpl6O nedochází po trans fekci k produkci žádné bílkoviny bez přidání vektoru pro expresi RE. Při použití gpl60/REV se dvěma cistrony dochází k produkci obdobného množství gp!6O jako po současné transfekci při použití vektorů s jedním cistronem, obsahujících gpl6O a REV současně.

těchto studií je možno předpovědět, že při použití vektorů se.'dvěma cistrony při nitrosvalovém podání in vivo dochází k účinnější expresi gp!6O než při použití směsi vektorů s obsahem gpl6O a REV vzhledem k tomu, že vektor se dvěma cistrony zajistí blízkost konstrukcí gpl6O a REV ve strukturně prodloužených svalových buňkách, obsahujících větší počet jader. Při použití dvou cistronů je rovněž možno usnadnit expresi gag po zařazení RRE do oblasti transkripce ve vektoru. Obdobným způsobem je možno usnadnit také expresi nepříbuzných genů v PNV se dvěma nebo třemi cistrony, například současnou expresi imunogenních epitopů HIV, imunogenních epitopů chřipkového viru, antigenů, odvozených od nádorových buněk a imunomodulačních genů, jako jsou například interleukin, B7 a GM-CSF.

Základní složky konstrukce tedy zahrnují následující složky (obr. 2, cistrony I, II a III):

1. tPA-gpl2O MN,

2. gpl60_IIIB/IRES/REV_IIIB^

3. gpl6O_1IIB,

4. EEV_iiib, '5. tat/REV/gpl60 (klon genomu IIIB, u nějž dochází ke slabé expresi gpl6O),

6. REV/gpl6O,

7. gpl6O_MN>

8. gpl6O z primárních klinických izolátů HIV,

9. nef, při použití genu klinicky získaných kmenů,

10. gag_IIIB, k získání CTL proti gag,

11. tPA-gpl20j, k provedení zkoušek,

12. gpl60 se strukturními mutacemi: náhrada smyčky V3 z klinicky získaných kmenů HIV, řada mutací na různých konstrukcích, například různé odstranění smyčky, mutace Asn k odstranění sterické zábrany strukturních epitopů pro neutralizační protilátku a mutanty, které vyřazují místo vazby CD4,

13. gp41 ke specifickému vyvolání tvorby neutralizačních, protilátek proti gp41, zvláště epitop pro monoklonální protilátku 2F5, uložený těsně před transmembránovou oblastí, široce konzervovanou v celé řadě kmenů. Exprese tohoto peptidu je v nepřítomnosti gpl20 obtížná a vyžaduje řadu manipulací, bylo například prokázáno, že epitop 2F5, sestřižený do konečné části smyčky chřipkového viru HA může vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek proti HIV, jiným možným přístupem je zařazení příslušných vedoucích řetězců, například signálního peptidu tPA, čímž je možno dosáhnout exprese produktu tohoto genu,

14. gag, jde o podobnou konstrukci jako v odstavci 5 při použití klinicky získaných kmenů,

15. řev pro dicistronovou konstrukci s obsahem gpl60 a gag,

16. kódová sekvence B7,

17. sekvence GM-CSF,

18. interleukinové sekvence, zvláště ty, které obsahují kódové sekvence pro IL-12,

19. antigeny, spojené s nádorovými buňkami,

20. geny pro antigeny, k jejichž expresi dochází u jiných pathogenů než HIV, například nukleocrotein, hemaglutinin, matrice, neu.raminidáza a další antigenní bílkoviny chřipkového viru, geny viru cparu, geny lidského papillomaviru, antigeny bakterií tuberkulosy, antigeny viru hepatitidy A, B a C a kombinace těchto látek a dalších antigenů pro tvorbu nejméně dicistronových konstrukcí, které je možno mísit s celou řadou dalších polycistronových konstrukcí za vzniku prostředků, který takovou směs obsahuje a který může vyvolat imunitní reakci proti všem antigenům z uvedených pathogenních organismů nebo proti nádorovým antigenům.

Při konstrukcích s obsahem HIV env je zřejmé, že by bylo žádoucí dosáhnout exprese kódových r.ukleovýdh kyselin pro řetězce aminokyselin různých env smyček V3. Jako příklad je možno uvést všechny, nebo kterýkoliv z následujících řetězců aminokyselin nebo jejich částí, pro něž mohou být kódovými sekvencemi polynukleotidové imuncgeny HIV podle vynálezu.

Sekvence gp!60 smyčky V3 pro konstrukce FMV

North American/European Consensus, řetězec č. 1:

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysSerlIeHisIleGlYProGlyArgAIa

PheTyrThrThrGIyGluIleneGIyAspIIeArgGÍnAIaHisCys

MN, řetězce č. 2:

CysThrArgProAsnTyrAsnLysArgLysArglleHisIleGIyProGlyArgAla

PheTyrThrThrLysAsnllelleGlyThrlIeArgGlnAlaHisCys

IIIB, (HXB2R), řetězec č. 3:

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysArglleArglIeGlnArgGIyProGly

ArgAiaPheVaiThrlIeGIyLysIleGlyAsnMetArgGInAlaHisCys

116-v, řetězec č. 4:

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgLysGlylleHisIleGlyProGlyArgAla

PheTyrThrThrGiyLysIIelleGlyAsnlIeArgGlnAlaHisCys

452-p, řetězec č. 5:

CysThrArgProSerAsnAsnAsnThrAfgLysSerlleHisIIeGIyProGIyLys

AlaPheTyrAlaThrGlyAlalIelleGlyAspIleArgGlnAIaHísCys

146-v, řetězec č. 6:

CysThrArgProAsnAsnAsnThrArgArgSerlleHisIIeAIaProGiyArgAIa

PheTyrAlaThrGIyAspIIelleGlyAspIleArgGliiAIaKisCys

Ochranná účinnost polynukleotidových imunogenů HIV proti následující infekci virem může být prokázána pomocí imunizace nereplikující plasmidové DNA podle vynálezu.

Tento postup je výhodný vzhledem k tomu, že není použita žádná skutečně infekční látka, nepodávají se částice viru a je možno prokázat selekci mezi determinantami. Mimoto vzhledem.ktomu, že sekvence pro gag, proteázu a řadu dalších produktů je u různých kmenů HIV konzervována, je ochra na proti následné infekci virulentním kmenem HIV homologní a zahrnuje i kmeny, heterologní vzhledem ke kmenu, z nějž byl získán klonovaný gen.

Po nitrosvalové injekci vektoru pro expresi kódové DNA pro gpl60 dochází ke vzniku podstatné ochranné imunity proti následující infekci virem. Zvláště dochází k produkci specifických protilátek proti gpl6O a k produkci primárních CTL. Imunitní reakce proti konzervovaným bílkovinám může být účinná navzdory různým změnám v obalových bílkovinách. Vzhledem k tomu, že každý produkt genu HIV je do určitého stupně konzervován a reakce CTL vzniká jako reakce na nitrobuněčnou expresi a zpracování MHC je pravděpodobné, že řada virových genů dává vznik analogické reakci jako při použití gpl60. Z tohoto důvodu byla řada těchto genů klonována, a to při použití příslušných vektorů pro expresi, jak bude dále podrobněji uvedeno a bylo prokázáno, že tyto konstrukce jsou dostupnými imunogenními látkami.

Podle vynálezu je tedy možno vyvolat zkříženou ochrannou imunitu bez použití látek se samovolnou replikací nebo pomocných činidel. Mimoto poskytuje imunizace pomocí polynukleotidových vakcín podle vynálezu řadu dalších výhod. Především je možno ji uplatnit jak na infekční organismy, tak na nádory, protože odpověď CD8⁺CTL je důležitá v obou ' těchto případech, jak je doloženo v publikaci K. Tanaka a další, Annu. Rev. Immunol., 6, 359, 1988. Znamená to, že vyvolání imunitní reakce proti bílkovině, která je podstatná pro transformační postup může být účinným prostředkem pro ochranu proti nádoru nebo pro vyvolání imunitní reakce. Mimoto prokazuje vznik vysokého titru protilátek proti bílkovině, k jejíž expresi dochází po injekci virové bílkoviny a DNA pro lidský růstový hormon (například D.-c. Tang a další, Nátuře, 356, 152, 1992), že jde o snadný a vysoce účinný prostředek pro přípravu vakcíny pro tvorbu protilátek, a to odděleně nebo v kombinaci s tvorbou CTL proti konzervovaným antigenům.

Snadnost přípravy a čištění konstrukcí DNA kontrastuje s pracným dříve prováděním čištěním bílkovin a může usnadnit získání kombinovaných vakcín. Je možno snadno připravit konstrukce s obsahem většího počtu účinných prvků, například kódových sekvencí pro gpl60, gpl20, gp41 nebo jakéhokoliv jiného genu HIV a tyto konstrukce mísit a současně podávat. Vzhledem k tomu, že po injekci takové DNA dochází k dlouhodobé expresi bílkovin, jak bylo popsáno v publikacích H. Lin a další, Circulation, 82, 2217, 1990,

R. N. Kitsis a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 4138, 1991, E. Hansen a další, FEBS Lett., 290, 73, 1991, S, Jiao a další, Hzm. Gene Therapy, 3, 21, 1992, J. A. Wolff a další Human Mol. Genet., 1, 363, 1992, je možno prodloužit tvorbu buněk B a T a uchování jejich paměti, jak bylo popsáno v D. Gray a P. Matzinger, J. Exp. Med., 174, 969, 1991,

S. Oehen a další, tamtéž, 176, 1273, 1992, čímž je možno zajistit dlouhodobou humorální imunitu současně s imunitou, buněčně zprostředkovanou.

Standardní postupy molekulární biologie pro přípravu a čištění konstrukcí DNA dovolují přípravu imunogenních ' konstrukcí DNA podle vynálezu. K přípravě vakcín podle vynálezu je tedy možno použít běžných postupů molekulární biologie, avšak takto získané specifické konstrukce s obsahem polynukleotidových imunogenů mohou zcela neočekávaně zajistit neutralizaci primárních izolátů HIV z různých kmenů, což je výsledek, kterého až dosud nemohlo být dosaženo při běžném použití celého inaktivovaného viru nebo při použití vakcín, obsahujících podjednotky bílkovin tohoto viru.

Množství DNA pro expresi nebo RNA po transkripci, které má být do vakcíny zařazeno, bude záviset na účinnosti použitých promotorů transkripce a translace a na schopnosti produktu genu vyvolat po expresi vznik imunitní reakce. Obecně se bude podávat přímo do svalové tkáně imunologicky nebo profylakticky účinná dávka 1 ng až 100 mg, s výhodou 10 až 300 mikrogramů. Je možno uvažovat také o podání podkožní injekcí, intradermální injekcí, vstřebáním pokožkou a o dalších způsobech podání, jako intraperitoneálně, nitrožilně nebo inhalací. Je také možno očkování opakovat. Po vakcinaci polynukleotidovým imunogenem HIV je možno podat také další injekce bílkovinných imunogenů HIV, například produktů genů pro gpl60, gpl20 a gag. Parenterální podání, jako nitrožilní, nitrosvalové nebo podkožní podání interleukinu-12 současně nebo následně s podáním PNV může být rovněž výhodné.

Polynukleotidy je možno podávat jako takové, to znamená že může jít o čisté nukleotidy, které nejsou spojeny s jakýmkoliv jiným proteinem, pomocnou látkou nebo činidlem, které by mohlo mít také vliv na imunitní systém příjemce.

V případě podání čistého polynukleotidu je žádoucí podat tuto látku ve formě fyziologicky přijatelného roztoku, například ve sterilním fyziologickém roztoku chloridu sodného, popřípadě s přísadou pufru. DNA však může také být spojena s liposomy, například s liposomy lecithinu nebo jinými zná> mými liposomy ve formě směsi nebo může být DNA spojena s pomocným činidlem, o němž je známo, že zvyšuje odpověď imunitního systému, například s bílkovinou nebo jiným nosičem. Výhodné může být také přidání látek, které usnadní příjem DNA do buněk, jako jsou vápenaté ionty. Tyto látky se obvykle uvádějí jako látky, které mohou usnadnit transfekci nebo jako farmaceuticky přijatelné nosiče. Jsou také známy postupy pro přípravu tak zvaných mikroprojektilů, opatřených povlakem polynukleotidů. Tyto útvary, které jsou v oboru známé, je rovněž možno použít pro vakcinaci podél vynálezu.

Jedním z možných provedení vynálezu je polynukleotid, který po uložení do tkáně savců vyvolává in vivo v jediné buňce současnou expresi dvou nebo tří produktů odlišných genů, tento polynukleotid obsahuje:

první promotor transkripce, účinný v eukaryotických buňkách, uložený proti směru exprese pod řízením prvního cistronu, druhý cistron po směru exprese od prvního cistronu, pod řízením prvního promotoru transkripce nebo druhého promotoru transkripce, popřípadě třetí cistron po směru exprese od druhého cistronu pod řízením prvního promotoru transkripce, druhého promotoru transkripce nebo třetího promotoru transkripce, terminátor transkripce za prvním, druhým i třetím cistronem, pokud nenásleduje další cistron bez vlastního promotoru transkripce.

V dalším možném provedení se vynález týká polynukleotidu, který obsahuje sekvence nukleové kyseliny, které nejsou schopné replikace v eukaryotických buňkách, avšak které jsou schopné exprese za vzniku produktu genu po uložení t

do eukaryotické tkáně in vivo. Produkt genu působí s výhodou imunostimulačně nebo jako antigen, schopný vyvolat imu- nitní reakci. To znamená, že nukleové kyseliny podle vynálezu mohou obsahovat kódové řetězce pro gen REV po sestřihu, pro imunogenní epitop HIV a popřípadě pro citokin nebo prvek, současně stimulující T-buňky, například některou látku ze skupiny bílkovin B7.

V dalším možném provedení se vynález týká dosažení současné exprese produktů dvou nebo tří odlišných genů v jediné buňce in vivo, tento postup spočívá v tom, že se do tkáně obratlovce přivede 0,1 mikrogramů až 100 mg polynukleotidu podle vynálezu.

Při použití polynukleotidů podle vynálezu je možno při použití genu HIV, závislého na REV vyvolat in vivo imunitní reakci tak, že se

a) izoluje gen HIV, závislý na REV,

b) izolovaný kmen se naváže na řídící sekvence tak, že může dojít k jeho expresi po operativní vazbě na řídící sekvence, přičemž po uložení do živé tkáně tyto řídící řetězce zahájí transkripci a následnou translaci uloženého genu,

c) gen, schopný exprese, se uloží do živé tkáně,

d) gen pro REV z HIV se uloží ve smyslu trans nebo cis vzhledem ke genu HIV, závislému na REV a

e) popřípadě se ke zvýšení imunitní reakce přivádí ještě další gen HIV, schopný exprese.

Podle vynálezu je možno vyvolat tvorbu buněk, obsahujících antigen ke stimulaci tvorby CTL, specifických proti antigenům HIV. Tento postup spočívá v tom, že se buňky obratlovce in vivo uvedou ve styk s polynukleotidem, obsahu' jícím antigenní epitop HIV, dále REV v případě, že je účinná exprese tohoto epitopu závislá na REV a mimoto ještě kódové sekvence pro B7.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Popis jednotlivých materiálů

Vektory pF411 a pF412: tyto vektory byly subklonovány z vektoru pSP62, který byl zkonstruován v laboratoři R. Gallo. Plasmid SP62 se běžně dodává (Biotech. Research Laboratories, lne.)Tento plasmid obsahuje fragment Xbal o velikosti 12,5 kb z genomu HXB2, subklonovaného z lambda

HXB2. Pak se pSP62 štěpí restrikčními enzymy Sall a Xba I, čímž se získají fragmenty HXB2: 5 -Xbal/Sall o 6,5 kb a 3'-sall/XbaI o 6 kb. Tyto sekvence byly po uložení subklonovány v plasmidu pUC18 v místechjštěpení enzymy Smál a Sáli za vzniku pF411 (5 -Xbal/Sall) a pF412 (3 -Xbal/Sall). pF411 obsahuje gag/pol a pF412 obsahuje tat/rev/env/nef.

Reakční činidla Repligen:.

Rekombinantní rev IIIB, RP1024-10 rekombinantní gp!2O, IIIB, RP1001-10 monoklonální protilátka proti rev, RP1O29-1O m-AB proti gpl2O, RP 1010-10.

AIDS Research and Reference Reagent Program: Hybridom mAB proti gp41, Chessie 8, č. 526.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vektory pro výrobu vakcíny

A) Vektor VI

Vektor VI pro expresi byl zkonstruován z pCMVIE-AKIDHFR (Y. Whang a další, J. Virol. 61, 1796, 1987). Geny AKI a DHFR byly odstraněny rozštěpením vektoru enzymem EcoRI a samovolným navázáním fragmentu. Tento vektor neobsahuje intron A v promotoru CMV, takže bylo možno jej přidat jako PCR-fragment se zrušeným vnitřním místem působení Sací (v poloze 1855 při číslování podle B. S. Chapman a další, Nuc. Acids. Res., 19, 3979, 1991). Jako matrice pro PCR reakci byl užit pCMVintA-Lux, který byl připraven vazbou fragmentu HindlII a Nhel z pCMV6al20 (B. S. Chapman a další, tamtéž) a který obsahuje zesilovač transkripce/promotor z hCMV-IEl a intron A do místa působení HindlII a Xbal plasmidu pBL3 za vzniku plasmidu pCMVIntBL. Fragment genu pro luciferázu s délkou 1881 párů baží (s vyplněným Klenowovým fragmentem HindlII-Smal) z RSV-Lux (J. R. de Wet a další, Mol. Cell. Biol., 7, 725, 1987) byl klonován v místě působení Sáli v pCMVIntBL po vyplnění Klenowovým fragmentem a po zpracování působením fosfatázy.

Primery, které byly použity k vazbě na intron A: 5-primer, řetězec č. 7:

5'-CTATATAAGCAGAGCTCGTTTAG-3',

3*-primer, řetězec č. 8:

5'-GTAGCAAAGATCTAAGGACGGTGACTGCAG-3'.

K odstranění místa působení enzymu Sací byly použity následující primery;

Negativní řetězec, řetězec č. 4:

5- GTATGTGTCTGAAAATGAGCGTGGAGATTGGGCTCGCAC-3', pozitivní primer, řetězec č. 10:

5'-GTGCGAGCCCAATCTCCACGCTCATTTTCAGACACATAC-3'.

PCR-fragment byl rozštěpen enzymy Sací a BglII a pak byl uložen do vektoru, rozštěpeného týmiž enzymy.

B) Vektor pro expresi VIJ, řetězec č. 12

Tento vektor byl zkonstruován k odstranění promotoru a prvků pro ukončení transkripce s vektoru VI, aby bylo možno je Uložit v lépe definované souvislosti, vytvořit kompaktnější vektor a tím zlepšit čištění plasmidu a jeho výtěžek.

Vektor VIJ je odvozen od vektorů VI z příkladu 1 a pUC18, který se běžně dodává. Postupuje se tak, že se VI rozštěpí enzymy Sspl a EcoRI za vzniku dvou fragmentů DNA. Menší z těchto fragmentů obsahuje promotor CMVintA a prvky pro ukončení transkripce růstového hormonu skotu BGH, které řídí expresi heterologních genů (řetězec č. 13). Tento fragment se čistí elektroforézou na agarozovém gelu. Zakončení tohoto fragmentu se pak vyplní při použití enzymu T4 DNA-polymerázy k usnadnění vazby tohoto fragmentu na další fragment DNA, vyplněný stejným způsobem.

Vektor pUC18 byl zvolen jako základní struktura nového vektoru pro expresi. Je známo, že při použití tohoto vektoru je možno dosáhnout vysokých výtěžků a mimoto je vektor při poměrně malém rozměru dobře charakterizován svou sekvencí i svou funkcí. Z tohoto vektoru byl odstraněn celý operon lac, který nebylo možno využít pro účely vynálezu a který by mohl snížit výtěžek plasmidu a expresi heterologního genu. Odstranění tohoto operonu bylo uskutečněno částečným rozštěpením reštrikčním enzymem Haell. Zbytek plasmidu byl čištěn elektroforézou na agarozovém gelu, zakončení byla doplněna pomocí T4 DNA-polymerázy, pak byl vektor zpracováván působením alkalické fosfatázy z telecích střev a navázán na svrchu popsané prvky CMVintA/BGH. Byl získán plasmid s oběma možnými orientacemi promotorových prvků v základní konstrukci pUC. Jeden z těchto plasmidů poskytoval o mnoho vyšší výtěžky DNA v E. coli. Tento plasmid byl označen VIJ (řetězec č. 12). Struktura tohoto vektoru byla ověřena ana47 lýzou sekvence ve spojovacích oblastech a pak bylo prokázáno, že při jeho použití je možno získat srovnatelnou nebo vyšší expresi heterologních genů ve srovnání s použitím vektoru VI.

C) Vektor pro expresi VIJneo, řetězec č. 14

Ukázalo se, že je zapotřebí odstranit také gen amp^rpro selekci bakterií pěstováním na půdách v přítomnosti antibiotika vzhledem k tomu, že při fermentací ve velkém měřítku nesmí být ampicilin použit. Uvedený gen byl ze základní struktury pUC v plasmidu VIJ odstraněn rozštěpením restrikčními enzymy SspI a Eam 11051. Zbytek plasmidu byl čištěn elektroforézou na agarosovém gelu, zakončení byla vyplněna pomocí T4 DNA-polymerázy a pak byl materiál zpracováván působením alkalické fosfatázy z telecích střev. Běžně dodáváný gen kan , odvozený od transposonu 903 a obsazeny v plasmidu pUC4K byl vyštěpen při použití restrikčního enzymu Pstl, rovněž čištěn elektroforézou na agarozovém gelu a zakončení byla vyplněna pomocí T4 DNA-polymerázy. Tento frag-r men pak byl navázán na základní strukturu VIJ a byly odvozeny plasmidy s genem kan v různé orientaci, tyto plasmidy byly označeny jako VIJneo 1 a 3. Sekvence každého z těchto plasmidů byla potvrzena analýzou pomocí restrikčních enzymů, analýzou sekvence ve spojovacích oblastech a bylo prokázáno, že je možno připravit stejné množství plasmidů jako v případě plasmidu VIJ. Exprese produktů heterologních genů byla pro tyto vektory rovněž srovnatelná s výsledkem, dosaženým při použití VIJ. Pro další pokusy byl vybrán plasmid VlJneo-3, který bude dále uváděn pouze jako VIJneo (řetězec č. 14) p

a který obsahuje gen kan v teze orientaci, v jaké se nacháp zí gen amp v plasmidu VIJ.

D) Vektor pro expresi VIJns

K plasmidu VIJneo bylo přidáno místo působení enzymu Sfil k usnadnění integračních zkoušek. Přidání bylo provedeno tak, že byl navázán vazný řetězec o 13 párech baží, obsahující místo působení Sfil (New England BioLabs) na místo KpnI v sekvenci BGH tohoto vektoru. Pak byl plasmid VIJneo linearizován rozštěpením enzymem KpnI, fragmenty byly čištěny na gelu, zakončení byla vyplněna pomocí T4 DNA-polymerázy a navázána na vazný řetězec Sfil se stejně vyplněným koncem. Po klonování byly izoláty analyzovány vytvořením mapy restrikčních enzymů a byla ověřena jejich sekvence. Získaný nový vektor byl označen VIJns. Exprese heterologních genů v tomto plasmidu s obsahem místa působení Sfil, byla srovnatelná s expresí týchž genů v plasmidu VIJneo s místem působení KpnI.

E) Vektor pGEM-3-IRES

Místo pro vstup do ribosomu IRES viru encephalomyocarditidy EMCV umožňuje účinnou expresi dvou genů v jediném transkriptu mRNA v případě, že je místo IRES uloženo mezi těmito geny. Tento nekódový segment genu byl využit k vytvo ření vektorů pro expresi pro polynukleotidové vakcíny s obsahem dvou cistronů. Segment EMCV IRES byl subklonován jako fragment po štěpení EcoRI/BssHII o velikosti 0,6 kb z plasmidu pCITE-1 (Novagen). Tento fragment byl čištěn na agarozovém gelu, zakončení byla doplněna pomocí T4 DNA polymerázy, a pak byl fragment navázán na vektor pGEM-3 (Promega), který byl rozštěpen Xbal, zakončení byla vyplněna pomocí T4 DNA polymerázy a materiál byl pak podroben působení fosfatázy. Byly získány klony s oběma ze dvou možných orientací této DNA ve vektoru pGEM-3 a byla analyzována sekvence DNA pro každou spojovací oblast. Ve výhodné orientaci pro následnou konstrukci vektorů se dvěma cistrony je místo působení Ncol uloženo v oblasti IRES proximálně k místu působení BamHI ve vektoru pGEM-3. Takto získaný vektor byl označen pGEM-3-IRES.

F) Vektor pGEM-3-IRES*

Druhý vektor s obsahem IRES byl připraven tak, že obsa hoval mutace v sekvenci IRES (IRES ), tyto mutace byly uloženy pomocí PCR-oligomeru, tak, aby bylo mcžno optimalizovat expresi pomocí IRES ve srovnání s použitím divokého typu IRES. Amplifikace pomocí PCR po uložené mucaci byla uskutečněna při použití vektoru pCITE-1 (Novagen) s použitím následujících negativních a positivních oligomerů: 5'-GGT ACA AGA TCT ACT ATA GGG AGA CCG GAA TTC CGC-3', řetězec č. 11,

5'-CCA CAT AGA TCT GTT CCA TGG TTG TGG CAA TAT TAT CAT CG-3' řetězec č. 15. Mutované zbytky, které jsou v negativním kodo nu podtrženy, vyloučily kodon ATG proti směru exprese od výhodného ATG v sekvenci Ncoll/Kozak na 3'-zakončení IRES.

G)

Vektor pGEM-3-IRES/REV

HIVii^q REV se podrobí PCR-amplifikaci z pCV-1 (číslo v katalogu 303, NIH AIDS Research and Reference Program) při použití syntetických oligomerů. Positivní a negativní oligomery byly následující: 5 -GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC AGC-3', řetězec č. 16 a 5'-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GCA CTA TTC TTT AGC TCC TGA CTC C-3', řetězec č. 17. Tyto oligomery obsahují místa působení enzymu BglII na každém konci otevřeného čtecího rámce pro translaci a místo působení EcoRV přímo -proti směru exprese od místa působení BglII na 3'-zakončení rev. Po ukončení PCR byl gen REV zpracováván restrikčním enzymem Ncol (místo je uloženo v Kozákově sekvenci) a restrikčním enzymem BglII a fragmenty se naváží na pGEM-3-IRES, předem rozštěpený res. trikčními enzymy Ncol a BamHI. Pak se pomocí analýzy sekvence DNA ověří každá oblast spojení i celá sekvence genu REV o velikosti 0,3 kb.

H) Vektor VIJns-tPA

Aby bylo možno navázat heterologní vedoucí peptidovou sekvenci na vylučované a/nebo membránové bílkoviny, byl plas mid VIJn modifikován tak, aby obsahoval vedoucí řetězec specifického tkáňového aktivátoru lidského plasminogenu tPA.

K tomuto účelu byly spojeny dva syntetické komplementární oligomery a ty pak byly navázány do plasmidu VIJn, předem rozštěpeného enzymem BglII. Pozitivní a negativní oligomery byly následující: 5'-GATC ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA-3', řetězec č. 18 a 5'-GAT CTC GCT GGG TGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GGT-3', řetězec č. 19. Kozáková sekvence je v pozitivním oligomeru podtržena. Tyto oligomery mají na svých zakončeních některé baze navíc tak, aby byly kompatibilní , pro vazbu jiných sekvencí po jejich rozštěpení enzymem BglII Po vazbě se místo působení BglII proti směru exprese odstraní, kdežto místo po směru exprese se uchová pro uskutečnění následné vazby. Obě místa spojení i celá vedoucí sekvence tPA se ověří analýzou řetězce DNA. Mimoto, obdobně jako u optimalizovaného vektoru VIJns (= VIJneo s místem působení Sfil) se uloží místo působení Sfil v místě Kpnl v oblasti terminátoru BGH plasmidu VIJn-tPA tak, že se místo Kpnl vyplní pomocí T4 DNA-polymerázy a pak se naváže vazný řetězec, obsahující místo působení Sfil (číslo v katalogu 1138, New England BioLabs) . Tato modifikace se'-ověří rozštěpením restrikčními enzymy s následným čištěním fragmentů elektroforézou na agarozovém gelu.

I) Vektor VlJns-HIV_IIIB REV

REV byl amplifikován. pomocí PCR tak, jak bylo popsáno svrchu pro vektor pGEM-3-IRES/REV, materiál byl rozštěpen restrikčním enzymem BglII a fragmenty byly navázány na plasmid VIJns, předem rozštěpeny enzymem BglII a zpracovaný působením alkalické fosfatázy z telecích střev. Oblasti spojení byly ověřeny analýzou DNA a exprese REV byla ověřena in g

vitro transfekcí buněk RD a imunoblotěm (na 10 buněk bylo získáno více než 1 mikrogram REV).

J) Vektor pGEM-3-RRE/IRES/REV

Aby bylo možno připravit kazetu, obsahující prvek RRE, závislý na REV, který se musí nacházet v transkriptu RNA, aby mohlo dojít k expresi genů, závislých na REV, byl získán RRE z HIV, kmene HXB2 pomocí PCR při použití následujících syntetických oligomerů. Jako pozitivní oligomer byl užit 5'-GGT ACA TGA TCA GAT ATC GCCC GGG C CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AG-3', řetězec č. 20 a jako negativní oligomer , 5'-CCA CAT TGA TCA G CTT GTG TAA TTG TTA ATT TCT CTG TCC-3', řetězec č. 21. Tyto oligomery obsahují na každém svém konci místo působení enzymu Bell a místa působení EcoRV a Srfl na 5'-zakončení. Zakončení RRE byla vyplněna a navázána do vektoru pGEM-3-/IRES/REV v místě působení enzymu HincII, které je uloženo před IRES. Tvorba příslušných produktů vazby byla ověřena mapováním míst působení restrikčních enzymů a analýzou sekvence DNA v oblastech spojení.

Příklad 2

Vakcíny gpl20

Exprese genu env, závislého na REV jako gpl20 byla uskutečněna následujícím způsobem: gpl20 byl klonován pomocí PCR z kmene MN viru HIV při použití nativního vedoucího peptidového řetězce (VlJns-gpl20) nebo ve formě složené bílkoviny s vedoucím peptidem tkáňového aktivátoru plasminogenu, tPA po jeho použití k náhradě nativního vedoucího peptidu (VlJns-tPA-rgpl20) . Bylo prokázáno, že exprese tPA-gpl20 je nezávislá na REV (B. S. Chapman a další, Nuc..Acids Res.,

19, 3979, 1991. Je nutno uvést, že by pravděpodobně bylo možno použít další vedoucí sekvence, které by rovněž splnily svou funkci, pokud jde o nezávislost genu gpl2O na REV. Tato úloha byla splněna přípravou následujících konstrukcí gpl2O při použití svrchu popsaných vektorů.

I. Konstrukce vakcín gpl2O

A) VlJns-tPA-HIV_MN-gpl20

Gen gpl20 z HIV^ (Medimmune) byl amplifikován pomocí PCR při použití oligomerů, zkounstruovaných pro odstranění prvních 30 aminokyselin vedoucího peptidového řetězce a k usnadnění klonování ve vektoru VIJns-tPA za vzniku chimérní bílkoviny, tvořené vedoucím peptidem tPA, následovaným zbývající sekvencí gpl20 za zbytkem aminokyseliny v polože 30. Tato konstrukce dovoluje expresi gpl20, nezávislou na REV a vylučování rozpustného gpl20 z buněk, obsahujících uvedený plasmid. K tomuto účelu byly použity následující pozitivní a negativní PCR-oligomery: 5'-CCC CGG ATC CTG ATC ACA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', řetězec č. 22 a 5'-C CCC AGG AATC CAC CTG TTA GCG CTT TTC TCT CTG CAC CAC TCT TCT C-3', řetězec č. 23. Stop kodon pro translaci je podtržen. Tyto oligomery obsahují místo působení enzymu BamHI na každém konci otevřeného čtecího rámce pro translaci, přičemž místo působení Bell je uloženo směrem 3' od místa BamHI pozitivního oligomeru. PCR-produkt se pak rozštěpí enzymem Bell a pak enzymem BamHI a fragmenty se naváží na plasmid VlJns-tPA, předem rozštěpený enzymem BglII a pak zpracovaným působením alkalické fosfatázy z telecích střev. Pak se analyzuje sekvence výsledného vektoru k potvrzení fúze vedoucího řetězce tPA a kódové sekvence gpl20 uvnitř čtecího rámce, načež se ověří exprese a sekrece gpl2O imunoblotem buněk RB po transfekci. Je tedy zřejmé, že tento vektor s obsahem kódového řetězce pro rPA-HIV^-gpl20 je možno použít pro uložení dvou nebo tří cistronů pro expresi gag, B7 nebo jiných antigenů.

B) Vl-tPA-HIV_MN-gpl20

Poněkud odlišná verze svrchu popsaného chimérního vek toru tPA-HIV_MN-gpl2O byla zkonstruována při použití dříve použité verze základního vektoru VI po expresi, který obsahoval poněkud odlišnou vedoucí peptidovou sekvenci tPA, _t lišící se od sekvence, popsané při VlJns-t?A.

V kterékoliv ze svrchu popsaných konstrukcí PNV se ’uloží sekvence IRES po stop kodonu pro translaci a po směru exprese se uloží imunomodulační viry, například B7, čímž se získají polynukleotidy s obsahem dvou nebo tří cistronů, využitelné podle vynálezu. U těchto PNV dochází k účinné expresi produktů obou genů.

C) VIJns-tPA-HIV„_TTn-gpl2O

Tento vektor je analogický I. A. až na to, že pro sek věnci gpl2O byl užit kmen IIIB. Pozitivní a negativní PCR-oligomery, které byly použity, měly tyto sekvence:

5'-GGT ACA TGA TCA CA GAA AAA TTG TGG GTC ACA GTC-3', řetězec č. 24, a 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC TTA TCT TTT TTC TCT, CTG CAC CAC TCT TC-3', řetězec č. 25. Tyto oligomery mají místo působení Bell na každém konci uložené části a také místo působení EcoRV těsně proti směru od místa působení Bell na 3 -zakončení. 5'-terminální místo působení Bell dovoluje vazbu do místa působení BglII v plasmidu VIJns-tPA za vzniku chimérního genu tPA-gpl2O s kódovým řetězcem pro vedoucí sekvenci tPA a pro gpl2O bez přirozené vedoucí sekvice.

Vznik produktu vazby byl ověřen vytvořením mapy míst působení restrikčních enzymů a analýzou sekvence DNA.

II. Exprese vakcíny gpl2O in vitro

Exprese in vitro byla zkoušena na buňkách lidského rhabdomyosarkomu RD. Stanovení množství tPA-gpl2O, vylučovaného z buněk RD po transfekci prokázalo, že po transfekci vektorem VlJns-tPA-gpl20 dochází k sekreci gpl2O.

III. Vakcinace gpl2O in vivo

Údaje, týkající se výsledků od jednotlivých myší jsou shrnuty graficky na obr. 12

Titr protilátek proti gp!2O, vytvořený po sekreci chimérního gpl2O* podle výsledků zkoušky ELISA zvíře GMT (rozmezí) myš 5310 (l,8xl0³ až l,5xl0⁴) (dvě následné dávky po 200 mikrogramech) králík 143 (75 až 212) (tři následné dávky po 2 mg) opice A.G.

(dvě následné dávky po 2 mg)

171 (4.10 až 420) tvorba protilátek byla vyvolána podáním VlJns-tPA-gpl20_TTTaΣΣΣΒ nitrosvalově jako očkovací látky.

Reakce^T-lymfocytů skupiny II MHC na gpl2O jako specifický antigen po podání VlJns-tPA-gpl2O_MN jako PNV

Myším Balb/c bylo jako vakcína podáno dvakrát vždy 200 mikrogramů VlJns-tPA-gpl20_MN, pak byly myši usmrceny a jejich sleziny byly podrobeny zkouškám in vitro na reaktivitu pomocných T-lymfocytů na rekombinantní gp!20. Zkoušky na proliferaci T-buněk byly provedeny při použití mononukleárních buněk z periferní krve, PBMC, při použití rekombinantního gpl20_IIIB (Repligen, číslo v katalogu RP 1016-20) při koncentraci 5 mikrogramů/ml a při použití 4 x 10⁵ buněk/ml.

Základní úroveň příjmu H-thymidinu těmito buňkami byla prokázána pěstováním těchto buněk v živném prostředí bez jakýchkoliv přísad, maximální proliferace byla vyvolána stimulací pomocí ConA v koncentraci 2 mikrogramy/ml. ConA vyvolávalo vrchol reaktivity přibližně po třech dnech, po této době byl buněčný materiál oddělen, kdežto vzorky po působení an, tigenu byly odděleny po pěti dnech, v obou případech byly odebrány také kontrolní vzorky buněk, pěstovaných v živném prostředí bez přísad. Odpovědi u očkovaných myší byly srovnávány s reakcí u kontrolních myší z téhož kmene a téhož stáří. ConA-pozitivní kontroly měly vysokou proliferaci buněk z kontrolníchci imunizovaných myší. Intenzivní reakce pomocných T-buněk byla získána u očkovaných myší po působení gpl20, kdežto kontrolní myši nereagovaly (práh pro specifickou reaktivitu je index stimulace SI větší než 3-4, SI se vypočítá jako poměr impulzu za minutu ve vzorku a v kontrolním vzorku). SI 65 a 14 byl získán pro očkované myši, což odpovídá titru protilátek proti gpl20 při zkoušce ELISA pro tyto myši 5645 a 11 900. Je zajímavé, že v případě vyšší reakce ve smyslu tvorby protilátek bylo možno prokázat významně nižší reaktivitu T-buněk než u myší s nižším titrem protilátek. Tento pokus prokazuje, že vylučovaný gpl2O účinně aktivuje pomocné T-buňky in vivo a rovněž vyvolává silnou tvorbu protilátek. Mimoto byla reakce imunitního systému stanovena také při použití antigenu, který byl ve srovnání· s antigenem ve vakcíně PNV heterologní, byl například použit gpl2O z kmene IIIB a MN.

Proliferační odpověď T-buněk ze sleziny na rgpl20 po vakcinaci VlJns-tPA-gpl2O_MN

Průměr CPM (index stimulace)

q Myši (titr agpl20) rgpl20²	prostředí¹	ConA¹	, 2 prostředí
1 (kontroly ^10) 339 (1)	185 3.58 (546)	187 (1)	574 (3)
2 (kontroly <^-10) (1,8), 237 (1)	229 775 (969)	283 (1)	511-
3 (imunní, 5643) 23 109 (65), 317 (1)	221 003 (697)	354 (1)
4 (imunní, 11 900)	243 427 (1063)	235 (1)

3384 (14) 229 (1) buňky, oddělené ve dni 4 po inkubaci dinem, ConA byl užit v koncentraci 2 hodin s ³H-thymi/Ug/ml.

3

Buňky byly odděleny ve dni 5 po 24 h. inkubaci s --H-thymidinem, rekombinantní gpl2O_III0 v množství 5/Ug/ml,

Titr protilátek δΡ¹²⁰ΙΙΙΒ (reciproční, ELISA) a proliferace po podání 2 x 200 mikrogramů DNA/myš Balb/c.·

CPM = impulsy za minutu.

Svrchu uvedené údaje jasně prokazují účinnou expresi antigenů HIV in vivo po použití polynukleotidové vakcíny s obsahem tohoto antigenu a vyvolání specifické imunitní reakce na produkt genu, k jehož expresi došlo. Konstrukci PNV podle vynálezu je možno snadno modifikovat tak, aby obsahovala dva cistrony zařazením stop kodonů po směru exprese od gpl2O a pak zařazením druhého nebo třetího cistronu s kódovým řetězcem pro REV, B7, gag nebo jiné antigeny, odlišné od antigenu HIV, může jít například o kódové geny pro nukleoprotein chřipkového viru nebo pro hemaglutinin.

Příklad 3

Vakcíny gp!6O

Kromě konstrukcí pro vylučovaný gpl2O byly připraveny také konstrukce pro expresi gp!6O, vázaného na membránu, v celé délce řetězce. Výhody konstrukce s obsahem gpl60 ve srovnání s konstrukcemi pro gpl2O spočívají v tom, že

1) je k dispozici větší počet epitopů pro stimulaci CTL i pro produkci neutralizačních protilátek včetně gp41, proti němuž se vytváří účinná monoklonální protilátka, neutralizující HIV (2F5, jak bylo uvedeno svrchu) a mimoto

2) je možno získat nativnější strukturu bílkoviny ve srovnání se strukturou gpl6O po jeho produkci virem a

3) při použití konstrukce s obsahem HA chřipkového viru, vázaného na membránu, je možno dosáhnout vyšší imunogenity (Ulmer a další, Science, 259, 1745 - 1749, 1993, a Montgomery D. a další, DNA and Cell Biol., 12, 777 - 783, 1993)

Gen pro gp!6O si v podstatě uchovává svou závislost na REV i v přítomnosti heterologní vedoucí peptidové sekvence.

Z tohoto důvodu byly vytvořeny dva postupy nezávisle na tom, zda bylo při přípravě vektoru pro gp!6O použito exprese gpl20 a zkušeností, získaných při dosahování této exprese.

1) fragment DNA genomu, účinný pro heterologní expresi gp!6O a obsahující celé sekvence tat, REV a gpl60 se subklonuje v plasmidu VIJns (VIJns-tat/REV/env), jde o postup podle publikace Wang a další, P.N.A.S., USA, 90, 4156 - 4160, květen 1993. Všechny údaje byly získány při použití injekce bupivacainu 24 hodin před injekcí nukleové kyseliny. Vzhledem k tomu, že bupivicain poškozuje svalovou tkáň, jde o postup, který není možno použít pro imunizaci u lidí,

2) uskuteční se PCR-klonování minimálního ORF gpl60 ve vektoru se dvěma cistrony před místem IRES tak, aby došlo k účinnému zahájení translace druhého cistronů s kódovou sekvencí pro REV po translaci gpl60. Tato konstrukce může zajistit účinným způsobem současnou produkci obou bílkovin, gpl60 i REV při použití konstrukce plasmidu VlJns-gpl60/ /IRES/rev. Každý z těchto vektorů byl připraven kromě monocistronových vektorů VlJns-gpl60 a BIJns-REV. Vzhledem k tomu, že z literatury i z vlastních pokusů je zřejmé, že mRNA pro env vyžaduje přítomnost místa sestřihu SD pro tat/REV pro stabilitu v heterologním systému pro expresi, byly připraveny také vektory VlJns-gpl60 a VlJns-gpl6O/ /IRES/REV s místem SD proti směru exprese env ORF. Tyto konstrukce byly připraveny následujícími postupy.

I. Konstrukce vakcíny gpl60

Oba vektory pro expresi gpl60, VlJns-gpl60 a VlJns-gpl60/IRES/nev(dále uvedené postupy A a B) byly připraveny tak, že místo sestřihu SD pro tat/rev bylo uloženo bezprostředně proti směru exprese sekvence gpl60 do místa působení Pstl ve vektoru VIJns, jde o jed.iné místo působení Pstl v obou vektorech. Pak byly zkonstruovány syntetické komplementární oligomery s kódovou sekvencí pro SD pro vazbu na místo Pstl při zachování původního místa na 5-zákon59 čení, avšak při rozrušení místa působení Pstl na 3-zakončení po uskutečnění vazby. Byly použity tyto sekvence:

5'-GTC ACC GTC CTC TAT CAA AGC AGT AAG TAG TAC ATG CA-3', řetězec č. 26 a 5.TGT ACT ACT TAC TGC TTT GAT AGA GGA CGG TGA CTG CA-3, řetězec č. 27. Struktura výsledných plasmidů byla ověřena mapováním restrikčních míst a analýzou řetězce DNA v rozsahu celé oblasti SD/Pstl.

A) VIJns-HIV_IIIBgpl60

Kódová sekvence pro gpl6O kmene IIIB byla klonována při použití PCR-amplifikace z plasmidu pF412, který obsahuje 3-terminální polovinu genomu kmene IIIB HIV, odvozenou od klonu HXB2 tohoto kmene. Jako pozitivní a negativní oligomery pro PCR-amplifikaci byly použity tyto sekvence:

5-GGT ACA TGA TCA ACC ATG AGA GTG AAG GAG AAA TAT CAG C-3, řetězec č. 28, a 5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3, řetězec č. 29. Kozáková sekvence a stop kodon pro translaci jsou podtrženy. Tyto oligomery obsa hují místo působení restrikčního enzymu Bell vně otevřeného čtecího rámce pro translaci na obou koncích genu env. Místa štěpení Bell jsou kompatibilní pro vazbu s místy po štěpení BglII s následnou ztrátou citlivosti na oba restrikční enzymy. Enzym Bell byl zvolen pro PCR-klonování gpl6O vzhledem k tomu, že tento gen obsahuje vnitřní místo působení BglII a také místo působení BamHI. Negativní oligomer rovněž přináší místo působení enzymu EcoRV, uložené těsně před místem působení Bell, jak bylo popsáno svrchu pro jiné geny, zpracované působením nebo pomocí PCR. Amplifikovaný gen gpl6O byl čištěn na agarosovém gelu, rozštěpen Bell a uložen do vektoru VIJns, předem rozštěpeného enzymem BglII a zpracovaného alkalickou fosfatázou z telecích' střev. Klonovaný gen měl velikost přibližně 2,6 kb a obě místa spojení gpl60 a VIJns bylo potvrzeno analýzou sekvence DNA.

B) VlJns-GIV_IIIB gpl60/IRES/REV

Plasmid gGEM-3-IRES-REV byl rozštěpen restrikčními enzymy HindlI a Smál, obsaženými ve vazné oblasti plasmidu tak, aby došlo k odstranění celé sekvence IRES/REV o přibližně 0,9 kb a pak byly fragmenty navázány na VlJns-HIV_IIIBgpl60, předem rozštěpený EcoRV a zpracovaný fosfatázou.

Tímto postupem byl získán plasmid VIJns se dvěma cistrony o velikosti 8,3 kb s obsahem gpl60, následovaným ISES a REV pro řízení exprese obou uvedených genů HIV. Všechna místa spojení byla ověřena analýzou sekvence DNA.

C) VlJns-tPA-HIV_IIIB-gpl60

Tento vektor je podobný vektoru z příkladu 2 C) s tím rozdílem, že pomocí PCR byl získán gpl60 v celé délce bez nativní vedoucí sekvence. Pozitivní oligomer byl stejný jako v příkladu IC, mimoto byl použit negativní oligomer:

5'-CCA CAT TGA TCA GAT ATC CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC C-3', řetězec č. 30. Tyto oligomery obsahují na každém svém konci místo působení Bell a také místo působení EcoRV těsně ' proti směru exprese od místa Bell na 3'-zakončení. 5-terminální místo působení Bell dovoluje vazbu do místa BglII na vektoru VIJns-tPA pro vznik chimérního genu tPA-gpl60 s kódovou sekvencí pro vedoucí řetězec tPA a pro gpl60 bez jeho nativní vedoucí sekvence. Protukty vazby byly ověřeny mapováním míst působení restrikčních enzymů a analýzou sekvence DNA.

D) VlJns-tat/rev/env_IIIB

Tento vektor pro expresi byl zkonstruován podle publikace D. Rekosh a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85, 334, 1988 při použití genomového segmentu klonu HXB2 z kmene IIIB HIV-1, vektor obsahuje celou sekvenci tat, rev a env bez sestřihu. Vektor VIJns byl rozštěpen enzymem BglII, zakončení byla vyplněnanT4 DNA-polymerázou a materiál byl zpracován působením alkalické fosfatázy z telecích střev.'Fragment Sall/Xhol genomu IIIB v plasmidu pF412 byl získán rozštěpením uvedenými enzymy, zakončení byla rovněž vyplněna T4 DNA-polymerázou. Struktura produktl vazby byla ověřena mapováním míst působení restrikčních enzymů a analýzou sekvence DNA.

E) VlJns-rev/env^j_IB

Tento vektor je variací vektoru z předchozího odstavce, rozdíl spočívá v tom, že je odstraněna celá kódová oblast tat v exonu 1 až do začátku otevřeného čtecího rámce REV. Vektor VlJns-gol60_IIIB (odstavec A svrchu), byl rozštěpen restrikčními enzymy Pstl a KpnI k odstranění 5'-oblasti genu gpl6O. Pak byla užita PCR-amplifikace k získání kódového segmentu DNA pro první exon REV proti směru exprese od místa působení KpnI v gp!6O z klonu genomu HXB2. Byly použity následující pozitivní a negativní sekvence oligomerů 5'-GGT ACA CTG CAG TCA CCG TCC T ATG GCA GGA AGA AGC GGA GAC -3', řetězec č. 31 a 5'-CCA CAT CA GGT ACC CCA TAA TAG ACT GTG ACC-3, řetězec č. 32. Tyto oligomery mají na 5'a 3*-zakončení místa působení restrikčních enzymů Pstl a KpnI. Výsledná DNA se rozštěpí enzymy Pstl a KpnI, fragmenty se čistí elektroforézou na agarosovém gelu a uskuteční se vazba s vektorem ClJns-gpl60(PstI/KpnI). Struktura výsled ného plasmidu se ověří rozštěpením restrikčními enzymy.

IIv Exprese in vitro v případě vakcíny gpl6O

Buňky RD a 293 byly přechodně podrobeny transfekci konstrukcemi pro expresi go!60 a REV. Analýza Western blot na obr. 5, uskutečněná při použití monoklonální protilátky proti gp41 (Chessie 8, NIH AIDS Research and Reference Program, č. v katalogu 526) prokazuje, že pro expresi gpl6O při použití vektoru VlJns-gpl60 (SD) je zapotřebí přidání vektoru. VIJns-REV, tento vektor produkuje více než 1 mikrogram REV na 10 buněk po přechodné transfekci. Při použití vektoru VlJns-gpl60/IRES/REV dochází k účinné expresi gp!60 bez přidání REV, což potvrzuje funkci konstrukce se dvěma cistrony. Podobné výsledky byly dosaženy při použití monoklonální látky proti gpl20 (1C1, Repligent, č. v katalogu RP1010-10) při použití imunoblotu. Proteolytické zpracování gpl60 na zralé formy gpl20 a gp41 je možno pozorovat v případě všech vektorů. Přidání REV (trans) k vektoru gpl60/REV se dvěma cistrony nemělo za následek vyšší ecpresi gpl60, což prokazuje, že pro tento vektor není exprese REV omezujícím faktorem pro expresi gpl60. Expresi gpl60 bylo možno zvýšit v případě, že byl zařazen fragment tat/REV SD do konstrukce gpl60/REV se dvěma cistrony, což prokazuje důležitost tohoto místa pro optimální expresi gpl60 v závislosti na REV. Bylo také překvapující, že při expresi gpl60/REV se dvěma cistrony docházelo k více než lOx vyšší expresi gpl60 než při použití konstrukce tat/REV/env pro přechodnou transfekci, což opět prokazuje vysokou účinnost tohoto vektoru pro expresi gpl60.

Uvedené vektory obsahují konstrukci nukleové kyseliny pro vakcinaci plasmidem s geny gpl60 a REV a to ve formě oddělených plasmidů nebo v tomtéž plasmidů. V případě konstrukce tpa-gpl60 není nutno zajistit přítomnost REV cis ani trans k dosažení účinné exprese gpl60, takže je možno do konstrukce se dvěma cistrony zařadit jiné geny.

Pro konstrukce se závislostí na REV je důležité prokázat, zda účinná exprese gpl60 po očkování vyžaduje přítomnost

REV v tomtéž plasmidu vzhledem k tomu, že po nitrosvalové injekci jsou svalovými buňkami přijímána velmi malá množství DNA a do jednotlivých svalových buněk, z nichž každá obsahuje stovky jader se nemusí dostat kopie odlišných plasmidů, přítomných v blízkosti těchto buněk.

III. Vakcinace vakcínami gp!6O in vivo

Byly užity tři odlišné postupy pro srovnání schopnosti vyvolat tvorbu protilátek proti gpl20 u primátů, odlišných od člověka při použití vakcín PNV podle vynálezu s kódovou sekvencí pro gp!6O. Byla uskutečnaně vakcinace

1) při použití VlJns-gpl60_IIIB/IRES/REV (SD), tento vektor obsahuje dva cistrony gpl60/REV,

2) při použití konstrukce VlJns/tat/rev/env__TIB s obsahem kódové sekvence pro gpl60 genomu kmene IIIB a

3) při použití směsi vektorů se dvěma cistrony,

VlJns-gpl60_IIIB (SD) a BIJns-REV.

K vakcinaci byly použity dávky 2 mg/zvíře, bylo provedeno až trojí očkování v intervalech 1 měsíc a současně byla odebrána krev. Byly získány titry protilátek (ELISA) pro rekombinantní gpl2O^jj_B u opic po vakcinaci každým z uvedených vektorů. Vektor gp!60/REV se dvěma cistrony vyvolával tvorbu protilátek u opic rhesus i u opic AG a na rozdíl od toho nevyvolávaly vektory s obsahem gpl6O genomů a vektory, tvořené směsí vektorů s jedním cistronem prokazatelnou tvorbu protilátek po dvojím očkování (to znamená měsíc po druhé vakcinaci). Všechny čtyři opice, jimž byl podán vektor se dvěma cistrony gpl60/REV rovněž vytvářely specifické protilátky proti gp41, jak je možno ověřit testem BIAcore při použití rekombinantní gp41 (ABT) jako zmobilizovaného substrátu, bližší údaje nejsou uvedeny. Sérum, odebrané těmto opicím bylo rovněž reaktivní při při zkoušce ELISA proti smyčce titry byly přibližně až 100. Tyto výsledky prokazují, že exprese in vivo, vyvolaná pomocí PNV s větším počtem cistronů není analogická výsledkům, získaným při transfekci in vitro, kde bylo možno prokázat expresi gpl60 pro všechny tři typy vektorů. Je nutno uvést zvláště skutečnost, že transfekce in vivo vedla k ekvivalentní expresi směsí dvou vektorů s jedním cistronem, gpl60 a REV ve srovnání s vektorem s obsahem dvou cistronů gpl6O/REV, jak je zřejmé z obr. 5. Tyto pokusy prokazují, že PNV se dvěma cistrony mohou zajistit účinnou koordinovanou expresi po vakcinaci in vivo, kdežto u jiných postupů vakcinace není možno dostatečné exprese dosáhnout. Výsledky jsou znázorněny na obr. 9 pro dvě opice AG, pro dvě opice rhesus a pro imunitní odpověď u králíka.

Titry protilátek proti gpl20 (ELISA) po podání gpl60 PNV u primátů, odlišných od člověka, 2 mg DNA na vakcinaci

T i t r

Vektor/zvíře	po 2.dávce	po 3. dávce
VIJns-tat/rev/enVj opice Afričan Green AG	1.	<20	ND¹
	2 .	<20	ND
	3.	4 20	ND
VlJns-gpl60_IIIB + VlJns-rev^
opice AG	1.	420	ND
	2.	< 20	ND
	3.	2_20	ND

VI Jns-gp 160IRES / rev

opice	AG	1.	85	90
		2 .	75	60
opice	rhesus	1.	165	175
		2.	290	260

^ND = nebylo stanoveno

PNV tohoto typu obsahuje ekvimolarní směs dvou vektorů s jedním cistronem.

Titry protilátek proti (ELISA) po podání vektoru⁵⁴ gpl60/rěv se dvěma cistrony u primátů, odlišných od člověka, dávka 2 mg DNA na vakcinaci zvíře titr po 3. vakcinaci

opice	AG 1.	70
	2.	45
opice	rhesus 1.	55
	2.	100
* Byl pro	použit vektor VlJns-gpl60_IIIB/IRES/rev jako vektor vyvolání tvorby protilátek.

Příklad 4 . Vakcíny SIV

Konstrukce SIV env, vektor VIJn-SIV gpl52 byla vytvořena PCR-klónováním z klonu genomu izolátu viru a sekvence obou spojení ve vektoru byla ověřena analýzou sekvence DNA. Uvedený virus je homologní s virem, který je užíván v New England Regional Primáte Center NRPC pro pokusnou infekci SIV opic rhesus. Obdobná konstrukce byla připravena také pro gpl52 SIV tak, že v kódové sekvenci DNA jsou pro oblast vedoucího peptidu použity odlišné kodony při zachování nativního řetězce aminokyselin. Tímto zásahem se sníží závislost konstrukce na REV a získá se stabilnější transkript mRNA. Konstrukce vakcíny tohoto typu byly připraveny následujícími postupy:

I. Konstrukce vakcíny SIV

A) ^vlJ-^SIVMAC25i ^ρ2θ §^a8

Centrální peptid SIV gag, který je označován p28 gag, byl zvolen pro konstrukci polynukleotidové vakcíny k vyvolární tvorby CTL u primátů, odlišných od člověka. Tato oblast gag obsahuje kódovou sekvenci známého epitopu CTL pro makaky, kteří vytváří haplotyp MHC skupiny I, označovaný jako Mamu-AOl. Opice s tímto haplotypem by tedy měly reagovat tvorbou CTL na epitop gag po vakcinaci příslušným plasmidem s obsahem gag. Vzhledem k tomu, že geny gag SIV i HIV obsahují řídící sekvence se závislostí na REV, je exprese p28 gag méně závislá na REV, takže i v nepřítomnosti REV je možno dosáhnout určité exprese.

SIV p28 gag byl klonován ve vektoru pro expresi VI při použití místa působení restrikčního enzymu BglII po • PCR-amplifikaci z plasmidu p239SpSp5' (NIH AIDS Research and Reference Program, č. v .katalogu 829) při použití běžných syntetických oligodeoxyribonukleotidů. Tento plasmid obsahuje kódovou sekvenci pro 5'-polovinu genomu ^si^m_AC239* ^SIVMAC239 ^{J<e linie SIV}MAC251 ^P° P^asážování in vitro a obsahuje určité mutace ve srovnání s původním virem. Řetězec aminokyselin pro tyto viry je však v úseku p28 gag identický Pozitivní a negativní oligomery pro PCR měly sekvence:

5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT GGT AAC-3', řetězec č. 33 a 5'-CCA CAT AGA TCT TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC C-3', řetězec č. 34. Tyto oligomery zajistí místa působení enzymu BglII vně otevřených čtecích rámců pro translaci přítomnost KOzakova iniciačního kodonu pro translaci a přítomnost stop kodonu pro translaci. Sekvence p28 gag po PCR byla čištěna na agarosovém gelu, rozštěpena působením BglII a navázána do vektoru VI po rozštěpení enzymem BglII a po působení fosfatázy. Uvedený gen byl pak subklonován v optimalizovaném vektoru pro expresi VIJ při použití' míst působení restrikčního enzymu BglII a výsledný vektor byl označen V1J-SIV p28 gag. Klonovaný gen měl délku přibližně 0,7 kb. Místa spojení VIJ CMV promotoru a 5'- zakončení p28 gag bylo ověřeno analýzou sekvence DNA pro každou konstrukci. Pak byla srovnávána in vitro exprese bílkoviny SIV p28 pro konstrukce VIJ a VI při použití Westerm blot a plasmy z SIV-infikovaných makaků pro detekci bílkoviny gag. Konstrukce V1J-SIV p28 gag vždy poskytovala největší množství produktu s příslušnou molekulovou hmotností. Obdobné nebo ještě lepší výsledky bylo možno získat při použití dalších, ještě více optimalizovaných vektorů VIJneo, VIJns a VIR.

B) V1J-SIV_MAC251 nef

SIV nef byl klonován po PCR-amplifikaci z plasmidu pBK28, který obsahuje kodovou sekvenci pro celý genom 2^^VMAC251 (^z^^sl<án darem od Dr. Vanessa Hirsch. NIAID. NIH.

, Rockville, MD, nyní číslo v katalogu 133, NIH AIDS Research and Reference Program). Pozitivní a negativní oligomery pro PCR reakci měly následující sekvence: 5'-GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATG AGG-3', řetězec č. 35 a 5'-CCT AGG TTA GCC TTC TTC TAA CCT CTT CC-3', řetězec č. 36. Je obsažena Kozáková sekvence a stop kodon pro translaci. Amplifikovaný gen nef byl čištěn na agarosovém gelu, zakončení bala vyplněna při použití T4 DNA polymerázy, fosforylována na 5'-zakončení, při použití T4 DNA kinázy a klonována v místě působení BglII s vyplněným zakončením ve vektoru VIJ po působení alkalické fosfatázy z telecích střev. Délka klo novaného genu byla přibližně 0,76 kb. Místo spojení VIJ CMV promotoru a 5'-zakončení nev bylo ověřeno analýzou sekvence DNA. Exprese in vitro byla zkoumána při použití analýzy

Western blot a antisera proti HIV nef (číslo v katalogu 331, HIH AIDS Research and Reference Program).

C) VlJn-SIV_MAC251 gpl52

SIV env, který se uvádí také jako gpl52 byl klonován po PCR-amplifikaci z plasmidu pKB28 ve vektoru VIJneo. Positivní a negativní oligomery pro PCR-reakci měly následující sekvence: 5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GGA TGT CTT GGG AAT CAG C-3', řetězec č. 37 a 5'-CCA CAT AGA TCT GAT ATC GTA TGA GTC TAC TGG AAA TAA GAG G-3', řetězec č. 38. Opět jsou obsaženy Kozáková sekvence a kodon pro ukončení translace. PCR-produkt obsahuje místo působení restrikčního enzymu BglII vně otevřeného čtecího rámce pro translaci na obou koncích a přídatné místo působení enzymu EcoRV, které bezprostředně předchází 3'-terminální místo působení BglII, je však uloženo za stop kodonem amber. Tímto způsobem je možno připravit místo působení restrikčních enzymů pro snadné provedení následujícího klonování. Amplifikovaný gen gpl52 se čistí na agarosovém gelu, rozštěpí se enzymem BglII a naváže na vektor VIJn, předem rozštěpený enzymem BglII a zpracovaný působením fosfatázy. Klonovaný gen měl délku přibližně 2,2 kb. Spojení každého konce gol52 s VIJn CMV promotorem a BGH terminátorem bylo ověřeno analýzou sekvence DNA.

II. Vakčinace in vivo při použití SIV-vakcín

Pro očkování opic rhesus byly použity dvě konstrukce s obsahem genu SIV a bylo prokázáno, že vyvolávají u primářů, odlišných od člověka tvorbu specifické reakce CTL, jak je znázorněno na obr. 4.

Vektor V1J-SIV p28 gag, při jehož použití dochází k expresi centrálního peptidu gag relativně nezávisle na REV a vektor V1J-SIV nef byly vstřiknuty nitrosvalově opicím Macaca mulatta v množství 3 mg/vakcinace, vakcinace byla třikrát opakována v intervalu 1 měsíc. Reakce těchto opic ve smyslu CTL, specifických pro gag v případě haplotypu Mamu-AOl MHC I je primárně omezena na jediný peptidový epitop v oblasti p28 gag. Opice Mamu-A01⁺, jimž byl podán vektor V1J-SIV p28 gag reagovaly tvorbou specifických CTL na gag 1 měsíc po druhé injekci, kdežto opice Mamu-AOl , jimž byla podána tatáž DNA a opice, jimž byl podán kontrolní vektor VIJ tímto způsobem nereagovaly.-Také in vitro bylo možno prokázat po druhé a třetí vakcinaci primární CTL i CTL po restimulaci peptidem gag. Tato reakce je srovnatelná s reakcí, která je vyvolána při naočkování vaccinia-gag. Po určité době se množství CTL u zvířat začalo snižovat. Tato zvířata pak byla ještě jednou očkována k podpoře tvorby CTL. U zvířat, očkovaných vektorem C1J-SIV nef nebylo možno pozorovat reakci ve smyslu tvorby specifických CTL, i když byla navržena jemnější zkouška, obdobná zkouškám na detekci gag CTL (znamená to, že u opic rhesus nebylo možno nalézt žádný vztah mezi dominantním MHC I haplotypem/peptidem nef, takže se ke stimulaci užívá peptidů s neznámým účinkem bez pozitivní kontroly).

Příklad 5

Další konstrukce vakcíny

A) VlJns-HIV_IIIB gag/pol-RRE/IRES/REV

Pomocí PCR-amplifikace sekvencí HIV^-j..^ gag-pol ^sněkolika variacemi byly připraveny vektory pro expresi se dvěma cistrony s kódovou sekvencí gag s případnou přítomností oblasti pro proteázu pol. Zařazení segmentu pol pro proteázu (prt) dovoluje proteolytické zpracování gag za vzniku různých peptidů, například pl7, p24, pl5 a podobně, obsahující částice kapsidu, kdežto při vynechání oblasti pro tento enzym se získá p55 ve formě nezralých částic kapsidu.

Delší sekvence pol nebyly zařazeny, aby nebyla ohrožena bezpečnost použití vzhledem k tomu, že tyto deslší sekvence by mohly zahrnovat enzymatickou účinnost reverzní transkriptázy a integrázy oblasti pol. Pro částice kapsidu gag ve zralé i nezralé formě musí být přítomen počáteční zbytek Met, a zbytek aminokyseliny glycinu, následující v poloze 2 za tímto zbytkem musí být myristoylován. V případě, že dojde k mutaci na tomto glycinovém zbytku, nedojde k myristoylaci a částice gag nebudou z buněk vyloučeny. Tato modifikace gag dovoluje stanovit, zda je vznik CTL proti gag po vakcinaci vektory gag ovlivněn proteolytickým zpracováním a/nebo vyloučením kapsidu z buněk. Některé z dále uvedených vektorů obsahují místo sestřihu proti směru exprese od otevřeného čtecího rámce gag. Tyto vektory dovolují stanovení, zda je místo sestřihu nezbytné pro optimální expresi gag, závislou na rev, jak tomu bylo při zařazení > tat/rev SD pro optimální expresi gpl60.

1) VlJns-HIV_IIIB gag-prt/RRE/IRES/REV

Kódový segment DNA pro gag-prt byl získán PCR-amplifikací při použití následujících pozitivních a negativních oligomerů: 5'-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GGT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3*, řetězec č. 39, a 5'-CCA CAT GGA TCC GC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC TAA TGC-3', řetězec č.

40. Tyto oligomery mají na každém konci segmentu místo působení enzymu BamHI a Kozákův iniciační řetězec pro translaci včetně místa působení Ncol a mimoto místo působení Srfl bezprostředně proti směru exprese od místa BamHI na 3'-zakončení

Místo působení Srfl bylo použito ke klonování kazety RRE/IRES/REV z plasmidu pGEM-3-RRE/IRES/REV, plasmid byl vyštěpen při použití restrikčního enzymu EcoRV bezprostředně po směru exprese od gag-prt. Všechna místa spojení byla ověřena analýzou sekvence DNA a zjištěním míst působení restrikčních enzymů.

2) VlJns-HIV_IIIB gag-prt/RRE/IRES/REV(SD)

Tento vektor byl připraven stejným způsobem jako předchozí vektor s tím rozdílem, že při PCR byl jako pozitivní oligomer použit oligomer se sekvencí 5-GGT ACA GGA TCC CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3 - řetězec č. 41. Tímto způsobem je možno uložit místo sestřihu SD proti směru exprese na začátek sekvence gag. Tato kontrukce byla ověřena mapováním míst působením restrikčních enzymů a analýzou řetězce DNA v místech spojení.

3) VIJns-HIVjgag-prt/RRE/IRES/REV(w/o-myristoylace)

Tento vektor byl připraven stejně jako vektor z odstavce 1 svrchu s tím rozdílem, že pro PCR byl jako pozitivní oligomer použit oligomer se sekvencí 5”-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3', řetězec č. 42.

4) VlJns-HIV_IIIB gag/RRE/IRES/REV

Tento vektor byl také připraven stejně jako vektor z odstavce 1 svrchu s tím rozdílem, že pro PCR byl jako negativní oligomer použit oligomer se sekvencí 5'-CCA-CAT GGA TCC GCC CGG GCC TTT ATT GTG ACG AGG GGT CGT TGC-3', řetězec č. 43.

5) VlJns-HIV_IIIB gag/RRE/IRES/REV (SD)

Také tento vektor byl připraven stejným způsobem jako svrchu uvedený vektor 4 s tím rozdílem, že pro PCR byl jako pozitivní oligomer použit oligomer se sekvencí 5^-GGT AGA GGA TCC ČCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG-3', řetězec č. 44.

6)

VUns-HIV_IIIB gag/RRE/IRES/REV .(w/o-myristoylace)

Tento vektor byl připraven stejným způsobem jako vektor 5 svrchu s tím rozdílem, že pro PCR byl jako pozitivní oligomer použit oligomer se sekvencí 5'-GGT ACA GGA TCC ACC ATG GCT GCG AGA GCG TCA GTA TTA AGC-3', řetězec č. 45.

B) VIJns-HIV nef

V tomto vektoru je použit gen nef z virového kmenu, representativního pro kmen za infikované populace, pozitivní a negativní oligomery pro PCR byly obdobné jako ty, které byly užity pro SIV nef.

C) pGEM-3-X-IRES-B7 (kde X je jakýkoliv gen s antigenním účinkem)

Aby bylo možno připravit konstrukci vakcíny se dvěma cistrony pro koordinovanou expresi kódového genu pro imunogen a kódového genu pro imunostimulační bílkovinu, byl gen B7 myši amplifikován pomocí PCR v buněčné linii CH1 lymfomu B, získané z ATCC. B7 náleží do skupiny bílkovin, při jejichž použití dochází k pomocné stimulaci T-buněk při současném použití antigenů v důsledku histokompatibilních komplexů I a II. Buněčná linie CH1 je dobrým zdrojem mRNA B7 vzhledem k tomu, že jde o fenotyp, který může být konstitutivně aktivován a k expresi B7 dochází primárně buňkami, aktivovanými antigenem, jako jsou B-buňky a makrofágy. Tyto buňky byly dále stimulovány in vitro při použití cAMP nebo IL-4 a mRNA byla připravena běžným způsobem při použití guanidiniumthiokyanátu. Syntéza cDNA byla uskutečněna při použití této mRNA a sestavy pro PCR, GeneAmp RNA (Perkin-Elmer Cetus) a oligomeru se sekvencí 5'-GTA CCT CAT GAG CCA CAT AAT ACC ATG-3', (řetězec č. 46), specifickou pro B7 proti směru exprese od otevřeného čtecího rámce pro 37. Pák byla uskutečněna PCR-amplifikace B7 při použiti následujících pozitivních a nega tivních oligonerů: 5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG GCT TGC AAT TGT CAG TTG ATG C-3', řetězec č. 47 a 5'-CCA CAT AGA TCT CCA TGG GAA CTA AAG GAA GAC GGT CTG TTC-3', řetězec č. 48. Tyto oligomery mají místo působení BglII na obou koncích a Kozákovu sekvenci pro počátek translace s místem působení Ncol a mimoto další místo působení Ncol, uložena bezprostředně před 3'-terminálním místem působení BglII. Po rozštěpení enzymem Ncol se získá fragment, vhodný pro klonování v pGEM-3-IRES po jeho rozštěpení enzymem Ncol. Výsledný vektor, pGEM-3-IRES-B7 obsahuje kazetu IRES-B7, kterou je snadno možno přenést do vektoru VIJns-X, kde X znamená kódový gen pro antigen.

D) pGEM-3-X-IRES-GM-CSF (kde X znamená jakýkoliv kódový gen pro antigen)

Tento vektor obsahuje analogickou kazetu jako v odstavci C s tím rozdílem, že se místo B7 užije gen pro imunostimulační cytokin, GM-CSF. GM-CSF je cytokin pro diferenciaci a stimulaci makrofágů, u nějž bylo prokázáno, že vyvolává silnou tvorbu protinádorových T-buněk in vivo, jak bylo uvedeno v publikaci G- Dranoff a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 90, 3539, 1993.

E) pGEM-3-X-IRES-IL-12 (kde X znamená jakýkoliv kódový gen pro antigen)

Tento vektor obsahuje obdobnou kazetu jako vektor v odstavci C s tím rozdílem, že místo B7 byl užit gen pro imunostimulační cytokin IL-12. Bylo prokázáno, že IL-12 posunuje reakci imunitního systému směrem k buněčné reakci T-buněk na rozdíl od humorální odpovědi, jak bylo popsáno v L. Alfonso a další, Science, 263, 235, 1994.

F) VlJns-HIV_x gp!60/IRES/rev_IIIB (SD)

Tento vektor je analogický vektoru, který byl popsán v odstavci I.B svrchu s tím rozdílem, že se místo gp!60, odvozeného od laboratorního kmene IIIB užijí geny gp!6O, odvozené od různých klinických kmenů.

G) VlJns-PR8/34/HA-IRES-SIVp28 gag

Tato konstrukce obsahuje hemaglutinační gen chřipkového viru HA spolu s genem SIV p28 gag pro koordinační expresi přes prvek IRES. Gen PR8/34/HA byl podroben PCR-amplifikaci při použití těchto pozitivních a negativních oligomerů: 5'-GGT ACA AGA TCT ACC ATG AAG GCA AAC CTA CTG GTC CTG-3', řetězec č. 49 a 5'-CCA CAT AGA TCT GAT ATC CTA ATC TCA GAT GCA TAT TCT GCA CTG C-3', řetězec č. 50. Výsledný segment DNA má místa působení restrikčního enzymu BglII na každém konci a místo působení EcoRV na 3 -zakončení. Po roz štěpení enzymem BglII byl tento gen klonován ve vektoru VIJns po jeho rozštěpení enzymem BglII a po zpracování alka lickou fosfatázou. Pak byl SIV p28 gag vyštěpen z vektoru V1J-SIV p28 gag při použití enzymů Ncol a BglII. Vektor pGEM-IRES byl rozštěpen enzymy Ncol a BamHI pro vazbu s p28 gag/NcoI/BfIII. Kazeta IRES-p28 gag se odstraní rozštěpením restrikčními enzymy Srna! a HindlI a uloží se do místa působení EcoRV vektoru VlJns-A/PR8/HA. Koordinovaná exprese těchto genů in vivo dovoluje vyvolání silné tvorby protilátek při vakcinaci s použitím PNV (HA), současně se tvoří T-buňky, které napomáhají v příslušném prostředí potenciaci CTL-reakce, vyvolané produktem druhého genu (SIV p28 gag). Tato konstrukce rovněž prokazuje možnost použití PNV a způsobu podle vynálezu pro vyvolání reakce imunitního systému proti několika antigenům, které mohou ale nemusí pocházet z HIV. Je zřejmé, že tento typ konstrukce je možno mísit s dalšími konstrukcemi s obsahem dvou nebo tří cistronů za vzniku multivalentní kombinační polynukleotidové vakcíny.

H) VlJns-tPA-gpl60_IIIB/IRES/SIV p28 gag

Vektor VlJns-tPA-gpl60_IIIB byl rozštěpen enzymem EcoRV, zpracován působením alkalické fosfatázy z telecích střev a navázán na IRES-SIV p28 gag, vyjmutý z plasmidů pGEM-3-IRES-SIV p28 rozštěpením restrikčními enzymy Smál a HindlI. Koordinovaná exprese těchto genů in vivo dovoluje současně využití bílkoviny, která dává vznik tvorbě pomocných T-buněk, gpl6O a bílkoviny, která vyvolává tvorbu CTL epitopů skupiny I MHC (SIV p28 gag). Tato vakcina je určena pro imunizaci opic rhesus pro vyvolání tvorby neutralizačních protilátek proti env a CTL, stejně jako CTL proti SIV gag. Opice, jimž byla podána tato vakcina, byly pak uvedeny do styku s příslušnými viry SHIV podle J. Li a další, J. A.I.D.S. 5,

639 - 646, 1992.

I) VlJns-tPA-gpl20_IIIB/IRES/SIV p28 gag

Tento vektor byl zkonstruován stejným způsobem jako vektor z předchozího odstavce s tím rozdílme, že místo genu pro gpl6O byl užit vektor VlJns-tPA-gpl20_IIIB. Také tento vektor byl použit k očkování a pokusná zvířata pak byla uvedena do styku s SHIV.

J) VlJňs-tPA-gpl2O_IIIB/IRES/HIV gag/IRES/rev

Tento vektor je obdobný svrchu uvedeným vektorům s tím rozdílem, že obsahuje tři cistrony, takže kromě gpl20 dochází k expresi gag a rev.

K) VlJns-tPA-gpl60_IIIB/IRES/HIV gag/IRES/rev

Tento vektor je obdobný svrchu uvedeným vektorům s tím rozdíkem, že obsahuje tři cistrony a kromě exprese gpl2O je možno dosáhnout exprese gag a rev.

Příklad 6

Zkouška na T-lymfocyty, cytotoxické pro HIV

Dále budou popsány zkoušky, použité pro očkované myši. Obdobné zkoušky je možno uskutečnit také u primátů s tím rozdílem, že je zapotřebí pro každého živočicha vytvořit autologní linie B-buněk jako cílových buněk. To je možno uskutečnit u člověka při použití viru Epstein-Barr a pro opice rhesus při· použití viru oparu B.

Z čerstvě odebrané periferní krve nebo ze sleziny se získají mononukleární buňky PBMC při použití odstředění (Ficoll-Hypaque) pro oddělení červených krvinek od bílých krvinek. U myší je možno použít také lymfatické uzliny.

CTL je možno připravit z PBMC pěstováním in vitro v přítomnosti IL-2 v množství 20 jednotek/ml a konkavalinu A v množství 2 mikrogramy/ml po dobu 6 až 12 dnů nebo při použit specifického antigenu tak, že se užije stejné množství ozářených buněk, obsahujících antigen. Tímto specifickým antigenem může být syntetický peptid, obvykle obsahující 9 až 15 zbytků aminokyselin, takové peptidy jsou známé pro rozpoznání CTL v případě MHC haplotypu použitých živočichů, nebo je možno použít konstrukce viru vaccinia, konstruované tak, aby došlo k expresi příslušného antigenu. Cílovými buňkami mohou být buď syngenické buněčné linie nebo linie, odpovídající MHC haplotypu a zpracované tak, aby obsahovaly příslušný antigen, jak bylo popsáno pro stimulaci CTL in vitro. V případě myší Balb/c je možno použít P18 peptid ArglleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyrThrThrLysAsn, řetězec č.

v případě kmene HIV MN v koncentraci 10 mikromol k restimulaci CTL in vitro s použitím ozářených syngenních slezinných buněk, je také možno sensitizovat cílové buňky při zkoušce na cytotoxicitu při použití množství 1 až 10 mikromol při inkubaci při teplotě 37 °C přibližně 2 hodiny před pokusem. Pro tyto myši s H-2^d MHC jsou dobrými cílovými buňkami buňky buněčné linie myšího mastocytomu P815. Cílové „ 51 buňky, sensitizovane antigenem se uvedou do styku s Na CrO^, který se zvolní z cílových buněk po jejich usmrcení působením CTL, začlenění radioaktivní látky se uskuteční inkubací buněk po dobu 1 až 2 hodiny při teplotě 37 °C, užije se množštvi 0,2 mCi na přibližně 5 x 10 buněk, pak se buněčný materiál několikrát promyje. Pak se CTL smísí s těmito cílovými buňkami v různém poměru efektorových buněk k cílovým buňkám, například 100 : 1, 50 : 1, 25 : 1 a podobně, buněčný matriál se společně peletuje a pak inkubuje 4 až 6 hodin při teplotě 37 °C, načež se supernatant podrobí zkouškám na přítomnost radioaktivní látky při použití počítače gamma-záření. Cytotoxicita se vypočítává jako celkové množství impulsů z cílových buněk (po působení 0,2% Tritonu X-100), od tohoto množství se odečte množství, spontánně uvolněné z cílových buněk.

Příklad 7

Zkouška na protilátky, specifické proti HIV

Byly navrženy zkoušky ELISA pro zjištění protilátek proti HIV při použití specifických rekombinantních bílkovin nebo syntetických peptidů jako antigenu. Mikrotitrační plotny s 96 vyhloubeními byly opatřeny inkubací přes noc při teplotě 4 °C povlakem rekombiantního antigenu, který byl užit v množství 2 mikrogram/ml v PBS (fyziologický roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem) v množství 50 mikrolitrů/vyhloubení při uložení plotny na výkyvnou desku k mírnému promíchávání obsahu. Jako antigen byl použit rekombinantní antigen (gpl20, Repligen Corp., gpl60, gp41: American Bio-Technologies, lne.) nebo syntetický peptid (peptid V3, odpovídající sekvenci izolátu viru IIIB, American Bio-Technologie lne., nebo epitop gp41 pro monoklonální protilátku 2F5). Plotny byly čtyřikrát omyty pufrem pro omývání (PBS/ /0,05 % Tween 20) a pak byl přidán pufr pro blokování v množství 200 mikrolitrů/vyhloubení, 1% roztok mléka Carnation v PBS/0,05 % Tween-20) a směs byla inkubována 1 hodinu při teplotě místnosti na výkyvné desce. Sérum, odebrané před pokusem a imunní sérum bylo zředěno pufrem pro blokování . do požadovaného zředění a bylo přidáno vždy 100 mikrolitrů příslušného ředění do každého vyhloubení. Plotny byly inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti na výkyvné desce a pak byly čtyřikrát omyty omývacím pufrem. Pak byla ke každému vzorku přidána sekundární protilátka, konjugovaná s peroxidázou z křenu (proti Ig rhesus, Southern Biotechnology Associates, nebo proti Ig myši nebo králíka, Jackson Immuno Research) v ředění 1 : 2000 v pufru pro blokování a v množství 100 mikrolitr/vyhloubení a směs byla znovu inkubována 1 hodinu při teplotě místnosti na výkyvné desce. Pak byly plotny čtyřikrát omyty omývacím pufrem a pak vyvíjeny přidáním roztoku o-fenyldiaminu (o-PD, Calbiochem) v množství mg/ml ve 100 mM citrátovém pufru o pH 4,5, do každého vyhloubení bylo přidáno 100 mikrolitrů roztoku. Plotny pak byly odečítány ke zjištění absorbance při 450 nm, a to nejprve kontinuálně prvních 10 minut a pak byl proveden další odečet po 30 minutách odečítacím zařízením (Thermomax microplate reader, Molecular Devices).

Příklad 8

Zkouška na neutralizeční protilátky proti HIV

Neutralizace HIV izolátů in vitro při použití sér z očkovaných zvířat byla uskutečněna následujícím způsobem. Séra, odebraná před pokusem a zkušební séra byla inaktivována 60 minut při teplotě 56 °C před použitím. Pak bylo přidáno titrované množství HIV-1 v sériovém ředění zkoumaných sér 1:2, pak byla séra inkubována 16 minut při teplotě místnosti, načež bylo přidáno 10 lidských lymfoidních buněk MT-4 v mikrotitrační plotně s 96 vyhloubeními. Směsi viru a buněk byly inkubovány 7 dnů při teplotě 37 °C a pak ,bylo vyhodnoceno uhynutí buněk působením viru zbarvením kultur tetrazoylovou barvou. Neutralizaci viru je možno prokázat na základě prevence uhynutí buněk.

Příklad 9

Ochrana šimpanzů proti virulentnímu HIV-1

Až dosud je jediným modelem pro skutečnou infekci šimpanz. U šimpanzů se sice nevyvíjí po infekci HIV syndrom imunodeficience, je však možno je infikovat izoláty HIV. Kmenem, který je nejěastěji používán, je kmen IIIB (BH10), přesto že jsou vyvíjeny postupy i pro jiné izoláty, například SF2. Vakcinaci šimpanzů je možno uskutečnit analogickým způsobem jako vakcinaci jiných primátů, odlišných při použití HIV konstrukcí env a gag-pol, odvozených od kmene HIV-1 IIIB (HXB2 klon), jak již bylo popsáno tak, aby bylo dosaženo humorální i buněčné reakce proti HIV. Virus pro pokusnou infekci šimpanzů je kmen IIIB, který byl po užit také v konstrukcích pro očkování, avšak tento virus je heterogenní, takže HXB2 je pouze jednou z nejméně tří variací kmene IIIB, přítomných ve viru. To znamená, že při očkování s použitím genu HXB2 kmene IIIB neběží o zcela homologní vakcínu.

Šimpanzy byli očkováni 3 až 5x při použití polynukleo tidové vakcíny s obsahem genu HIV, bylo použito 0,1 až 3 mg materiálu na jedno očkování. Po ověření humorální reakce a reakce CTL proti HIV po podání vakcíny se těmto opicím podá 10 až 140 CID_5Q (infekční dávka pro 50 % šimpanzů) nitrožilním podáním HIV-I_IIIB v ředění 1 : 25 ve fyziologickém roztoku. Očkovací materiál se ředí těsně před použitím. Infekce šimpanzů se sleduje detekcí specifických sekvencí DNA pro virus HIV-1 při použití DNA, odvozené z PBMC, získaných od pokusných šimpanzů, podrobnosti jsou uvedeny v příkladu 10. Ochranu po podání vakcíny je možno popsat jako různé reakce na styk s virem od úplné sterilizační imu nity (nemožnost prokázat virus po infekci) až k podstatnému snížení a/nebo opoždění průkazu viru v krevním oběhu po sty ku s virem. Je zřejmé, že sterilizační imunita je po vakcinaci nejvýhodnější, avšak i snížení nebo opoždění možného průkazu viru v krevním oběhu může významně posunout dobu vzniku imunodeficience u očkovaných lidí.

Příklad 10

Izolace genů z klinických izolátů HIV

Geny viru HIV byly klonovány z infikovaných PBMC, aktivovaných působením ConA. Výhodným postupem pro získání virových genů bylo PCR-amplifikace z infikovaného buněčného genomu při použití specifických oligomerů, ohraničujících požadované geny. Druhým postupem pro získání virových genů bylo čištění virové RNA ze supernatantu infikovaných buněk a příprava cDNA z tohoto materiálu s následným provedením PCR. Tento postup je obdobný postupu, který byl popsán svrchu pro klonování myšího genu B7 až na užité PCR-oligomery a hexamery, použité při přípravě cDNA místo specifických oligomerů.

DNA genomu byla čištěna z usazeniny infikovaných buněk jejich rozrušením v roztoku STE (10 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0) s přidáním 0,1 mg/ml proteinázy K a 0,5 % SDS. Směs byla inkubována přes noc při 56 °C a pak byla extrahována polovinou svého objemu při použití směsi fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu 25 : 24 : 1. Vodná fáze byla vysrážena přidáním octanu sodného do konečné koncentrace 0,3 M a dvou objemů chladného ethanolu. Po usazení DNA z roztoku byla DNA znovu uvedena do suspenze v 0,1 x TE roztok (1 x TE = 10 mM Tris-HCl o pH 8,0 a 1 mM EDTA). Pak se přidá SDS do koncentrace 0,1 % s 2 jednotkami ribonukleázy A, načež se směs inkubuje 30 minut při teplotě 37 °C. Roztok se extrahuje směsí fenolu, chloroformu a isoamylalkoholu a materiál se pak sráží ethanolem jako svrchu. DNA se uvede do suspenze v 0,1 x TE a její množství se stanoví na základě absorpce ultrafialovéhn světla při 260 nm. Vzorky se uloží při -20 °C až do použití pro PCR.

PCR se provádí při použití se stavy (Perkin-Elmer C,etus) a při využití následujících pozitivních a negativních oligomerů pro gpl6O: 5 -GA AAG AGC AGA AGA CAG TGG CAA TGA-3*, řetězec č. 52 a 5*-GGG CTT TGC TAA ATG GGT GGC AAG TGG· CCC GGG C ATG TGG-3*, řetězec č. 53. Tyto oligomery přidávají místo působení enzymu Srfl na 3*-zakončení výsledného fragmentu DNA. Segmenty, získané pomocí PCR se klonují ve vektorech pro vakcinaci VIJns nebo VIR a oblast V3 a místa spojení se ověří analýzou sekvence DNA.

Příklad 11

Sekvence míst spojení v konstrukci vakcíny

Geny byly klonovány způsobem podle příkladu 10. V každém případě byla analýza spojovacích sekvencí z 5 -promotorové oblasti (CMVintA) do klonovaného genu analyzována při použití primeru CMVintA s následující sekvencí: 5 -CTA ACA GAC TGT TCC TTT CCA TG-3*, řetězec č. 54, čímž vzniká kódová sekvence. Spojení terminátoru a kódové sekvence je rovněž znázorněna. Tato sekvence se vytvoří při použití primeru BGH se sekvenci 5 —GGA GTG GCA CCT TCC AGG—3 , retezec c·

55. Tímto způsobem vzniká sekvence nekódového řetězce. V každém případě se sekvence ověří srovnáním se známou sekvencí (Genbank) z uvedených i jiných izolátů HIV. Poloha spojení je označena toto označení neznamená jakékoliv přerušení sekvence. První kodon ATG v každé sekvenci je kodon pro počátek translace příslušného klonovaného genu.

Každá sekvence představuje úplnou konstrukci DNA pro označený gen HIV, schopnou exprese. Názvosloví bylo užito podle úmluvy název vektoru-kmen HlV-gen. Biologická účinnost těchto konstrukcí byla prokazována stejným způsobem jako v předchozích příkladech.

Sekvence v 5'-spojení CMVintA a genů HIV a ve 3 -spojení genů HIV a terminátoru BGH v konstrukcích pro expresi při použití různých kmenů HIV a různých bílkovin

1. VT.Ins-rgyTJIB:

řetězec č. 56

5'-GGA GAC AGC GACGAA GAC CTC CTC AAG GCA GTC AGA CTC ATC AAG-?’ řev....

Sekvence začíná na 5 -konci PCR oligomeru, dále ve vektoru 7 je uvedena úplná sekvence 5'-zakončení rev.

řetězec č. 57

5'-GAT GGC TGG GAA CTA GAA GGC AGA GCA GAT CT/ GAT ATC GCA CTA

BGH rzv...

TTC TTT AGC TCC TGA CTC CAA TAT TGT-3'

2. VI Jns-gol 6QTHB:

řetězec č. 58

5’-CTT AGA TG A ACC ATG AGA GTG .AAG GA GAA ATA TCA GCA CTT GTG

CMVinta gpl60

GAG ATG GGG GTG GAG ATG GGG GAC CAT GCT CCTTGG GAT GTT GAT GAT CTG TAG TGC TAC AGA AAA ATT GTG GGT-3’ řetězec č. 59

5'-CTG GGA ACT AGA AGG CAC AGC AGA TG A GAT AGT GTC CCC ATC TTA BGH gpl60

TAG CAA AAT CCT TTC GAA GCC CTG TCT TAT TCT-3’

ΓΠ . dGEM-3-IRES: p’rimery SP6 (5 -GAT TTA GGT GAC ACT

ATA G-3', ret. č. 6oa.· T7 (5ΥΓΑΑ TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’ (Promega Biotech) byly·užity pro analýzu sekvence)

Řetězec č. 62

5'-CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA/ AAT TCC G...

pGEM-3 (SP6) IRES

Řetězec č. 63

5’-A CCC GGG GAT CCT CT/ A GCG CGC TTG TCT CTT GTT CCA...

pGEM-3 (T7) IRES

4. pGEM-3-XRES/reVjjjg: (analýza řetězce se provádí při použití primeru T7 (Promega) pro 3'-zakončení rev a IRES 3'-oligomerů se sekvencí 5'-GG GAC GTG GTT TTC C-3', řetězec č. 64 pro spojení IRES/rev).

Řetězec Č. 65

5-TAT GGC GAC AAC CZ AT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA

IRES rev

CCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT -3'

Řetězec č. 66

5’-CTC GAG CCA TGG GCC CCT/ AGA CTA TAG CGT GAT AAG AAA TCG AGG pGEM-3 rev

ÁCT GAG GTT ATA ACA TCC TCT AAG GTG GTT ATA AAC TCC CGA AGG-3’

PGEM-3-RRE/IRES/rev :

při použití oligomerů SP6 (Promega) pro analýzu řetězce a IRES'5'-oligomerů 5'-G CTT CGG CCA GTA ACG-3', řetězec č. 67.

Řetězec č. 68

5-TTG CAT GCCTGC AGG T/ GGT ACA TGA TCA GAT ATC G CCC GGG / C pGEM-3 RRE

CGA GAT CTT CAG ACTTGG AGG AGG AGA TAT GAG GGA CAA TTG GAG-?'

IRES-5’

Řetězec S. 69

5-GGG GCG GAA TT/T AGA GTC A/ ATT GAT CAG CTT GTG TAA TTG TTA

RRE-3*

ATT TCT CTG TCC CAC TCC ATC CAG GTC GTG TGA TTC...-3'

6. VlJns-(tat/rev SD): Použit pro VlJns-gpl60jjjg/IRES/rev, (SD) a pro VlJns-gplSO^(SD), analýza řetězce byla provedena při použití oligomeru, komplementárního k gpl6O smesměrem k 5'-konci gplSO a do CMVintA: 5*-CCA TCT CCA CAA ' GTG CTG-3*, řetězec c. 70.

Řetězec č. 71

5-AGA TCT A AGG ACG GTG ACT GCA / TGT ACT ACT TAC TGC TTT GAT

CMVintA taí/rev SD

AGA GGA CGG TGA / CTG CAG AAA AGA CCC ATG GAA A-?'

CMVintA

7. VlJns-gplSO-j.j.jg/IRES/reVjjjg (SD):. analýze sekvence místa spojení gp!60/IRES byla provedena při použití IRES 5'-oligomeru, 5*-G CTT CGG CCA GTA ACG-3', řetězec c. 72.

Řetězec č. 73

5-GGC ACA GCA GAT C/ AG ATG GGG ATC TGA TA TCG CACTATTCTTTA

BGH rev

GCT CCT GAC TCC TGA CTC-3’

Řetězec č. 74

5‘-GGA ATT/ TGA GTC ATC / CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCTTTC CAA

IRES gplóO

S. VI.Ins-ggp-grrmK7SP1:

Řetězec č. 75

5’-CTT AGA TC/ C CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG GCG GCG ACT GGT-3’

CMVintA gag (SD)

Řetězec č. 76

5'-GGC ACA GCA GAT Ol CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC

BGH prt

TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC...-3'

9. Vl,Ins»ggg-grfHTB:

Řetězec č. 77

5’-CTT AGA TC/ CÁC CAT CGG TCC GAC ACC GTC AGT ATT AA GCG GGG

CMVintA gag

GGA GAA TTA GAT CGA TGG GAA AAA ATT...-3’

Řetězec č. 78

5'-GGC ACA GCA GAT CZ CGC CCG GGC TTA CAT CTC TGT ACA AAT TTC TAC

BGH prt

TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC...-3’

10. Vl.Ins-tPA:

Řetězec č. 79

5-TCA CCG TCC TTA GAT C/ ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTCTGC CMVintA vedoucí řetězec tPA

TGT GTG CTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA/ G ATC

BGH

TGC TGT GCC TTC TAG TTG CCA GCC-3' · VUns-tPA-gpl2fl.MN:

Řetězec č. 80

5’-TTC GTT TCG CCC AGC GA/ TCA CAG AAA AAT TGT GGG TCA CAG TC-3' tPA gpl20MN

Řetězec č. 81

5'-GGC ACA GCA GAT C/ CAC GTG TTA GCG CTT TTC TCT CTC CAC CAC-3’

BGH gpl20MN

12. V1J-STVMAC25T tt2S.g^g

Řetězec Č. 82

5’-TCA CCG TCC TTA GAT CT/ ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GGT

CMVintA p28 gag...

GGT AAC TAT GTC CAC CTG CCA TTA AGC CCG AGA ACA-3'

Řetězec č. 83

5'-GGC ACA GCA GAT CT/TTA CATTAA TCT AGC GTT CTG TCC CGG TCC-3' BGH p28 gag

13. VUrSTVMA.C25tag£

Řetězec č. 84

5-TCA CCG TCC TTA GAT C/ GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ΑΠ TCC á í

CMVintA nef.....

AGG CAA TCC AAG CCG GCT GGA GAT CTG ACA GAA A-3’

Řetězec č. 85

5'-GGC ACA GCA GAT CA/ C CTA GGTTAG CCT TCT TCT AAC CTC TTC CTC

BGH nef....

TGA CAG GCC TGA CTT GCT TCC AAC TCT TCT GGG TAT CTA G-3’

14. VI Jns-fzzf/rgv/g/zv:

Řetězec č. 86

5'-ACC GTC CTT AGA T/ TC GAC ATA GCA GAA TAG GCG TTA CTC GAC AGA

CMVintA tatí rev! env

GGA GAG CAA GAA ATG GAG CCA GTA GAT CCT AGA CTA GAG CCC TGG»

Řetězec č. 87

5’-GGC ACA GCA GAT C/ C GAG ATG CTG CTC CCA CCC CAT CTG CTC-T

BGH tatí rev! env

Příklad 12

Zkoušky na proliferaci T-buněk

PBMC je možno získat způsobem, který byl popsán svrchu v příkladu 6 a pak je možno sledovat reakce na specifický antigen podle proliferace buněk PBMC. Proliferace se sleduje při použití H-thymidinu, který se přidá k buněčným kulturám posledních 18 až 24 hodin inkubace před izolací buněk. V zařízení na oddělení buněk se zadrží DNA s obsahem isotopů na filtrech v případě, že došlo k proliferaci, buňky v klidovém stavu nezařadí isotop do svého metabolismu, takže se na filtru nezadrží. Pro hlodavce i primáty se uloží 4 x 10 buněk do ploten s 96 vyhloubeními v celkovém množství 200 mikrolitrů v úplném prostředí RPMI s 10 % fetálního telecího séra. Základní proliferační odpovědi se stanoví při použití PBMC a samotného prostředí, nespecifické odpovědi se získají při použití lektinů, jako fytohemaglutininu PHA nebo konkanavalinu A ConA v množství 1 až 5 mikrogramů/ml, jde o positivní kontroly. Specifický antigen je tvořen známým peptidovým epitopem, čištěnou bílkovinou nebo inaktivovaným virem. Koncentrace antigenu jsou v rozmezí 1 až 10 mikromol pro peptidy a 1 až 10 mikrogram/ml pro bílkoviny. Vrcholy, získané při použití lektinu jsou dosaženy po 3 až 5 dnech inkubace buněčné kultury, k vrcholu specifické odpovědi na antigen dochází až po 5 až 7 dnech. Ke specifické proliferaci dochází v případě, že počet impulsů, který se získá po aplikaci antigenu je nejméně trojnásobný ve srovnání se základním počtem impulsů a často se udává jako poměr k základnímu počtu impulsů, což se označuje jako stimulační index SI. Je známo, že gpl60 HIV obsahuje několik peptidů, které mohou způsobit proliferaci T-buněk u jednotlivců, imunizovaných nebo infikovaných gpl6O/gpl2O HIV. Nejúživěnšjči z těchto peptidů jsou peptid TI: LysGlnllelleAsnMetTrpGlnGluValGlyLysAlaMet TyrAla, řetězec· č. 88, T2: HisGluAspIlelleSerLeuTrpAspGln SerLeuLys, řetězec č. 89 a TH4: AspArgValIleGluValValGlnGly AlaTyrArgAlalleArg, řetězec č. 90. Bylo prokázáno, že tyto peptidy stimulují proliferaci PBMC u myší, primátů, odlišných od člověka a také u lidí, sensitisovaných stykem s antigenem. ' .

Základní postupy pro tyto zkoušky jsou uvedeny v následujících publikacích.

L. Arthur a další, J. Virol., 63, 5046, 1989, (model s použitím^- chimp/HIV, zkouška na neutralizaci viru)

T. Maniatis a další, Molec. cloning: a lab. manual, str.

280, Cold Spring Harbor Lab., CSH, NY, 1982 (čištění DNA genomu).

E. Emini a další, J. Virol., 64, 3674, 1990 (uvedení do styku s antigenem, zkouška na neutralizaci).

Příklad 13

Příprava vektoru VIR

Aby bylo možno optimalizovat základní vektor pro očko vání, byl připraven derivát VIJns, který byl označen VIR. Účelem této konstrukce bylo získat vektor pro očkování s co nejmenším rozměrem, to znamená bez sekvencí DNA, které , nejsou nezbytné tak, aby si vektor stále ještě uchovával optimalizovanou expresi heterologního genu a vysoký výtěžek plasmidu, tak jak je toho možno dosáhnout při použití vektoru VIJ a VIJns. Z literatury a také prováděním různých pokusů bylo zjištěno,že 1) mohou být odstraněny ze základní struktury pUC ty oblasti, které zahrnují počátek replikace E. coli, aniž by byl ovlivněn výtěžek plasmidu z bakterií,

2) je možno odstranit 3 -oblast genu kan za otevřeným čtecím rámcem kanamycinu v případě, že se do této polohy uloží bakteriální terminátor a 3) je možno odstranit skupinu přibližně 300 bp z 3'-poloviny terminátoru BGH, aniž by došlo k nepříznivému ovlivnění jeho řídící funkce (za původním místem působení enzymu KpnI v prvku BGH) .

Vektor VIR byl zkonstruován při použití PCR k syntetizaci tří segmentů DNA vektoru VIJns, představujících CMVintA promotor/BGH terminátor, počátek replikace a prvky pro odolnost proti kanamycinu. Pak byla do každého segmentu uložena jediná místa působení restrikčních enzymů při použití PCR-oligomerů, a to místo působení SspI a Xhol pro CMVintA/BGH, místo působení EcoRV a BamHI pro gen kan^r a Bell a Sáli pro ori . Tato místa působení byla zvolena z toho důvodu, že dovolují přímou vazbu každého ze segmentů DNA, získaných pomocí PCR za současné ztráty tohoto místa.

Z míst působení EcoRV a SspI zůstanou vyplněná zakončení DNA, kompatibilní pro další vazbu, kdežto po místech působení BamHI a Bell zůstanou komplementární přečnívající zakončení, stejně jako po místech působení enzymu Sáli a Xhol.

Po získání těchto segmentů pomocí PCR se každý segment rozštěpí příslušným restrikčním enzymem, uvedeným svrchu a pak se fragmenty spolu spojí v jediné reakční směsi, obsahující všechny tři segmenty DNA. 5'-konec ori^r je konstruován tak, že zahrnuje nezávislou sekvenci terminátoru T2 rho, obvykle se nacházející v této oblasti, takže může dojít k terminaČní informaci pro gen pro odolnost proti kanamycinu. Struktura ' produktu vazby byla potvrzena rozštěpením při použití více než osmi enzymů a byla také provedena analýze sekvence DNA v místech spojení. Bylo dosaženo obdobných výtěžků DNA plasmidu a obdobné heterologní exprese jako v případě použití vektoru VIJns. Čisté snížení rozměru vektoru bylo o 1346 bp (VIJns = 4,86 kb, VIR = 3,52 kb), jak je zřejmé z obr. 11, řetězec č. 45.

K syntéze vektoru VIR byly užity PCR-oligomery (místa působení restrikčních enzymů jsou v následující sekvenci podrtžena a příslušný enzym je za sekvencí uveden v závorkách) .

(1) 5’-GGT ACA AAT AH GG CTA TTG GCC ATT GCA TAC G-3' [Sspl], řetězec č. 91:

(2) 5’-CCA CAT CTC GAG GAA CCG GGT CAA TTC TTC AGC ACC-3' [Xhol], řetězec S. 92:

(proCMVintA/BGH segment) (3) 5’-GGT ACA GAT ATC GGA AAG CCA CGT TGT GTC TCA AAA TC3'[EcoRV], řetězec č. 93:

(4) 5'-CCA CAT GGA TCC G TAA TGC TCT GCC AGT GTT ACA ACC-3’ [BamHI], řetězec S. 94 (pro segmentu genu pro odolnost proti kanamycinu) (5) 5'-GGT ACA TGA TCA CGT AGA AAA GAT CAA AGG ATC TTC TTG3'[Bcil], řetězec č.95:

(6) 5’-CCA CAT GTC GAC CC GTA AAA AGG CCG CGT TGC TGG-3' [Sall], řetězec č. 96:

(pro počátek replikace E·. coli)

Analýza sekvence spojení byla pro VIR provedena při použití následujících oligomerů:

5’-GAG CCA ATA TAA ATG TAC-3’, řet .č. 97: [CMVintA/kan^rspojení)

5’-CAA TAG CAG GCA TGC-3’, řet.č. 98 BGH/ori spojení).

5’-G CAA GCA GCA GAT TAC-3', řet.č. 99 [ori/kan^r spojení).

Příklad 14

Geny HIV, které jsou patrně nejdůležitější pro konstrukci PNV, jsou env a gag. Jak env, tak gag vyžaduje přítomnost řídící bílkoviny HIV, rev pro expresi. Vzhledem k tomu, že exprese produktů těchto genů je pro funkci PNV podstatná, byly podrobeny zkouškám dva typy vektorů pro vakcinaci, a to závislé a nezávislé na rev. Pokud není uvedeno jinak, byly všechny použité geny odvozeny od laboratorního izolátu kmene IIIB HIV-1.

A. Gen env

V závislosti na tom, jak velký segment genu je použit, je možno dosáhnout účinnosti exprese tohoto genu, nezávislé na rev -tak, že se nativní vedoucí peptid env nahradí vedoucím peptidem genu specifického tkáňového aktivátoru plasminogenu, tPA a dosáhne se exprese výsledného chimérního genu za CMV promotorem s CMV intronem A. Jako příklad vektoru pro vylučovaný gpl2O je možno uvést takto zkonstruovaný vektor VlJns-tPA-gpl20, při jehož použití je možno dosáhnout u očkovaných myší a opic reakce imunitního systému proti antigenů gpl2O.

Uveřejněné zprávy prokazují, že bílkoviny, spojené s membránou, mohou vyvolat daleko vyšší tvorbu protilátek ve srovnání s vylučovanými bílkovinami. Mimoto mohou bílkoviny, spojené s membránou, vyvolat také tvorbu protilátek proti dalším epitopům. Aby bylo možno tento předpoklad ověřit, byly zkounstruovány vektory VlJns-tPA-gpl6O a VlJns-rev/env. Vektor s obsahem tPA-gpl60 vedl k produkci prokazatelného množství gplSO a gpl2O bez přidání rev, jak bylo ‘ prokázáno imunoblotovou analýzou buněk RD po jejich transfekci in vitro, přestože tato exprese byla daleko nižší než v případě vektoru s obsahem rev/env, kde je exprese závislá na rev. Tato skutečnost může být způsobena inhibičními oblastmi, v jejichž přítomnosti se závislost transkriptu gpl6O projevuje· na mnoha místech gpl6O včetně COOH-zakončení gp41.

Vektory, které obsahují zkrácené formy tPA-gpl6O, tPA-gpl43 a tPA-gpl5O byly zkonstruovány pro zvýšení celkové exprese env vyřazením těchto inhibičních sekvencí.

Ve zkráceném vektoru gpl6O chybí nitrobuněčná oblast gp41 s úseky peptidů (například leu-leu), o nichž je známo, že v jejich přítomnosti se bílkoviny membrány váží spíše na lysosomy než na buněčný povrch. Z tohoto důvodu je možno očekávat, že přítomnost gpl43 a gpl5O zvýší transport bílkoviny k buněčnému povrchu ve srovnání s gpl6O s úplnou délkou.a z tohoto důvodu by uvedené bílkoviny měly vyvolávat vyšší tvorbu protilátek proti gpl6O po vakcinaci s použitím DNA.

Byla také vyvinuta kvantitativní zkouška ELISA pro expresi gpl6O/gpl2O v buňkách po transfekci, tak, aby bylo možno stanovit relativní schopnost exprese pro tyto vektory a také pro další vektor, spojující vlastnosti tPA-gp!6O a rev/env (vektor rev/tPA-gpl6O). Po transfekci buněk 293 in vitro s následným kvantitativním stanovením gpl2O, spojeného s buněčnou stěnou nebo uvolněného, byly získány následující výsledky:

1) Pro analogický pár plasmidů, rev/env a rev/tPA-gpl6O, nezvýšila náhrada nativního vedoucího peptidu v gpl6O vedoucí sekvencí tPA celkovou expresi gpl6O nebo množství vylučovaného gpl2O. Je tedy pravděpodobné, že • vedoucí peptid není příčinou neúčinného přesunu gpl6O směrem k povrchu buněk v těchto buňkách.

2) Při použití vektoru s obsahem tPA-gp!60 dochází k 5 až lOx nižší expresi gpl6O než při použití vektoru s obsahem rev/env·, přičemž obdobné podíly zůstávají uvnitř buňky nebo jsou transportovány směrem k povrchu.

3) Při použití vektoru tPA-gpl43 je možno dosáhnout 3 až 6x vyšší sekrece gpl2O než při použití vektoru s obsa hem rev/env při pouze malém množství gpl43, vázaného na buňky, což znamená, že cytoplasmatické zakončení gpl6O způ sobuje zadržení gpl6O uvnitř buněk, což je možno odstranit částečním vypuštěním této sekvence.

4) Při použití tPA-gpl50 bylo dosaženo pouze nízké exprese gpl6O jak do buněk, tak při vylučování produktu exprese do prostředí, takže jde o nestabilitu zkrácené bílkoviny nebo o méně vhodnou konstrukci.

Při použití tPA-gpl2O, odvozeného od primárního izolátu HIV a obsahujícího smyčku peptidu V3, fenotypy makrofágu, nevyvolávající tvorbu syncycia a tropický úsek makrofágu bylo možno dosáhnout vysoké exprese i sekrece gpl20 buňkami 293 po transfekci, což znamená, že došlo ke klonování ve funkční formě.

Příklad 15

Serologické zkoušky

A. Reakce typu protilátky

1. gpl2O PNV

Byl proveden pokus s intradermálním a nitrosvalovým očkováním myší při použití VlJns-tPA-gpl2O (100, 10, a 1 mikrogram, 3x). Bylo prokázáno, že při nižší dávce byla intradermální vakcinace výhodnější, avšak po třech dávkách byly výsledky pro oba typy očkování ekvivalentní.

Pro opice rhesus RHM a africké zelené opice AGM bylo provedeno očkování při použití vakcíny VlJns-tPA-gpl20 (MN) Vrcholy pro protilátky proti gpl20 se od sebe lišily více než pětinásobně mezi oběma druhy opic, 1780 (AGM) a 310 (RHM). Tyto výsledky prokazují, že u AGM je možno vyvolat tvorbu podstatně vyššího titru protilátek než u RHM a je tedy vakcinací těxhto opic možno dosáhnout vyšší neutralizační titry pro HIV.

2) gpl60 PNV

Při vakcinaci myší do svalů při použití VIJns-rev/env nebylo možno dosáhnout až do tří injekcí tvorby protilátek proti gpl6O, kdežto při intradermální vakcinaci bylo možno dosáhnout reakce po jediné injekci a množství protilátek bylo vyšší než po nitrosvalovém podání celkově (GMT = 2115 (ID) a 95 (IM) po podání 200 mikrogram/myš). Je pravděpodobné, že funkce konstrukcí, závislých na rev se lépe projevuje při podání ID.

U opic RHM po ID nebo IM očkování vakcínou VJlns-rev/env bylo dosaženo vrcholů GMT 790 a 140 po 4 až 5 dávkách, 2 mg/dávka. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky u myší a prokazují, že PNV, závislá na rev je účinnější pro tvorbu protilátek při očkování ID, pro konstrukci VlJns-tPA-gpl20, nezávislou na rev však nebylo možno tento výsledek potvrdit. V případě RHM po IM podání tPA-gpl60 DNA bylo možno prokázat pouze nižší a vyriabilnější tvorbu protilátek než u opic po podání rev/env, což potvrzuje zjiš tění, že exprese tohoto vektoru v případě gpl60 je 4 až 7x méně účinná než pro rev/env.

B. Neutralizace viru in vitro

Byla provedena zkouška na neutralizaci viru snížením jeho infekčnosti (produkce p24 gag) při použití kmene MN HIV jako zdroje viru (Quality Biologicals, lne., QBI). Při nízkém množství viru 100 TCID^q bylo možno pozorovat úplnou neutralizaci při ředění sér 1 : 10 pro všechna tři antiséra při snížení produkce viru o 80 až 90 % ve všech vzorcích až do ředění 1 : 80 ve srovnání s kontrolními séry. Avšak při vyšším množství viru 1000 TCIDj-θ již nebylo možno pozorovat neutralizaci v žádném vzorku.

U RHM byly provedeny zkoušky na neutralizaci kmene IIIB HIV (QBI) při použití 100 TCIDj-θ viru po vakcinaci DNA pro tPA-gpl20 kmene IIIB. Ve dvou různých pokusech bylo dosaženo nejlepších výsledků při ředění séra 10 (40 až 99% snížení p24 gag), přičemž snížení gag bylo v některých vzorcích možno pozorovat až do ředění 80x. Nejhomogennější vzorky měly konečné titry protilátek proti gpl20 při zkoušce ELISA nejméně 2000 až 3000.

Na RHM byly provedeny obdobným způsobem zkoušky na neutralizaci HIV IIIB (QBI) po očkování DNA pro rev/env.

Bylo možno pozorovat jen nízkou úroveň neutralizace. U dvou ze tří RHM bylo možno prokázat neutralizaci až 84 % při ředění séra 10, snížení p24 gag bylo možno pozorovat při ředění 20 nebo 40, v jednom ze vzorků nebylo možno neutralizaci vůbec prokázat. Tyto vzorky měly titr protilátek proti gpl20 při zkoušce ELISA 700 až 800, což je nejmenší použitelný titr pro séra pro vakcinaci DNA pro gpl60 při neutralizačních zkouškách.

C) Možnosti zvýšení imunity

Bylo provedeno několik pokusů na zkoušky s DNA plasmidu tak, aby bylo možno zvýšit příjem DNA po očkování a zvýšit expresi reporterového genu nebo imunitní reakci myší nebo opic. Uvádí se, že při použití roztoku DNA v hypertonické sacharosé až do koncentrace 20 až 25 % je možno dosáhnout uniformější distribuce příjmu DNA, jak je možno prokázat expresí reporterového genu a tento postup byl použit v pokusech, v nichž byla vyvolána tvorba specifických protilátek proti gpl60 u hlodavců a primátů, odlišných od člověka po vakcinaci plasmidem s obsahem rev/gpl60. Rovněž se uvádí, že anestetikum bupivikain v koncentraci 0,25 až 0,75 % podstatně zvyšuje imunitní reakci u myší i primátů po podání DNA vakcíny při použití před IM injekcí nebo současně s injekcí DNA, rozpuštěné v isotonickém roztoku chloridu sodného.

Počáteční pokusy s bupivikainem prokázaly, že po nitrosvalovém podání 0,5% roztoku došlo k uhynutí. Mortalita závisela na objemu použitého roztoku a také na tom, zda byla myším injekce podána pod vlivem anestetika. Při použití 0,1 ml anestetika bylo možno pozorovat nejvyšší počet uhynutí. Při našich pokusech byly užity 0,25% roztoky bez významnějšího uhynutí zvířat, a to před podáním nebo součas· ně s podáním PNV pro gpl20 nebo rev/env. Při předběžných pokusech, při nichž byl bupivikain podán před očkováním, nebylo možno pozorovat zvýšení imunitní reakce ve srovnání s reakcí u kontrolních myší, avšak v průběhu většího pokusu při podání do pokožky a do svalu nebylo možno pozorovat vze stup protilátek po jedné injekci a v některých případech bylo možno pozorovat pokles protilátek. Pokusy nebyly ještě dokončeny, v plánu je trojí opakování očkování.

V tomto pokusu se sahcarosou byla také ověřena řada podmínek, popsaných v literatuře. Byla zkoušena koncentra> ce sacharosy 10, 15, 20 a 25 % ve fyziologickém roztoku nebo PBS s obsahem 0,1 mg/ml plasmidu tPA-gpl20. Všechny vzor ky byly zkoušeny současně IM i ID až na 25% sacharosu/BPS, která byla podána 15 až 30 minut před IM injekcí DNA/PBS. Hodnoty ze séra, získané po prvním očkování neprokázaly zvý šení tvorby pro.tilátek.

Příklad 16

Reakce T-lymfocytů

A. Proliferace a sekrece cytokinu

T-lymfocyty ze zvířat, na něž bylo in vivo působeno antigenem, mohou proliferovat a vylučovat cytokiny při pěstování v buněčné kultuře in vitro po přidání tého antigenu. Reaktivní T-buňky obvykle mají omezený fenotyp CD4+, (pomocné buňky), MHC skupiny II. Pomocné T-buňky mohou být seskupeny podle typu cytokinu, vylučovaného po stimulaci antigenů. Buňky T^l vylučují primárně IL-2 a gamma-interferon, kdežto u buněk T_u2 dochází k sekreci IL-4, IL-5 a

IL-10. Lymfocyty T_H1 a cytokiny podporují buněčnou imunitu včetně reakce CTL a DTH, kdežto T„2 a cytokiny vyvolávají H aktivaci B-buněk pro humorální imunitu. Zkoušky byly prováděny nejprve u myší a primátů AGM a RHM při použití antigenů rgpl20_TTTO in vitro po očkování vektorem HIV tPA-gpl2O PNV a bylo prokázáno, že bylo dosaženo proliferace T-buněk u obou druhů opic po aplikaci gpl2O in vitro a že tyto odpovědi jsou typu T„1 a jsou dlouhodobé, u myší více než 6 měsíců. Pokusy byly provedeny také s rev PNV.

1. Zkoušky na myších

Myši byly očkovány třikrá nebo jedenkrát vždy 200 mikrogramy VlJns-rev a pak byla provedena zkouška in vitro na proliferaci po aplikaci rekombinantní bílkoviny rev. Myši, očkované třikrát měly hodnoty SI 9 až 12, kdežto myši, očkované jedenkrát, měly hodnoty SI, odpovídající základním hod.notám 2 až 3. Buňky T ze sleziny ze všech zvířat po vakcinaci rev, avšak nikoliv z kontrolních myší vylučovaly gamma-interferon po aplikaci rekombinantního rev (2,4 až 2,8 ng/ml po očkování třikrát, 0,4 až 0,7 ng/ml po očkování jedenkrát), v supernatantech nebyl prokázán IL-4 (citlivost 47 pg/ml pro interferon a 15 pg/ml pro IL-4, což znamená, že tato reakce T-buněk je povahy T„l, stejně jako po vakciri naci gpl20 DNA. Sekrece cytogenu může být citlivější zkouškou než proliferace a mohla by prokázat 'pamět T-buněk. Podobné výsledky byly získány u myší po 6 měsících po očkování. Protilátky proti rev nebyly prokázány v žádném vzorku, což bylo možno očekávat.

100

2. Zkoušky na opicích

U tří opic RHM bylo možno prokázat silnou proliferaci T-buněk, SI = 9 až 30, jako reakce na r-rev po dvou vakcinacích vektorem VIJns-rev. U žádného zvířete nebylo možno prokázat protilátky proti rev. Tyto výsledky souhlasí s výsledky u myší a potrvzují, že vakcinaci rev PNV je možno vyvolat silnou reakci T-buněk bez tvorby protilátek.

Další pokusy na týchž opicích při vakcinaci DNA pro tPA-gpl20 prokázaly, že i) je možno dosáhnout in vitro proliferace T-buněk jako reakci na rgpl20 po jediném očkování, ii) je možno zesílit primární reakci dalším očkováním a iii) podobnou proliferaci je možno pozorovat také u opic, infikovaných SHIV (SI = 5 až 70 a 5 až 35).

B. Cytotoxické T-lymfocyty proti env

U dvou ze čtyř opic RHM bylo možno po očkování IM vakcínou tPA-gpl20 a po očkování ID vakcínou gpl60/IRES/rev pozorovat podstatnou tvorbu CTL (více než 20% rozrušení při poměru 10 : 1 E/T) proti homologním cílovým buňkám 6 týdnů po jediném očkování. Dva týdny po druhé vakcinaci bylo možno pozorovat u všech čtyř opic 20 až 35 % rozrušených buněk při poměru 20 : 1 E/T. Všechny reakce CTL v těchto pokusech byly omezeny na MHC skupiny I. Odstranění T-buněk CD8+ úplně odstranilo cytotoxicitu u všech čtyř opic. CTL-reakce přetrváváte několik měsíců a dalším očkováním bylo možno ji zvýšit na původní nebo ještě vyšší úroveň. Tato CTL-reakce může být charakterizována jako nejsilnější reakce, získaná u RHM po vakcinaci.

ΙΟΙ

Informace ο řetězcích

1) Obecné informace^.

i) Přihlašovatel: Shiver John W.

Liu Margaret A.

Perry Helen C.

ii) Název vynálzu: Polynukleotid, způsob vyvolání imunitní odpovědi a vakcína iii) Počet řetězců: 100

2) Informace o řetězci č. 1

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 35 aminokyselin

3) typ: aminokyselina 0) druh řetězce: jednoduchý D) topologie: obojí ii) Typ molekuly: peptid iii) Hypotetický řetězec: 0 iv) Antimediátorový řetězec: 0

v) Typ fragmentu: vnitřní

XÍ)	Popis	řet	ězce č.	1
Cys	Thr	Arg	Pxo	Asn Asn	Asn	Thr	Arg	Lvs	SerZie His	Zle	Gly ?ro
T				5				1*0			15
Gly	Arg	Ala	?he	Tyr Thr	Thr	Gly	Glu	Zle	Zle Gly Asp	Zle	Arg Gin
	20				25			30
Ala	His	Cys
		35

2) Informace o řetězci: č. 2

i) vlastnosti řetězce:

102

A) délka: 35 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetěž-se: jednoduchý

D) topologie: oboji ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetický řetězec: 0 ivj antimediátorový řetězec: 0

v) týp fragmentu: vnitřní xi) Popis řetězce č. 2

Cys

Thr

Arg

Pro

Asn Tyr Asn

Lys

Arg

Lys

Arg

Ile

His

Zle

Gly Pro

1

5

10

15

Giy

Arg

Ala

Phe

Tyr Thr Thr

Lys

Asn

Zle

Gly

Thr

Zle

Arg Gin

20

25

30

Ala His Cys 35

2) Informace o řetězci č. 3

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 36 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0

v) typ fragmentu: vnitřní

Xi)	popis	řetězce č.	3
Cys	Thr Arg	Pro Asn Asn	Asn	Thr	Arg	Lys	Arg	Zle Arg	Zle	Gin	Arg
1*	5				ÍO				15
Gly	Pro Gly	Arg Ala Phe	Val	Thr	Zle	Gly	Lys	Zle Gly	Asn	Mec	Arg
	20			25				30

Gin Ala His Cys 25

103

2) Informace o řetězci č. 4

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 35 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

O druh řetězce: jednoduchý D) topologie: oboji ii) typ molekuly: peptid iiij hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce č. 4

*

Cys 2

Thr Arg ?ro

Asn Asn Asn 3

Thr

Arg

Lys 10

Gly

Zle

His

Zle

Gly ?ro 15*

Gly

Arg

Ala

?he·

Tyr Thr Thr

Gly

Lys

Zle

Gly

Asn

Zle

Arg Gin

20

25

30

Ala His Cys 25 _t 2) Informace o řetězci č. 5

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 36 aminokyselin

3) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce S. 5

104

Cys	Thr	Arg	Pro	Ser Asn	Asn	Asn	Thr	Arg Lys	Ser Zle His	Zle	Gly
i				5				10		15
Pro	Gly	Lys	Ala	Phe^Ťyr	Ala	Thr	Gly	Ala Zle	Zle Gly Asp	Zle	Arg
			20				25		30*
Gin	Ala	His	Cvs

2) Informace o řetězci č. 6

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 35 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce č. 6

Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Arg Ser Zle His Zle Ala Pro

1* 5 10 15

Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp Zle Zle Gly Asp Zle Arg Gis * 25 30

Ala His Cys 35

2) Informace o řetězci č. 7

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 23 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární

105 ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový' řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 7

CTATATAAGG AGAGCTCGTT TAG

2) Informace o řetězci č. 8

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 30 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 8

GTAGCAAAGA TCTAAGGACG GTGACTGGAG

2) Informace o řetězci č. 9

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 39 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 i

- 106 - I i

i ί

xi) popis řetězce č. 9 ^!

GTATGTGTCT GAAAATGAGC GTGGAGATTG GGCTCGCAC

J-. ... *

2) Informace o řetězci č. 10

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 39 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C.) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce S. 10

GTGCGAGCCC AATCTCCACG CTCATTTTCA GACACATAC

2) Informace o řetězci č. 11

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 36 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: íineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 11

GGTACAAGAT CTACTATAGG GAGACCGGAA TTCCGC

107

2) Informace o řetězci č. 12

i) vlastnosti řetězce:

·

A) délka: 4432 párů^bazí

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 12

TCGCGCsrrr cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca

r^ rr·! WR> irrr	RR^l ^RRRR^R u x ΛΛΧϊν· sjsjri. i	wosjwA^š. A	Cjr AQ AAG^J w *j	Tg»A(^sA?CG\wG	mR5 RRRRRRR x — X *s3
. Xkj\u\«x«saw x^J	IRR ^X R R R RfRR R . -<na	CTTAACTATG	CGGCATCAGA	rr^ r> itwrr«r* υ\.Αΐ»Λ. X <J -Λ	R RR R RRR R X. X UAUAU X *<JX
> rr> ir** »rr—»r ΛΧ wAx.AÍUG.J	R»RR^R« Ά ύχ^Χ^ΛΛΛχΛ	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAATACGGC	* mR * r * rrr r ru· wftwrxx x<jvj
r»rh írrr^rr> -ΛΑ	WWRRR^ RR»R	\|RR»RT» ÍR/RR Φ'	TCATAATATG	iR⁴* r * πτηι» m·* ,λΧλ. - .Λ.Λ	RTRRRRRRm rRR X X X \»Λ X
rrr* r R·* «twr* X s.w.IAG.A. -Λ	CCGCCATGTT	R * R * iRřRR Τ» řR*R ζ^Α0.ζχ· χ^λχ x	ATTGACTAGT	mu #RTR* * íRH R»R -Λ- .ΑΛ-Λ«*	AATCAATTAC
t r««.rrrr rpm> tjsrOa x ’-λ! ~λ	R*WRRm řR% R^R ςτ± .UA-rtui-w	CATATATGGA	GTTCCGCGTT	ACATAACTTA	> *rRRR 1·χ3^ ΧΛΛΛίυν
RRRRRR»^^*RR L. WW ws··»· .	TGACGGCGGA	ACGACCCCCG	CCCATTGACG	TCAATAATGA	AmRt flvrnmmmz. LjíAÍwíX^w
f* \ rrv. Rm /R G. λ-λ<ι iAALu	CGAATAGGGA	RRřT¥RRR-« íRřRR t· « . XXwAi XJ	ACGTCAATGG	RRRR Z*mH ^xsjwAwxAx -	TACGGTAAAC
TGCCCACTTG	rr « rrh r*y rr \JS»rtW .Λν-ΛΧ x-	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	AC3CCCCCTA	TTGACGTCAA

CGAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC

TGACGGTAAA ^rwrrr r x X

CATGAATGGG

CRRRR^ x \·ΛλΑ 4λλϊ

R*RR —»R R R R M

AGGTCGTTTA

TAGAAGACAC

CGTGGAGAGC

TTGACGCAAA

GTGAACCGTC

CGGGACGGAT hxx — xv*x —— xrt<J X '-ΛΧ <x»XJ\x

GGTTTGACTC

GGCACGAAAA

TGGGCGGTAG

AGATCGCCTG

CGAGCCTCCG

TATTACGATG x ^χλχχ x rxxrx AtxX^XíWV.ZXx . X

TCAACGGGAC

GGGTGTACGG

GAGACGCGAT

CGGGGGGGAA

G-nx-x m/x——— UÁxyXJVJ X

CCAAGTCTCG

TTTCCAAAAT

TGGGAGGTCT

C*xx/xx**—.rwn χΛΧαχ X XJ X ·

CGGTGCATTG ιχχχχχχ. —X*X x x x x Λ

ACGGGATTGA

GTCGTAACAA

ATATAAGCAG

TTGACCTCCA

GAXCO

120

180

240

300

60

420

480

340

600

660

720

730

340

900

950

1020

108

TCCCCGTGCC	AAGAGTGACG	TAAGTACCGC	CTATAGAGTC	TATAGGCCCA CCCCCTTGGC	1080
TTGTTATGCA	TGGTATACTG	-nmrmij,- ' iili.	GGGGTCTATA	CACCCCCGCT TCCTCATGTT	1140

ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	GCCTAffAGGT ··	GTGGGTTATT	GACCATTATT GACCACTCCC	1200
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT 'ccÁŽTAÁCATG		1260
GCTCTTTGCC ACAACTCTCT
TTATTGGCTA	TATGCGAATA	CACTGTCCTT	CAGAGACTGA	CACGGACTCT GTATTTTTAC	1320
AGGATGGGGT	CTCATTTATT	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACCACCG TCCCCAGTGC	1380
CGGCAGTTTT ACATGGGCTC	TATTAAACAT TTCT£CGGTA	AACGTGGGAT	CTCCACGCGA	ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG	1440
Gw www wwAGw	TTCTACATCC	GAGCCCTGCT CCCATGCCTC	1500
CAGCGACTCA	TGGTCGCTCG	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCGA GACTTAGGCA	1550
CAGCACGATG	CCCACCACGA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	GTGGCGGTAG GGTATGTGTC	1620
TGAAAATGAG	CTCwwGwAGC	GGGCTTGCAC	CGCTGACGCA	TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC	1530
GGCAGAAGAA	GATGCAGGCA	GCTGAGTTGT	TGTGTTCTGA	TAAGAGTCAG AGGTAACTCC	1740
	CTGTTAAC3G	x wwAwwwwaw	TGTAGTCTGA	· WW XWWWW*-	1300
><·	AGACATAATA	GCTGACAGAC	TAACAGACTG	TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT	1360
CTGCAGTCAC	CGTCCTTAGA	.w xWW Λwiww	CTTCTAGTTG	CCAGCCATCT GTTGTTTGCC	1220
CCTCCCCCGT	G w CIT C CTT w	ACGGTGGAAG	GTGCGACTCC	CACTGTCCTT TCCTAATAAA	1980
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	GGTGTCATTC	řrvnrrv··''' • Λ- .WXWWWW wwxwwwwxww	2040
WWWJtWwAU<lW	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	wwaxwwXwww wztlwwwwxww	2100
rn<*^z ww «w -λΚλλϊ	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACCCGGTTC	CTCCTGGGCC AGAAAGAAGC	2150
AGGCACATCC		GACACACCCT	GTCCACGCCC	wxww-xwx.zi <j;.^wrtuw«-»	2220
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTGAGGAGGG	CTCCGCCTTC	AATCCCACCC GCTAAAGTAC	2280
• - X	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCG	CACGAAACCA	AACCTAGCCT CCAAGAGTGG	2340
GAAGAAATTA	AAGGAAGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC CTCCAACATG	2400
TGAGGAAGTA	ATGAGAGAAA	TCATAGAATT	TCTTCCGCTT	CCTCGCTCAC TGACTCGGTG	2460
L»ww X www 1 ww	TTCGGCTGCG	GCGAGCGGTA	TCAGCTCACT	CAAAGGCGGT AATACGGTTA	2520
TCCACAGAAT	CAGGGGATAA	CGGAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCGA GCAAAAGGCG	2530
AGGAACGGTA	AAAAGGCCGC	gttgctggcg	TTTTTCCATA	GGCTCCGCCC CCCTGACGAG	2540
CATCACAAAA	ATCGACGCTC	AAGTCAGAGG	TGGCGAAACG	CGACAGGACT ATAAAGATAC	27Q0
CAGGCGTTTC	CCCCTGGAAG	CTCGCTCGTG	CGCTCTCCTG	TTCCGACCCT GCCGCTTACC	2750

109

GGATACGTGT ccgcgtttct

AGGTATCTCA GTTCGGTGTA

GTTCAGCCCG ACGGCTGCGC

CACGACTTAT CGCGACTGGC

GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT

TTTGCTATCT GCGCTCTGCT

TCCGGCAAAC AAACCACCGC

CGCAGAAAAA AAGGATCTCA

TGGAACGAAA ACTCACGTTA

TAGATCCTTT TAAATTAAAA

TGGTCTGACA GTTACCAAT3 —Λ,»Αί<·Μ·η<»·ι·5 m* _w «j x * wΛ1'w —·η .ΛΌ.

wAA J.UVJ'-» i\JA

A ΑΛυ\-ΛΛ4ΛΛ AV-wA'J'wwAC'· •'wwaaL.w Auí- á a! -λλ

AkJ A . A SJS»SJV. A AS»XÍ A A A A 'J'* 1\·Λ» Ι\-λ«»— « WAUU

TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC f •mmmm·* mm% m mmm bxUx »ΛΧ'.AL i^AiUU · -Λ»

AGATGCTTTT CTGTGACTGG

Cm * mmm » S^rrvn mmmm»pmm <**»*«kjAL wurtu*. . >«. *

TTAAAAGTGC TCATCATTGG

CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT

CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC

GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG

CTTATCCGGT AACTATCGTC

AGcaSčCACT ggtaacagga \ _f

GAAGTGGTGG CGTAACTACG

GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA

TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG

AGAAGATCCT TTGATCTTTT agggattttg gtcatgagat

ATGAAGTTTT AAATCAATCT

CTTAATCAGT GAGGCACCTA % mmm·*»**^**”»*· m« λ

AL ÍA^wwU.'- U Α^ίΧΛίϊΛ^ΛΛ mm* m·* í****^ř*^ ř***^-»-*^ r*

AA x X AC *- <j 'w uaSjaS. w«- λ*»

CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA

TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG

CATTGCTACA GGCATCGTGG

TTCCCAACGA TCAAGGCGAG

Qmm^mmmm*··*’' C *0λ^<Σ'**Ό*^λ^Ό

GGCAGCACTG CATAATTCTC

TGAGTACTCA ACCAAGTCAT

GGCGTCAATA CGGGATAATA

AAAACGTTCT TCGGGGCGAA

GTAACCCACT CGTGCACCCA

TTTCTCAATG CTCACGCTGT

GCTGTGTGCA CGAACCCCCC

TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA

TTAGCAGAGC GAGGTATGTA

GCTACACTAG AAGGACAGTA

AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA

TTTGCAAGCA GCAGATTACG

CTACGGGGTC TGACGCTCAG

TATCAAAAAG GATCTTCACC

AAAGTATATA TGAGTAAACT

TCTCAGCGAT CTGTCTATTT

Cm* mm % m* mm m*»^ mmm»»mm’» .ALOA.AL^ <3XíASjr>JVíV- .

Gmmm* m***”^·** mmm> m> mmm* *>-»Λ<3Λ. _w ΑΛ

GTGGTCCTGC AACTTTATCC

TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT mmmm » «RmmMmmmmmm i'JÍAA'-Uk.iů

TTACATGATC CCCCATGTTG

TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA mm* rHyvmtf»* m mmm^ mmmmm* «aAUASJAUAA UvwAiwwUiA mmmm* m* iw* mmmm* rnrnmmm 1 ^íuavAA.a (jrxsjAAisa^SJVJ

C„„„m^ >»* m* m*»» m * mm w^s-jvwaLa .auaASjaaL ·

AACTCTCAAG GATCTTACCG

ACTGATCTTC AGCATCTTTT

actttcacca	z»mmmmmmmm** S9V.W A « I wikďU	GTGAGCAAAA	ACAGGAAGGC	AAAATGCCGC	AAAAAAGGGA
ATAAGGGCGA	CACGGAAATG	TTGAATACTC	ATACTCTTCC	TTTTTCAATA	TTATTGAAGC
ATTTATCAGG	GTTATTGTCT	CATGAGCGGA	TACATATTTG	AATGTATTTA	GAAAAATAAA
CAAATAGGGG	TTCCGCGCAC	ATTTCCCCGA	AAAGTGCCAC	CTGACGTCTA	AGAAACCATT
ATTATCATGA	CATTAACCTA	TAAAAATAGG	CGTATCACGA	GGCCCTTTCG	TC

2820

2880

2940

3000

3050

3120

3180

3240

3300

3350

3420

3480

3540

3500

550

3720

3730

3840

3900

3950

4020

4030

4140

4200

42S0

4320

4380

4432

110

2) Informace o řetězci č. 13

i) vlastnosti-.řetězce:

A) délka: 2196 párů Vazi

B) nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 13

ATTGGCTATT GGCGATTGCA TACGTTGTAT CGATATCATA ATATG7ACAT TTATATTGGC SO

TCATGTCCAA CATTACCGCG ATGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA 120

Λ. -AU.»jrxjrxjxJ X	· Λϋ x X wΛ	TAGCCGATAT	ATGGAGTTCG	LíX-«J * .ΛΧ.Λ1Λ	ΛΧ- - .AL<juxrt	130
	CTGGCTGACG	GCGCAACGAC	<«««UX. w »Λ ·	TGACGTCAAT	ΛΛΧχλΑ^-χΛ x αχ	240
GTTCCCATAG	TAACGCCAAT	AGGGACTTTC	CATTGACGTC	AATGGGTGGA	GTATTTACGG	300
TAAACTGCCC	ACTTGGCAGT	ACATCAAGTG	TATCATATGC	CAAGTACGCC	'w—w XAX iUAX	3Ó0
?x mr·· x xj x xAAiuaI-u t	GTAAATGGCC	CGCCTGGCAT	TATGCCCAGT	ACATGACCTT	Aj,<JWXJAL - · .	420
CCTACTTGGC	AGTACATCTA	CGTATTAGTC	ATCGCTATTA	CGATGGTGAT	GC^jG^ZTTGG	430
GAGTACATCA	áXLaaíx-xjxvaj	ATAGCGGTTT	GACTCACGGG	GATTTCGAAG	GAC	540
ATTGACGTCA	ATGGGAGTTT	GTTTTGGCAC	CAAAATCAAC	GGGACTTTCG	AAAATGTCGT	□ 00
AACAACTCCG	CGGGATTGAC	GCAAATGGGC	GGTAGGCGTG	TACGGTGGGA	XJXJ X'w X Αχλχλ	550
AGCAGAGCTC	GTTTAGTGAA	CGGTCAGATC	GCCTGGAGAC	GCGATGGACG	<»«fV’XWWT*TV’' <· w .xj x . x -urtL	720
CTCCATAGAA	GACACCGGGA	CGGATCGAGC	L. X LU υΧ»ΧΛΛ. w	GGGAACGGTG	CATTGGAACG	730
CGGATTCCCC	GTGCGAAGAG	TGACGTAAGT	ACCGCGTATA	GAGTCTATAG	GCGGACGGCG	340
TTGGCTTCTT	ATGCATGCTA	TACTGTTTTT	Qvwx» x ixjxjúu x	CTATACACGG	CCGCTTCCTC	900
ATGTTATAGG	TGATGGTATA	GCTTAGCCTA	TAGGTGTGGG	TTATTGACCA	TTATTGACCA	950
Xw * WwSb w «A* X	GGTGACGATA	CTTTCGATTA	CTAATCCATA	ACATGGCTCT	TTGCCACAAC	1020
	GGCTATATGC	CAATACACTG	TCCTTCAGAG	ACTGACACGG	ACTCTGTATT	1080

111

TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA

AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA

TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGSTAGCGGC GGAGCTTCTA

GCCTCCAGCO ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCG

AGGGACAGCA CGATGCCCAC CACCACCAGT GTGCCGCACA

GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG GGAGCGGGCT TGCACCGCTG

GCAGCGGCAG AAGAAGATGC AGGCAGCTGA GTTGTTGTGT

ACTCCCGTTG CGGTGCTGTT AACGGTGGAG GGCAGTGTAG

GCGGCGCGCG CGACGAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA

CTTTTCTGCA GTCACCGTCC TTAGATCTGC TGTGCCTTCT

TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC

ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT

GGTGGGGCAG CACAGCAAGG GGGziGwřvTTG GsjnAG«GnA» GGTGGGCTCT ATGGSTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC GAAGGAGGCA CATCCCCTTC TCTGTGACAC ACCCTGTCCA AGCCCCACTC ATAGGACACT CATAGCTCAG GAGGGCTCGG AGTACTTGGA GCGGTCTCTC CCTCCCTCAT CAGCCCACCA AGTGGGAAGA AATTAAAGCA AGATAGGCTA TTAAGTGCAG ACATGTGAGG AAGTAATGAG AGAAATCATA GAATTC

2) Informace o řetězci S. 14

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 4864 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0

TATACAACAC CACCGTCCCC

CGCGAATCTC GGGTACGTGT

CATCCGAGCC CTGCTCCCAT

TAACAGTGGA GGCCAGACTT

AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT

ACGCATTTGG AAGACTTAAG

TCTGATAAGA GTCAGAGGTA

TCTGAGCAGT ACTCGTTGCT

GACTGTTCCT TTCCATGGGT

AGTTGCCAGC CATCTGTTGT

ACTCCCACTG TCCTTTCCTA

CATTCTATTC TG!

!GTGG * zr <«· r*f*·* * <R/»· x

Λ« W '—Λ « x- A J, \ J

Cjw A 4.4. _ 4. X» · WWWV. χΛ^Λ/ΪΛ

CGCCCCTGGT TCTTAGTTCC

CCTTCAATCC CACCCGCTAA

AACCAAACCT AGCCTCCAAG nliuyrtunwňrt λα lux-.x —λ

1140

1200

1250

1320

1380

1440

1500

1550

1520

1530

1740

1800

1850

1S20

1980

2040

2100

2150

2196

112 xi) popis řetězce č. 14

Τ'—Lai—x 1 .	CGGTGATGAC	GGTGAAAACC	TCTGACACAT	Va>MAwa X w A. A.	GAGACGGTCA
CAGCTTGTCT	GTAAGCGGAT	Lr— wt«tdnMik»wΛ	GACAAGCCCG	TCAGGSCGCG	TCÁwGGvjwTw
TTGGCGGGTG	X ΑΧΛΛΪΜΑ l\JkJ	CTTAACTATG	CGGGATCAGA	GCAGATTGTA	CTGAGAGTGC
ACCATATGCG	GTGTGAAATA	CCGCACAGAT	GCGTAAGGAG	AAAATACGGC	ATCAGATTGG
<«m* χΛχ	TTGCATACGT	TGTATCCATA	TCATAATATG	TACATTTATA	TTGGCTCATG
TCCAACATTA	a -	GACATTGATT	ATTGACTAGT	TATTAATAGT	AATCAATTAC
GGGGTCATTA	GTTCATAGCC	CATATATSGA	— U A · A-X-kJk-U A A	ACATAACTTA	C3GTAAATGG
CCCGCCTGGC	/*********71 AW Aw <— — *-A	ACGACCCCCG	CCGATTGACG	TCAATAATGA	CGTATGTTCC
CATAGTAACG	CGAATAGGGA	CTTTCCATTG	ACGTCAATGG	GTGGAGTATT	TACGGTAAAC
TGCCCACTTG	GCAGTACATC	AAGTGTATCA	TATGCCAAGT	ACGCCCCCTA	TTGACGTCAA
TGACGGTAAA	mm «**<» »»m	GGCATTATGC	CCAGTACATG	ACCTTATGGG	ACTTTCCTAC
TTGGCAGTAC	ATCTACGTAT	TAGTCATCGC	TATTACGATG	GTGATGCGGT	TTTGGCAGTA
V- Λ X «ΛΛ1WW	WW A ΜΛ * AUw	owmmm * mmm tfw - · *	> <* mmm ALuwuun.·.	CCAAGTCTCC	·» % mm»*** aawmAx i^n
A ΑΛΛί <7S7VJ	> r—r*m	* ·* >	TCAACGGGAC	TTTCCAAAAT	sj a '-'J lAALzun

'•‘CwWV.V—	mmm* m* n A χ'^ΛΑυ'-ΛΛΛ	mmmi—^^mm* m i VJV9S9W A ΛΟ	a3A»a? xu χλΑάϊ	mmm^w —irnmmm A X A .	atataagcag
AGCTCGTTTA	/—mm* * mm W X^Í/W-AU i A.	AGATCGCCTG	GAGACGCCAT	CCACGCTGTT	TTSACCTCCA
TAGAAGACAC	> a<—m AUVUA¹» —Α»Λ A	CCAGCCTCCG	^^mmmmmm* * A· Αϊ A3 >» <— UU\J ΛΛ	--tmmmm * iwn** XxTJiUAAx xA	m* 'lAARAASfl* 'JrtAA'J'-UWA ·

TCGCGGTGCC AAGAGTGACG TAAGTACCGC CTATAGAGTC TATAGGCCCA CGGCCTTGGC

TTCTTATGGA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGTCTATA CACCGCCGCT TGGTCATGTT

ATAGGTGATG	GTATAGCTTA	ΛΑΑΒ» m U5.W ·Λ·Αυ\ί X	>—mmmmmrn^ mm A> iUWU A AAa ·	GACCATTATT	m* 4m X»mmm m «·Ale A <· — —
CTATTGGTGA	CGATACTTTC	CATTACTAAT	CCATAACATG	GCTCTTTGCC	» m* * mmmmmm a^aAL i L X^ .
A -Λχ AkJÁJ’— .A	TATGCCAATA	CACTGTCCTT	CAGAGAGTGA	CACGGACTCT	GTATTTTTAC
7» m·» m**m—»4—m λ(λ»Α X AíSJAJAJ A	£««£^ΜΤ—,^φφ	ATTTACAAAT	TCACATATAC	AACACGACCG	X mwm.AA\J AU'·
CCGCAGTTTT	TATTAAACAT	AACGTGGGAT	mmm¹' *· — AwAA^íiieUΛ	ATCTCGGGTA	CGTGTTCCGG
ACATGGGCTC	mmm mmmmmm* X AW A AmXIUXA	<j\jaua	TTCTACATCC	GAGCGGTGCT	CGGATGCCTC
CAGCGACTCA	X^x^tfAXXa	GCAGCTCCTT	GCTCCTAACA	GTGGAGGCCA	GACTTAGGCA
CAGCACGATG	CCCACCACCA	CCAGTGTGCC	GCACAAGGCC	mrv* mm mx^rn »m \j X\j\ds-xaw ΧΛυ	GGTATGTGTC

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

730

840

900

550

1020

1080

1140

1200

1250

1320

1380

1440

1500

1560

1520

- 113

TGAAAATGAG CTCGGGGAGC GGGCTTGCAC CGCTGACGCA TTTGGAAGAC TTAAGGCAGC

GGCAGAAGAA GATGCAGGCA GCTGAGTTGT TGTGTTCTGA TAAGAGTCAG AGGTAACTCC

CGTTGCGGTG CTGTTAACGG TGGAGGGCAG TGTAGTCTGA GCAGTACTCG TTGCTGCCGC ••A

	TAACAGACTG TTCCTTTCCA TGGGTCTTTT
	X» X X* w X'X	X x· Xux XXa X x»»—	X· X X*X« XAIj Xi\a	CCAGCCATCT	(j X'xx»'X'X^_Xx»<-'^.
L- w X X	Q^^^r^w^^w****P’PQ	ACGCTGGAAG	GTGCCACTCC	CACTGTC-CTT	TCCTAATAAA
ATGAGGAAAT	TGCATCGCAT	TGTCTGAGTA	GGTGTCATTC	TATTCTGGGG
GGGAGCACAG	CAAGGGGGAG	GATTGGGAAG	ACAATAGCAG	GCATGCTGGG
* X. -Λ1<ΛΛΙ	TACCCAGGTG	CTGAAGAATT	GACGCGGTTC	CTCCTGGGCC	AGAAAGAAGC
AGGCACATCC	CCTTCTCTGT	GACACACCCT	GTCCACGCCC	CTGGTTCTTA	GTTCCAGCCC
CACTCATAGG	ACACTCATAG	CTCAGGAGGG	U x x.x*x»x.-· - X ζ.	AATCCCACCC	GCTAAAGTAC
X.UVAWXUWl	CTCTCCCTCC	CTCATCAGCC	CACGAAACGA	AACCTAGCCT	CCAAGAGTGG
GAAGAAATTA	AAGCAAGATA	GGCTATTAAG	TGCAGAGGGA	GAGAAAATGC	CTCCAACATG

ZW<* A ΛΛΛ A • urtuurtnu x Λ	H m<* a * <· A A a ΛXUAUAUAAA	m^AmA/^A a X ».Λ1ΛΐίΛΛ- ·	.W. XX^^sJk. . i	,ΛΛΙΑΓ·'··»»/· A <· x,«- X x»<jx» · ΧΛΧ	X . .xix .
- x — ΜΪ	»p*p<~·»-· _ ^m/A J. χ XUVX Xuvu	GCSAGCGCxÁ	TCAGCTCACT	z-»·* * Ά<···—·ζ«Ύΐ ΧΛΛΛ\ΛίΧ*Γ>α X	A A <Ύ·Α ΛΛ«ΛΧ«Λί . -Λ
> zp » ww ΛΧΛ^ϊΛΛ*	CAGGGGATAA	CGCAGGAAAG	AACATGTGAG	CAAAAGGCGA	<·<»* A A JxzWVUAUiJX w
AGGAACCG*xA	AAAAGGCCG\«	<»Rřrv *a<· xa x ..ajx. XXlX»V.XI	TTTTTCCATA	kjtxas»	GGGTGACGAG
CATCACAAAA	A ΓΤ'Γ·’· A /Α<»Ζ·φ( AXXUAXJX «·—	AAGTCAGAGG	ίΡΖΖ·Ζ-»^ A<«\|I>A X X9X9X»4JAŽÍAX« w	CGACAGGACT	ATAAAGATAC

CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCGGCT7ACC

GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT

AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC

GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA

CACGACTTAT CGCGACTGGC AGCAGCGACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA

GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CGTAACTACG GGTACACTAG AAGGACAGTA

TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA

TGGGGGAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GCTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG

CGCAGAAAAA AAGGATCTCA AGAAGATCGT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG

TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC

TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT

1530

1740

1300

1850

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400 x -t Q V = 20

2530

2540

2700

2750

2320

2330

2940

3000

3050

2120

3130

3240

3300

3360

114

TGGTCTGACA GT7ACGAATG CTTAATCAGT

CGTTCATCCA 7AGTTGCČTG ACTCCGGGGG

AGGTGTTGCT GACTCATACC AGGCCTGAAT

GCCACGGTTG ATGAGAGCTT TGTTGTAGGT

TGCCACGGAA CGGTCTGCGT TGTCGGGAAG agttcgattt attcaacaaa gccgccgtcc

TACAACCAAT TAACCAATTC TGATTAGAAA

TTATTCATAT CAGGATTATC AATACCATAT

GAAAACTCAC CGAGGCAGTT CCATAGGATG

ACTCGTCCAA catcaataca acctattaat GAGAAAŤCAC CATGAGTGAC GACTGAATCC TTCCAGACTT GTTCAACAGG CCAGCCACTA

5 ·χ * PH Η* «Τ'	m· «T»n**m/ *	TTGCGCGTGA
υνΑί-ΛΛ. •Λ'·»	* ' > /··><**» ·* n* AAAW Λυ-υΑΛ ·	CGAATGCAAC
ATATTTTCAC	<***p^·» · ΟΛΛ. s-AUu	* Λ4Λ. - w.-w·
GCAGTGGTGA	GTAACCATGC	ATCATCAGGA
GGCATAAATT	CCGTCAGCCA	GTTTAGTCTG
CT^CCTTTGC	CATGTTTCAG	AAACAACTCT
ATTGTCGCAC	^^v·* ******	GaUa·
	AATTTAATCG	>e««****m^^T Λ Luvw w1wtfAU
ACACCCCTTG	TATTACTGTT	TATGTAAGCA
	<·* nnv»r»» ΛΛ A X AAL. Λ	TCAGAGATTT
CATTATTGAA	GCATTTATCA	visjw 4. . A - .4J4
TAGAAAAATA	AACAAATAGG	kJUi iLwOVOO
TAAGAAACCA	« ·»Λλ «Λ«<ηΑ·	GACATTAACC

CGTC

GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT

GGGGGGGCGC TGAGGTCTGC CTCGTGAAGA

CGCCCCATCA TCCAGCCAGA AAGTGAGGGA

GGACCAGTTG GTGATTTTGA ACTTTTGCTT

ATGCGTGATC TGATCCTTCA ACTCAGCAAA

CGTCAAGTCA GCGTAATGCT CTGCCAGTGT

AACTCATCGA GCATCAAATG AAACTGCAAT

TTTTGAAAAA GCCGTTTCTG TAATGAAGGA

GCAAGATCCT GGTATCGGTC TGCGATTCCG

TTCCCCTCGT CAAAAATAAG GTTATCAAGT

GGTGAGAATG GCAAAAGCTT ATGCATTTCT

CGCTCGTCAT CAAAATCACT CGCATCAACC

GCGAGACGAA ATACGC^jATC ^^-.«χ^λλλλ

CGGCGCAGGA ACACTGC\.^G

AATACCTGGA ATGCTGTTTT CCCGGGGATC

GTACGGATAA AATGCTTGAT GGTCGGAAGA

ACCATCTCAT CTGTAACATC ATTGGCAACG

GGCGCATCGG GCTTCCCATA CAATCGATAG

CGAGCCCATT TATACCCATA TAAATCAGCA

CAAGACGTTT CCCGTTGAAT ATGGCTCATA

GACAGTTTTA TTGTTCATGA TGATATATTT

TGAGACACAA CGTGGCTTTC CCCCCCCCCC

CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT

ACATTTCCCC GAAAAGTGCG ACCTGACGTC

TATAAAAATA GGCGTATCAC GAGGCCCTTT

3420

3480

3540

3600

3650

3720

2780

3840

3900

3960

4020

4030

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4630

4740

4800

4860

4864

115

2) Informace o řetězci č. 15

i) vlastnosti řetězce

Λ

A) délka: 41 párů .-hazi

B) typ: nukleová kyselina Č) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 15

CCACATAGAT CTGTTCCATG GTTGTGGCAA TATTATCATC G

2) Informace o řetězci č. 15

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 39 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí , D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA • iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 16

GGTACAAGAT CTACCATGGC AGGAAGAAGC GGAGACAGC

116

2) Informace o řetězci č. 17

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 43 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 17

CCACATAGAT CTGATATCGC ACTATTCTTT AGCTCCTGAC TCC

2) Informace o řetězci č. 18

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 78 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 18

GATCACCA'

GATGCAATGA AGAGAGGGCT CTGCTGTGTG CTGCTGCTGT GTGGAGCAGT

CTTCGTTTCG CCCAGCGA •73

117

2) Informace o řetězci č. 19

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 78 pária .baží

B) typ: nukleová kyselina O.druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 19

GATGTCGCTG GGGGAAACGA AGACTGCTCG ACACAGCAGG AGGACACAGC AGAGCCCTCT 50

Λ A XUXA * <«. wA X a l O

2) Informace o řetězci č. 20

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 52 párů baží

B) typ: nukleová kyselina > C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 20

GGTACATGAT CAGATATCGC CGGGGCGGAG ATCTTCAGAC TTGGAGGAGG AG

118

2) Informace o řetězci č. 21

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 40 párů paží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 21

CCACATTGAT CAGCTTGTGT AATTGTTAAT TTCTCTGTí

2) Informace o řetězci č. 22

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 39 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí , D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA •iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 22

CGGCGGATCG TGA7GACAGA AAAATTGTGG GTCACAGTC

2) Informace o řetězci č. 23

i) vlastnosti řetězce

120 ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový·.. ř.etězec : 0 xi) .popis řetězce č. 25

CCACATTGAT CAGATATCTT ATCTTTTTTC TCTCTGCACC ACTCTTC 47

2) Informace o řetězci č. 26

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 38 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 26

GTCACCGTCC TCTATCAAAG CAGTAAGTAG TACATGCA 33 .2) Informace o řetězci č. 27

i) vlastnosti řetězce

A) délka 38 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0

121 xi) popis řetězce č. 27

TGTACTACTT ACTGCTTTGA TAGAGGACGG TGACTGCA

2) Informace o řetězci č. 28

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 40 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 28

GGTACATGAT CAACCATGAG AGTGAAGGAG AAATATCAGC

2) Informace o řetězci č. 29

i) vlastnosti řetězce t

A) délka: 43 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 29

CCACATTGAT CAGATATCCC CATCTTATAG CAAAATCCTT TCC

122

2) Informace o řetězci č. 30

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 43 párů bází

B) typ: nukleová kyselina

C) ' druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 30

WwAlAALaUAíaTwww ^ΛΛΛΛ

2) Informace o řetězci č. 31

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 43 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 31

GGTACACTGC AGTCACCGTC CTATGGCAGG AAGAAGCGGA GAC

123

2) Informace o řetězci č. 32

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 32 párů baží

B) typ: nukleová kyselina C·) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 32

CCACATCAGG TACCCCATAA TAGACTGTGA CC 32

2) Informace o řetězci č. 33

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 45 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 33

GGTACAAGAT CTACCATGGG ACCAGTACAA CAAATAGGTG GTAAC

i

124

2) Informace o řetězci č. 34 ' i) vlastnosti řetězce

A) délka: 37 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 34

CCACATAGAT CTTTACATTA ATCTAGCCTT CTGTCCC

2) Informace o řetězci č. 35

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 33 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí t

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 35

GGTACAACCA TGGGTGGAGC TATTTCCATG AGG

2) Informace o řetězci č. 36

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 29 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

125

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekulycDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 36

CC7AGGTTAG CCT7CTTCTA ACCTCT7CG 29

2) Informace o řetězci č. 37

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 37 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 37

GGTACAAGAT CTACGATGGG ATGTCTTGGG AATCAGC 37

2) Informace o řetězci č. 38

i) vlastnosti’ řetězce

A) délka: 43 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA

126 iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 38

CCACATAGAT CTGATATCGT ATGAGTCTAC TGGAAATAAG AGG 42

2) Informace o řetězci č. 39

i) vlastnosti řetězce

A) délka 42 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce S. 39

GGTACAGGAT CCACCATGGG TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC 42

2) Informace o řetězci č. 40

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 50 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

127 xi) popis řetězce č. 40

CCACATGGAT CCGCCCGGGC TTACATCTCT GTACAAATTT CTACTAATGC 50

2) Informace o řetězci č. 41

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 33 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 41

GGTACAGGAT CCCCGCACGG CAAGAGGGGA GGG i-j

2) Informace o řetězci č. 42

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 42 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 42

GGTACAGGAT CCACCATGGC TGCGAGAGCG TCAGTATTAA GC

128

2) Informace o řetězci č. 43

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 45 párů baží

B) typ: nukleová kyselina Cl druh řetězce: obojí

D) topologie'; lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 43

CCACATGGAT CCGCCCGGGC CTTTATTGTG ACGAGGGGTC GTTGC

2) Informace o řetězci č. 44

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 33 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 44

2) Informace o řetězci č. 45

i) vlastnosti řetězce

129

A) délka: 42 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ. molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 45

GGTACAGGAT CCACCATGGC TGCGAGAGCG TCAGTATTAA G!

2) Informace o řetězci č. 46

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 27 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 46

GTACCTCATG AGCCACATAA TACCATG

2) Informace o řetězci č. 47

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 40 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární

130 ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 47

2) Informace o řetězci č. 48

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 42 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 48

CGACATAGAT CTCCATGGGA ACTAAAGGAA GACGGTCTGT TG 42

2) Informace o řetězci č. 49

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 39 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

131 xi) popis řetězce č. 49

GGTACAAGAT CTACCATGAA GGCAAACCTA CTGGTCCTG

2) Informace o řetězci č. 50

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 45 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 5h

CCACATAGAT CTGATATCCT AATCTCAGAT GCATATTCTG CACTGi

4ó

2) Informace o řetězci g. 51

i) vlastnosti řetězce

A) délka: délka 15 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce č. 51

Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn 15 10 15

132

2) Informace o řetězci č. 52

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 26 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) 'druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 52

GAAAGAGGAG AAGACAGTGG CAATGA

2) Informace o řetězci č. 53

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 40 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 53

GGGCTTTGCT AAATGGGTGG CAAGTGGCCC GGGCATGTGG

2) Informace o řetězci č. 54

i) vlastnosti řetězce

133

A) délka: 23 párů baží

B) typ£ nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický ře.tězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 54

CTAACAGACT GTTCGTTTCZ ATG

2) Informace o řetězci č. 55

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 18 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 55

GGAGTGGCAC CTTGCAGG

2) Informace o řetězci č. 56

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 45 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární

134 ii) typ molekuly: cDNA •iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 56

GGAGACAGCG ACGAAGACCT CCTCAAGGCA GTCAGACTCA TCAAG 45

2) Informace o řetězci č. 57

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 71 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: lineární ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 57

GATGGGTGGC AACTAGAAGG CACAGCAGAT CTGATATCGC ACTATTCTTT AGGTCCTGAC 50

TCCAATATTG T ,71

2) Informace o řetězci č. 58

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 119 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

135 ^χΐ) popis řetězce č. 58

CTTAGATCAA CGATGAGAGT GAAGGAGAAA TATCAGGACT TGTGGAGATG GGGGTGGAGA

TGGGGCACCA TGCTCCTTGG GATGTTGATG ATCTGTAGTG CTACAGAAAA ATTGTGGGT

2) Informace o řetězci č. 59

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 78 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 59

CTGGGAACTA GAAGGGACAG CAGATCAGAT AGTGTCCCCA TCTTATAGCA AAATCCTTTC

CAAGCCCTGT CTTATTCT

2) Informace o řetězci č. 50

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 19 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí iii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 ' oO

119 oO

136 xi) popis řetězce č. 60

GATTTAGGTG ACACTATAG 19

2) Informace o řetězci č. 61

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 20 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 61 σ»* * m mu/*·-’'UAL· 20

2) Informace o řetězci č. 62

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 28 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 62

CA.TGCCTGCA GGTCGACTCT AAATTCCG

137

2) Informace o řetězci č. 63

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 37 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 63

ACCCGGGGAT CGTCTAGCGC GCTTGTCTCT TSTTCCA

2) Informace o řetězci č. 64

i) vlasntosti řetězce

A) délka: 15 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 64

GGGACGTGGT TTTCG

138

2) Informace o řetězci č. 65

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 66 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 65

TATGGCCACA ACGATGGCAG GAAGAAGCGG AGACAGCGAC GAAGACCTCC TCAAGGCAGT 60

CAGACT 66

2) Informace o řetězci č. 66

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 90 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 66 ctcgagc:

AL ^,Λ.Λ'ώ'-υ i υΑ-ΛΛυΛΛΛ. LuAAjaL « ν»Λ Lnj 4 .λ-λΑ^λ 'CTAAGG

TATAAA CTCCCGAAGG

139

2) Informace o řetězci č. 67

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 16 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce S. 67

2) Informace o řetězci č. 68

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 87 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 68

TTGCATGCCT GCAGGTGG7A CATGATCAGA TATCGCCCGG GCGGAGATCT TCAGACTTGG

AGGAGGAGAT ATGAGGGACA ATTGGAG

140

2) Informace o řetězci č. 69

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 79 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 69

-.AuAwx<.AA · x<rz\X'M*AsjM» · x^íuíAAíIo . .aAí.íx-w /uxLwXALíx Ou

ΛΧ '.xAwu X w ÍJiUXUAX.X /7

2) Informace o řetězci č. 70

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 18 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 70

CCATCTCCAC AAGTGCTG

141

2) Informace o řetězci č. 71

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 77 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec : 0 xi) popis řetězce č. 71

AGATCTAAGG ACGGTGACTG CATGTACTAC TTACTGCTTT GATAGAGGAC GGTGACTGCA 50

GAAAAGACCC ATGGAAA 77

2) Informace o řetězci č. 72

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 15 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: O iv) antimediátorový řetězec: O xi) popis řetězce č. 72

GCTTCGGCCA GTAACG

142

2) Informace o řetězci č. 73

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 62 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 73

Gsj\..<tCAGCAG ATCAGATGGG GATCTGATAT CGCACTATTC TTTAGCTCCT GACTCCTGAC SO *pr·

2) Informace o řetězci č. 74

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 42 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 74

GGAATTTGAG TCATCCCCAT CTTATAGCAA AATCCTTTCC AA

143

2) Informace o řetězci č. 75

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 42 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 75

CTTAGATCCC CGCACGGGAA GAGGCGAGGG GCGGCGACTG GT

2) Informace o řetězci č. 75

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 70 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 76

GGGACAGCAG ATCCGCCCGG GCTTACATCT CTGTACAAAT TTCTACTAAT GCTTTTATTT

144

2) Informace o řetězci č. 77

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 70 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 77

CTTAGATCCA CCATGGGTGC GAGAGGGTCA GTATTAAGCG GGGGGAGAAT TAGATCGATG

GGAAAAAATT

2) Informace o řetězci č. 78

i) vlastnosti řetězce:

A) délka:70 párů baží

B) typ: nukleová kyselina ' C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediát-orový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 78

GGGACAGCAG ATCCGCCCGG GCTTACATCT CTGTACAAAT TTCTACTAAT GCTTTTATTT

145

2) Informace o řetězci č. 79

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 118 párů baží

B) typ: nukleová kyselina O’ druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 79:

TCACCGTCCT TAGATCACCA TGGATGCAAT GAAGAGAGGG CTCTGCTGTG TGCTGCTGCT 60

GTGTGGAGCA GTCTTCGTTT CGCCCAGCGA GATCTGC7G7 GCCTTCTAGT TGCCAGCC 118

2) Informace o řetězci č. 80

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 43 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 80

TTCGTTTCGC CCAGCGATCA CAGAAAAATT GTGGGTCACA GTC

146

2) Informace o řetězci č. 81

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 43 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topografie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce δ. 81

GGCACAGCAG ATCCACGTGT TAGCGCTTTT CTCTCTCCAC CAC 43

2) Informace o řetězci ě. 82

i) vlastnosti řetězce

A) délka: 80 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topografie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 82

TCACCGTCCT TAGATCTACC ATGGGACCAG TACAACAAAT AGGTGG1

TGCCATTAAG CCCGAGAACA

ATGTCCACC

147

2) Informace o řetězci č. 83

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 44 párů baží

B) typ: nukleová kyselina Cj .druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 83

GGCACAGCAG ATCTTTACAT TAA-CTAGCG TTCTGTCGCG GTCC

2) Informace o řetězci č. 84

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 80 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 84 ^CGGTCGT TAGATCGGTA CAACGATGGG TGGAGCTATT TCCATGAGGC AATCCAAGCC

GGCTGGAGAT CTGACAGAAA

148

2) Informace o řetězci č. 85

i) vlastnosti řetězce:

A)

B)

Č) délka: 85 párů baží typ: nukleová kyselina druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 85

GGGACAGCAG ATCACCTAGG TTAGCCTTCT TCTAACCTCT TCCTCTGACA GGCCTGACTT

2) Informace o řetězci č. 86

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 90 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 86

ACCGTCCTTA GATTCGACAT AGCAGAATAG GCGTTACTCG ACAGAGGAGA GCAAGAAATG 50

GAGCCAGTAG ATCCTAGACT AGAGCCCTGG

149

2) Informace o řetězci č. 87

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 41 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 87

GGCACAGCAG ATCGGAGATG CTGCTCCCAC CZCATCTGCT G

2) Informace o řetězci č. 88

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 15 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce č. 88

Lys Gin Ha II· Asn Mac Trp Gin Glu Val Gly Lys Ala Mac Tyr Ala 1 S 10 ' 15

150

2) Informace o řetězci č. 89

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 13 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce č. 89

H’s Glu Asc Zle Zle Ser Leu Tm Asp Gin Ser Leu Lvs 1 ‘ 5 10

2) Informace o řetězci č. 90

i)-.'vlastnosti řetězce:

A) délka: 15 aminokyselin

B) typ: aminokyselina

C) druh řetězce: jednoduchý

v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis řetězce č. 90

Asp Arg Val Zle Glu Val Val Gin Gly Xaa Tyr Arg Ala Zle Arg 1 5 10 1=

151

2) Informace o řetězci č. 91

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 33 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 91

GGTACAAATA TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACG

2) Informace o řetězci č. 92

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 36 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topolofie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 92

CCACATCTCG AGGAACCGGG TCAATTCTTC AGCACC 36

152

2) Informace o řetězci č. 93

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 38 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) · druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 93

GGTACAGATA TCGGAAAGCC ACGTTGTGTC TCAAAATC

2) Informace o řetězci č. 94

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 37 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 94

CCACATGGAT CCGTAATGCT CTGCCAGTGT TACAACC

153

2) Informace o řetězci č. 95

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 39 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) · druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 95

GGTACATGA7 CACGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTG

2) Informace o řetězci č. 95

i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 35 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 96

CGACATGTCG ACCCGTAAAA AGGCCGCGTT GCTGG

154

2) Informace o řetězci č. 97

i) vlastnosti řetězce:

A)

B)

C) délka: 18 párů baží typ: nukleová kyselina druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 97

GAGC Z AATAT AAATGTAC i 3

2) Informace o řetězci č. 98 i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 15 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí t

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 98

CAATAGGAGG CATGC

155

2) Informace o řetězci č. 99 i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 16 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: obojí

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 99

GCAAGCAGCA GATTAC

2) Informace o řetězci č. 100 i) vlastnosti řetězce:

A) délka: 3547 párů baží

B) typ: nukleová kyselina

C) druh řetězce: dvojitý

D) topologie: obojí ii) typ molekuly: cDNA iii) hypotetický řetězec: 0 iv) antimediátorový řetězec: 0 xi) popis řetězce č. 100

GATATTGGCT	ATTGGCCATT	GCATACGTTG	TATCCATATC	ATAATATGTA	CATTTATATT	50
GGCTCATCTC	CAACATTACC	GCCATGTTGA	CATTGATTAT	TGACTAGTTA	TTAATAGTAA	120
TCAATTACGG	GGTCATTAGT	TCATAGCCGA	TATATGGAGT	TCCGCGTTAC	ATAACTTACG	130
GTAAATGGGC	CGCGTGGCTG	ACCGCCCAAC	GACCCCCGCC	CATTGACGTC	AATAATGACG	240
TATGTTCCCA	TAGTAACGCG	AATAGGGACT	TICCATTGAC	GTCAATGGGT	GGAGTATTTA	300
CGGTAAACTG		AGTACATCAA	GTGTATCATA	TGCCAAGTAC	GCCCCCTATT	350

156

GACGTCAATG	ACGGTAAATG	v *· XMJVJ	CATTATGCCC	AGTACATGAC	CTTATGGGAC	420
	GGCAGTACAT	CTACGTATTA	w x Uzii SJ*·»	TTACCATGGT	GATGCGGTT7	430
TGGCAGTACA	TCAATGGGCG	rw~ 'ΦΆΓ*''* „‘JUA X Λΐϊ<·*Αί	TTTGACTCAC	GGGGATTTCC	AAGTCTCCAC	340
CCCATTGACG	TCAATGGGAG	CCCGTTTTGG	CACCAAAATC	x -	TCCAAAATGT	500
CGTAACAACT		GACGCAAATG	U»\JM.*JVJř x Auúv»	/—^S^* /<·»**^ U xU ΧΛ\-<Γ»3 X W	GGAGGTCTAT	550
ATAAGCAGAG	CTCGTTTAGT	’-αΛΛν.'—X U.AAj	ATCGCCTGGA	GACGCCATCC	ACGCTGTTTT	720
GACCCCCAC A	GAAGACACCG	GGACCGATCC	> /^r»»»T**w·* Alas-x	GCCGGGAACG	GTGCATTGGA	730
	CCCSTGCCAA	GAGTGACGTA	AGTACCGCCT	·* T»n t·^ ζ·κ/·η»ιι Λ ·Λ«Λ« X U.	TAGGCCCACC	340

CCGTTGGCTT CTTATGCATG CTATACTGTT TTTGGCTTGG GGTCTATACA CCCCCGCTTC 500

CTCATGTTAT AGGTGATGGT ATAGCTTAGC CTATAGGTGT GGGTTATTGA CCATTATTGA 350

CCACTCGGCT ATTGGTGACG ATACTTTCCA TTACTAATCC ATAACATGGC TCTTTGCGAC 1020

AACTCTCTTT ATTGGCTATA TGCCAATACA CTGTCCTTCA GAGACTGACA CGGACTCTGT 1030

ATTTTTACAG	GATGGGGTCT	CACTTAT7A7	TTACAAATTC	ACATATACAA	CACCACCGTC	1140
CCCAGTGCČC	GCAGTTTTTA	TTAAACATAA	Λ/·»^ΑΛΧΙ\|·» U.«j x UWAi w -	UsXIUjWx/AAx	CxC wGGTAC «7	1200
TGTTCCGGAC	ATGGGCTCTT	CTCCGGTAGC		CTACATCCGA	U3V» w^ xujik· -'«-'w.	1250
CATGCCTCCA	GCGACTCATG	Lí •U«jw'«	Awv« « <·«· X» «'J'·	TCCTAACAGT	Z*** * Λχ»ζ»χ«η UíŠj AUu\· .-Αχ» λ	1220
CCTAGGCACA	GCACGATGCC	CACCACCACC	Aua'JXⁱO'»m«J'·	ACAAGGCCGT	Ζ·ΛΖ>ΛΖ»Λ*/·»·Ζ· U»\3V.U»W XZlWXJW	1230
TATGTGTCTG t	AAAATGAGCT	U. wvjv/vj Aux»um	GCTTGCACCG	'^^GACGCAT^^	TGGAAGACTT	1440
AAGGCAGCGG	CAGAAGAAkrA	TGCAGGCAGC	l\«Aů x' Συ» r · s»	TGTTCTGATA	AGAGTCAGAG	1500
GTAACTCCCG	TTGCGGTGCT	GTTAACGGTG	(jAmwW^Aw fcU#	TAGTCTGAGC	AGTACTCGTT	1550

GCTGCCGGGC GC3CCACCAG ACATAATACC TGACAGACTA ACAGACTGTT CCTTTCCATG 1520 GGTCTTTTCT GCAGTCACCG TCCTTAGATC TGCTGTGCCT TCTAGTTGCC AGCCATCTGT 1530 TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC 1740 CTAATAAAAT GAGGAAATTG CATCGCATTG TC7GAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG 1300 TGGGGTGGGG CAGCACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA 13S0 TGCGGTGGGC TCTATGGGTA CGGCCGCAGC GGCCGTACCC AGGTGCTGAA GAATTGACCC 1320 GGTTCC7CGA CCCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CCGCCCCCC? 1330 GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCSAC AGGACTATAA 2040 AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG 2100

157

CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCGCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA

CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC GGTG7AGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA

CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG

GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG CAGAGCGAGG

TATGTAGGCG GTGC7ACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG

ACAG7ATTTG GTATCTGCGC TCTGC7GAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC

TCTTGATCCG GCAAACAAAC CAGCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG

ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GTGATCCCGT

AATGCTCTGC CAGTGTTACA ACCAATTAAC CAATTCTGAT TAGAAAAACT CATCGAGCAT

CAAATGAAAC 7GCAATTTAT TCATATCAGG ATTATCAATA CCATATTTTT GAAAAAGCGG

TTTCTGTAAT GAAGGAGAAA ACTCACCGAG GCAGTTCCAT AGGATGGCAA GATCCTGGTA

TCGGTCTGCG ATTCCGACTC GTCCAACATC AATACAACCT ATTAATTTCC CCTCGTCAAA

AATAAGGTTA TCAAGTGAGA AATCACCATG AGTGACGACT GAATCCGGTG AGAATGGCAA

AAGC7TATGC ATTTCTTTCC AGACTTGTTC AACAGGCCAG CCATTACGCT CGTCATCAAA

ATCACTCGCA TCAACCAAAC CGTTATTCAT TCGTGAITGC GCCTGAGCGA GACGAAATAC

GCGATCGCTG TTAAAAGGAC AATTACAAAC AGGAATCGAA TGCAACCGGC GCAGGAACAC

TGCCAGCGCA TCAACAATAT TTTCACCTGA ATCAGGATAT TCTTCTAATA CCTGGAATGC

TGTTTTCCCG GGGATCGCAG TGGTGAGTAA CCATGCATCA TCAGGAGTAC GGATAAAATG

CTTGATGGTC GGAAGAGGCA TAAATTCCGT CAGCCAGT7T AGTCTGACCA TCTCATCTGT

AACATCATTG GCAACGCTAC CTTTGCCATG TTTCAGAAAC AACTCTGGCG CATCGGGCTT

CCCATACAAT CGATAGATTG TCGCACCTGA TTGCCCGACA TTATCGCGAG CCCATTTATA

CCCATATAAA TCAGCATCCA TGTTGGAATT TAATCGCGGC CTCGAGCAAG ACGTTTCCCG

TTGAATATGG CTCATAACAC CCCTTGTATT ACTGTTTATG TAAGCAGACA GTTTTATTGT

TCATGATGAT ATATTTTTAT CTTGTGCAAT GTAACATCAG AGATTTTGAG ACACAACGTG

2150

2220

2230

2340

2400

2450

2520

2530

2540

2700

2750

2320

2330

2940

3000

3050

3120

3130

3240

3300

3350

3420

3430

3540

547

Zastupuje:

fy - fy

- 158 -

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1) VU-5IYMAC?g1,0-28 , s místem spojení řetězce č. 82

1) Vl.Ins-ggg-grrHIB- s místem spojení řetězce č. 77 •ý-CTT AGA TC/ CAC CAT GGG TGC GAG AGC GTC AGT ATT AA GCG GGG CMVintA gag

-GGA GAA TTA GAT CGA TGG GAA AAA ATT...-3’ a řetězec č. 78

1. Polynukleotid, který po zavedení do buněk savců vyvolává.současnou expresi produktů nejméně dvou genů v buňkách, polynukleotid je tvořen prvním promotorem pro transkripci proti směru exprese pro řízení transkripce prvního cistronu, druhým cistronem směrem po směru exprese od prvního cistronu, pod řízením transkripce prvním promotorem pro transkripci nebo druhým promotorem pro transkripci a popřípadě třetím cistronem po směru exprese od druhého cistronu při řízení transkripce prvním promotorem, druhým promotorem nebo třetím promotorem pro transkripci a z terminátoru transkripce za prvním, druhým i třetím cistronem.

2~. ?oLynukiectid, vyvolávající tvorců neutralizačních protilátek proti HIV, reakci I-cur.ěk, specifických proti HIV něco ochrannou reakci imunitního systému pa zavedeni do tkáně obratlovců včetně lidské tkáně in vivo, poiynuk, ieotid je tvořen genem s kódovou sekvencí pro produkt ze skupiny HIV gag, gag-proteáza a env, přičemž gen obsahuje prvek RRE, reagující na přítomnost REV a je operativně spojen s promotorem transkripce, '/hodným pro expresi genu u savců, gen je rovněž spojen s místem pro vstup do ribosomu, IRES a toto místo je spojeno s druhým genem s kódovou sekvencí pro produkt genu REV.

26. Vakcína pro vyvolání imunitní odpovědi proti infekci HIV, v y z n a č u j í c í se t i m , 2s obsahuje polynukleotid podle nároku 1 a farmaceutický nosič.

167

27. Polynukleotíd, který je tvořen

a) eukaryotickým promotorem transkripce,

b) otevřeným čtecím rámcem 3 -vzhledem k promotoru transkripcs s kódovou sekvencí pro imunogenní epitop HIV, přičemž otevřený Čtecí rámec obsahuje místo sestřihu na S -straně otevřeného čtecího rámce, dále obsahuje prvek, reagující na přítomnost REV kdekoLiv v otevřeném čtecím rámci a stop kodon pro ukončení translace otevřeného čtecího rámce,

c) místem pro vstup do ribosomu, IRES, 3'- od stop kodonu pro translaci otevřeného čtecího rámce,

d) otevřeným čtecím rámcem s kódovou sekvencí pro gen HIV REV po sestřihu na jehož 3 -konci je stop kodon pro translaci,

e) popřípadě 3' od stop kodonu pro translaci REV- ještě druhým místem IRES, následovaným otevřeným čtecím rámcem s kódovou sekvencí imunomodulačního nebo imur.cstimulačního genu ze skupiny genů pro C-M-C3F, IL-L2, interferon a bílkovinu 37,

f) signálem pro ukončení transkripce, uloženým za posledním otevřeným Čtecím rámcem.

27. Polynukleotíd, tvořený kódovými sekvencemi, ze skupiny

a) signál pro počátek transkripce v eukaryotícké buňce,

b) otevřený čtecí rámec ORF genu HIV, před nímž je uložen heterologní vedoucí řetězec, takže exprese genu ORF HIV nezávisí na přítomnosti produktu genu HIV REV,

168

c) sekvence vstupu do ribosomu, IRES, 3' od stop kodonu pro translaci HIV ORF,

d) kódová sekvence pro ORF pomocného stimulačního prvku

T-buněk 3' vzhledem k IRES a

e) terminátor transkripce 3 vzhledem ke stop kodonu pro translaci pomocného stimulačního prvku T-bunšk.

28. Polynukleotid podle nároku 27, v němž gen HIV ORF v odstavci b) je tPAgpl20 nebo tPAgpl6O.

29. Polynukleotid, tvořený následujícími kódovými sekvencemi:

a) eukaryotický signál pro počátek transkripce,

b) otevřený čtecí rámec genu HIV, před nímž je uložena heterologní vedoucí sekvence, takže exprese ORF genu HIV není závislá na přítomnosti produktu genu HIV REV,

c) sekvence vstupu do ribosomu, IRES, 3* vzhledem ke stop kodonu pro translaci HIV ORF,

d) otevřený čtecí rámec ORF genu HIV, před nímž je uložena heterologní vedoucí sekvence, takže exprese HIV ORF není závislá na přítomnosti produktu genu HIV REV a

e) signál pro ukončení transkripce 3” od štip kodonu pro translaci genu HIV ORF.

30. Prostředek, vyznačující se tím , že obsahuje větší počet konstrukcí pro expresi, z nichž každá ve tkáni savce vyvolává expresi více než jednoho cistronu s kódovou sekvencí pro antigeny ve vztahu k pathogenním organismům, vyvolávajícím onemocnění nebo ve vztahu k nádorům.

169

31. Polynukleotidová konstrukce, znázorněná na obr. 2, k níž první, druhý a třetí cistron obsahují kódové sekvence, které jsou kombinacemi kterýchkoliv dvou nebo tři následujících sekvencí:

S?A-gpl20 MN,

SPiS0-_zr3/IRES/REV-.g?130---rev—

2’CCC ACA GCA GAT CA/ C CTA GGT TAG CCT TC? TCT AAC CTC TTC CTC

BGH ítsf....

TGA GAG GCG TG A CTT* GCT TCC AAC TCT TCT GGG TAT CTA G-3'

π) Vllns-rgtÍrevfenv: . s místem spojení řetězce č. 86 5'-ACC CTC CTT AGA TZ TC GAC ATA CGA CAA TAG GCC TTA CTC CAC A.CA

CMVintA cadrzvíeirs

GGA GAG GAA CAA ATC GaG CGA CTA. GAT CCT AGA CT.A GAG CCC TC·:

a řstezec 5. 87 :'-GGC A.CA. GCA. GAT G C GAG ATG CTC CTC CGA CG BGH zadmi env

CA.'

CTG CTG-?.

2. Polynukleotid podle nároku 1, v němž první cistron obsahuje kódovou sekvenci alespoň jednoho imunogenního epitopu antigenu, spojeného s pathogenním mikroorganismem nebo nádorem.

3. Polynukleotid podle nároku 2, v němž kódový řetězec je odvozen od viru.

4. Polynukleotid podle nároku 3, v němž kódový řetězec je odvozen od viru lidské imunodeficience HIV.

5 . tat/REV/gplSO (kl on genomu III3, u nějž dochází expresi gplSO), 6 . REV/gplSO, ** / . ^s?LSQMN’ 8 . gploO z primárníc h klinických izolátů HIV, o . nef, při použiti genu klinicky získaných kmenů, 10. gag----, k získán ,í CTL proti gag, 1 * L í- . z?A-gp120---3, k provedení zkoušek,

5’-TCA CCG TCC TTA GAT C/ GGT ACA ACC ATG GGT GGA GCT ATT TCC ATG

CMVintA nef.....

AGG CAA TCC AAG CCC GCT GGA GAT CTG ACA GAA A-3*

- 166

-<

co α>

G

5'-GGC ACA GCA GAT CT/ TTA CAT TAA TCT AGC CTT CTG TCC CGG TCC-3’ BGH p28 gag tn) VLI-STVMAC?51ggf, s místem spojení řetězce č. 84

5-TCA CCC TCC TTA GAT CT/ ACC ATG GGA CCA GTA CAA CAA ATA GCT

CMVintA p28 gag....

GGT AAC TAT GTC CAC CTG CCA TTA AGC CCG AGA ACA-3' a řetězec č. 83

5'-GGC ACA GCA GAT C/ CAC GTG TTA GCG CTT TTC TCT CTC CAC CAC-3’ BGH gpl20MN

5'-TTC GTT TCG CCC AGC GA/ TCA CAG AAA AAT TGT GGG TCA CAG TC-3' tPA gplZOMN a řetězec č. 81

5-TCA CCG TCC TTA G AT Q ACC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC CMVintA tPA vedoucí sekvence

TGT GTG ČTG CTG CTG TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG CCC AGC GA/ G ATC

BGH -TGC TGT GCC TTC TAG TTG CCA GCC-3*

k) Vl.Jns-tPA-gpl2<lMN, s místem spojení řetězce 80

5-GGC ACA GCA GAT C/ CGC CCG GGC TTA CAT CTC TCT ACA AAT TTC TAC

BGH prt TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC...-3’

165

j) Vl.Ins-tPA. s místem spojení řetězce S. 79

5’-GGC ACA. GCA GAT C/ CGC CCG GGC TTA CAT CTC TCT ACA .AAT TTC TAC

BGH prt

TAA TGC TTT TAT TTT TCT TCT GTC...-3’

5’-CTT AGA TC; C CCG CAC GGC AAG AGG CGA GGG GCG GCG ACT GGT-3’

CMVintA gag (SD) a řetězec č. 76

5’-GG A ATT/ TGA GTC ATC / CCC ATC TTA TAG CAA AAT CCT TTC CAA -3' IRES gplóO

h) VIJns-gag-flrrnTBÍSDk s místem spojení řetězce č. 75

5'-GGC ACA GCA GAT.C/ AG ATG GGG ATC TGA TA TCG CAC TAT TCT TTA

BGH rev

GCT GCT GAC TCC TGA CTC-3’ a řetězec č. 74

5- AGA TCT A AGG ACG GTG ACT GCA / TGT ACT ACT TAC TGC TTT GAT

CMVintA tatlrev SD

AGA GGA CGG TGA / CTG CAG AAA AGA CCC ATCLGAA A-3'

CMVintA

164

g) ^v 1 .Ins-gp 1 óOuTB/TRES/rgyTTTB-fSP). s místem spojení řetězce, č.73

5-CTC GAG CCA TGG GCC CCT/ AGA CTA TAG CGT GAT .AAG AAA TCG AGG pGEM-3 rev ,\CT GAG GTT ATA ACA TCC TCT AAG GTG GTT ATA AAC TCC CGA AGG-3'

e) pGEM-3-RRE/IRES/rgvHTB. s místem spojení řetězce č. 68 5‘-TTG CAT GCC TGC AGG TZ GGT ACA TGA TCA GAT ATC G CCC GGG / C pGEM-3 RRE

CGA GAT CTT CAG ACT TGG AGG AGG AGA TAT GAG GGA CAA TTG GAG-3'

IRES-5’ a řetězec č. 69 ;-GGG GCG GAA TTZ T AGA GTC A/ AT? GAT CAG CTT GTG TAA TTG TTA

RRE-3’

ATT TCT CTG TCC CAC TCC ATC CAG GTC GTG TGA TTC...-3’

f) VUns-^taf/rgy SP\ s místem spojení řetězce č. 71

5’-TAT GGC CAC AAC CZ AT GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA

IRES rev

CCT CCT CAA GGC AGT CAG ACT -3' a řetězec S. 66

5’-CAT GCC TGC AGG TCG ACT CTA/ AAT TCC G...

pGEM-3 (SP6) IRES a' řetězec Č. 63 y-A CCC CGG GAT CCT CTZ A GCG CGC TTG TCT CTT GTT CCA...

pGEM-3 (T7) IRES

163 cl) pGEM-3-mES/rgvlIIB, s místem spojení řetězce S. 65

5'-CTG GCA ACT AGA AGG CAC AGC AGA TC/ A GAT AGT GTC CCC ATC TTA

BGH gplóO

TAG CAA .AAT CCT TTC CAA GCC CTG TCT TAT TCT-3'

c) ggEM-HKES, s místem spojení řetězce č. 62

5’-CTT AGA TC/ A ACC ATG AGA GTG .AAG GA GAA ATA TCA GCA CTT GTC

CMVinta gplóO

GAG ATG GGG GTG GAG ATG GGG CAC CAT GCT CCT TGG GAT GTT GAT GAT CTG TAG TGC TAC AGA .AAA ATT GTG· GGT-3'.

a. řetězec ě. 59

5'-GATGGC TGG CAA CTA GAA GGC ACA GCA GAT CTz GAT ATC GCA CTA

BGH ^rsvTTC TTT AGC TCC TGA CTC CAA TAT TCT-3'

b) YUns-gp160THB. s místem spojení řetězce č. 58:

5'-GGA GAC AGC GACGAA GAC CTC CTC AAG GCA GTC AGA CTC ATC AAG-3’. a řetězec č. 57

5. Polynukleotid podle nároku 2, v němž první cistron je tvořen kódovou sekvencí genu viru lidské imunodeficience ze skupiny env, gag, gag/pol, gag/proteáza nebo gag a část pol s výjimkou kódové sekvence pro funkční polymerázu nebo je první cistron tvořen sekvencí genu pól.

159

6. Polynukleotid podle nároku 1, v němž druhý cistron je tvořen kódovou sekvencí viru lidské imunodeficience, přičemž jde o sekvenci REV v případě, že první cistron je tvořen kódovou sekvencí genu HIV, jehož účinná exprese v buňkách je závislá na přítomnosti produktu genu REV.

7* >

Ο co.

<' .Π

ΣΕ

Ο to« •Μ

Ο ο

crx

Γ“

Ο ο>

) re ο<

a ratsssc č.

SS

7. Polynukleotid podle nároku 6, v němž první cistron je tvořen kódovou sekvencí pozdního genu HIV ze skupiny env, gag a pol. 8. Polynukleotid podle nároku 7, v němž první cistron

je tvořen kódovou sekvencí HIV gpl6O, gpl2O, gp41, gpl2O bez místa vazby CD4 a HIV env s imunologicky pozměněnou smyč· kou V3, která obsahuje změnu, týkající se glykosilace nebo jsou substituovány koncové části smyčky V3.

9. Polynukleotid podle nároku 6, v němž třetí cistron je tvořen kódovou sekvencí pro cytokin nebo pomocným stimulačním prvkem pro T-buňky.

10. Polynukleotid podle nároku 9, v němž sekvencí pro cytokin je sekvence pro interferon, GM-CSF nebo interleukin.

11. Polynukleotid podle nároku 9, v němž sekvencí pro pomocný stimulační prvek pro T-buňky je kódový gen pro bílkovinu B7.

12r Polynukleotid podle nároku 1, v němž první cistron je tvořen kódovou sekvencí pro epitop viru lidské imunodeficience, nezávislý na REV, druhý cistron je tvořen kódovou sekvencí pro cytokin a třetí cistroj je tvořen kódovou sekvencí pro pomocný stimulační prvek pro T-buňky, přičemž cistrony mohou být zařazeny také v odlišném pořadí.·

160

13. Polynukleotid podle nároku 12, v němž druhý cistron je tvořen kódovou sekvencí pro interferon nebo GM-CSF a třetí cistron je tvořen kódovou sekvencí pro bílkovinu B7.

14. Polynukleotid podle nároku 1, v němž je druhý nebo třetí cistron uložen pod řízením transkripce promotorem transkripce, uloženým proti směru exprese od prvního cistronu a proti směru exprese od druhého a třetího cistronu je uložena sekvence s funkcí místa vstupu do ribosomu, IRES, pro účinnou translaci druhého a třetího cistronu nebo mRNA se dvěma nebo třemi cistrony po transkripci od prvního cistronu přes druhý a třetí cistron až do terminátoru transkripce za druhým nebo třetím cistronem.

15. Polynukleotid podle nároku 14, v němž se sekvence IRES volí ze sekvence IRES viru encephalomyocarditidy EMCV, IRES viru puchýřnatosti vepřů a IRES polioviru.

16. Polynukleotid podle nároku 14, v němž první cistron je tvořen kódovou sekvencí genu viru lidské imunodeficience HIV, závislého na REV, druhý cistron je tvořen kódovou sekvencí REV a třetí cistron je tvořen kódovou sekvencí pro pomocný stimulační prvek pro T-buňky nebo pro cytokin a mimoto je před prvním cistronem uložen promotor transkripce a před druhým a třetím cistronem je uložena sekvence IRES bez promotoru transkripce.

17. Polynukleotid podle nároku 16, v němž je první cistron tvořen kodovou sekvencí pro gp!60 pro HIV, před prvním cistronem je bezprostředně uložen časný promotor cytomegaloviru, druhý cistron je tvořen kódovou sekvencí REV HIV, třetí cistron je popřípadě tvořen kódovou sekvencí pro interferon, GM-CSF, interleukin nebo bílkovinu B7.

18. Polynukleotid, tvořený sekvencí nukleové kyseliny, která není schopna replikace v eukaryotických buňkách,

161 avšak je schopná exprese za vzniku produktu genu po uložení polynukleotidu do eukaryotické tkáně in vivo, kde produkt genu působí jako imunostimulační látka nebo jako antigen, schopný vyvolat reakci imunitního systému, sekvence nukleové kyseliny obsahuje kódovou sekvenci pro gen REV po sestřihu, imunogenní epitop viru lidské imunodeficience HIV po sestřihu a popřípadě rozpoznávací prvek pro T-buňky nebo sekvenci pro cytokin.

19. Polynukleotid podle nároku 18, v němž se imunogenní epitop HIV volí ze skupiny gag, gag-proteáza nebo env nebo imunogenní část této sekvence, jako cytokin je obsažena sekvence pro interleukin 12 a jako sekvence pro pomocný stimulační prvek pro buňky je obsažena sekvence pro bílkovinu B7.

20. Polynukleotid podle nároku 19, v němž se imunogenní epitop volí ze skupiny HIV gpl60, gpl20 a gp41.

21. Polynukleotid podle nároku 19, v němž imunogenní epitop gag je pl7, p24 nebo pl5.

22. Polynukleotid, tvořený prvním genem s kódovou sekvencí pro HIV gag, gag-proteáza nebo imunogenní epitop env, přičemž gen obsahuje prvek RRE, odpovídající na přítomnost REV nebo je modifikován tak, že obsahuje RRE, gen je operativně vázán na promotor transkripce, vhodný pro expresi genu u savce a mimoto je vázán na místo vstupu do ribosomu IRES a toto místo je vázáno na gen s kódovou sekvencí pro produkt genu REV.

23. Polynukleotidová konstrukce- s. následující sekvencí

162

a) VLIns-rgvinB. , s· místem spojeni řetězce č. 56

12. s?4l ke specifickému vyvolání tvorby neutralizačníoh protilátek proti gpai, zvláště epitep pro monoklcnáini protilátku 2F3, uložený těsně před transmemoránovcu oblastí, široce konzervovanou v celé řadě kmenů. Ixprese tohoto peptidu je v nepřítomnosti gp!2O obtížná a vyžaduje řadu manipulaci, bylo například prokázáno, že epitop 2F3, sestřižený do konečné části smyčky chřipkového viru HA může vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek proti HIV, jiným možným přístupem je zařazení

170 příslušných vedoucích řetězců, například signálního peptidu t?A, čímž je možno dosáhnout exprese produktu tohoto genu,

14. gag, jde o podobnou konstrukci jako v odstavci 5 pří použití klinicky tiskaných kmenů,

15. rev pro dicistronovou konstrukci s obsahem gpiSO a gag, 15. kódová sekvence 37,

12. gploO se strukturními mutacemi: náhrada smyčky 73 z klinicky získaných kmenů HIV, řada mutací na různých konstrukcích, například různé odstranění smyčky, mutace Asn k odstranění stařičké zábrany strukturních epitopů pro neutralizační protilátku a mutanty, které vyřazuji miste vazby CD4,

13.

sekvence C-M-G27, interleukinavé sekvence, zvláště ty, které obsahují kódové sekvence prc 11-12, antigeny, spojené s nádorovými buňkami.

geny pro antigeny, k jejichž expresi dochází u jiných pathogenů než HIV, například nukíeccrctein, hemagiutinin, matrice, neuraminibáza a další antdgenni dílkovány chřipkového viru, geny viru oparu, geny lidského papiilomaviru, antigeny bakterii tuierkuicsy, antigeny víru hepatitidy A, 3 a C a kcnci.oace těchto látek a (dalších antigenů pro tvorbu nejméně dioistroncvých konstrukcí, které je možno misi: s celou řadou dalších polycistranových konstrukci ta vzniku prcstřec ku, který takovou směs obsahuje a kter· imunitní reakci proti všem antigenům z genních organismů nebo proti nádorovým přičemž segmenty A a 3 r.a obr. 2 jsou míst mu nebo kombinace terminátoru transkripce směru exprese a promotor transkripce pro t nu po směru exprese.

ý může vyvc lat uvedených pat.no- a vstupu do ribosopro oistron proti ranskripci cistroóastupuje: