KR970701782A - 생체내에서 유전자의 통합성 발현(Coordinate in vivo gene expression) - Google Patents

생체내에서 유전자의 통합성 발현(Coordinate in vivo gene expression)

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KR970701782A
KR970701782A KR1019960704941A KR19960704941A KR970701782A KR 970701782 A KR970701782 A KR 970701782A KR 1019960704941 A KR1019960704941 A KR 1019960704941A KR 19960704941 A KR19960704941 A KR 19960704941A KR 970701782 A KR970701782 A KR 970701782A
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마가렛 에이 리우
존 더블유 쉬버
헬렌 씨 페리
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다니엘 마크 알
머크 앤드 캄파니, 인코포레이티드
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Abstract

동물 조직내로 작접 도입시 2또는 3개의 시스트론의 통합성 발현을 유도할 수 있는 DNA 작제물 및 RNA 전사체를 포함하는 핵산이 된다.본 발명의 이-또는 삼-시스트론성 폴리뉴클레오타이드는, HIV 유전자생성물, HIV와 관련되지 않은 항원을 코드하는 유전자 및 GM-CSF, 인터루킨 및 T-세포 공자극 인자로서 작용하는 B7계 단백질의 일원을 포함하는 면역자극성 유전자 생성물을 코드하고 공동발현시키는 ㅍㄹ리뉴쿨레오타이드를 포함한다. 본 발명의 방법 및 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 단일 세포 내에서의2개 이상의 유전자의 통합성 발현에 이용될 수 있다.

Description

생체내에서유전자의 통합성 발현(Coordinate in vivo gene expression)
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 HIV 게놈을 나타낸 개략도이다.
제2도는 3개의 시스트론(Ⅰ,Ⅱ및 Ⅲ)각각에 의해 코드되는 3개이하의 유전자 생성물의 생체내 단일세포내에서의 통합성 발현을 유도할 수 있는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 작제물을 나타낸 개략도이다. 단편 A 및 B 는 전사 종결 시그날 프로모터 또는 내부 라이보좀 도입 위치(IRES)를 포함하는 조절 서열을 나타낸다. 제3도는 CMV-intA 전사 프로모터, 5'-스플라이싱 공여체, (gh120,gp41 및 REV-반응성 원소, RRE를 보여주는) HIV gp160, 내부 라이보좀 도입 위치(IRES),REV 시스트론, BGH 전사 터미네이터 및 원핵 세포 전사 프로모터에 의해 유도되는 네오마이신 내성 마커를 포함하는 HIV env 폴리뉴클레오타이드 면역원 작제물을 상세히 나타낸 도이다.
제5도는 HIV 폴리뉴클레오타이드 면역원에 의해 유도된 gp160의 웨스턴 블럿 분석도이다. 이 결과는 단일 폴리뉴쿨레오타이드 작제물의 하나 이상의 유전자 생성물의 단일 세포내에서의 공발현을 보여준다. gp160만을 코드하는 폴리뉴클레오타이드(패널B참조, 왼쪽으로부터 4번째 레인) 는 측정 가능한 GP160을 발현하지 않고, (REV만 코딩하는 작제물의 공형질감염에 의해)REV를 트랜스로 첨가하면, 양호한 gp160 발현이 나타난다.(팬널 A, 왼쪽에서 네번재 라인). 게놈성 tex/REV/env 작제물은 REV 가 트랜스로 제공되든 그러하지 아니하든 gp160이 낮은 수준으로만 발현된다.(팬널A 및 B, 세번째 라인). 그러나, 이시스트론성 gp160/IRES/REV 작제물은 gp160을 고발현시킨다.(팬널 A 및 B, 왼쪽에서 다섯번째 레인). gp160 코딩 서열의 5'쪽에 제공된 스플라이싱 공여체(SD)가 있는 gp160/IRES/REV을 코딩하는 이시스트론성 작제물에서 최고로 벌현돤다.(팬널 A 및 B, 오르쪽레인). 추가의 REV가 트랜스로 제공되는 경우(팬널 A,오른쪽레인) 더이상의 발현이 이루어지지 않기 때문에 시스템은 발현된 REV 수준에 의해 제한되지 않는다.
제7도는 V1Jneo 서열을 나타낸 도이다.

Claims (44)

  1. 진핵세포에서 제1시스트론의 상부의 존재하고 전사조절을 작동시키는 제1전사 프로모터;제1 시스트론의 하부에 존재하고, 제1전사 프로모터 또는 제2전자 프로모터의 전사 조절하에 있는 제2시스트론; 제2시스트론으 하부에 존재하고, 제1전사프로모터, 제2전사 프로모터 또는 제3전사 프로모터의 전사 조절하에 있는 임의의 제3시스트론; 및 제1, 제2 및 제3 시스트론 각각에 수반되는 전사 터미네이터를 포함하고, 포유동물 세포내로 도입시 세포내에서 2개 이상의 유전자 생성물의 공동발현을 유도하는 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 제1 시스트론이 병원체 또는 암 관련 항원의 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포드하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제2항에 있어서, 병원체가 바이러스인 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제3항에 있어서, 바이러스가 사람 면역결핍 바이러스(HIV)인 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제2항에 있어서, 제1 시스트론이 env,gag/pol,gag/프로테아제,gag 및 작용성 폴리머라제를 코드하지 않는 pol의 일부분, 및 pol중에서 선택되는 사람 면역결핍 바이어스(HIV)유전자를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항에 있어서, 제2시스트론이, 제1시스트론이 HIV 유전자를 코드하고 이의 효과적인 발현이 HIV유전자를 발현시키는 세포내에서 REV 유전자 생성물의 이용가는성에 의존 하는 경우, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) REV 유전자를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제6항에 있어서, 제1시스트론이 env,gag 및 pol중에서 선택되는 HIV후기 유전자를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제7항에 있어서, 제1 시스트론이 HIV gp160, HIV gp120, HIV gp41, CD4 결합 부위가 부족한 HIV gp120 및 변형된 글리코실화 패턴 또는 치환된 V3 루프 팁을 갖는 면역학적으로 변형된 V3를 가진 HIV env를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제6항에 있어서, 제3시스트론이 사이토카인 또는 T-세포 공자극 인자를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 사이토카인이 인터페론, GM-CSF 또는 인터루킨인 폴리뉴클레로타이드.
  11. 제 9항에 있어서, T-세포 공자극 인자가 B7 단백질을 코드하는 유전자인 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제1항에 있어서, 제1시스트론이 REV-독립성 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에피토프를 코드하고, 제2시스트론이 사이토카인을 코드하고, 제3시스트론이 T-세포 공자극 인자를 코드하며, 각 시스트론이 순서를 바꿔 존재할 수 있는 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 제2시스트론이 인터루킨,인터페론 또는 GM-CSF를 코드하고, 제3 시스트론이 B7 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제1항에 있어서, 제2시스트론또는 제3시스트론이 제1시스트론의 상부의 전사프로모터의 전사 조절하에있고, 제1시스트론을 시작으로 제2시스트론 및 제3시스트론을 각각 통과하여 제2시스트론 및 제3시스트론 다음의 전사 터미네이터까지 전사된 이- 또는- 삼- 시스트론성 전령 RNA 상에의 제2시스트론 및 제3시스트론의 효과적인 해독을 수행하기 위한 내무 라이보좀 도입 부위(IRES)의 기능을 갖는 서열이 제2시스트론 및 제3시스트론 각각의 상부에 제공되는 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, IRES 가 뇌심근염 바이러스 (EMCA)IRES, 돼지 소포성 바이러스 IRES 및 폴리오바이러스 IRES중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제14항에 있어서, 제1시스트론이 사람 면역결핍 바이러스(HIV)REV의 존성 유전가를 코드하고, 제2시스트론이REV를 코드하고, 제3시스트론이 T-세포 공자극 인자 또는 사이토카인을 코드하고, 추가로 제1시스트론 전방에 전사 프로모터가 선행하고 제2시스트론 및 제3시스트론 전방에 각각 IRES가 선행하고 제2시스트론 및 제3시스트론에 전사 프로모터가 없는 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, 제1시스트론의 전방HIV gp160을 코드하고, 제1시스트론의 전방에 사이토메칼로바이러스 초기 프로모터가 선행하고, 제2시스트론이 HIV REV를 코드하고, 임의의 제3시스트론이 인터페론, GM-CSF, 인터루킨 또는 B7 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  18. 진핵세포에서는 복제할 수 없으나 진행 세포 조직내로 폴리뉴클레오타이드를 도입하여 생체내에서 발현되어 면역자극제로서 또는 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원으로 작용할 수 있는 유전자 생성물을 생성할 수 있는 인접한 핵산 서열을 포함하고, 이 핵산 서열이 스플라이싱된 REV 유전자, 스플라이싱된 사람 면역결핍바이러스(HIV) 면역원성 에피소드, 및 임의로 사이토카인 또는 T- 세포 인자를 코드하는 폴리뉴클레오타니드.
  19. 제 18항에 있어서, HIV 면역원성 에피토프가 gag,gag-프로테아제, env 도는 이의 면역언성 부분중에 서 선택되고, 사이토카인이 인터루킨-12이고, T-세포 공자극 인자가 B7 단백질인 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제 19항에 있어서, env 면역원성 에피토프가 HIV gp160, HIV gp120및 HIV gp41중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제19항에 있어서, gag 면역원성 에피토프가p17, p24 또는 p15 인 폴리뉴클레오타이드.
  22. HIVgag,gag-프로테아제 또는 env 면역원성 에피토프를 코드하는 제1유전자, REV 반응성 인자(RRE) 를 함유하거나RRE 를 함유하도록 개질딘 유전자, 포유동물에서 유전자 발현에 적합한 전사 프로모터와 작동성으로 연결된 유전자, 내부라이보좀 도입 부위 (IRES) 와 연결된 유전자 및 REV 유전자생겅물을 코드하는 유전자와 연결된 IRES 를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  23. 하기 폴리뉴클레오타이드 작제물:
  24. 사람조직을 포함하는 척추동물 조직 내로 도입하면 생체내에서 항-HIV중화 항체, HIV 특이성 T-세포 면역 반응 또는 예방적 면역반응을 유도하고, HIV gag,gag-프로테아제 또는 HIV env 중에서 선택되는 유전자 생성물을 코드하는 유전자, REV 반응성 인자(RRE)를 함유하는 유전자, 포유동물에서 유전자 발현에 적합한 전사 프로모터와 작동성으로 연결된유전자, 내부 라이보좀 도입 부위(IRES) 와 연결된 유전자 및 REV 유전자 생성물을 코드하는 제2유전자와 연결된 IRES를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제1항의 폴리뉴클레오타이드 약1㎎ 내지 약100㎎을 척추동물 조직내로 도입시키는 것을 포함하여, 2개 이상의 유전자 생성물을 단일세포 생체내에서 공동발현시키는 방법.
  26. 제6항의 폴리뉴클레오타이드 약1㎎ 내지 약100㎎을 척추동물 조직내로 도입시키는 것을 포함하여, 척추동물에서 HIV 에피토프에 대한 면역반응을 유도하는 방법.
  27. 제14항의 폴리뉴클레오타이드 약1㎎ 내지 약 100㎎을 척추동물조직내로 도입시키는 것을 포함하며, 척추동물에서 HIV 에피토프에 대한 면역반응을 유도하는 방법.
  28. a) REV 의존성HIV 유전자를 단리하고; b) 유전자를 생조직내로 도입하는 경우 단리된 유전자의 전사를 개시시킨후 해독시키는 조절 서열과의 작동적으로 연결에 의해 유전자가 발현가능도록 하는 조절 서열을 단리된 유전자와 연결하고;c) 발현가능한 유전자를 생조직내로 도입하고;d) HIV REV 를 코드하는 유전자를 HIV REV 의존성 유전자에 대해 트랜스 또는 시스로 도입하는 것을 포함하는, REV 의존성 HIV유전자를 사용하여 면역반응을 유도하는 방법.
  29. 제28에 있어서, 추가의 발현가능한 HIV 유전자로 추가항원자극하거나, 재조합 정제된 HIV 유전자 생성물로 추가항원자극하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제28에 있어서, REV-의존성 HIV 유전자가 gag 또는 env 유전자 생성물을 코드하는 방법.
  31. 유도된 면역 반응이 제1HIV 균주에 의한 감염 및 제1균주와 이종인 균주에 의한 감염을 중화시키도록 제1HIV균주로부터의 HIV 유전자를 척추동물 조직내로 도입하는 것을 포함하고, HIV 유전자가 보존된 REV의존성 HIV 에피토프를 코드하고, 기능성 REV가 시스 또는 트랜스로 제공되는, HIV 유독성균주에 의한 감염 또는 질환에 대한 면역반응을 유도하는 방법.
  32. 제1항의 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 HIV감염에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 백신.
  33. 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 영장류의 조직내로 도입시키고 동시에 인터루킨 12를 비경구적으로 투여하는 것을 포함하여 영장류에서 항-HIV 면역반응을 유도하기 위한 방법.
  34. 제33항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드의 제1시스트론이 HIV gp160을 코드하고, 폴리뉴클레오타이드의 제2시스트론이 HIV REV를 코드하고, 폴리뉴클레오타이드의 제3시스트론이 B7을 코드하는 방법.
  35. a) 진핵세포 전사 프로모터; b) 오픈 판촉 프레임의 5'측의 스플라이스공여체 서열, 오픈 판독 프레임내 임의위치의 REV 반응성 인자 및 오픈 판독 프레임의 해독 종결을 코드하는 종결 코돈을 갖는, 면역원성 HIV 에피토프를 코드하는 전사 프로모터의 3'측에 존재하는 오픈 판촉 프레임; c) 오픈 판독 프페임의 해독 종결 코돈의 3'측에 존재하는 내부 라이보좀 도입 부위(IRES); d) 3'말단에 해독 종결 코돈이 존재하는 스플라이싱된 HIV REV 유전자를 코드하는 오픈 판독 프레임; e) 임의로, REV 해독 종결 코돈의 3'측에 존재하는, 제21RES 및 이를 따르는 GM-CSF, IL-12, 인터페론 및 B7 단백질중에서 선택되는 면역조절성 또는 면역자극성 유전자를 코드하는 오픈 판독 프레임; 및 f) 최종 오픈 판독 프레임을 따르는 전사-종결 시그날을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  36. a) 척추동물 세포를 생체내애서 항원성 HIV 에피토프를 코드하는 서열, 임의로 HIV REV 및 B7 단백질을 코드하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 노출시키는 것을 포함하여, HIV 항원에 특이적인 림포카인을 분비하는 세포독성 및 헬퍼 T-세포 증식 작용 기능을 자극하는 항원-제시 세포를 유도하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, HIV 에피토프가 env, gag 및 pol중에서 선택되는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가 HIV 에피토프, REV 및 B7 단백질 각각의 사이에 IRES를 코드하는 방법.
  39. a) 진핵세포 전사 개시 시그날; b) HIV 유전자 오픈 판독 프레임(ORF)의 발현이 HIV REV 유전자 생성물의 이용가능성에 의존하지 않도록 이종 리더 서열이 선행하는 HIV 유전자 ORF; c) HIV ORF의 해독 종결 코돈의 3'측의 내부 라이보좀 도입 부위(IRES)로서 작동하는 서열; d) IRES의 3'측에 T-세포 공자극인자의 ORF를 코드하는 서열; 및 e) T-세포 공자극 인자의 해독 종결 코돈의 3'측의 전사 종결 시그날을 코드하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  40. 제39항에 있어서, b)의 HIV 유전자 OFR가 tPAgp120 또는 tPAgp160인 폴리뉴클레오타이드.
  41. a) 진핵세포 전사 개시 시그날; b) HIV 유전자 오픈 판독 프레임(ORF)의 발현이 HIV REV 유전자 생성물의 이용가능성에 의존하지 않도록 이종 리더 서열이 선행하는 HIV 유전자 ORF; c) HIV ORF의 해독 종결 코돈의 3'측의 내부 라이보좀 도입 부위(IRES)로서 작동하는 서열; d) HIV 유전자 ORF의 발현이 HIV REV 유전자 생성물의 이용가능성에 의존하지 않도록 이종 리더 서열이 선행하는 HIV 유전자 오픈 판독 프레임(ORF); 및 e) HIV 유전자 ORF의 해독 종결 코돈의 3'측의 전사 종결 시그날을 코드하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  42. 각각의 작제물이 병원체가 일으키는 질환 또는 종양과 관련된 항원을 코드하는 하나 이상의 시스트론의 발현을 포유동물 조직내에서 유도할 수 있는, 다수 발현 작제물을 포함하는 조성물.
  43. 펩티드 또는 폴리펩티드가 숙주내에서 해독 생성물로서 생성되는 경우 면역원성 또는 면역조절성이 있고, 제1펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드 단편과 제2펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 폴리펩티드 단편 사이에 전사 터미네이터가 존재하지 않는 경우 제1펩티드 또는 폴리펩티드가 제1전사 프로모터의 작동성 조절하에 있는 폴리뉴클레오타이드의 단편에 의해 코드되고 제2펩티드 또는 폴리펩티드도 제1전사 프로모터의 작동성 조절하의 폴리뉴클레오타이드의 단편에 의해 코드되며, 전사 터미네이터가 제1펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 단편과 제2펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 단편 사이에 제공되는 경우 제2펩티드 또는 폴리펩티드는 제2전사 프로모터의 작동성 조절하에 있는 폴리뉴클레오타이드의 단편에 의해 코드되는 하나 이상의 제1 및 제2펩티드 또는 폴리펩티드를 코드하는 비감염성, 비통합성 폴리뉴클레오타이드를 숙주의 조직과 직접 접촉시켜 도입함으로써, 제1 및 제2펩티드 또는 폴리펩티드가 숙주의 단일 세포내에서 생성되어 면역화를 일으키는 단계를 포함하는 숙주 척추동물을 면역화시키는 방법.
  44. 제2도에 나타낸 제1, 제2 및 제3시스트론 각각이 1) tPA-gp120MN; 2) gp160ⅢB/IRES/REVⅢB; 3) gp160ⅢB; 4) REVⅢB 5) tat/REV/gp160; 6) REV/gp160; 7) gp160MN; 8) 임상학적으로 관련된 일차 HIV 단리체로부터의 gp160; 9) 임상학적으로 관련된 균주로부터의 유전자를 사용하는 nef; 10) gagⅢB; 11) tPA-gp120ⅡB; 12) HIV의 임상학적으로 관련된 균주로부터의 V3 루프 치환체를 포함하는 구조적인 돌연변이, 가변성 루프 제거와 같은 일부 작제물에 대한 일부 돌연변이 구조적인 중화 항체 에피토프에 대한 탄수화물 입체 장애물을 제거하기 위한 Ans 돌연변이 및 CD4 결합 부위 녹아웃(knockout) 돌연변이를 갖는 gp16-; 13) tPA 시그날 펩티드 리더 서열에서와 같이 적절한 리더 서열을 갖는 gp41; 14) 임상학적으로 관련된 균주로부터의 유전자를 사용하는 상기 5)로부터의 작제물과 유사한 gag; 15) gp160 및 gag 이시스트론에 대한 rev; 16) B7 코딩 서열; 17) GM-CSF 서열; 18) 인터루킨 서열; 19) 종양 연관 항원 및 20) 다수의 다른 폴리시스트론 작제물과 조합될 수 있는 하나 이상의 이시스트론성 작제물을 형성하여 모든 제시된 병원체 또는 종양 항원에 대하여 면역 반응을 일으킬 수 있느 칵테일 조성물을 제공하는, 인플루엔자 바이러스 핵단백질, 헤마글루티닌, 매트릭스, 뉴라미니다아제 및 다른 항원성 단백질과 같은 HIV 이외의 병원체; 사람 파필로마바이러스 유전자; 투베르쿨로시스 항원; A형, B형 또는 C형 간염 바이러스 항원; 및 이들 및 다른 항원의 조합물에 의해 발현되는 항원을 코드하는 유전자의 2 내지 3개의 조합물을 코드하고, 제2도의 단편 A 및 B가 내부 라이보좀 도입부위 또는 상부 시스트론의 전사를 종결시키는 전사 종결 서열 및 하부 시스트론의 전사를 개시하는 전사 프로모터 서열의 조합물인, 제2도에 나타낸 인자를 갖는 폴리뉴클레오타이드 작제물.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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