CZ245994A3

CZ245994A3 - Piperazides of substituted phenylalanine derivatives as thrombin inhibitors

Info

Publication number: CZ245994A3
Application number: CZ942459A
Authority: CZ
Inventors: Joerg Stuerzebecher; Helmut Vieweg; Peter Wikstroem; Christoph Adler
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1995-10-18
Also published as: ATE223392T1; HU9402923D0; KR950703543A; EP0635008A1; CA2133761A1; EP0635008B1; HUT68042A; AU5878194A; DE59410179D1; JPH07509731A; US5607937A; WO1994018185A1

Description

Oblast technikv j | . . ! . í 5 i

Vynález se týká nových inhibitoru proteináz, obsahuýíGi--fenylalanin jako jádro, kde aromatický zbytek v meta poloze nese bazickou skupinu a alfa-amino skupina je sulfonylovaná různými zbytky. Zavedení různých N-substituovaných piperazidových skupin na C-konec vedlo k objevu vysoce účinných inhibitorů se zlepšenou biologickou dostupností.

Dosavadní stav technikv

Inhibitory proteináz jsou potenciální léčiva, která lze použít ke kontrole fyziologických procesů zahajovaných a udržovaných proteinázami. Pro mnoho endogenních a přirozeně se vyskytujících inhibitorů se ukázalo, že mohou ovlivňovat aktivitu proteináz in vivo a ulehčovat hyperproteolytické stavy (viz Hoerl, W. H., v Design of Enzyme Inhibitors as Drugs, s. 573-581, (Sandler, M. a Smith, H. J., Eds.) Oxford University Press, 1989). Avšak terapeutické aplikace takových inhibitorů s relativně vysokou molekulovou hmotností je omezena pro jejich zvláštní proteinovou strukturu. Protože tyto inhibitory se jednak neabsorbují ve střevech po orálním podání, jednak vykazují antigenní aktivitu, bylo velmi zajímavé hledat syntetické inhibitory enzymů s nízkou molekulovou hmotností.

Čtyři třídy enzymů odpovědných za procesy závislé na proteinázách zahrnují serinové, thiolové, kovové a aspartátové proteinázy. Serinové proteinázy jsou proteolytické enzymy, které mají reaktivní serinový zbytek na aktivním centru. Enzymy, jako je trypsin, které štěpí proteinové vazby na C-konci basických aminokyselin argininu a lysinu, patří do skupiny trypsinu serinových proteináz. V této skupině mají zvláštní fyziologickou důležitost ty enzymy, které působí koagulaci a fibrinolýzu krve, které uvolňují kinin a vyvolávají dodatečnou aktivaci nebo které jsou složkami zmíněných enzymatických soustav.

Koagulace krve se spouští aktivací zymogenu dvěma různými cestami. Prvá vnitřní cesta vede ke koagulaci krve řetězem reakcí řízených složkami krve. Druhá vnější cesta vede ke koagulaci krve kratším řetězem reakcí založených na interakci mezi složkami krve a tkání. Obě cesty vyvolávají aktivaci zymogenového faktoru X na serinový proteinázový faktor X^, který sám katalýzuje aktivaci trombinu na serinovou proteinázu koagulující fibrinogen, trombin. Faktor X_a, který je produktem jak vnitřní, tak vnější aktivační cesty se původně považoval za výhodný cílový enzym pro intervenci zabraňující procesu koagulace krve (Tidwell, R. R. aj., Thromb. Res. 19, 339-349 (1980)). Avšak jak se nedávno ukázalo, syntetické inhibitory faktoru X_a in vivo a in vitro neinhibují koagulaci (Stuerzebecher, J. aj., Thromb. Res. 54, 245-252 (1989) a nejsou antitrombolyticky účinné (Hauptmann, J. aj., Thromb. Haemostas. 63, 220-223 (1990). Proto se vývoj antikoagulačních inhibitorů zaměřil na objev inhibitorů trombin.

ί

Pro vývoj syntetických inhibitorů trombinu se široce studovaly deriváty benzamidinu (Stuerzebecher, J. aj., Acta Biol. Med. Germ. 33, 1665-1676, 1976). Mezi nimi se ukázaly mít příznivou základní strukturu pro vývoj účinných inhibitorů deriváty aminokyselin obsahující benzamidinovou skupinu a para orientovanou amidinovou skupinu. Zatím nejúčinnějším popsaným inhibitorem trombinu benzamidinového typu je derivát aminokyseliny N-alfa-(2-naftylsulfonyl-4- amidinofenylalanin piperidid (NAPAP) (K_± = 6*10~® mol/1) (Stuerzebecher,

J. aj., Thromb Res. 29, 635-642 (1983).

Jiné typy inhibitorů, o nichž je známo, že také inhibují trombin jsou:

Prvá skupina se skládá z peptidyl-arginin chlormethyl ketonů, například H-D-Pro-Arg-CH₂C1 (Kettner C. aj., Thromb. Res. 14, 969-973 (1979). Druhá skupina se skládá z peptidylarginin aldehydů, například Boc-D-Phe-Pro-Arg-H a H-D-PhePro-Arg-H (Bajusz, S., Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217- 221 (1978).

Avšak tyto inhibitory které inhibují trypsin a trombin se srovnatelnou afinitou se nesyntetizují snadno, jsou nestálé a mohou působit nežádoucí postranní reakce pro svou vysokou reakční schopnost. Trombin jakož i trypsin se inhibují reakcí závislou na čase derivátem boronové kyseliny Boc -D-Phe-Pro-Boro-Arg-C_ioH_xe (viz Evropskou patentovou přihlášku číslo 0 293 881). Naopak, selektivní inhibitor trombinu, kyselina (2R,4R)-4-methyl-l-(N-alfa-(3-methyl-l,2,3,5tetrahydro-8-chinolinsulfonyl)-L-arginin)-2-pipecolin karbo4 xylová nemá (Kikumoto, R Všechny prakticky žádnou aktivitu inhibující trypsin . aj. Biochemistry 23, 85-90, 1984).

benzamidinové deriváty dosud studované mají farmakodynamické a farmakokinetické vlastnosti, které je činí nevhodné pro terapeutické aplikace. Při orální aplikaci se neabsorbují ve střevech, jsou rychle vylučovány z oběhu a jejich toxicita je relativně vysoká. To platí jak pro amidy N-alfa-arylsulfonylovaných (Markwardt, F. aj., Thromb. Res. 17, 425-431 (1980) tak pro amidy N-alfa- arylsulfonylovaných aminoacylovaných 4- amidinofenylalaniny (viz patentovou přihlášku číslo DD-A-235 866). Odpovědnost za nevhodné farmakologické vlastnosti lze přičíst silně zásadité amidinové funkci (Kaiser, B aj. Pharmazie 42, 119-121, 1987). Experimenty zaměřené na náhradu silně zásadité amidinové funkce ve vysoce účinné inhibitory méně zásaditými skupinami napřed selhaly, protože vedly k významné ztrátě účinnosti (Stuerzebecher, J. aj., Pharmazie 43, 782-783, 1988). Také zavedení karboxylové skupiny do inhibitoru, aby se snížila zásaditost amidinové funkce vedly k snížení inhibiční aktivity. Tedy deriváty 4- amidinofenylalaninu, jejichž C-konec aminokyseliny je volná karboxylová skupina, jsou zcela neúčinné jako inhibitory (Wagner, G. aj., Pharmazie 39, 16-18, 1984), Vieweg, H. aj., Pharmazie 39, 82-86, 1984).

Modifikace NAPAP zavedením substituentu na alfa-dusík vedlo k malému zvýšení antitrombinové aktivity (viz Evropskou patentovou přihlášku číslo FR-A-2 593 812, avšak nezlepšilo farmakologické vlastnosti Cadroy, Y. aj., Thromb. Hae5 mostas. 58, 764-767 (1987).

Vývoj selektivních inhibitorů trombinu vycházejících z N-alfa- substituovaných 3- amidinofenylalaninů pokračoval. Zjistilo se, že amidy typu N-alfa- substituovaných 3- amidinofenylalaninů s karboxylovou skupinou v amidovém okolí jakož i takové deriváty, u nichž amidinová funkce nahrazena jinou zásaditou skupinou ukázaly zlepšené farmakologické vlastnosti. Zejména se zjistila u benzamidinových derivátů po prvé jistá sorbce po orální aplikaci (PCT/CH 9100235).

Podstata vynálezu

Tato třída látek se dále vyvíjela. Zjistilo se například, že zavedením nových substituentů na N-4-atom N-alfasulfonylováných 3-amidinofenylalanin piperazidů, zejména zavedením zbytků acyl- (-C0-X-), sulfonyl (-S0 -Y-), karbamoyl (-CO-NR'R''), nebo funkcializované alkyiové zbytky, kde X, Y a R', R v příznivých případech představují methylové skupiny a funkcializovaný alkylový zbytek má OH skupinu, se inhibiční účinnost proti trombinu významně zlepšit a bylo pozorováno výjimečné zvýšení resorpční schopnosti. To se pozorovalo zejména při rektální či duodenální aplikaci derivátů, použitých jak jako soli, tak jako volné báze.

Připravily se nejen racemické směsi, ale též čisté optické antipody. Například se syntetizoval v tomto rámci Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-amidino-(L) -fenylalanin-4- acetylpiperazid. Zjistilo se, že tato sloučenina je nejen silným inhibitorem trombinu a účinně ovlivňuje koagulaci, ale také překvapivě má zlepšené farmakokinetické vlastnosti. Absorbuje se ve střevech, zejména při rektální aplikaci krysám a je přítomna v krvi po relativně dlouhou dobu v antitrombolyticky účinné koncentraci pro inhibici koagulace krve. To také platí pro sloučeniny s jinými ochrannými skupinami na C-konci, které nesou N-substiťuované piperazidiny jako amidové zbytky.

Vedle účinných inhibitorů trombinu se zlepšenou biologickou dostupností se v uváděné třídě látek našly inhibitory trypsinu, které byly vysoce účinné v případě sníženi aktivity trombinu, mezi deriváty majícími na piperazidovém dusíku například .heteroarylový nebo acylový zbytek (-CO-X-), kde X představuje přímý či rozvětvený alkyl (^C3-C_io), aralkyl nebo cykloalkyl (C -C_io). Inhibice aktivity trypsinu inhibitory hyperproteolytických stavů v pankreasu má velký terapeutický význam.

Tento vynález se týká nových fenylalanin piperazidů inhibujících proteinázy obecného vzorce I, který může představovat jak racemáty, tak L- a D- konfigurované sloučeniny

i 2 so₂-R kde R¹ představuje bazickou skupinu vzorce

Ί (a) HN=C(-)-NH₂

I amidino nebo (b) -CH₂-NH_a aminomethyl

R² představuje (ne)substituovaný arylový nebo heteroarylový zbytek, například fenyl, 4-methylfenyl, 2,4,6- trimethyl- nebo -triisopropylfenyl, 4-methoxy-2,3,6- trimethylfenyl, 2,2-dimethy1-6-methoxy- či 2,2,5,7,8- penťamethylchromanyl, antrachinonyl, 1- či 2-naftyl, chinolyl či isochinolyl nebo kamforový zbytek a

R³ představuje acylový zbytek -COX, kde X znamená vodík, alkyl, přímý či rozvětvený, možná substituovaný alkyl, s výhodou nižší alkyl, zejména methyl, (ne)substituovaný aryl nebo cykloalkyl s výhodou (C_a-C ), aralkylový zbytek, ve kterém aromatický zbytek může být substituovaný například halogenovým atomem, alkylem či alkoxy, hydroxy nebo nitro skupinou, karboxamidový zbytek vzorce -CO-NR'R, thiokarboxamidový zbytek vzorce -CS-NR'R nebo ethylamidový zbytek vzorce -CH₃-CO-NR'R, kde R' - R = H, R' = R = alkyl, R' = H, R = alkyl, R' = H, R - aryl, nebo R' a R mohou tvořit cykloalifatický nebo heterocykloalifatický kruh s atomem dusíku, zbytek SO_a~Y, kde Y znamená (ne)substituovaný alkyl, s výhodou methyl, trifluormethyl, trichlormethyl, (ne) substituovaný aryl nebo heteroaryl, například fenyl, 4- methylfenyl, 2,4,6-trimethyl- nebo -triisopropylfenyl, 4- methoxy2,3,6-trimethylfenyl, 2,2-dimethy1-6-methoxy- či 2,2,5,

7,8-pentamethylchromanyl, antrachinonyl, 1- či 2-naftyl, chinolyl nebo O-aryl, s výhodou fenyl, -NR'R, kde R' a R je H či to může být stejný nižší alkyl C -C , cykloalifatický kruh s 5 až 8 C atomy, které mohou být substituované hydroxylovou nebo oxo skupinou, (ne)substituovaný heteroarylový zbytek, například pyridyl či pyrimidinyl, nebo (ne)substituovaný heterocykloalifatický zbytek, například N-methylpyperidyl, funkcionalizovaný alkylový zbytek vzorce -(CH ) -X, kde alkylový řetězec může být přímý či rozvětvený, n = 1 až a funkční zbytek představuje hydroxylovou skupinu, jejíž H atom může být substituovaný alkylovou, aralkylovou, arylovou, hydroxyalkylovou nebo acylovou skupinou, halogenový atom, terciární aminová skupina vzorce -N(Alk)₂, kde alkylové skupiny mají 1 až 3 atomy a jsou stejné a mimo to atom dusíku může patřit cykloalifatickému kruhu s 5 až 7 členy kruhu, ke kterému lze přidat jeden nebo dva další kruhy, skupina acylaminomalonát vzorce AcHN-C(-)(COO-Alk) , skupina AcHN-CH(-)COOH, kde Ac obecně znamená formyl nebo acetyl a Alk je nižší alkyl nebo H₂N-CH(-)COOH skupina, a jejich soli s minerálními či organickými kyselinami.

Mezi fenylalanin piperazidy definovanými v obecných nárocích mají zvláštní důležitost sloučeniny, kde kde R^x představuje bazickou skupinu vzorce (a) = amidino,

R² představuje 2-naftyl, antrachinon, 2,4,6- triisopro9 pylfenyl a 2,2,5,7,8- pentamethylchromanyl a

R³ představuje acylový zbytek, zejména formyl nebo acetyl, funkcionalizovaný alkylový zbytek, například 2- hydroxethyl a zbytek SO__-Y, karboxamidový zbytek jakož i heteroarylový zbytek, například 2-pyridyl či 2-pyriroidinyl.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde R¹ představuje (a) = amidino, se připraví dále popsanými principielně známými postupy.

Alkylestery (D,L)-3-kyanofenylalaninu obecného vzorce II se převedou ve vhodném rozpouštědle se sulfonylchloridem, kde R² má významy popsané v obecném vzorci I, na racemické sloučeniny obecného vzorce IV, ze kterých se získají racemáty sulfonylovaných kyanofenylalaninů V, ze kterých se získají racemáty kyselou nebo alkalickou hydrolýzou.

L- konfigurované sulfonylované aminokyseliny V lze získat enzymatickou hydrolýzou sloučenin IV chymotrypsinem ve směsi acetonitril / voda. D-konfigurováné sulfonylované aminoalkyl karboxyláty IV, získané touto procedurou se převedou na D- konfigurované sulfonylované aminokarboxylové kyseliny V kyselou hydrolýzou ve směsi 1 N HC1 a kyseliny octové zahříváním pod refluxem.

Kyano sloučeniny s piperazidovou strukturou VI, které mohou mít racemickou nebo L- či D- konfiguraci lze získat ob vyklými spojovacími procedurami ze sloučenin V majících odpovídající konfiguraci s obecného vzorce VII.

Mimo to piperazidy VI se mohou získat principiálně známou metodou spočívající nejprve v ochraně racemického, L- či

D-3-kyanofenylalaninu zavedením Boc skupiny na aminovou funkci. Získaná karboxylová kyselina V, se skupinou Boc místo SO_a-R², se transformuje na odpovídající Boc chráněnou sloučeninu VI konverzí s piperazinovým derivátem VII, ze které se kyano sloučeniny s piperazidovou strukturou VI dostanou kyselém odštěpení Boc skupiny a konverzí se sulfonylchloridem obecného vzorce III.

Přidání H₂S ke kyanové funkční skupině dá thioamidy Vlil, které se konvertují na thioimidátové halidy IX konverzí s alkylhalidem. Mimo to se mohou získat imidátové halidy X z kyanových sloučenin VI známým způsobem.

Aby dostaly cílové sloučeniny obecného vzorce I, kde R¹ představuje (a) amidino, mající racemickou nebo L- či Dkonfiguraci a kde R² a R³ mají významy popsané v obecném vzorci I, a X = halogen, s výhodou chlor, thioimidátové soli IX se konvertují na sloučeniny obecného vzorce i v alkoholickém roztoku s octanem amonným, nebo imidátové soli X se konvertují na sloučeniny obecného vzorce I v alkoholickém roztoku amoniaku. Amidinové soli takto získané lze konvertovat vhodným způsobem na volné báze.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde R¹ představuje aminomethyl (b) se mohou získat kyanových sloučenin VI katalytickou hydrogenací, například Ranyův nikl/ vodík ve vhodných rozpouštědlech v přítomnosti amoniaku.

Biologická aktivita sloučenin podle tohoto vynálezu se stanovila jak in vitro tak in vivo. Pro charakterizaci inhibiční aktivity in vitro se vypočtou disociační konstanty K pro inhibici trombinu a příbuzných enzymů trypsinu, faktoru X , faktoru XII , plasmového kallikreinu, žlázového kallikreinu a tPA podle vzorce (E)*(I) (El) kde (E) představuje koncentraci volného enzymu, (I) koncentraci volného inhibitoru a (El) koncentraci komplexu enzym -inhibitor (Dixon, Biochem J. 55 170-173 (1953)). Čím je hodnota K pro zkoušený enzym nižší, tím je vyšší afinita inhibitoru pro enzym a menší množství inhibitoru je potřeba pro inhibici enzymu, například trombinu.

Pro stanovení účinnosti inhibitorů proti krve koagulaci vyvolané trombinem in vitro se použily různé testy s jeho přirozeným substrátem fibrinogen. Pro tento účel se stanovily v lidské plazmě trombinový čas (TT), aktivovaný částečný tromboplastinový čas (aPTT) a protrombinový čas (PT), rychlá hodnota).

Toxicita sloučenin podle tohoto vynálezu se hodnotila stanovením LD_so (to je dávky, která působí smrt 50 % testovaných zvířat během pozorovací doby jeden týden) u myší po intravenózním a perorálním podávání.

Pro farmakokinetickou charakterizaci se stanovily koncentrace v plazmě u krys po intravenósní (i.v.), perorální (p.o.) intraduodenální (i.d.) a rektální aplikaci podle následující třístupňové procedury;

1. Fyziologický roztok NaCl zkoušené substance se podrobí vysokotlaké kapalné chromatografii (HPLC), aby se stanovila retenční doba, charakteristická pro danou substanci za vybraných zkušebních podmínek.

2. Zkoušená substance se zředí in vitro v krysí plazmě, tento roztok se také podrobí HPLC, aby se vidělo, zda se charakteristický pík opět objeví v retenční době specifické pro substanci.

3. Zkoušená substance se rozpustí ve fyziologickém roztoku NaCl a aplikuje se (i.v.), (p.o.) (i.d.) a rektálně krysám v dávkách 1, 50 a 100 mg na kg tělesné hmotnosti. Odebírají se vzorky krve v časových intervalech 15 minut, ze kterých se připraví vzorky plazmy odstředěním. Tyto vzorky plazmy se také podrobí HPLC, aby se vidělo, zda se charakteristický pík opět objeví v retenční době specifické pro substanci .

Aby se ukázala farmakologické účinnost, zkoušená substance se rozpustí ve fyziologickém roztoku NaCl a aplikuje se rektálně krysám v dávkách 5 a 20 mg na kg tělesné hmotnosti. Odebírají se vzorky krve v časových intervalech, ze kterých se připraví vzorky plazmy odstředěním a podrobí se koagulačnímu testu (trombinový čas (TT) a aktivovaný částečný tromboplastinový čas (aPTT)).

Antitrombolitická- účinnost sloučenin se stanovila na krysách modelem stasou vyvolané trombosy podle Wesslera aj.

(J. Appl. Physiol. 14, 943-946, 1959). Trombosa se vyvolala sérem 30 minut po aplikaci inhibitoru a makroskopicky vyhodnotila za dalších 10 minut.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou použít jako diagnostická činidla nebo léčiva ve formách vhodných pro aplikaci jak ve formě solí, tak jako volné báze.

Příklady provedeni vynálezu

Vynález je podrobně vysvětlen ve čtyřech následujících příkladech.

Přiklad 1

Nalfa-( 2-naftvlsulfonyl-3-amidino-(L)-fenvlalanin-4-acetvlpiperazid methylester Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-kyano-(D,L)-fenylalaninu, vzorec IV, Alk = -CH₃, R² = 2-naftyl

Hydrochlorid methylesteru 3-kyano-(D,L)-fenylalaninu (24.1 g, 0.1 mol) se suspendoval v 200 ml dioxanu a za míchání se přidal N-methylmorfolin a po kapkách roztok 2naf tylsulf onylchloridu v 200 ml ethylacetátu. Směs se míchala 16 hodin při pokojové teplotě, vysrážený hydrochlorid N-methylmorfolinu se odfiltroval a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustil v 50 ml methanólu, přidalo se 50 ml diethylethéru a směs se nechala krystalovat. Vzniklá sraženina se odfiltrovala, promyla se diethylethérem a sušila se ve vakuové sušárně (KOH / H₂SO₄). Výtěžek: 36 g (91.3 %). Teplota tání: 122-123 °C.

TCL: R* - 0.65 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová 1 objemově).

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-kyano-(L)-fenylalanin (vzorec V, R² = 2-naftyl)

Methylester Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-kyano-(D,L)-fenylalaninu (17.4 g, 44 mmol) se rozpustil v 260 ml acetonitrilu a 130 ml vody. Přidalo se 100 mg chymotrypsinu jakož i 0.785 g chloridu draselného a pH roztoku se upravilo na 6.8-7 pomocí 2 N NaOH. Po 24 hodinovém míchání při pokojové teplotě se přidalo dalších 50 mg chymotrypsinu, pak po 5 a opět po 10 hodinách a shora uvedené pH se udržovalo kontrolovaným přidáváním celkem 11 ml 2 N NaOH. Po následující filtraci se acetonitril odpařil za sníženého Po okyselení s IN HC1 se vodná fáze opět extrahovala ethylacetátem. Sebrané organické fáze se promyly nasyceným roztokem chloridu sodného, sušily síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku, přičemž produkt počal ke konci destilace krystalovat. Po přerušení destilace se přidalo 30 ml diethylethéru a 70 ml hexanu, sraženina se odfiltrovala, promyla se malým množstvím diethylethéru a sušila se. Výtěžek: 7.2 g (85.8 %), Teplota tání: 192-193 °C. Otáčivost °C = + 11.9 °(C = 3, v methanolu).

TCL: R_f = 0.25 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová 1 objemově).

Nalfa-( 2-naf tylsulf onyl-3-kyano-(L)-f enylalanin-4-acetylpiperazid (vzorec VI, R² = 2-naftyl, R³ = -COCH₃)

1-acetylpiperazin (1.59 g, 13.2 mmol) se rozpustil v 10 ml THF a 20 ml DMF a roztok se smíchal s HOBt (1.28 g, 7.9 mmol) a s Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-kyano-(D,L)-fenylalaninem (2.5 g, 6.6 mmol) a ochladil na 0°C. Po přidání DCC (1.5 g, 7.7 mmol) se roztok 22 hodiny míchal při pokojové teplotě. Po následující filtraci vysrážené dicyklohexyl močoviny se rozpouštědlo odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustil v chloroformu a čistil se kolonovou chromatograf ií na silikagelu 60s elucí chloroform / methanol 93:7. Získalo se 2.9 g (90 %) amorfního produktu.

Otáčivost 20 °C = + 46.3 °(C = 1, v methanolu).

TCL: R_e = 0.36 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová 1 objemové).

Nálf a- (2-naf tylsulf onyl-3-thiokarboxamid- (L)-fenylalanin-4acetylpiperazid (vzorec VIII, R² = 2-naftyl, R³ = -COCH₃)

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-kyano-(L)-fenylalanin-4-acetylpiperazid. (2.78 g, 5.6 mmol) se rozpustil v 25 ml pyridinu. K roztoku, který se nasytil uváděním H^S po 10 minut, se přidalo 20 kapek TEA. Reakční směs se nechala stát při pokojové teplotě 2 dny, pak se rozpouštědlo odpařilo a zbytek se rozpustil v ethylacetátu a extrahoval se 1 N HC1. Organická fáze se promyla nasyceným roztokem chloridu sodného, sušila nad síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odpařilo. Získalo se 2.6 g (88 %) amorfního produktu, který se v této formě zpracoval.

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-S-methyliminothiokarbonyl-(L)fenylalanin-4-acetylpiperazid, hydrojodid, (vzorec IX, Alk = -COCH₃, X = J, R² - 2-naf tyl, R³ = -COCHJ

2.6 g (4.96 mmol) shora popsaného thioamidu se rozpustilo v 6 ml acetonu. K roztoku se přidal methyljodid (6 g, 42.3 mmol) a reakční směs se nechala stát při pokojové teplotě 20 hodin. Pak se rozpouštědlo odpařilo a olejovitý zbytek se třel s isopropanol / diethylethéru, získaný prášek se odfiltroval, promyl se diethylethérem a sušil se. Výtěžek; 3.1 g (94 %).

Nalfa-(2-naftylsulfonyI-3-S-amidino-(L)-fenylalanin-4-acetylpiperazid, hydrochlorid, (vzorec I, X = Cl, R² = 2-naftyl, R³ = -COCH₃)

Hydrojodid methylthioimidátu (3.0 g, 4.5 mmol) se rozpustil v 100 ml methanolu. K roztoku se přidal octan amonný (0.8 g, 10.4 mmol) a zkušební směs se zahřívala 3 hodiny na 60 °C na vodní lázni. Pak se rozpouštědlo odpařilo a zbytek se rozpustil v teplém isopropanolu a hydrojodid amidinu se vysrážel ethylacetátem, odfiltroval, promyl se ethylacetátem a diethylethérem a sušil se. Pro konverzi na hydrochlorid se získaný produkt rozpustil v methanolu a roztok prošel silně bazickým iontoměničem (Amberlite IRA-410, sycený Cl“). Hydrochlorid se vysrážel z koncentrovaného methanolického roztoku ethylacetátem a diethylethérem 1:1. Výtěžek: 1.8 g (73.5 %). Otáčivost 20 °C = + 61.8 ° (C = 1, v methanolu). TCL: R* = 0.2 (organická fáze ethylacetát 4 / kyselina octová 1/ voda 2, objemově). Specifická otáčivost odpovídající D- konfigurované sloučeniny otáčivost (20 °C) = - 62.2 °(C = 1, v methanolu).

Přiklad 2

Nalfa-(2-naftylsulfonvl)-3-amidino-(L)-fenylalanin-4-( 2hvdroxvethylpipera z id

Nalf a- (2-naf tylsulf onyl-3-kyano- (L) -f enylalanin-4- (2-hydroxyethylpiperazid, hydrochlorid, (vzorec VI, R² = 2- naftyl, R³ = -CH₂CH₂OH)

2.0 g Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-kyano-(L)-fenylalaninu se přidalo k 10 ml thionylchloridu a směs se zahřívala 30 minut pod refluxem. Po ochlazení se k získanému roztoku přidával hexan, až se roztok zakalil. Vykrystalovaný chlorid kyseliny se odfiltroval po 1 hodině, promyl hexanem a sušil se ve vakuu. Tento produkt (1.7 g, 4.26 mmol) se rozpustil v THF (25 ml) přidal se po kapkách k roztoku 2- hydroxyethylpiperazinu v THF (15 ml). Po 1 hodině míchání se vysrážený hydrochlorid 2- hydroxyethylpiperazinu odfiltroval a rozpouštědlo se odpařilo. Zbytek se rozpustil v 15 ml methanolu, přidávala se voda, až se roztok zakalil. Směs se nechala stát přes noc, kdy se piperazid oddělil jako olej. Po odstranění matečného louhu se olej rozpustil v 100 ml ethylacetátu, a ethylacetátový roztok se promyl nasyceným roztokem chloridu sodného, sušil nad síranem hořečnatým a koncentro19 val se ve vakuu. Zbylý roztok se okyselil 2N ethylacetát / HC1, pak se přidalo 50 ml diethyletheru. Po 1 hodině stání se vzniklá sraženina odfiltrovala, promyla se diethylethérem a sušila se ve vakuu. Výtěžek: 1.65 g (73 %). Otáčivost 20 °C = - 5.4 ° (C = 1, v methanolu). TCL: R* = 0.43 (organická fáze ethylacetát 4 / kyselina octová 1/ voda 2, objemově).

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-methoxyiminokarbonyl-(L)-fenylalanin-4-(2-hydroxyethyl)acetylpiperazid, dihydrochlorid, (vzorec X, Alk = -COCH_a, X = Cl, R² = 2-naftyl, R³ = -CH CH OH)

1.4 g (2.65 mmol) shora popsané kyano sloučeniny se rozpustilo ve směsi 7.5 ml absolutního methanolu a 10 ml absolutního dioxanu. Do roztoku se zavedl za chlazení ledem sušený plynný HC1 (5.2 g, 143 mmol) a směs se nechala stát 3 dny v ledničce. Pak se směs vlila do 150 ml diethyletheru, vzniklá sraženina se po odstranění matečného louhu zpracovala, suspendovala v 40 ml absolutního ethanolu, krystalický prášek se odfiltroval, promyl se ethanolem, diethylethérem a sušil se. Výtěžek: 1.44 g (91 %).

TCL: R^ = 0.15 (organická fáze ethylacetát 4 / kyselina octová 1/ voda 2, objemově).

TCL: = 0.95 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová objemově).

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-amidino-(L)-fenylalanin-4-(2hydroxyethyl)-piperazid, dihydrochlorid, (vzorec I, X = Cl,

R² = 2-naftyl, R³ = -CH₂CH₂OH)

Shora popsaný dihydrochlorid methylimidátu (1.3 g, 2.18 mmol) se suspendoval v 30 ml methanolu. K roztoku se přidal ethanolický roztok amoniaku za míchání, až se dosáhlo pH 8.7, kdy se dostal čirý roztok. Směs se zahřívala 3 hodiny na 60 °C na vodní lázni. Pak se rozpouštědlo odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustil v 15 ml absolutního ethanolu a po přidání 20 kapek 2N ethylacetát / HCI se dihydrochlorid amidinu vysrážel ethylacetátem, odfiltroval, promyl se ethylacetátem a diethylethérem a sušil se. Výtěžek: 1.02 g (80.3 %). Otáčivost 20 °C = + 14.2 ° (C = 1, v methanolu) .

TCL: R_£ = 0.18 (organická fáze ethylacetát 4 / kyselina octová 1/ voda 2 objemově).

TCL: R_£ = 0.6 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová 1 objemově).

Specifická otáčivost odpovídající D- konfigurované sloučeniny otáčivost (20 °C) = - 15.0 ° (C = 1, v methanolu).

Aby se získala volná báze, dihydrochlorid amidinu (0.5826 g, 1 mmol) se rozpustil v 20 ml methanolu a k roztoku se přidalo ekvimolekulární množství 0.1 N NaOH (20 ml). Pak se rozpouštědlo odpařilo za sníženého tlaku, aby se odstranily ještě zbylé stopy vody, provedla se několikrát azeotropická destilace s toluen-isopropanolem. Takto získaná báze ještě obsahuje NaCl. Aby se odstranila anorganická složka, přidala se směs 15 ml absolutního methanolu a 10 ml chloroformu a 10 ml diethylethéru, kdy se báze po míchání rozpustila. Nerozpustný NaCl odfiltroval a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku Zbytek ztuhl po tření s diethylethérem. Výtěžek: 0.48 g (94 %).

Přiklad 3

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-amidino-(L)-fenvlalanin-4-methylsulfonvlpiperazid.

Nalfa-(2-naftylsulfony1-3-kyano-(L) -fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazid (vzorec VI, R² = 2-naftyl, R³ = -SO₂CH₃)

Hydrochlorid 1-methylsulfonylpiperazinu (1.56 g, 7.8 mol) se suspendoval v 15 ml DMF a suspenze se smíchala s 2naftylsulfonyl-3-kyano-(L)-fenylalaninem v 70 ml THF a ochladila se na 0 °C. Po přidání DCC (1.61 g, 7.8 mmol) se směs ještě míchala 20 hodin při pokojové teplotě. Pak se vysrážená dicyklohexyl močovina odfiltrovala a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustil v chloroformu a čistil se kolonovou chromatografii na silikagelu 60 s elucí chloroformem. Získalo se 3.34 g (89 %) amorfního produktu. Otáčivost 20 °C = + 47.3 °(C = 1, v methanolu).

TCL: R_s = 0.36 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová 1 objemově).

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-thiokarboxamid-(L)-fenyíalanin-4methylsulfonylpiperazid (vzorec VIII, R² - 2-naftyl, R³ = -SO CH )

Shora popsaná kyano sloučenina (2.9 g, 5.2 mmol) se rozpustila v 35 ml pyridinu. K roztoku se přidalo 15 kapek

TEA a roztok se nasytil uváděním H_aS po 10 minut. Reakční směs se nechala stát při pokojové teplotě 2 dny, pak se rozpouštědlo odpařilo za sníženého tlaku a zbytek se rozpustil v ethylacetátu, kdy thioamid postupně vykrystaloval. Sraženina se odfiltrovala, promyla se ethylacetátem a sušila se. Výtěžek: 2.98 g (96 %).

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-S-methyliminothiokarbonyl-(L)fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazid, (vzorec IX, Alk = -COCH₃, X = J, R² = 2-naftyl, R³ = -SO₂CH₃)

2.95 g (5.26 mmol) popsaného thioamidu se rozpustilo za zahřívání v 4 ml DMF. K roztoku se přidal roztok 50 ml acetonu a methyljodidu (7.1 g, 50 mmol) a reakční směs se nechala stát při pokojové teplotě 20 hodin. Směs se vlila do 400 ml diethylethéru, vzniklá sraženina se odfiltrovala, promyla se diethylethérem a sušila se. Výtěžek: 3.25 g (88 %).

Nalfa-(2-naftylsulfonyl-3-S-amidino-(L)-fenylalanin-4methylsulfonylpiperazid, hydrochlorid, (vzorec I, X = Cl, R² = 2-naftyl, R³ = -SO_CH₃)

Hydrojodid methylthioimidátu (3.23 g, 4.6 mmol) se rozpustil v 110 ml methanolu. K roztoku se přidal octan amonný (0.58 g, 7.5 mmol) a směs se zahřívala 3 hodiny na 60 °C na vodní lázni. Pak se rozpouštědlo odpařilo za sníženého tlaku a zbytek se rozpustil v methanolu a hydrojodid amidinu se vysrážel ethylacetátem a diethylethérem 9:1, odfiltroval, promyl se diethylethérem a sušil se. Pro konverzi na hydrochlorid se získaný produkt rozpustil v methanolu a roztok prošel silně bazickým iontoměničem (Amberlite IRA-410, sycený Cl^-). Hydrochlorid se vysrážel z koncentrovaného methanolického roztoku diethylethérem. Výtěžek: 2.1 g (79 %). Otáčivost 20 °C = + 70.0 ° (C = 1, v methanolu).

TCL: R* = 0.32 (organická fáze ethylacetát 4 / kyselina octová 1/ voda 2, objemově).

Specifická otáčivost odpovídající D- konfigurované sloučeniny otáčivost (20 °C) = - 70.5 °(C = 1, v methanolu).

Přiklad 4

Pmc-3-amidino-(L)-fenvlalanin-4-methylsulfonvlPÍperazid

Boc-3-kyano-(L)-fenylalanin g (26.5 mmol) hydrochloridu 3-kyano-(L)-fenylalaninu a 9.1 ml (53.2 mmol) N-ethyldiisopropylaminu se suspendovalo v 18 ml vody. K této suspenzi se přidal 2-(Boc-oxyimino)2-fenyl-acetonítril (7.2 g, 29.2 mmol) v 20 ml dioxanu a směs se míchala 16 hodin při pokojové teplotě. Po dalším přidání 50 ml vody se roztok extrahoval 50 ml ethylacetátu, pH organická fáze se upravilo na 3 zředěnou kyselinou solnou. Po 3 extrakcích po 100 ml ethylacetátu se sebrané organické roztoky promyly nasyceným roztokem chloridu sodného, sušily nad síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Výtěžek: 6.2 g (81 %).

Boc-3-kyano- (L) -fenylalan'in-4-methy lsulf onylpiperaz id

Hydrochlorid 1-methylsulfonylpiperazinu (4.92 g, 24.5 mmol) a NMM (2.7 ml, 24.5 mmol) se rozpustily v 50 ml DMF.

Po přidání HOBt (4 g, 29.6 mmol) a roztoku Boc-3-kyano-(L)fenylalaninu (5.93 g, 20.4 mmol) v 200 ml THF se směs ochladila se na 0 °C. Po přidání DCC (5.1 g, 24.7 mmol) se směs ještě míchala 48 hodin při pokojové teplotě. Pak se vysrážená dicyklohexyl močovina odfiltrovala a THF část roztoku se odpařila za sníženého tlaku. Zbytek se zfiltroval, filtrát se vlil do směsi 100 ml 5 % kyselého uhličitanu sodného a 200 ml ledové vody, vzniklá sraženina se odfiltrovala, promyla se vodou, rozpustila se v methanolu a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Aby se odstranily ještě zbylé stopy vody, provedla se několikrát azeotropická destilace s toluen-isopropanolem. Pouze lehce nečistý produkt se dále zpracoval. Výtěžek: 7.9 g (89 %).

Hydrochlorid 3-kyano-(L)-fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazidu

7.9 g shora popsaného surového produktu se rozpustilo v 70 ml ethylacetátu a 30 ml diethylethéru, přidalo se 50 ml 2.5 N HCl v ethylacetátu a roztok se 48 hodin míchal při pokojové teplotě, kdy žádaný hydrochlorid vykrystaloval. Po přidání 200 ml diethylethéru se směs 1 hodinu míchala, sraženina se odfiltrovala promyla se diethylethérem a sušila. Výtěžek: 4.95 g (73 %).

Pmc-3-kyano-(L)-fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazid (vzorec VI, R² = Pmc, R³ = -SO₂CH₃)

Hydrochlorid 3-kyano-(L)-fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazinu (4.76 g, 12.8 mmol) a NMM (1.29 g, 12.8 mmol) se rozpustily v 50 ml DMF, přidal se Pmc-chlorid (4.64 g, 15.3 mmol) a NMM (1.55 g, 15.3 mmol) a se směs míchala 48 hodin při pokojové teplotě. Pak se vysrážený hydrochlorid NMM odfiltrovala a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Zbytek se převedl do ethylacetátu, organická fáze se promyla 0.1 N HCl a nasyceným roztokem chloridu sodného, sušila nad síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku. Získaný produkt se čistil kolonovou chromatografií na silikagelu 60 s elucí chloroformem. Získalo se 6.45 g (84 %) produktu. Otáčivost 20 °C = + 10.4 °(C = 1, v methanolu): TCL: R^ = 0.66 (chloroform 40/ methanol 4 / kyselina octová 1 objemově).

Pmc-3-thiokarboxamid-(L)-fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazid (vzorec VI, R^a * Pmc, R³ = -SO₂CH₃)

6.34 g (10.5 mmol) shora popsané kyano sloučeniny sa rozpustilo v 40 ml pyridinu. K roztoku, který se nasytil uváděním H_aS po 10 minut, se přidalo 20 kapek TEA. Reakční směs se nechala stát při pokojové teplotě 2 dny, pak se rozpouštědlo odpařilo a zbytek se rozpustil v 100 ml ethylacetátu, krátce zahřál, odfiltroval, promyl se ethylacetátem a sušil se. Výtěžek: 5.86 g (88 %).

Pmc-3-S-methyliminó'thiokarbonyl- (L) -f enylalanin-4-methylsul fonylpiperazid, hydrojodid, (vzorec IX, Alk = -COCH , X = J,

R² = Pcm, R³ = -SO CH )

5.86 g (7.52 mmol) shora popsaného thioamidu se rozpustilo za zahřívání v 11 ml DMF,v 250 ml acetonu. K roztoku se přidal methyljodid (13 g, 92 mmol) a reakční směs se nechala stát v temnu při pokojové teplotě přes noc. Směs se vlila do 1 1 diethylethéru, vzniklá sraženina se odfiltrovala, promyla se diethyletherem a sušila se. Výtěžek: 6.23 g (87 %).

Pmc-3-S-amidino-(L)-fenylalanin-4-methylsulfonylpiperazid, hydrochlorid, (vzorec I, X - Cl, R² = Pmc, R³ = -SO₂CH₃)

Hydrojodid methylthioimidátu (6.23g, 8 mmol) se rozpustil v 350 ml absolutního methanolu. K roztoku se přidal octan amonný (1 g, 13 mmol) a směs se zahřívala 60 °C na vodní lázni za míchání, až se vzniklá sraženina opět úplně rozpustila, což trvalo 4 hodiny. Reakce se sledovala tenkovrstvou chromatografií a celkově se přidal 1 g octanu amonného (13 mmol)v dávkách 0.2, 0.5 a 0.3 g po 2, 4a 6 hodinách. Po 8 hodinách se nezjistila TCL žádná výchozí sloučenina. Pak se rozpouštědlo odpařilo a zbytek se rozpustil v ethanolu a hydrojodid amidinu se vysrážel ethylacetátem / diethylethérem 1:1. Pro konverzi na hydrochlorid se získaný produkt rozpustil v methanolu a roztok prošel silně bazickým iontoměničem (Amberlite IRA-410, sycený Cl”). Hydrochlorid se vysrážel z koncentrovaného methanolického roztoku diethylethérem. Výtěžek: 3.34 g (64 %). Otáčivost 20 °C = + 47.7 ° (C = 1, v methanolu).

TCL: R_£ = 0.5 (organická fáze ethylacetát 4 / kyselina octo27 vá 1/ voda 2, objemově).

Specifická otáčivost odpovídající D- konfigurované sloučeniny, otáčivost (20 °C) = - 48.3 °(C = 1, v methanolu).

Všechny hydrochloridy amidinu se čistily kolonovou chromatografií na Sephadex LH-20 s methanolem jako eluentem.

Zkratky
Ac	acetyl
AcONHiPr	-CH_aCONHCH(CH₃)₂
BOC	t-butylkarbonyl
Bzl	benzyl
cBu	cyklohexyl
cHex	cyklobutyl
cPr	cyklohexyl
DCC	dicyklohexylkarbodiimid
DMF	dimethylformamid
Et	ethyl
EtOH	ethyl
EtOEtOH	hydroxyethyl-ethoxy
For	formyl
HOBt	hydroxybenztriazol
Me	methyl
NMM	N-methylmorfolin
Ph	fenyl
TEA	triethylamin
THF	tetrahydrofuran

Legendy k tabulkám 1-2

R^x R²

AMD = amidin Mtr = 2,3,6-trimethyl—methoxy-fenyl

AMe = aminomethyl TIPP == 2,4,6-triisopropylfenyl

TMeP = 2,4,6-trimethyl-fenyl Tol = 4-methyl-fenyl 2-Naph = 1-naftyl 1-Naph = 2-naftyl

Cm = kamfor-10

2-Pyl

2-Pyridyl

/\

2-Pym

2-Pyrimidyl

Biologické vlastnosti některých reprezentativních sloučenin podle tohoto vynálezu se uvádějí níže:

Tabulka 1 ukazuje inhibici koagulačního enzymu trombinu ve srovnání s trypsinem uvedenými sloučeninami pomocí dissociační konstanty (vyjádřené v mikromolech na litr). Všechny zkoumané sloučeniny kompetitivně inhibují štěpení substrátu vyvolané těmito dvěma enzymy. Mezi deriváty 3amidinofenylalaninu uvedenými v tabulce 1 je řada sloučenin majících vysokou antitrombinovou aktivitu, například hodnota K_± mezi 0.1 a 0.001 mikromolech na litr. U většiny sloučenin je inhibice trombinu výraznější než inhibice trypsinu. Hodnota Κ_χ inhibice trypsinu jsou až o řád vyšší než pro inhibici trombinu. Řada sloučenin inhibuje trombin i trypsin se srovnatelnou afinitou, zatím co některé deriváty, zejména s určitými acylovámi a heteroarylovými zbytky na piperazinovém dusíku jsou silnými inhibitory trypsinu.

Tabulka 1 také ukazuje inhibiční aktivitu proti plasminu, faktoru X_a, faktor XII_a, plasmovému kallikreinu, žlázovému kallikreinu a tPA. Inhibice plasminu, faktoru X_aa plasmového kallikreinu je obyčejně mnohem slabší, hodnoty K_± jsou až o 1-2 řády vyšší. Deriváty jsou prakticky meúčinné proti faktor XH_a, žlázovému kallikreinu a tPA. Proto se některé sloučeniny považují za selektivní inhibitory trombinu, zatím co jiné deriváty dávají přednost trypsinu.

Toxicita řady sloučenin podle tohoto vynálezu je srovnatelná s dříve studovanými deriváty benzamidinu obsahujících aminokyselin (LD_so 10 - 50 mg/kg po i.v. aplikaci).

Připravily se optické antipody některých derivátů a studoval se jejich inhibiční účinek. Podle výsledků Turk,

D. aj. (FEBS Letters 287, 133-138, 1991) nejúčinnější formou byly L-enantiomery. Ve srovnání s isomerními směsmi jejich inhibiční účinek se zvýšil o 2 řády. Inhibiční účinek D- forem je nižší o 2 řády.

2-methylsulfonylová ochranná skupina může se nahradit Ac-SO₂, Pmc-SO_a, Mtr-SO_z, Cm-SO₂ nebo TIPP-SO₂, zbytkem. I zde se našly vysoce účinné inhibitory.

Sloučeniny, které nejsou v tabulce 1 charakterizovány (L) nebo (D), jsou racemáty a NAPS-F((3AMD)-Pzd(N-COOEt) znamená Nalfa-(2-naftylsulfonyl-(D,L)-3-amidinofenylalanin4-ethoxykarbonylpiperazid.

<

Q.

o

O

co

o

co

o

fN

t o

N*

o

X

O

o

fN

CO

— o

03

o

fN

ΤΓ

o

r*·

o

MO

O

M0

o

cO

o

m

N*

o

r—

o

ω •χ Li > -X o --4 NI (—4 •CO ι—I —i ra >ΝΙ -X

O

MO x

o

co

o

co

o

co

o

CN

co

o

co

o

Pokračování tabulky 1

Inhibice různých setinových proteináz podobných trypsinu substituovanými piperazidy Nalfa - chráněných 3- substituovaných fenylalaninů

	G)
>	C_i
o
ε
N	r—M
03	r—f
r—1	ro

CL-X co o

4?oooooomor-t~* 'TN'·— OiOOMir-CNCO

O ε

3.

Ul o co +4 1-4 .X H-ι co X Μ—I

U

O

-H CO _X X CO Uu

N

CO c

—i cn

CL

X

Ul r-i ε

o

Ui >to co

X

CN x

cz

CN

co

o

r“

O

r*

CN

r»

N*

o

Ν'

o

fN

v

o

ro

o

M0

r>

Ν’

in

CO

o

r*

r~

Ν'

o

tn

N*

r—

o

MO

co

♦—

o

fN

tn

o

ΓΩ

τ—

T—

zs

zv

Λ

/·»

Z\

-

r~

o

Γ—

r*

o

in

r-

M0

r-

o

r-

MO

N*

fN

Ν'

N*

MO

Oc

tn

co

O

ιΛ

r*

m

fN

O

fN

Ν'

r-

CO

«—

N*

tn

<n

ID

CN

O MO co co co cn mo

Ό CN C «-oocoeococoN^ojcocofOcorooxNOCNLnr-ocN r- ΠΊ c- — r- τ— CN r— r—

VO CO ID r— m MO 43· Ν' CO <N ΙΟ CO CN CO VOCN^TCNCNCOCOvOvOMOvON^CNr-CO cONninnaoNTíCNooooooooooo COOOOCO«— OOOOOOCOOOOOOOOO τ co

cřNinnoiNOíNt-

<3 4? r-

ν ο o ω σι η (n

·— co

.09

r- CO CN

VO CN

Ν'

o o o o o

o

O

o

O

o

cn co

co cn ·—

m

tn

o o o o o

o

O

o

o co

o

O τ-

o

1- M0 O

CN M0

(N

m

o

OC

X

00

Ό

CO

(íf\

X

to

CN

CN CJ

< /

Z-K

X“N,

4J Nf

x/

o

CJ

ε ~

X

1

Σ

2

O CNUl

3 O

fN

o o —

o

CJ

ω

»-4 ε

NZ

CMS X

a x

T^

Σ E 2 X

Σ

ε

X X

X CJ u

o o

u

CN CN 1 O

CN CN CN CN

u

X X

CJ

CJ — 1

1 1

1

U O O O X

O

o

υ

O

0

1 I

o

o o o

< to to cj ω

to

co

<

Cu

fN fN

u

CJ CJ CJ

υ υ cj

x:

X X

XXX

ε

ez

ct

CL CL

CX Ct Ct

o

0

CL

CJ

<Ú

CJ f0

ra ra

Q fl

υ

U

u

CL

22

2 2

Z xS Z

e

ε

Η

ε

U

OJ

1

+

1-4

CJ

1

1 1

1 1 1

Cu

CL

ε

22

E-

<

fN

CN CM

CN CN

fN fN fN

X

*—*

·*—»

Q

a

Q

o

Q

CJ

s

Q

a

Q

a

o

a

O

CJ

Q

C

ε

z.

ε

•Γ*

ΖΞ

ε

-r

ε

<

Ame 2-Naph 2-Pyi 24 0.53 26 130 > 1000 94 > 1000 > 1000

Tabulka 2 je přehled všech syntetizovaných sloučenin, těsto váných in vitro, které nejsou zahrnuty v tabulce 1.

Přehled všech syntetizovaných sloučenin, které nejsou zahrnuty v tabulce

Tabulky 3-5 ukazují výsledky studií farmakokinetiky reprezentativních sloučenin podle tohoto vynálezu a pro srovnání hodnoty s NAPAP. Tabulka 6 ukazuje výsledky získané s vybranými sloučeninami po intraduodenální aplikaci. Zkoušené sloučeniny se podávaly krysám intravenózně (tabulka 3), perorálně (tabulka 4) a rektálně (tabulka 5). Po podání se odebíraly se vzorky krve v časových intervalech od 2 do maximálně 360 minut, ve kterých se hladiny zkoušených sloučenin v krvi stanoví pomocí HPLC.

Tabulka 3

Koncentrace (ng/ml) vybraných sloučenin v plazmě krys po intravenózní aplikaci 1 mg/kg

Sloučenina číslo

Cas -	5	6
(minut)	NAPAP	X	1	2	3
5	1150	812	1058	780	2210	879	823
15	428	169	394	224	145	367	289
30	376	40	150	95	313	151	194
60	192	8	89	38	112	50	141
120	84	0	74	12	0	0	86
180	106	0	51	10	0	0	70

Tabulka 4

Koncentrace (ng/ml) vybraných sloučenin v plazmě krys po orální aplikaci 50 mg/kg

Čas (minut)	Sloučenina	Číslo
NAPAP	X	1	2
30	0	33	87	1197
60	0	10	63	873
120	0	0	57	333
180	0	0	69	124
240	0	0	91	44
300	0	0	61	46

Tabulka 5

Koncentrace (ng/ml) vybraných sloučenin v plazmě krys po rektální aplikaci

Čas	Sloučenina	číslo
NAPAP 100	X 100	1 100	2 100	3 20	5* 20	6 20
(minut)	Dávka mg/kg
30		18	3255	31406	32448	7260	1650	1179
60		0	2371	17862	23132	3800	958	449
120		0	1804	3776	5302	1740	299	850
180		0	898	1075	2696	814	192	272
240		0	626	438	1263	215		46
300		0	5.92	220	810	61
360		0	448	158	508	34

* = volná báze sloučeniny

Tabulka 6

Koncentrace (ng/ml) vybraných sloučenin v plazmě krys po intraduodenální aplikaci 100 mg/kg

Čas (minut)	-- Sloučenina	číslo
2	3	3*	5	5*	6
30	21691	3824	2262	8744	1576	20460
60	15152	2172	795	9314	1900	6495
120	4275	1457	361	8612	1763	3284
180	2598	945	228		297	2064
240	2185	1277	144		530	1500
300	2195	1400	276		137	1203
360	2847				119	1437

* = volná báze sloučeniny

Zkoušené deriváty ukazují zlepšené farmakokinetické chování nejen s NAPAP, ale i s dříve popsaným piperazidem X. Ačkoliv sloučeniny 1, 2, 3, 5 a 6 podle tohoto vynálezu se vylučují srovnatelnou rychlostí po intravenózní aplikaci a resorbují se jen lehce po orální aplikaci, z části velmi vysoké hladiny v krvi, trvající 1 až 2 hodiny, se zjistily po rektální aplikaci. Po rektální aplikaci NAPAP nemohl být v krvi zjištěn, zatím co některé reprezentativní sloučeniny studované podle tohoto vynálezu dosahují extrémně vysoké koncentrace. Sloučeniny 1, 2 a 3 lze zjistit v plazmě i po 6 hodinách. Hladiny ,y plazmě po rektální aplikaci jsou konsistentně vyšší než dříve popsaného piperazidu X. Také koncentrace v plazmě měřené po intraduodenální aplikaci, z čás38 ti po více hodinách, jsou značné.

Některé reprezentativní sloučeniny podle tohoto vynálezu vykazují mimořádnou antikoagulační aktivitu in vitro. Ve všech případech trombinový čas (TT) byl nejvíce prodloužen. To odpovídá selektivitě těchto inhibitorů, které vedle srážecích faktorů inhibují nejúčinněji trombin. To ukazuje pro sloučeniny 1 až 11 tabulka 7. Prodloužení aktivovaného částečného tromboplastinového času (aPTT), který je vedle trombinu také ovlivněn jinými enzymy, které se účastní časné fáze koagulace, se dosáhne vyššími koncentracemi inhibitoru. To také platí pro protrombinový čas (PT), který představuje vnější koagulační cestu. Tabulka 7 ukazuje koncentrace, které jsou nutné pro zdvojnásobení srážecích časů. Pro účinné inhibitory trombinu 1, 2, 4, 5, 6 a 7 je to hodnota menší než 10“⁷ mol/1 pro prodloužení TT, až 10® mol/1 pro prodloužení aPTT a PT. Aktivní inhibitor NAPAP a sloučenina X, studované pro srovnávací účely, jsou účinné podle jejich hodnoty Κ_χ.

Inhibitory piperazinového typu jsou v plazmě (absolutně) stálé. Inkubace v lidské plazmě při 37 °C nevedla k žádné změně inhibiční aktivity po 5 hodin.

Tabulka 7

Inhibice koagulace v lidské plazmě vybranými sloučeninami

Číslo	Inhibice trombinu Κ_χ, μιηοΐ/ΐ	Koncentrace [gmol/l] pro zdvojnásobení
trombinový čas	aPTT	protrombinový čas
NAPAP	0,006	0,048	0,50	1/0
X	0,67	4,1	20	45
1	0,023	0,095	0,90	2,5
2	0,012	0,055	0,36	0,90
3	0,036	0,14	0,65	1,3
4	0,014	0,085	1,2	2,0
5	0,0021	0,034	0,26	0,39
6	0,004	0,042	0,3	0,65
7	0,012	0,075	0,55	1,0
8	0,031	0,13	1/2	2,0
9	0,020	0,12	0,57	1,1
10	0,0053	0,10	0,44	0,8
11	0,026	0,22	1,8	3,1

Antikoagulační efekt sloučenin lze také ukázat in vivo. Po rektální aplikaci zkoušených sloučenin se antikoagulační efekt stanovil v plazmě experimentálních zvířat. To se ukazuje pro sloučeniny 2,3,5 a 6 v tabulce 8. Podobně jako postup koncentrací v plazmě stanovený pomocí HPLC, antitrombinový účinek lze stanovit v srážecím testu.

Tabulka 8

Inhibice koagulace v krysí plazmě po rektální aplikaci slou čenin 2, 3, 5 a 6

Čas (minuty)	Koncentrace v plazmě (ng/ml)	Srážecí čas (sekundy)
trombinový čas	aPTT
	sloučenina 2	20 mg/kg
0	0	64	28
30	5440	> 300	120
60	2090	> 300	87
120	812	> 300	59
180	660	> 300	50
	sloučenina 2	5 mg/kg
0	0	32	22,5
30	296	> 300	37
60	160	224	33
120	60	176	30
180	40	107	26,4
	sloučenina 3	5 mg/kg
0	0	45	23,5
30	897	> 300	39,8
60	462	298	32,8
120	355	165	27,4
180	49	114	26,0

Tabulka 8 - pokračování

Čas	Koncentrace	Srážecí čas (sekundy)
(minuty)	v plazmě
trombinový čas	aPTT
	(ng/ml)
	sloučenina 5	20 mg/kg
0	0	153	22
30	1572	> 300	65
60	983	> 300	62,5
120	380	> 300	36
180	195	> 300	29,7
	sloučenina 5	5 mg/kg
0	0	51,5	21,2
30	168	> 300	34,5
60	65	255	30,5
120	82	137,5	27,5
180	10	95	25,3
	sloučenina 6	5 mg/kg
0	0	55,3	22,3
30	648	> 300	34,5
60	362	> 300	31,5
120	157	> 300	28,4
180	83	213	26
Po	rektální aplikaci	se sloučeniny podle	tohoto

zu absorbují v rozsahu, který vede k antitromboliticky ak tivním hladinám v plazmě. To se ukázalo modelem stasou vyvo lané trombosy podle Wesslera aj. Tato metoda spočívala v makroskopickém vyhodnocení trombů vyvolaných sérem v segmentech hrdelní žíly podle stupnice (0 = kapalná krev, 1 = jeden nebo několik malých trombů, 2 = neúplně uzavřený vaskulární segment, 3 = úplně uzavřený vaskulární segment). Antitrombolitická účinnost závisí jasně na dávce. Při dávce 100 nebo 20 mg/kg formace trombů je úplně potlačena, při nižší dávce se zabrání vaskulární okluzi nebo formace trombů je zvýšená.

Tabulka 9

Závislost na dávce antitrombolitické účinnosti sloučeniny 2 po rektální aplikaci v modelu stasou vyvolané žilné trombosy u krys

Dávka (mg/kg)	Hladiny	v plazmě	(ng/ml)	Stupnice	trombů	Relativní stupnice trombů
0	1
n	30	minut 60	minut	2	3
0	5		0	0	0	0	1	9	1
100	3	28698	16118	6	0	0	0	0
.20	4		1617	998	6	1	0	0	0,05
5	5		228	160	0	8	2	0	0,41

• *T·· n = počet experimentálních hodnocovaly 2 segmenty žily

Relativní stupnice rozměrem trombů v ošetřené nota u 5 mg/kg je 1.2 a zvířat. U každého se obecně vytrombů je poměr mezi průměrným skupině (například průměrná hodprůměrný rozměr trombů kontrolní skupiny je 2.9.

Piperazidy syntetizované způsobem popsaným v tomto vynálezu se používají jako takové nebo jako soli s fyziologicky snesitelnými minerálními či organickými kyselinami lze převést na vhodné aplikační formy pomocí vhodných pomocných látek a nosičů. Podle farmakologických vlastností jsou zvlášť významné tablety, dražé, kapslí, čípky a roztoky.

Dávka závisí především na antitrombinové aktivitě, biologické dostupnosti jakož i na celkové konstituci pacienta, přičemž dostatečná antitrombolitická aktivita se může dosáhnout dávkami mezi 0.5 a 50 mg/kg.

Převedení na 3 farmaceutické formy by se mělo ukázat na sloučenině 2, hydrochloridu Nalfa-(2-naftylsulfonyl-(L)-3amidinofenylalanin-4-acetylpiperazidu.

Přiklad a

Tablety s 20 mg sloučeniny 2 jako aktivní látkou, pokryté ochrannou lakovou vrstvou odolnou žaludečním šťávám

Složeni

Jádro: 20 mg aktivní látky, 96 mg laktózy, 3 mg mastku a 1 mg stearátu hořečnatého.

Pokrytí: 23.92 mg Eudragit S 12.5P (Roehra Pharma, Darmstadt), 0.266 mg dibutylftalátu, 0.744 mg mastku a23.92 mg aceton/ ethanol 1:1.

Výrobní proces: Aktivní látka smíchaná s aditivy se lisovala sítem s oky 0.5 mm a jednou sušila, tvarovala do oválných jader tablet. Ochranný lak se nastříkal ve zvláštním granulátoru a potom se lakovaná jádra sušily.

Přiklad b

Čípky s 10 mg sloučeniny 2 jako aktivní látkou

Složeni

Čípky obsahují 10 mg aktivní látky a 1 g Witepsolu W45 jako podkladové látky.

Specifikace pro výrobu čípků 10: 100 mg jemně práškované aktivní látky se hněte se zkapalněnou podkladovou látkou. Přípravek se míchá po částech se zbylou zkapalněnou podkladovou látkou a zpracovává se, až se dostane regulární kvalita. Blízko hranice litelnosti se směs vlije do vhodné formy a nechá se v klidu ochladit.

Příklad c

Injekční a infusní roztok s 2.5 mg/ml sloučeniny 2 jako aktivní látkou

Výrobní proces: 0.25 g aktivní látky se zředí v 100 ml vody pro injekce, pak se roztok zfiltruje a, pokud je to nutné, plní se do 2 ml ampulí. Uzavřené nádoby s tímto roztokem (infusní láhve,ampule) se sterilují v páře při 121 až 124°C.

Claims

1. L,D-, L- nebo D- fenylalanin piperazidy vzorce I ¹ 2 so₂-R^z kde R¹ představuje bazickou skupinu vzorce (a) HN=C(-)-NH₂ nebo (b) -CH₂-NH₂ amidino aminomethyl

R² představuje (ne)substituovaný arylový nebo heteroarylový zbytek a

R³ představuje acylový zbytek vzorce -COX, kde X znamená vodík, alkyl, přímý či rozvětvený, možná substituovaný alkyl nebo (ne)substituovaný aryl nebo cykloalkyl, aralkylový zbytek, ve kterém aromatický zbytek může být substituovaný, karboxamidový zbytek vzorce -CO-NR'R, thiokarboxamidový zbytek vzorce -CS-NR'R'' nebo ethylamidový zbytek vzorce -CH₂-CO-NR'R, kde R' = R = H, R' = R = alkyl, R' = H, R = alkyl, R' = H, R = aryl, nebo R' a R mohou tvořit cykloalifatický nebo heterocykloalifatický kruh s atomem dusíku, zbytek SO₂-Y, kde Y znamená (ne)substituovaný alkyl, (ne) substituovaný aryl nebo heteroaryl nebo -NR'R, kde R' a R je H či to může být stejný nebo různý nižší alkyl C —C ,

X 3 ' cykloalifatický kruh s 5 až 8 C atomy, které mohou být substituované hydroxylovou nebo oxo skupinou, (ne)substituovaný heteroarylový zbytek nebo heterocykloalifatický zbytek, funkcionalizovaný alkylový zbytek vzorce -(CH^J^-X, kde alkylový řetězec může být přímý či rozvětvený, η = 1 až

8 a funkční zbytek představuje hydroxylovou skupinu, jejíž H atom může být substituovaný , halogenový atom, terciární aminovou skupinu vzorce -N(Alk)₂, kde alkylové skupiny mají 1 až 3 atomy a jsou stejné a mimo to atom dusíku může patřit cykloalifatickému kruhu s 5 až 7 členy kruhu, ke kterému lze přidat jeden nebo dva další kruhy, skupina acylaminomalonát vzorce AcHN-C(-)(COO-Alk)_z, skupina AcHN-CH(-)COOH nebo H₂N-CH(-)COOH skupina, a jejich soli s minerálními či organickými kyselinami.

2. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1, vyznačené tím, že (ne)substituovaný arylový nebo heteroarylový zbytek v R² představuje fenyl, 4-methylfenyl, 2,4,6-trimethyl- nebo triisopropylfenyl, 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenyl, 2,2- dimethyl- 6-methoxy- či 2,2,5,7,8-pentamethylchromanyl, antrachinonyl, 1- či 2-naftyl, chinolyl či isochinolyl nebo kamforový zbytek.

3. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 nebo 2 vyznačené tím, že X v acylovém zbytku R³ představuje nižší alkyl, zejména methyl nebo v případě cykloalkylu s výhodou (C-C ).

4. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 nebo 2 vyznačené tím, že aromatický zbytek aralkylového zbytku R³ je substituovaný halogenovým atomem, alkylem, alkoxy, hydroxy nebo nitro skupinou.

5. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 nebo 2 vyznačené tím, že alkylový zbytek ve zbytku SO_a-Y je methyl, trifluormethyl nebo trichlormethyl.

6. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 nebo 2 vyzná* ’ » · čené tím, že arylový nebo heteroarylový zbytek ve zbytk“ SO_a-Y je fenyl, 4- methylfenyl, 2,4,6- trimethyl- nebo -triisopropylfenyl, 4-methoxy- 2,3,6-trimethylfenyl, 2,2- dimethyl- 6-methoxy- či 2,2,5,7,8-pentamethylchromanyl, antrachinonyl, naftyl, chinolyl nebo O-aryl.

7. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 nebo 2 vyznačené tím, že (ne)substituovaný heteroarylový zbytek v R³ je pyridyl či pyrimidinyl, nebo (ne)substituovaný heterocykloalifatický zbytek je N-methylpyperidyl.

8. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 nebo 2 vyznačené tím, že H atom e hydroxylové skupiny ve funkcionalizovaném alkylovém zbytku v R³ je substituovaný alkylovou, aralkylovou, arylovou, hydroxyalkylovou nebo acylovou skupinou.

9. Fenylalanin piperazidy podle nároku 1 až 8 vyznačené tím, že Ac v acylaminomalonátové skupině vzorce AcHN-C(-) (COO-Alk)_a a v skupině AcHN-CH(-)COOH funkcionalizovaného alkylového zbytku znamená formyl nebo acetyl a Alk je nižší alkyl C_x-C₃.

10. Fenylalanin piperazidy podle jednoho z nároků 1 až 9 vyznačené tím, že R^x představuje bazickou skupinu vzorce (a) = amidino, anebo R² představuje 2-naftyl, antrachinon, 2,4,6- triisopropylfenyl a 2,2,5,7,8- pentamethylchromanyl a R³ představuje acylový zbytek, zejména formyl nebo acetyl, funkcionalizovaný alkylový zbytek, zejména 2- hydroxethyl a zbytek SO^-Y, karboxamidový zbytek nebo heteroarylový zbytek, zejména 2-pyridyl či 2-pyrimidinyl.

11. Způsob výroby fenylalanin piperazidů podle jednoho z nároků 1 až 10 vyznačený tím, že zahrnuje převedení alkylesteru (D,L)-3-kyanofenylalaninu vzorce II

CN

CH,-CH-COOAlk 4 i

NH₂ se sulfonylchloridem R²-SO_aCl, kde R² má významy popsané v nároku 1 nebo 2 na racemickou sloučeninu vzorce IV

CN

CH₂-CH-COOAlk

NH

Šo₂-R² ze které se získají racemáty sulfonylovaných kyanofenylalaninů vzorce V

CN

CH--CH-COOH £ i

NH * 2 so₂-r^z hydrolýzou konverzí sloučenin vzorce IV enzymatickou hydrolýzou s chymotrypsinem na D-konfigurované aminokyseliny vzorce V a konverzi D- konfigurovaných amino alkyl karboxy50 látů vzorce IV, získaných touto procedurou na D- konfigurované aminokarboxylové kyseliny V hydrolýzou, konverzi sloučenin V s piperazinovým derivátem vzorce VII \__/ na (D,L)-, D- nebo L-kyano sloučeniny s piperazidovou strukturou vzorce VI

CN ¹ 2 so₂-r^z syntetizování thioamidu vzorce VIII přidání H^S ke kyanové funkční skupině se konvertují na thioimidátové halidy vzorce IX

SAlk /

konverzí s alkylhalidem, nebo syntézu imidátových halidů vzorce X ₀Alk z kyanových sloučenin s piperazidovou strukturou vzorce VI a konverzi sloučenin vzorce IX s octanem amonným nebo se sloučeninou vzorce X v alkoholickém roztoku amoniaku na sloučeniny vzorce XI

N-R kde X představuje halogen, s výhodou chlor.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačený tím, že zahrnuje ochranu (D,L), L- či D-3-kyanofenylalaninu zavedením Boc skupiny na aminovou funkci, konverzi získané karboxylové kyseliny vzorce V, se skupinou Boc místo SO₂-R², s piperazinovým derivátem vzorce VII, na odpovídající Boc chráněné (D,L), Lči D-3-kyanosloučeniny s piperazidovou strukturou vzorce VI a konverzi této sloučeniny kyselým odštěpením Boc skupiny a konverzi se sulfonylchloridem obecného vzorce vzorce III na odpovídající Boc chráněné (D,L), L- či D-3- kyanosloučeniny s piperazidovou strukturou vzorce VI.

13. Způsob podle nároků 11 nebo 12 vyznačený tím, že zahrnuje získání sloučenin vzorce I, kde R¹ představuje aminomethyl hydrogenací, s výhodou katalytickou hydrogenaci kyanových sloučenin vzorce VI.

14. Použití fenylalanin piperazidů podle podle jednoho z nároků 1 až 10 jako solí či volných baží pro přípravu antitrombolyticky aktivních léčiv pro subkutanní nebo intravenósní, zejména orální, rektální či duodenální podávání.

15. Antitrombolyticky aktivní léčivo pro podávání subkutanní nebo intravenosní, zejména však orální, rektální či duodenální cestou, vyznačené tím, že obsahuje účinném množství alespoň jednoho fenylalanin piperazidu podle jednoho z nároků 1 až 10 a vhodná aditiva.

16. Antitrombolyticky aktivní léčivo podle nároku 15 vyznačené tím, že je ve formě tablet, dražé, kapslí, pelet, čípků, roztoků, injekcí nebo transdermálních systémů, jako jsou náplasti.