CZ21897A3 - Purified polypeptide compound, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof - Google Patents
Purified polypeptide compound, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof Download PDFInfo
- Publication number
- CZ21897A3 CZ21897A3 CZ97218A CZ21897A CZ21897A3 CZ 21897 A3 CZ21897 A3 CZ 21897A3 CZ 97218 A CZ97218 A CZ 97218A CZ 21897 A CZ21897 A CZ 21897A CZ 21897 A3 CZ21897 A3 CZ 21897A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- minutes
- cys
- gly
- lys
- fraction
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 150
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 141
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 140
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims description 139
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 133
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 231
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 63
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 61
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 60
- 241000238898 Agelenopsis aperta Species 0.000 claims abstract description 31
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- 239000002435 venom Substances 0.000 claims abstract description 19
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 claims abstract description 18
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 133
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 94
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 34
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 25
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 22
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 claims description 18
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 claims description 18
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 230000008061 calcium-channel-blocking effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002708 spider venom Substances 0.000 claims description 12
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 11
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 11
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims description 11
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000239290 Araneae Species 0.000 claims description 9
- ODDOYXKAHLKKQY-MMWGEVLESA-N Cys-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ODDOYXKAHLKKQY-MMWGEVLESA-N 0.000 claims description 5
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 108010085325 histidylproline Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 claims 3
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 claims 1
- 241000277301 Esociformes Species 0.000 claims 1
- DKSRGEHEBNUUNA-UHFFFAOYSA-N FC(C(=O)O)(F)F.[I] Chemical compound FC(C(=O)O)(F)F.[I] DKSRGEHEBNUUNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 claims 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims 1
- RSAQARAFWMUYLL-UHFFFAOYSA-N tic-10 Chemical compound CC1=CC=CC=C1CN1C(CCN(CC=2C=CC=CC=2)C2)=C2C(=O)N2CCN=C21 RSAQARAFWMUYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 abstract description 40
- 239000003643 water by type Substances 0.000 abstract description 5
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 132
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 132
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 69
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 60
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 45
- 239000000047 product Substances 0.000 description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 41
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 22
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 22
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 21
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 15
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 15
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 14
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 14
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 14
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 13
- 230000002461 excitatory amino acid Effects 0.000 description 13
- 239000003257 excitatory amino acid Substances 0.000 description 13
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 10
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N isopropylamine Chemical compound CC(C)N JJWLVOIRVHMVIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 6
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 5
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- QBHKCXPTYJQDLE-UHFFFAOYSA-N n-[3-[3-[3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propylamino]propyl-hydroxyamino]propyl]-2,5-dihydroxybenzamide Chemical compound NCCCNCCCCNCCCNCCCN(O)CCCNC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O QBHKCXPTYJQDLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ICSMWVXZVJFMRP-UHFFFAOYSA-N n-[3-[3-[3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propylamino]propyl-hydroxyamino]propyl]-4-hydroxybenzamide Chemical compound NCCCNCCCCNCCCNCCCN(O)CCCNC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 ICSMWVXZVJFMRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- ANSYYDWJWZLLLS-UHFFFAOYSA-N 3-phenyl-2-(6-sulfonylcyclohexa-2,4-dien-1-yl)oxaziridine Chemical compound O=S(=O)=C1C=CC=CC1N1C(C=2C=CC=CC=2)O1 ANSYYDWJWZLLLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940127291 Calcium channel antagonist Drugs 0.000 description 3
- XJUZRXYOEPSWMB-UHFFFAOYSA-N Chloromethyl methyl ether Chemical compound COCCl XJUZRXYOEPSWMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100028953 Gelsolin Human genes 0.000 description 3
- 101001059150 Homo sapiens Gelsolin Proteins 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N N-Methyl-D-aspartic acid Chemical compound CN[C@@H](C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229940061627 chloromethyl methyl ether Drugs 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 3
- YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N fura-2 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=3OC(=CC=3C=2)C=2OC(=CN=2)C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 YFHXZQPUBCBNIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 3
- FSGGDDPNTYEPDY-UHFFFAOYSA-N n-[3-[3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propyl-hydroxyamino]propyl]-2-(4-hydroxy-1h-indol-3-yl)acetamide Chemical compound C1=CC(O)=C2C(CC(=O)NCCCN(O)CCCNCCCCNCCCN)=CNC2=C1 FSGGDDPNTYEPDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ADYKROCSIOKCGW-UHFFFAOYSA-N Agel 489 Natural products NCCCNCCCCNCCCCNCCCN(O)CCCNC(=O)Cc1c[nH]c2ccccc12 ADYKROCSIOKCGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238899 Agelenopsis Species 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 2
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 2
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N Dimethylamine Chemical compound CNC ROSDSFDQCJNGOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000289 Esophageal Achalasia Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 206010030136 Oesophageal achalasia Diseases 0.000 description 2
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 206010042600 Supraventricular arrhythmias Diseases 0.000 description 2
- 201000000621 achalasia Diseases 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- LIURIBSBVUMOJS-UHFFFAOYSA-N agatoxin 489 Natural products C1=CC=C2C(CC(=O)NCCCN(O)CCCNCCCNCCCCNCCCN)=CNC2=C1 LIURIBSBVUMOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHELZAPQIKSEDF-UHFFFAOYSA-N allyl bromide Chemical compound BrCC=C BHELZAPQIKSEDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 2
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;sulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RHJLMJAWDKKWPH-UHFFFAOYSA-N 1,1-dichloro-2,2-dimethylpropane Chemical compound CC(C)(C)C(Cl)Cl RHJLMJAWDKKWPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKHGVMIXRPGHOO-UHFFFAOYSA-N 2-(benzenesulfonyl)-3-phenyloxaziridine Chemical compound C=1C=CC=CC=1S(=O)(=O)N1OC1C1=CC=CC=C1 MKHGVMIXRPGHOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCPTXJJVVDAEMW-XVFCMESISA-N 3',5'-cyclic CMP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H]2OP(O)(=O)OC[C@H]2O1 WCPTXJJVVDAEMW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- NHQDETIJWKXCTC-UHFFFAOYSA-N 3-chloroperbenzoic acid Chemical compound OOC(=O)C1=CC=CC(Cl)=C1 NHQDETIJWKXCTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- NLMQHXUGJIAKTH-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyindole Chemical compound OC1=CC=CC2=C1C=CN2 NLMQHXUGJIAKTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- GWIKUSMLTIXFCT-UHFFFAOYSA-N Agel 505 Natural products NCCCNCCCCNCCCCNCCCN(O)CCCNC(=O)Cc1c[nH]c2cccc(O)c12 GWIKUSMLTIXFCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N Benzenesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 KHBQMWCZKVMBLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BMHBJCVEXUBGFI-BIIVOSGPSA-N Cys-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)N)C(=O)O BMHBJCVEXUBGFI-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025027 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM69 Human genes 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N Glu-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O FYBSCGZLICNOBA-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- HLYCMRDRWGSTPZ-CIUDSAMLSA-N Glu-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O HLYCMRDRWGSTPZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N Gly-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(O)=O ZLCLYFGMKFCDCN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N His-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CN=CN1 LNCFUHAPNTYMJB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101000830203 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM69 Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN APFJUBGRZGMQFF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- OKIBNKKYNPBDRS-UHFFFAOYSA-N Mefluidide Chemical compound CC(=O)NC1=CC(NS(=O)(=O)C(F)(F)F)=C(C)C=C1C OKIBNKKYNPBDRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOKKHZGPKSLGJE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-D-aspartic acid Natural products CNC(C(O)=O)CC(O)=O HOKKHZGPKSLGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100004734 Niallia circulans btrJ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 206010036600 Premature labour Diseases 0.000 description 1
- 208000003782 Raynaud disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012322 Raynaud phenomenon Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003282 amino acid receptor affecting agent Substances 0.000 description 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N butane-2,3-diamine Chemical compound CC(N)C(C)N GHWVXCQZPNWFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000000480 calcium channel blocker Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N cystine group Chemical group C([C@@H](C(=O)O)N)SSC[C@@H](C(=O)O)N LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002027 dichloromethane extract Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 244000078703 ectoparasite Species 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 244000079386 endoparasite Species 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006200 ethylation reaction Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MJEMIOXXNCZZFK-UHFFFAOYSA-N ethylone Chemical compound CCNC(C)C(=O)C1=CC=C2OCOC2=C1 MJEMIOXXNCZZFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000004992 fast atom bombardment mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- ZOAMBXDOGPRZLP-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetamide Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)N)=CNC2=C1 ZOAMBXDOGPRZLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003617 indole-3-acetic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229940087646 methanolamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- SQDFHQJTAWCFIB-UHFFFAOYSA-N n-methylidenehydroxylamine Chemical compound ON=C SQDFHQJTAWCFIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000001423 neocortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000026440 premature labor Diseases 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPDUQYOLCLEGS-UHFFFAOYSA-M sodium;2-ethylhexanoate Chemical compound [Na+].CCCCC(CC)C([O-])=O VYPDUQYOLCLEGS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012258 stirred mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oblast vynálezu _Vild
- o , _ 3 7 1,
Vynález se týká čištěných polypeptidových sloučenin; 3 ϊϊ/;
ď*. «τ' vyskytujících se v jedu pavouka Agelenopsis aperta~,—jsou vhodné jako antagonisté excitačních aminokyselinových
L b iA i £ neurotransmiterů a/nebo jako blokovacích činidel vápníkových kanálků. Vynález se rovněž týká postupu přípravy těchftf$CG čištěných polypeptickových sloučenin a farmaceutických prostředků obsahujících tyto polypeptidové sloučen jiný.', f í f1 11 I í
*f‘3
Dosavadní stav techniky
Podle dosavadního stavu techniky bylo zjištěno, že jed pavouka Agelenopsis aperta obsahuje přinejmenším dva toxiny, které působí na průchod vápníku, viz,' publikace Jacksan, H. a kol,, Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987). Podle této publikace byl objeven toxin, označený jako AG2, který má molekulovou hmotnost menší než 1 000, přičemž se předpokládá, že tento toxin potlačuje průchod vápníku v mnohá tkáních. Kromě toho se v publikaci : Jackson, Η. , a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986), uvádí další toxin pavouka Agelenopsis aperta představující složku s molekulovou hmotností asi 6 000. Tento toxin způsobuje presynaptickou blokádu transmise a předpokládá se, že tento toxin blokuje vápníkové kanálky souvisící s uvolňováním neurotransmiterův—1------------------------------------------—.
Sloučeniny, které jsou antagonisty excitačních aminokyselinových neurotransmiterů, mají celou řadu. použití.
Antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů nacházejí klinické použili při léčení takových stavů, jako jsou záchvaty, mrtvice, mozková ischemie, nervové degenerativní poruchy, jako je Alzheimerova choroba a epilepsie, a jako psychoterapeutika, viz. publikace : Excitatory Amino Acids in Health and Dísease, D. Lodge·,·-Ed,...,. . John Wiley and Sons Ltd., New York, NY 1988. Tyto sloučeniny jsou dále užitečné při studiu fyziologie buněk, například nervových buněk a při hubení bezobratlých škůdců a hmyzu.
Sloučeniny, které působí jako antagonisté vápníku, mají celou řadu použití. Například mohou antagonisté vápníku nalézat klinické využití při léčení angíny, hypertenze,·· kardiomyopathie, supraventrikulární arytmie, ezofageální achalasie, předčasný začátek porodu, Raynaudovy choroby a dalších nemocí, viz. W.G. Nay.ler, Calcium Antagonists, Academie Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1988, které zde slouží jako odkazový materiál.
Kromě toho jsou tyto sloučeniny vhodné pro studium fyziologických procesů v buňkách, například v nervových a svalových buňkách a. pro hubení bezobratlého hmyzu.
Podstata vynálezu
Podstatu předmětného vynálezu představuje čištěná polypeptidová sloučenina vybraná ze skupiny zahrnující :
polypeptid (I), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci ze surového jedu pavouka Áge ná koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10'6 cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut. potom % > 70 ?δ B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až minut, kde A je 0, ll vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 38 minutách;
(b) je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů , 10“6 cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného množství 10 mililitrů za minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 30 % B, % —'-> 70 % A v průběhu 0 až 40 minut, Vatersova
Λ křivka 6, kde A je 0, lj vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 22 minutách;
(c) sekvence aminokyselin s koncovou aminoskupinou je následuj ící:
ř^N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-: gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyslys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argasn-glu-trp-leu-ser-;
(d) FAB MS: 7267;
a polypeptid, který má v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost týkající se blokování vápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (I),
-----------------------po-l-ypep-x-id—(-I-I-)— vzorce;-- ------------------------------ — asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-alaβ c.n._ *r o 1 □ - cr. 1 _ η τ·η - K 4 « -r· vc-rvc.flQn-jl V’ T.vr¢-J — y ~ o — J tyr-cys-Thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cysval-asn-asn-asn-C0NH2 a polypeptid, který má v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost týkající se -blokování- vápníkových-kanálků-jako-uvedený polypeptid (II) , polypeptid (III), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci ze surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, --r-ozměry--22-milimetrů-,x-250-milimetrůvelikost-pórů—~--—.
. 10”6 cm, velikost částic 10 gm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového:systémuř s lineárním gradientovým programem. 5 % ——:->·20*%·Β, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -—·—> 70 %B, 80 % .-> 30 % A .v průběhu 30 až minut, kde-A je 0,iI%^jh{ vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril·, při asi 39 minutách;
(b) je přítomen ve’frakci z frakce/popsanévýše v odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10“ cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 25 % B, % -> 75 % A v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova křivka '6, potom 25 % —-—> 50 % B, 75 % -> 50 % A ^v—průběhu-3 0-až—45—m-i-nut-,—Vater sova-jkř-i-vka-11-; —kde-A-j e—
0,1 vodný roztok trif luoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 36 minutách, a (c) sekvence aminokyselin s koncovou aminoskupinou je následující:
F^N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cysasp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyrgly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys- trp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cysglu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lysleu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leuasp-trp-;
(d) ion-spray MS: 7793 ;
a polypeptid, který má v podstatě stejnou sekvencí . aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (III), ;
polypeptid (IV) vzorce:
I^N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lysser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr- as cys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg- r arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg- ;-*· phe-val-thr-iie-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-C0NH2, a polypeptid, který má v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (IV), polypeptid (V), který má následující identifikační charakteristřky-------------—x------------------------------------ (a) je přítomen ve frakci ze surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů cm, velikost částic 10 gm, za použiti průtočného hííiuz5ΐνi 15 uiililitru/minutu a rczpcuštědlcvchc systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -—> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až
A minut, kde A je 0,ΐ|%ρ«ί| vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 43 minutách;
.....(b) je přítomen ve-frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a) , která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10~6 cm, velikost částic 5 gm, za použití průtočného množství 3,5 raililitru/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 25 % -> 40 % Β,
75-%Λ ť>~60-%-A~v průběhu 0-až~30-minut ,-kde =. A-j.e
0,ll% vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 20,25 minuty;
(c) sekvence aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je následující:
HjN-ile-val-gly.-gly-lys-thr-ala-lys-phe-glyasp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-glu-glu-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asp- ;
(d) molekulová hmotnost je asi 20 000; a polypeptid, který má v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokování vápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (V), polypeptid (VI), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10'6 cm, velikost částic 10 μπι, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému .
s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 íí A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až λ
minut, kde A je vodný roztok kyseliny .
trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 48,3 minuty;
(b) sekvence aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je následující:
HjN-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-serasn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro- ;
(c) molekulová hmotnost asi 80 000 a polypeptid, který má v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin a v podstatě stejnou účinnost při blokovánívápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (VI) , 7- á.
a farmaceuticky přijatelné solí odvozené od těchto sloučenin. 'ft· >
.•T; .
Ve výhodném provedení podle vynálezu je tato čištěná polypeptidová sloučenina vybrána ze skupiny zahrnující polypeptid (I), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis apertá, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů
3“ 7 106 “cmUAEérik^st^cástic”10~μπΐ'τ~za~pOužitíprůtočného------— množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom %
-> 70 % Β, 80 %
-> 30 % A v průběhu 30 až t__i_ * j Λ η i 1 oř.i _ _'I___— —υ flUG Λ J V , Λ I VUUIÍV LUÍ.UUA Λ-j btrJ.J.ii}' trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 38 minutách;
(b) je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10”cm, velikost částic 10 gra, za použití průtočného množství 10 -mililitrů/minutu-a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 30 % B, % -> 70 % A v průběhu 0 až 40 minut, Vatersova křivka 6, kde A je 0, vodný roztok trif luoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 22 minutách;
(c) sekvence aminokyselin a koncovou aminovou skupinou -je -následující-:
glu-lys - gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-aspgly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-Ieu-lyslys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argasn-glu-trp-leu-ser-;
(d) FAB MS; 7267;
polypeptid (II) vzorce:
Ϊ asp-cys-val-gly-glu-ser-gin-gin-cys-ala- !
asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyrtyr - cys - thr- cys -arg - tyr- phe - pro- lys - cys - ile - cys ...........va-l-’-asn---as-n---asn--G0NH-2T_,'v------- ---------............ . - - polypeptid (III), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka
Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 1O-6 cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rožpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, % --—> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 fy B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až minut, kde A je 0,l|%)-ft±J vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 39 minutách;
(b) je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 106 cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného ‘ množství 10 mililitrů/minutu a rožpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % ---> 25 % B, % --> 75 % A v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova 5 ' .
křivka 6, a potom 25 % -> 50 % B, % -> 50 % A v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova λ . - křivka 11, kde A je 0,1 vodný roztok trif luoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 36 minutách, a (c) sekvence aminokyselin a koncovou aminovou skupinou je následující: .
H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cysasp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyrgly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lystrp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys____________glu-lysxgly^met=lys-his-thr-cys-ile-thr-lysleu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leuasp-třp-;
(d) ion-spray MS: 7793,
1U polypeptid (IV) vzorce:
l^N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lysser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-argarg-thr-trp-cys- leu-val-asp-tyr-ser-arg- j phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-ČONí^, polypeptid (V), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka
Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, Tozměř^22*l^ilimetr'ů’”250 milimetrůV velikost*póřů~ ~ ~ . 10cm, velikost částic 10 μπι, za použití průtočného množství 15 mililitrů/rainutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % —:-> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až minut, kde A je 0,li , vodný roztok kyseliny sl· trifluoroctové a. B je acetonitril, při asi 43 minutách;
(b) je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 10cm, velikost částic 5 gm, za použití průtočného množství 3,5 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému } s lineárním gradientovým programem 25 % -> 40 % B, J % -> 60 % A v průběhu 0 až 30 minut, kde A je
Λ
0,lj%t-n4l vodný roztok trif luoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 20,25 minuty;
(c) sekvence aminokyselin a koncovou aminovou skupinou je následující:
H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-glyasp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-glu-glu-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asp- ;
(d) molekulová hmotnost je asi 20 000, poiypeptid (VI), který má následující identifikační charakteristiky:
(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů . 106 cm, velikost částic 10 μπι, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpoustědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % --> 20 % B, % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až
A * minut, kde A je Ο,1|%Η»*1 v°dný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 48,3 minuty;
(b) sekvence aminokyselin s koncovou aminovou skupinou je následující:
H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-serasn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro- ;
a (c) molekulová hmotnost je asi 80 000, a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto látek.
Do rozsahu předmětného vynález urovněž náleží — f armaceut ieký pr ostřede k_pro_b1okování_vápníkových kanálků _ v buňkách savců, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje některou z čištěných polypeptidových sloučenin nebo farmaceuticky přijatelných solí odvozených od těchto sloučenin v množství blokujícím vápníkové kanálky a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosičovou látku.
Podstata postupu přípravy čištěné polypeptidové sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující polypeptidy (I), (II), (III), (IV), (V) a (VI) a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin, podle uvedeného vynálezu spočívá v tom, že (a) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (I), se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 , 10cm, velikost částic 10 gm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systémuV lineárníiŤrgradientovýni prógráiněm “ % -> 20 % acetonitril95 -%--> 80. % .0,1. %-ní..
vodný roztok trifluoroctové kyseliny.v průběhu 0. až 30 minut, potom 20 % --> 70 % acetonitril, % -> 3Q % 0,11 vodný roztok trif luoroctové θ' kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí.od 220,do.230 nm,.přičemž frakce,.
která se eluuje při-asi 38 minutách se jímá: a potom se vloží na kolonu C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů fi x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10 cm, velikost částic 10 gm, a eluování se provádí za použití průtokového množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 30 % acetonitril, % -> 70 % 0,11 vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 40 minut, Vatersova křivka 6. při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22 minutách, se jímá a'potomsé' případně lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;
(b) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (II) , se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech. 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10”^ cm, velikost částic 10 pm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 %--> 80 %
A
0,11 vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 az minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, % -> 30 % 0,1 vodný roztok trif luoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 40 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 10 pm, přičemž eluování se provádí za použití průtokového · množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému · s nelineárním gradientovým programem 20 % -30 % =' ’ acetonitril, 80 % -> 70 % vodný roztok kyseliny trif luoroctové v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova-,ί w křivka 6, potom 3.0 % -> 50 % acetonitril, % -> 50 % 0,1 \ vodný roztok kyseliny’ trifluoroctové v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova křivka 11 a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22 minutách, se jímá a potom se případně lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;
(c) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (III) , se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na_.kol.oně_C^1.8^yydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 _ milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 10 gm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % > 80 %
Λ
Ο , l| vodný roztok trifluoroctové kyseliny v orůběhu 0 až
O ' * minut, potom 20 % --> 70 % acetonitril, s\ % -> 30 % 0,1^ vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce,' která se eluuje při asi 39 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10”^ cm, velikost částic pra, a eluování se provádí za použití průtokového množství mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 25 % acetonitril, gQ % --;-> 75 y0 0,iI%|jmJ vodný roztok kyseliny v
trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova křivka 6, _______________ potom 25 % ·-> 50 % acetonitril, 75 % -> 50 %
0,li%řni) vodný roztok kyseliny, trif luoroctové v průběhu 30 sb až 45 minut, Vatersova křivka 11 a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 36 minutách se jímá a potom se případně lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;
(d) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (IV), se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 10 pm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,l|%yft^ vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril,
Λ . X % --> 30 % 0,vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 40 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 10 gm, přičemž eluování se provádí za použití průtokového množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % acetonitril, 80
-> 70 % 0, vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova křivka-6, potom 30 % %
-> 50 % 0,1 > 50 % acetonitril, vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova křivka 11 a při detekci piku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 27,5 minuty se jímá a popřípadě lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje:
(e) v případě, že je požadován v podstatě čistý polypeptid (V) , se celý podíl jedu pavouka- Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 .10^. cm,..
velikost částic 10 gro za použití průtočného množství mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, % -> 80 % 0,1^ vodný roztok trif luoroctové ¥ .
kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 %
Λ acetonitril, 80 %---30 % 0,1|%}-β4| vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 43 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-18 Vydac o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cín, „velikost částic 5gmL a eluování se provádí za použití průtokového množství 3,5 mililitru/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem
-> 60 % O,lJj?&^ vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut
-> 40 % acetonitril, 75 . (.«V
J. \z a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 20,25 minuty se jímá a potom případně lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;
(f) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (VI), se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperza eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10_i® cm, velikost částic 10 gm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 %
0,11 vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, '80'%“
->*30'%· o vodný roztok trifluoroctové kyseliny v. průběhu .30 až. 55 minut; při monochromatické detekci píku v rozsahu od 220 do 230 nm,, přičemž, frakce, která se eluuje při asi 48,3 minuty se jímá a potom se popřípadě lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje;
nebo v alternativním provedení, se kterýkoliv z výše uvedených polypeptidů synteticky připraví metodami samy . o sobě známými;
a v případě, kdy jsou požadovány polypeptidy, které mají v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako libovolný z výše uvedených polypeptidů, potom se tento polypeptid nebo polypeptidy synteticky připraví metodami samy o sobě známými;
a případně se převedou výše uvedené polypeptidy na farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin metodami samýosobé známýmIT J
Obecně je vynález zaměřen na určité polyaminy a polypeptidy, vyskytující se v jedu pavouka Agelenopsis aperta. Tyto polyarainy a jejich farmaceuticky přijatelné soli antagonizují excitační aminokyselinové neurotransmitery. které působí na buňky, včetně nervových buněk, řady různých organizmů, včetně bezobratlých a obratlovců. Uvedené polypeptidy a jeden z uvedených polyaminů a jejich farmaceuticky přijatelné soli blokují vápníkové kanálky v buňkách, včetně nervových a svalových buněk různých organizmů, včetně bezobratlých a obratlovců. Vynález je rovněž zaměřen na použití těchto polyaminů a jejich solí pro antagonistické působení na excitační aminokyselinové neurotransmitery, přičemž tyto aminokyselinové neurotransmitery působí na buňky nervového systému organismu, pro léčení chorob a stavů zprostředkovaných excitačními aminokyselinovými neurotransmitery u savců a k hubení bezobratlého hmyzu a škůdců. Vynález je rovněž zaměřen na prostředky „ obsahujících uvedené polyaminy a jejich soli. Dáleje vynález zaměřen na použití uvedených polypeptidů a jednoho z uvedených polyaminů a jejich solí k blokování vápníkových kanálků v buňkách nervového a svalového systému organismu pro léčení chorob a stavů zprostředkovaných vápníkovými Γ kanálky u savců a při hubení bezobratlých škůdců a hmyzu a prostředků obsahujících uvedené polypeptidy, polyamin. a jejich solí.
Jak již bylo uvedeno je vynález zaměřen na určité polyaminy a polypeptidy, přítomné v jedu pavouka Agelenopsis aperta. Polyaminy a frakce ve kterých jsou přítomny podle vynálezu jsou tyto:____
Frakce A’ (AGEL 452):
Frakce A^ (AGEL-468) :
OH
Frakce A2 (AGÉlT 448) :
Frakce B2 (AGEL 504):
FAB MS: vysoké rozlišení: 505,3861 vypočteno pro ^27^48¾¾ ·
Frakce E (AGEL 489):
HO
Polypeptidy podle vynálezu a frakce ve kterých jsou podle vynálezu přítomny, jsou tyto:
Frakce G:
Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:
F^N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-aspgly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyslys-thr-cysrile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argasn-glu-trp-leu-ser-;
molekulová hmotnost celého peptidu podle FAB MS: 7267.
Frakce H2 :
Koncový ami-n aminokyselinové sekvence obsahuje:
H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-serval -cys - asp- gly -asn-glu- ser -asp-cys- lys cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cysarg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-glymet-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-hisčys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-;
molekulová hmotnost celého peptidu podle zjištěná metodou Ion-Spray MS : 7793.
Frakce I:
H2N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-glncys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr---tyr-cys-th-r-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-C0NH2;
FAB MS: 4158.
Frakce J:
— , H2N z asp z glu - pro - cys z i le -pro- le.u- gly - ly s z .......
ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-argarg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-argphe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-C0NH2;
molekulová , hmotnost-celého- peptidu metodou-FAB -MS : 5506.
Frakce :
Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:
H2N-ile-val-gly->gly-lys-thr-ala-lys-phegly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ilegln-gin-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-;
přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidú je asi 20 00.0. . ....... .
Frakce L2 :
Polypeptid získaný postupem podle přikladu 9.
έ ί
Frakce Μ:
Koncový amin aminokyselinové, sekvence obsahuje:
l^N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leuser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-;
přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidů je asi 80 000.
Tyto polyaminy a jejich farmaceuticky přijatelné soli antagonizují excitační aminokyselinové neurotransmitery, přičemž tyto neurotransmitery působí na buňky. To znamená, že uvedené polyaminy jsou sami o sobě vhodné k antagonizování neurotransmiterů. Tyto polyaminy jsou rovněž vhodné k hubení bezobratlých škůdců a hmyzu a k léčení chorob a stavů u savců zprostředkovaných excitačními aminokyselinovými neurotransmitery. Uvedené polyaminy jsou také vhodné jako psychoterapeuticky účinné látky pro savce.
Polyamin Bp· uvedený výše, a polypeptidy podle vynálezu blokují vápníkové kanálky v buňkách. To znamená, že -uvedený—polyamin. Bp.a .polypeptidy. jsou vhodné k blokování vápníkových kanálků v buňkách. Polyamin Bj a uvedené polypeptidy jsou dále vhodné k hubení bezobratlých škůdců a hmyzu a k léčení chorob a stavů u savců zprostředkovaných funkcí vápníkového kanálku v buňkách..
Do rozsahu vynálezu náleží rovněž polypeptidy, které mají stejnou aminokyselinovou sekvenci a v podstatě stejný blokující účinek na vápníkový kanálek jako výše uvedené polypeptidy.
Vynález je rovněž zaměřen na farmaceutické prostředky obsahujících uvedené polyarainy á polypeptidy.
Jed pavouka Agelenopsis aperta se získává o sobě známým způsobem běžně známým a používaným z dosavadního stavu techniky vylučováním elektrickou stimulací. Je vhodné, aby se při použitém postupu získávání jedu zabránilo kontaminaci jedu obsahem žaludku nebo hemolymfou. Takové způsoby jsou odborníkům z dosavadního stavu techniky dobře známé.. Získaný jed se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -78 *C. Následně se před použitím jed vyčistí postupem, popsaným v dalším popisu. >1 ·**'***·^· «*** · -rn i*n. *'»*f rtWMtaMtWM * t·Ι|> »W -f «ju· » ·* ,^τι··η>· mi iiim·· f. i? .
Čištění jedu se provádí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) s reverzní fází na různých. . . preparativních nebo semipreparativních kolonách, jako jsou kolony C-4 a C-18 Vydac (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Roád, Voburn Massachusetts 01801). Stanovení píku se provádí monochromaticky při 220-230 nm. Další analýza frakcí ...se :může provádět například pomocí polychromoraatických hodnot UV, stanovených diodovým detektorem Vaters 990 (Millipore Corporation, Vaters Chromatography: Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Jednotlivé frakce ze sloupců se jímají známými postupy, například za pomoci frakčního kolektoru ISCO FOXY a píkového detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Frakce se jímají do nádoby o vhodném objemu,, například’do nádob ze sterilního polyethylenu. Zahuštění frakcí se následné provádí lyofilizaci eluovaného podílu, přičemž potom následuje lyofilizace z vody. Čistota výsledných frakcí se stanoví chromatografickou analýzou na analytické koloně s gradientovým systémem, který je isokratičtější než systém, používaný k finálnímu čištění frakcí .
V .H.
ft«4.
Struktury odpovídajících frakcí se stanoví známými analytickými postupy, například hmotnostní spektrometrií a nukleární magnetickou resonancí. Polypeptidy podle vynálezu se sekvenují běžnými postupy známými z dosavadního stavu techniky. Například S-pyridyl-ethylace cystinového zbytku polypeptidu může probíhat v roztoku, načež se provede sekvenování aminokyselin polypeptidu. Příkladem takové
S-pyridylethylace může být tento postup. Asi 1 až 10 pg polypeptidu se rozpustí nebo zředí v až 50 pl pufru, který se připraví smíšením 1 dílu IM TrisHCl, pH 8,5, obsahující mM EDTA a 3 dílů 8 M guanidin.HCl. Následně se přidá Λ
2,5 pl 101 vodného roztoku 2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti ve tmě a pod argonem dvě. hodiny. Po inkubaci se přidají 2 pl 4-vinylpyridinu (čerstvé látky, uchovávané pod argonem při teplot -20 °C) , a směs se inkubuje další dvě hodiny při teplotě místnosti ve tmě a pod atmosférou argonu. Následně se směs odsolí, výhodně chromatografickým zpracováním na krátkém koloně s reverzní fází. Regenerovaný alkylovaný polypeptid se potom sekvenuje o sobě známým způsobem. >
Při provádění postupu podle vynálezu výše popsaným obecným způsobem se zjistilo, že vhodnou náplní kolony pro počáteční frakcionování jedu je náplň kolony C-18 Vydac 22 mm x 250 mra, o velikosti pórů 30 nm (300 Á) a o velikosti částic 10 pm. Tato kolona se eluuje rychlostí vymývání 15 mililitrů/minutu při použití lineárního gradientového prográmu 95 %——> 80 % A, _5_%-> 20 % B [0 ——> minuti_______ a dále 80 % -> 30 % A, 20 % -> 70 % B (0 -> minut] kde
A je O,l|% vodný roztok kyseliny trifluoroctové (TFA) a B je acetonitril. Tyto frakce byly shromážděny postupem uvedeným výše. Tímto způsobem bylo získáno 10 frakcí označených A, B,
Ε, G, Η, I, J, Κ, La Μ, které byly vybrány pro další analýzu a/nebo vyčištění. Kromě toho bylo zjištěno, že frakcionace celého podílu jedu při použití kolony C-18 Vyd 22 mm x 250 mm o velikosti pórů 30 nm (300 Á) a velikosti částic 10, gm, při eluování rychlostí 15 roililitrů/minutu_ a při použití lineárního gradientového programu :
% -> 10 % B, 95 % -> 90 % A [0 ——> 30 minut],
A a B mají výše uvedený význam, poskytla mimo jiné frakci označovanou v tomto popisu A’. Vymývací doby frakcí jsou uvedeny v příkladech 1 a 2.
Frakce A, B, G, H, I/J a L byly potom podrobeny čištění za použití různých kolon s různým gradientovým programem. Podrobné úďaj^pro^kažtióu šubf r akcí onač i' a získané výsledky jsou uvedeny v příkladech 3, 4, 6, 7, a 10,
Jak je uvedeno v následujících příkladech, frakce A’ A^, A2, B|, B2 a E obsahují polyaminové sloučeniny. Tyto sloučeniny a frakce ve kterých jsou obsaženy, jsou charakterizovány následujícím způsobem :
Frakce A’ (AGEL 452):
I
OH
H
Ň· ,NH,
Frakce A^ (AGEL 468):
Frakce A2 (AGEL 448) :
Frakce B1 (AGEL 505):
Frakce B2 (AGEL 504) :
FAB MS: s vysokou rozlišovací schopností: 505,3861 vypočteno pro ;
Frakce E /AGEL 489/:
Jak je uvedeno v následujících příkladech, frakce G, H2, I, J , L-^, L2 a M obsahují polypeptidy. Tyto polypeptidy a frakce ve kterých se vyskytují, jsou charakterizovány následujícím způsobem :
t·. .Ir η a *
Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:
H2N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-gl-u-cys-asp- ......
gly-aSn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr----g-l-y-g-l-u-gl-y-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys- ' lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argasn-glu-xrp-leu-ser-;
molekulová hmotnost celého peptidu podle FAB MS: 7267.:
-Frakce-H2---———-—-»*-
Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:
H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-serval -cys -asp -gly -asn -glu- ser -asp - cys- lys cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys- ' arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-glymet-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his1 cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-;
molekulová hmotnost celého peptidu podle zjištěná metodou Ion-Spráy MS : 7793.
Frakce I:
—^^N-asp-cys-να-1^-1γ^Τυ-3βι:-£ΐη^1η-~ — —- -- --------------cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2;
FAB MS: 4158.
Frakce J:
F^N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lysser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-argarg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-argphe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONt^;
molekulová hmotnost celého peptidu metodou FAB MS: 5506
Frakce L-^ :
Koncový amin aminokyselinové sekvence obsahuje:
l^N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phegly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ilegln-gln-lvs-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-;
přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 20 000.
Frakce L2 : - Polypeptid získaný postupem podle příkladu 9.
Frakce M:
Koncový amin aminokyselinové. sekvence obsahuj e:
-----H^N^glu-ala-thr -g-l-u- aia-aia-l-ys -va-1—leu--------.--— ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-:
přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 80 000.
Podle předmětného vynálezu, na základě výše uvedeného popisu a analyzovaných sloučenin přítomných ve frakcích jedu pavouka Agelenopsis aperta, je nyní možné získat tyto sloučeniny rovněž jinými postupy než izolací/vyčištěním ze surového jedu. Všechny takové postupy náleží do rozsahu předmětného vynálezu. Například polyaminy, obsažené ve frakcích A, Aj, A2 , B^, B2 a E, je možno připravit přímo syntetickými postupy. Polypeptidy, obsažené ve frakcích G,
H2, I, 1, L|, L2 a M a u kterých je popsána celá sekvence aminokyselin, mohou být připraveny synteticky in vitro o sobě známými postupy. Tyto polypeptidy mohou být „„připraveny.!! „pří klad...y„pept idovém.,syntetizátoru.na . pevné. ... -.........
fázi ABI 430A (Applied Biosystems, lne,, 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) při použití standardního postupu podle Merrifielda nebo jiných .běžně známých postupů z dosavadního stavu techniky prováděných s pevnou fází. Polypeptidy je možno připravit rovněž pomocí rekombinantních DNA postupů klonováním kódovaných sekvencí pro polypeptidy nebo jejich části. Takové polypeptidy, u kterých je známa pouze část aminokyselinové sekvence, mohou být klonovány například hybridizačními sondami využívajícími informaci známé aminokyselinové sekvence.
K výrobě polypeptidů podle vynálezu je možno použít kombinaci DNA postupů a syntézy proteinu in vitro.
Z dosavadního stavu techniky je známo, že určité aminokyselinové substituce je možno v polypeptidech provádět .... .tak, .aby „neovlivňovaly.,., nebo. ..v„.podstatě-neovlivňovaly„funkc i ...
těchto polypeptidů. Přesné provedení těchto substitucí se mění v závislosti na určitém polypeptidů. Určení možnosti provedení takovýchto substitucí se provádí o sobě známými postupy. Do rozsahu předmětného vynálezu tedy náleží všechny .ί (t které mají v podstatě stejnou sekvenci vlastnosti týkající polypeptidy, aminokyselin a v podstatě stejné blokování vápníkového kanálku.
V následujícím popisu je postupu přípravy určitých výše vzorce :
se uvedeno schéma syntetického uvedených polyaminů obecného
E
ve kterém R značí vodík nebo skupinu OH. Jednotlivé stupně tohoto reakčního schématu jsou označeny písmeny A až D.
REAKČNÍ SCHÉMA A
w 11 (ΙΙΪ) [bocj2o
▼
BOC
t
BQC (V)
REAKČNÍ SCHÉMA A (pokračování)
BOC
Ií
» H
BOC _ _(VI) [30C]20 gOC BOC • l
(VII)
(X)
N-3OC
H
REAKČNÍ SCHÉMA B
▼
REAKČNÍ SCHÉMA C
H
OCH2OCH3
(XVII)
H CX J NH .-R -CZ .
(XX) (XIX)
BOC (XXII)
OCH2CH=CH
REAKČNÍ
SCHÉMA
D χ + XIII or XXII ->
▼ T, OH 30C BOC
R' h , , i
(XXIV*)
REAKČNÍ
SCHÉMA
E
REAKČNÍ SCHÉMA F
(XXIX)
(XXX) (XXXI)
REAKČNÍ
SCHÉMA
G
X + XXVIII or XXXI ----►
(XXXII) or
BOC
N-3OC
H
(XXXIV) or
(XXXV)
REAKČNÍ
SCHÉMA
G (pokračováni)
(XXXVI) or
(XXXVII)
REAKČNÍ
SCHÉMA
H
SOC
(XXXVIII)
N-3OC
XXXVIII + XXI1
BOC (XXXIX)
BOC (XL)
O^^OH (XL')
Podle reakčního schématu A se sloučenina polyaminového meziproduktu vzorce X připraví řadou kroků, začínající diaminobutanera. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu tohoto meziproduktu vzorce X podle reakčního schématu A jsou uvedeny v částech-A až I příkladu 11. V reakčním schématu B je ilustrován postup přípravy meziproduktu vzorce XIII. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu tohoto meziproduktu podle reakčního schématu B jsou uvedeny v příkladu 11, částech J až L. Postup přípravy meziproduktu vzorce XXI je uveden v reakčním schématu C. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu sloučeniny vzorce XXI podle reakčního schématu C jsou uvedeny v částech A až F příkladu 12. Postup přípravy polyaminových sloučenin podle vynálezu vzorců XVI a XXV jsou uvedeny v reakčním schématu D. Reakční podmínky, vhodné pro vzájemné adování meziproduktů vzorce X a XIII nebo X a XXI a pro následující postup přípravy sloučenin vzorce XVI a XXV jsou uvedeny v příkladu 11, části M až 0 a příkladu 12, části G až I.
V reakčním schématech E a F jsou ilustrovány postupy přípravy meziproduktů XXVIII a XXXI. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktu podle reakčního schématu E jsou uvedeny v částech A až C příkladu 13. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktu podle reakčního schématu F jsou uvedeny v příkladu 14, částech A až C.
Postup přípravy polyaminových sloučenin podle vynálezu vzorce XXXVI a XXXVII jsou uvedeny v reakčním schématu G. Reakční podmínky, vhodné pro vzájemné adování meziproduktů vzorce X a XXVIII nebo X a XXXI a následnou přípravu sloučenin vzorce XXXVI a XXXVII jsou uvedeny v příkladu 13, částech D až F a v příkladu 14, částech D až F.
V reakčním schématu H je ilustrován postup přípravy polyaminové sloučeniny podle vynálezu vzorce XLI. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktu vzorce XXXVIII, adování této sloučeniny na meziprodukt vzorce XXII a následná příprava polyaminové sloučeniny podle vynálezu vzorce XLI jsou uvedeny v příkladu 15.
Jak již bylo uvedeno uvedené polyaminy antagonizují vratným způsobem excitační aminokyselinové neurotransmitery, které působí na buňky, například na buňky nervového systému řady organismů, včetně bezobratlých a obratlovců. Termín obratlovci zahrnuje savce. Termín bezobratlí zahrnuje v daném případě například hmyz, ektoparazity a endoparazity. Polyaminy výše uvedené frakce rovněž vratným způsobem blokují vápníkové kanálky, přítomné v řadě buněk, například v buňkách nervového systému a ve svalech, včetně kardiovaskulárního systému bezobratlích a obratlovců.
Schopnost těchto polyaminů antagonizovat excitační aminokyselinové neurotransmitery je prokázána jejich schopností blokovat zvyšování obsahu cGMP vyvolané kyselinou N-methyl-D-asparagovou v malém mozku neonatálních krys podle následujícího postupu. Malé mozky 8-14 dní starých krys Vistar se rychle vyjmou a umístí při teplotě 4 ’C v pufru, tvořeném Krebsovýra roztokem a hydrogenuhličitanem sodným o pH 7,4 a následně se rozřežou na segmenty 0,5 mra x 0,5 mm pomocí přístroje Mcllwain na řezání tkání (The Nickle Laboratory Ěngineering Co., Gomshall, Surrey, Anglie).
Segmenty malého mozku se vloží doKrebs/hydrogen- _____ uhličitanového pufru při teplotě 37 ’C: Pufr se kontinuálně udržuje v rovnováze směsí O2/CO2 v poměru 95 : 5. Segmenty malého mozku se popsaným způsobem inkubují po dobu devadesáti minut při třech výměnách pufru. Závěrem se pufr dekantuje, tkáň se odstředí (1 minutu při 3200 otáčkách za minutu), načež se tato tkáň opětně suspenduje ve 20 mililitrech Krebs/hydrogenuhličitanového pufru. Následně se alikvótní podíl 250 pl (přibližně 2 mg) vyjme a umístí do
1,5 mililitrovýčh mikrozkumavek. Přidá se'10 pl testované sloučeniny ze zásobního roztoku a potom 10 pl 2,5 mM roztoku NMDA-k zahájení reakce. Finální koncentrace NMDA je 100 pM.
Do kontrolních směsí se nepřidává NMDA. Zkumavky se inkubují jednu minutu při teplotě 37 C na protřepávané vodní lázni a následně se k ukončení reakce přidá 750 pl 50 mM roztoku Tris-Cl, 5 mM EDTA. Zkumavky se okamžitě ponoří na pět minut do vroucí vodní lázně. Obsahy každé zkumavky se následně zpracovávají.ultrazvukem_15 sekund pomocí ultrazvukové sondy nastavené na výkonový stupeň tři. Dále se odebere deset mikrolitrů a obsah proteinu,se stanoví postupem podle Lowřyho, viz. Anal. Biochem. 100:201-220 (1979). Zkumavky se potom podrobí odstřeďování (po dobu 5 minut při 10 000 x g) , 100 pl supernatantu se odstraní a obsah cyklického CMP (cGMP) se stanoví postupem podle testu New England Nuclear cGMP RIA-xesx (Boston, Massachusetts) .
Získané údaje jsou se uvedou, v pmol cGMP, generované jedním mg proteinu.
Polypeptidy podlé vynálezu nevratně blokují vápníkové kanálky, přítomné v různých buňkách, například v buňkách nervového a svalového systému bezobratlých a obratlovců.
Farmakologické testy :
Schopnost polyaminů- f rakce- -a-polypeptidů frakcí-G, ... , H2, I, J, K, , 1*2 a M blokovat vápníkové kanálky, se stanoví následujícím postupem. Disociované krysí neokortikální neurony se suspendují v Krebsově hydrogenuhličitanovém pufru o pH 7,4, obsahujícím 2 mM
CaCl2 a 1 % bovínního sérového albuminu (BSA). Neurony se odstředěním usadí a potom se opětné suspendují ve stejném pufru, který dále obsahuje 1 μΜ fura2/AM (Sigma Chem. Co.,
P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178). Buňky se inkubují po dobu dalších 15 minut ve stejném pufru ale bez fura2/AM. Následně se buňky promyjí v uvedeném pufru, ale tentokrát s obsahem 1,5 mM CaC^ a udržují v rovnováze při teplotě místnosti ve formě koncentrované buněčné suspenze 5 až 10 minut, Do kyvety z křemenného skla se nalije 1,2 ml předehřátého (37 ’C) pufru prostého BSA obsahujícího 1,5 mM CaCl2 a 10 mM glukózy a potom 0,3 ml koncentrované buněčné suspenze, připravené výše uvedeným postupem. Tato kyveta se umístí do termostatováné (37 °C) jednotky opatřené magnetickým míchadlem a fluorescence se změří fluorescenčním ς spektrofotometrem, například Perkin Elmer 650-40 (Perkin^
Elmer, Vilton, Connecticut 06897). Fluorescenční signál se ' ponechá stabilizovat po dobu asi jedné minuty. Následně se do kyvety přidají 1 až 4 μΐ zásobního roztoku testované 7, t sloučeniny v Krebsově hydrogenuhličitanovém pufru o vhodné Vffe koncentraci. Kalibrace fluorescenčních signálů a korekce,· rozptylu fůra-2 se provedou postupem podle Nemetha a kolť, viz. J. Biol. Chem. 262:5188 (1987). Po ukončení každého testu se stanoví,maximální hodnota fluorescence (Fmax) - - .
přídavkem ionomycinu a minimální hodnota fluorescence (Fmin) se stanoví následným přídavkem 5 mM EGTA k chelataci vápníku. Při použití popsaného postupu se blokování vápníkového kanálku účinkem testované sloučeniny projeví snížením fluorescence po přídavku testované sloučeniny.
Výsledky ;
Při provádění těchto testů za použití polypeptidových sloučenin podle předmětného vynálezu bylo zjištěno, že tyto polypeptidy vykazují hodnotu ICjq v rozmezí od 100 nm do 10 pm.
Do rozsahu daného vynálezu náleží rovněž polypeptidy, mající v podstatě-stejnou sekvenci aminokyselin jako polypeptidy frakcí G, I, J, Lj, Lj a M a které mají stejný blokující účinek na vápníkové kanálky jako uvedené polypeptidy.
Uvedené polyaminy působí antagonicky na excitační aminokyselinové neurotransraitery. Proto jsou tyto polyaminy vhodné k hubení bezobratlého hmyzu a k léčení chorob a stavů zprostředkovávaných excitačními aminokyselinovými neurotransraitery u savců, jako je mrtvice, záchvaty, mozková ischemíe,.nervové degenerační poruchy, například Alžheimerova choroba a epilepsie. Uvedené polyaminy je možno rovněž použít jako vhodná psychoterapeutická činidla u savců, Uvedené polyaminy jsou rovněž vhodné ke studiu fyziologie buněk,, například buněk nervového systému, čímž ovšem není tento výčet nijak omezován.
Polyarainy frakce a polypeptidy podle vynálezu jsou vhodné k blokování vápníkových kanálků a proto nacházejí uplatnění při hubení bezobratlého hmyzu a k léčení chorob a stavů zprostředkovávaných funkcí vápníkových kanálků u savců, jako je angína, hypertenze, kardiomyopatie, supraventrikulární arytmie, ezofageální achalasie, předčasný porod a Raynaudova choroba. Kromě toho jsou tyto sloučeniny vhodné při studiu fyziologie buněk, včetně buněk nervového a svalového systému.
Do rozsahu předkládaného řešení náleží rovněž farmaceuticky přijatelné soli polyaminů a polypeptidú podle předmětného vynálezu. Tyto soli se připravuji o sobě známými postupy. Běžnými metodami známými z dosavadního stavu techniky mohou být například tímto způsobem připraveny adiční soli s kyselinami odvozené od polyaminů podle vynálezu a bazické soli odvozené od polypeptidu podle vynálezu.
Polyamin nebo polypeptid podle vynálezu může být savcům podáván jako samotný nebo ve směsi s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou nebo ředidlem ve formě farmaceutických prostředků běžně používaných pro daný účel. Polyaminy a polypeptidy mohou být podávány perorálně nebo parenterálně, přičemž v případě polypeptidů je dávána přednost parenterálnímu způsobu podávání. Parenterální podávání zahrnuje intravenózní, intrarauskulární, intraperitoneální, subkutánní a topické podávání.
Při perorálním způsobu podávání polyaminů nebo polypeptidu podle vynálezu mohou být uvedené sloučeniny,,^ , například obsaženy v tabletách nebo kapslích nebo ve vodných roztocích nebo suspenzích. V případě tablet pro perorální aplikaci se běžně používají nosiče, jako je například laktóza a kukuřičný škrob a maziva, jako je například stearát hořečnatý. Pro perorální aplikaci v podobě kapslí jsou vhodnými ředidly laktóza a sušený kukuřičný škrob. Ve vodných suspenzích je účinná složka smíšena s emulgačním prostředkem nebo suspendačním činidlem. Do výsledného přípravku je možno přidávat v případě potřeby sladidla a/nebo příchutě
Pro intramuskulární, intraperitoneální, subkutánní a intravenózní použití se připraví sterilní roztoky účinné složky a pH roztoků se upraví pufrem. Pro intravenózní použití je nutno zajistit·, aby byl roztok isotonický.
Při použití polyaminu nebo polypeptidů nebo jejich solí podle vynálezu v humánní medicíně určí denní dávku ošetřující lékař. Dávka se bude měnit v závislostí na věku, hmotnosti a individuální odezvě každého pacienta, stejně jako v závislosti na symptomech pacienta a účinnosti konkrétního přípravku.
Při použití polyaminu nebo polypeptidů nebo jejich solí podle vynálezu k hubení bezobratlého hmyzu se uvedená sloučenina aplikuje přímo na hmyz nebo se umístí v prostředí výskytu tohoto bezobratlého hmyzu. Například může být sloučenina podle vynálezu nastříkána*~ná“ hmyzově“ formě — roztoku. Množství sloučeniny, nezbytné, k hubení bezobratlého hmyzu se bude měnit v závislosti na konkrétním.typu bezobratlého organismu a okolních podmínkách, přičemž toto aplikované množství musí být určeno osobou odpovídající za aplikaci této sloučeniny.
Při použití polyaminu nebo polypeptidů nebo jejich solí podle vynálezu ke studiu fyziologie buněk se uvedené sloučeniny aplikují na buňky o sobě známými postupy.
Například mohou být uvedené sloučeniny aplikovány ve vhodném fyziologickém pufru. Vhodná koncentrace sloučenin podle vynálezu pro taková studia je 100 μΜ. Koncentrace těchto látek však může být vyšší nebo naopak mnohem nižší než uvedených 100 μΜ. Konkrétní množství použité sloučeniny se pro daný účel stanoví individuálně.
Příklady provedení vynálezu
Čištěné polyaminy a polyamidy podle předmětného vynálezu a postupy jejich přípravy budou v dalším blíže popsány a vysvětleny pomocí následujících příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.
Příklad 1
Počáteční frakcionace surového jedu pavouka Agelenopsis aperta.
Surový jed pavouka Agelenopsis aperta, získaný od firmy Natural Product Sciences lne., Salt Lake City, Utah 84108 a uchovávaný ve zmrazeném stavu při teplotě asi -;7'8^C byl rozmražen a podíly 10 až 60 μΐ tohoto jedu, zředěnéína 200 gl, byly vloženy na kolonu C-18 Vydac (22 mm x 250 mra, velikost pórů 3.10“^ cm a velikosti částic 10 gm), přičemž eluování bylo prováděno při průtočném množství 15 mililitrů/minutu a za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5^% -> 2θ^& Β ,
93$ —:—> 8(J% A (v průběhu 0 -> 30 minut) a následně
-> 3CJ% A (v průběhu 30 —> 55 minut) kde A značí 0,1^%}-«^ vodný roztok TFA a B značí acetonitril. Stanovení píku bylo prováděno monochromaticky při 220-230 nm a frakce byly jímány ve sběrači frakcí ISCO/FOXY a detektoru píku ISCO 2159. Frakce byly jímány 20 až 60 minut. V závislosti na detekci píku byly jímány následující frakce:
Frakce Doba eluování
| A | asi | 21 minut |
| B | asi | 22,75 minut |
| Έ | asi | 27,5 minut |
| G | asi | 38 minut |
| H | asi | 39 minut |
| I | asi | 40 minut |
| J | asi | 40 minut |
| L | asi | 43 minut |
| M | asi | 48,3 minut |
Příklad 2
Frakcionace surového jedu pavouka Agelenopsis aperta.
Celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta, získaný stejným způsobem jako v příkladu 1, byl vložen na kolonu C-18 Vydac stejného typu jako v příkladu 1, přičemž eluování bylo prováděno při průtočném množství 15 mililitrů/minutu a za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5^b -> 1^ B, 9^6 ~—> 9cj% A (v průběhu 0 -> 30 minut) kde A značí 0,l|%f-eá^ vodný roztok TFA a B značí acetonitril. Detekce píku a jímání frakcí bylo provedeno stejným způsobem jako v příkladu 1, Získána byla frakce A’, která byla eluována asi 12,5 minuty. Tato frakce A’ byla potom připravena pro spektrální analýzu, přičemž byla lyofilizována z eluentu, načež následovala lyofilizace z destilované vody, což bylo provedeno standardními metodami.
Struktura této sloučeniny, která byla obsažena ve frakci A’ , byla potom určena za použití metody hmotové spektroskopie s rychlými atomy FAB MS. Data takto získaná a odvozená struktura jsou následující :
FAB MA : M/Z 453 (M+1)
Struktura : N-(2-amino-4-hydroxy-4.8,12,17tetraazeikos-1-yl)-4-hydroxy-benzamid.
Příklad Subfrakcionace frakce A a stanovení její struktury.
Frakce A, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C-4 Vydac (10 mm x 250 mm, veliiíost pórů 3.10”° cm a velikost částic 5 gm) a eluování byloí' prováděno za použití průtočného množství 4,0 mililitry/minutu rozpouštédlovým systémem s lineárním
gradientovým programem (ξ% — [v intervalu O -> 30 minut], roztok TFA a B značí acetonitril.
kde A značí 0,1%ρ+Η^ vodný Stanovení píku bylo provedeno při použití diodového detektoru Vaters 990 a jímání frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1. Tímto způsobem byly získány dvě frakce, které vykazovaly následující charakteristiky:
Frakce
Doba eluování
A1 asi 7 minut
A2 asi 9 minut
Frakce A^ a A2 byly následně upraveny pro spektrální analýzu, přičemž byly lyofilizovány z eluentu a potom z vody podle standardních metod.
Struktura sloučenin, obsažených ve frakcích Aj a A2 byla následně určena pomocí.FAB MS. Získané hodnoty jsou následující: .
Al:
FAB MS ; M/Z 469 (M+l), vysoké rozlišeni; 469,3863 vypočteno pro s chybou 2,0 mmg;
Struktura: N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17tetraazeikos-l-yl)-2,5-dihydroxy-benzamíd;
FAB MS : M/Z 449 (M.+1), 433, 376, 260, 203; Struktura: N-(16-amino-4-hydroxy-4,8,13triazahexadec-1-yl)- 4-hydroxy-IH-indol-3 -acetamid
Z '
Příklad 4
Subfrakcionace frakce B a stanovení její struktury.
Frakce B, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C-4 Vydac (22 mm x 250 mm. velikost pórů 3.1O”6 cm, velikosti částic 10 gm) , přičemž eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu rozpouštědlovým systémem s nelineárním gradientovým programem φ -> φ Β, 1θφ -> 1θφ Α
Λ Α γ Λ γ ?
[v intervalu 0 -> 5 minut], potom φ -> ΐφ Β,
ΙΟΟ^ο -> 9Ο^ο A [v intervalu 5 -> 20 minut] (Vatersova křivka 1) , potom 1θ[% -> 2oJ% Β , 9ojj% -> 8cJ% A (v intervalu 20 -> 30 minut] (Vatersova křivka 6), a potom 2O^o -> 5(^¾ B, 8Cjj% -> 50^& A [v intervalu
-> 40 minut] (Vatersova křivka 11). kde A znamenáš
0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril. Stanovení píku bylo provedeno při použití diodového detektoru Vaters 990 a jímání frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1. Tímto způsobem byly získány dvě frakce, které vykazovaly následující charakteristiky:
Frakce
Doba eluování
B^ asi 18,5 minuty
B2 asi 21,5 minuty
Tyto frakce byly následně upraveny pro spektrální analýzu, přičemž byly lyofilizovány z eluentu a potom z vody podle standardních metod.
Struktura sloučeniny, která byla obsažena ve frakci B| byla určena pomocí metody FAB MS. Získané hodnoty jsou
- následující:
FAB MS : M/Z 506 (M+1) : 489. 461. 433. 378, 333.
260, 231, 215, 203, 155, 119 vysoká rozlišovací schopnost : 506,3810 vypočteno pro C26H48N7°3’
Struktura: N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12.17tetraazeikos-l-yl)-4-hydroxy-IH-indol-3-acetamid
Molekulová hmotnost sloučeniny, obsažené ve frakci B£ byla stanovena pomocí metody FAB MS, přičemž byly získány následující výsledky:
FAB MS: vysoké rozlišení: 505,3861 vypočteno pro . C27H48Nó°3·
Příklad 5
Struktura sloučenina obsažené ve frakci E.
Frakce E, získaná postupem podle příkladu 1, byla upravena pro spektrální analýzu lyofilizací z eluentu a následně lyofilizací z vody, přičemž bylo použito standardních postupů. Struktura sloučeniny, obsažené ve frakci E byla stanovena pomocí metody FÁB MS, ^H-NMR a 13C-NMR. Získané hodnoty a odvozená struktura jsou následující :
- ρ FAB MS : M/Z 490 (M+l), 472, 433, 362, 333, 260,
215, 203, 177, 155, 119, vysoké rozlišení: 490,3860 vypočteno pro ^26^48^7θ2 s chybou 0,6 mmg 1H-NMR (500 MHz, d6-DMSO); 10,89 (s, IH), 8,90-7,85 (m, 6H), 7,55 (d, J=8,0 Hz, IH), 7,34 (d, J=S,0 Hz, IH) . 7,19 (s. IH), 7,08 (dd, J=8,0 Hz. J=S,0 Hz, IH) , 6,98 (dd, J=8,0 Hz, J=8,0 Hz, IH). 3,50 (s, 2H), 3,13 (m, 2H), 3,03-2,82 (m, 18H), 1,88 (m, 6H), 1,78 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), 13C-NMR (125,76 MHz, dÓ-DMSO): 170,94, 136,10,
127,17, 123,75, 120,92, 118,67, 118,26, 111,33,
108,97, 57,39, 57,07, 46,12, 46,12, 44,06, 43,89,
43,89, 36,52, 36,22, 32,78, 26,71, 23,79, 23,06,
22,65, 22,65, 22,45. Struktura: N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17tetraazeikos-l-yl)-lH-indol-3-acetamid
Alternativně, a podle výhodného provedení, byl surový jed frakcionován stejným způsobem postupem jako je uvedeno .y_„p fík ladu „1 ,_s__tou„ vyj imk.o.u.,_že_b.y 1 o „použito t _______, ____ rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem
-> 20j% B, 100 % -> 8^» A [v intervalu 0 -> 30 minut] a s detekcí píku při 220 nm. Frakce, která byla eluována přibližně během 26,0 minut, byla vložena na kolonu
- Bynamax Fenyl (4.6 mm x 250 mm,, s velikostí pórů 6.10? cm a velikostí částic 8 gm) a eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 1 ml/minutu a při isokratických podmínkách 1(^% B, 90^6 A, kde A a B mají stejný význam, jako v příkladu 1. Stanovení píku bylo provedeno pomocí diodového detektoru Vaters 990 (lambda = 220 nm) a frakce byly jímány stejným-způsobem jako v příkladu 1. Frakce, které byla eluována přibližně během 55,27 minuty byla lyofilizována z vymývacíhó roztoku a potom z vody, přičemž bylo použito běžných standardních postupů, čímž byla získána požadovaná sloučenina podle tohoto příkladu.
Τ - ř “ í—k—1 a - d.— -.,6 —„„ Subfrakcionace frakce G.
Frakce G, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C-18 Vydac (22 mm x 250 mm, velikost pórů 3.1O~6 cm a velikost částic 10 gm) a eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 10,0 mililitrů/minutu rozpouštědlovým systémem s nelineárním gradientovým programem 20j?& -> 3(^& B, 80^% —*—> 7(j^i A [v intervalu 0 -> 40 minut] (Vatersova křivka 6), přičemž bylo použito diodového detektoru Vaters 990 a jímání frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1. Frakce G, která byla podrobena subfrakcionaci uvedené výše, byla potom eluována na uvedené koloně po dobu asi 22 minut. Tato frakce, která obsahovala polypeptid, byla potom připravena pro sekvenování lyofilizací z eluentu, přičemž následovala lyofili-zace- z-vody,což.bylo..provedeno pomocí běžně známých postupů.
Analýza aminokyselin alkylovaného polypeptidů v této frakci byla provedena metodou Vaters Pico-Tag, přičemž bylo
použito instruktážního manuálu dodávaného s touto metodou. Sekvenční hodnoty byly stanoveny sekvencerem Protein/Peptid model 470A (výrobce Applied Biosystems, lne.. 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) s konverzí vodným roztokem TFA, Analýza výsledných fenylthiohydantoinových aminokyselin byla provedená on line s analyzátorem model 120A PTH, výrobce Applied Biosystems, nebo off line na koloně DuPont Zorbax PTH (Biomědical Product Department, Chromatography Products, Ε. I. duPont de Nemours and Co., Inc., 1007 Markét Street, Vilmington, Delaware 19898/.
Analýza aminokyselin metodou FAB MS celého polypeptidů prokázaly následující strukturu koncového aminu aminokyselinové sekvence části polypeptidů. obsaženého ve frakci G: >
H2N-glu-lyS'-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-aspgly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gin-trp- / ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr- · gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-gl--arg-gly-leu-lys- & lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argτ asn-glu-trp-leu-ser-; .
a FAB MS: 7267.
Příklad 7
Subfracionace frakce H a stanovení její struktury.
Frakce H, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C-18 Vydac (22 mm x 250 mm, velikost pórů 3.10”® cm a velikosti částic 10 μπι) , přičemž eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 10
gradientovým programem 20j% mililitrů/minutu rozpouštědlovým systémem s nelineárním . v > 75% A
A [v intervalu 0 --> 30 minut] (Vatersova křivka 6), a potom
25Í% -> 50$ Β , 75)% -> 5CÍ% A (v intervalu 30 -> 45 minut] (Vatersova křivka-, -kde-A znamená. 0.,.1% vodný m roztok TFA a B je acetonitril, přičemž stanovení píku bylo provedeno.při. použití diodového detektoru Vaters 990 a jímání frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1. 2 jímaných frakcí jsou důležité tyto:
Frakce Doba eluování
asi 36 minut asi 41 minut
Frakce H2 a H^, obsahující polypeptidy, byly následně upraveny pro sekvenování, přičemž toto sekvenování bylo provedeno postupem: popsaným v příkladu 6. Aminová koncová část aminokyselinové sekvence části polypeptidu, obsažené ve frakci H2, byla stanovena takto:
H2N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-glý met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his ____....... cy_sjtp_r o-asn- lys - ala - gl u-trp-gly-leu-asp-trp-;
a molekulová hmotnost celého polypeptidu byla stanovena pomocí metody Ion-Spray MS, přičemž bylo zjištěno, že tato molekulová hmotnost je 7793.
r ’
Příklad 8
Subfrakcionace frakcí I a J a stanovení jejich struktur;
Frakce I a J, získané postupem podle příkladu 1, které nebyly dostatečně odděleny v důsledku podobných vymývacích intervalů, jak je uvedeno v příkladu 1, byly společně umístěny na sloupec kolony C-4 Vydac (22 mm x 250 mm, velikost pórů 3.10^ cm a velikost částic 10 gm) a tato kolona byla potom eluována za použití průtočného množství 10 mililitrů/minutu rozpouštědlovým systémem s nelineárním —> 3(Sj% B, 80 -> 7Ój% A
-> 30 minut] (Vatersova křivka 6) a dále
30t% -> 50S% B, 7(& -> 50(% A [v intervalu 0 -> 45 gradientovým programem 20j% [v intervalu 0 — minut] (Vatersova křivka 11 ), kde A značí 0.1%Aft4j vodný roztok TFA a B je acetonitril. Stanovení píku a jímání frakcí bylo provedeno stejným postupem, jako je uvedeno v příkladu 6. Z jímaných frakcí byly zajímavé tyto:
Frakce Doba eluování
Ϊ asi 22 minut
J asi 27,5 minuty
Frakce I a J, které obsahovaly polypeptidy, byly připraveny pro sekvenování, přičemž toto sekvenování bylo provedeno stejným postupem jako v příkladu 6.
Aminokyselinová sekvence a hodnoty FAB MS polypeptidů, obsaženého ve frakci I, byly stanoveny takto:
HoN-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-glncys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyrphe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONl·^ a FAB MS: 4158.
Koncový amin aminokyselinové sekvence části polypeptidu a hodnota FAB MS celého polypeptidu, obsaženého ve frakci J byly stanoveny takto:
ř^N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys. ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pre-tyrcys-cys-pro-’his-pro-asp-asp-ala-gly-argarg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-argphe-val-thr-ile-cys~ser-gly-arg-lys-tyr-CONH2;
a FAB MS: 5506.
Příklad 9
Subfrakcionace frakce L a stanovení její struktury.
Frakce L, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C-18 Vydac (10 mm x 250 mm, velikost pórů 3.10“6 cm a velikosti částic 5 pm), přičemž eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 3.5 mililitru/minutu rozpouštědlovým systémem s lineárním gradientovým programem [v intervalu 0 -> 30 minut], kde A znamená 0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril. Stanovení píku a jímání frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 6. Z jímaných frakcí jsou důležité tyto:
Frakce Doba vymývání asi 20,25 minuty L2 asi 22,5 minuty
Frakce a L2, obsahující polypeptidy, byly následně upraveny pro sekvenování, přičemž toto sekvenování bylo provedeno postupem popsaným v příkladu 6.
Aminová koncová část aminokyselinové sekvence části polypeptidu, obsažené ve frakci Lj, byla stanovena takto:
H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phegly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ilegin-gin-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp
Molekulová hmotnost celého polypeptidu byla stanovena gelovou elektroforézou, přičemž bylo použité běžné metody, a tato hodnota činila 20 000.
ϊ
Příklad 10
Stanovení struktury sloučeniny.obsažené ve frakci M.
Frakce M, získaná postupem podle příkladu 1 a obsahující polypeptid, byla připravena pro sekvenování, přičemž toto sekvenování bylo provedeno stejným způsobem jako v příkladu 6.
Koncový amin aminokyselinové sekvence části polypeptidu, obsaženého ve frakci M, byl stanoven takto:
π 2 Ν-g1u-ala-1 hr-g1u-a1a-a1a-1y s-va1-1e user-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro a molekulová hmotnost, stanovená běžně známým postupem gelovou elektroforézou, byla asi 80 000.
Pří ~klad 11— -.......—........... ...
N-(20-amiňo-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl) -1Hindol-3-acetamid.
Syntetický postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že jé obsažena ve f rakci~E~popsané-‘v---p-ří-kladu-4-,^.byl-.pro-v.eden„násle,clujÁcím, způsobem.
Postup A :
V atmosféře dusíku bylo promícháváno 13,22 gramu (0,15 mol) diaminobutanu a 3,5 ml methanolu, přičemž potom bylo přidáno 9,94 mililitru (0,15 mol) akrylonitrilu prostřednictvím injekční stříkačky, což bylo prováděno po dobu—dvou—hodin—a—př-i-ehl-azení—na-0—S-^lC-.^Asi.^ptulS-______ hodinách byla takto získaný reakční směs podrobena chromatografickému zpracování na 600 gramech silikagelu za použití systému rozpouštědel CH2Cl2/MeOH v poměru 3 : 1 (2 litry) a následně směsí Ci^C^/MeQH s obsahem 5
objemových procent isopropylaminu (2 litry). Frakce obsahující adovaný produkt byly zkoncentrovány odpařením ve vakuu za vzniku viskózního oleje. NMR analýza potvrdila, ze získaným produktem byl adiční produkt obecného vzorce I, uvedený dále :
Postup B ;
H
(III)
Pod atmosférou dusíku bylo přidáno 5,78 g (0,041 mol) sloučeniny vzorce I, připravené postupem A, viz; výše, k 75 mililitrům CH^CN a 11,48 g KF Celitu a reakční směs byla promíchána. K takto promíchané směsi byl potom přidán, roztok obsahující 9,75 g (0,041 mol) sloučeniny vzorce II, která byla připravena postupem uvedeným v části A, ve 25 mililitrech CH^CN. Takto získaná reakční směs byla potom zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem, přičemž monitorování reakčního průběhu bylo provedeno metodou TLC (CI^C^/MeOH v poměru 3 : 1) . Po třech hodinách byla ponechána reakční směs ochladit a stát při teplotě místnosti. Následně byl Celit odfiltrován a filtrační koláč byl- -dobře -promyt—diCh-lorme-t-hanem-.—F-il-t-r-á-t—by-1- zkoneentrován ve vakuu. Surový produkt, obsažený ve zkoncentrovaném filtrátu byl podroben chromatografickému zpracování na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito 2 litrů směsi CI^C^/MeOH v poměru 3:1, potom 2 litrů směsí
-/° CHjCl^/MeOH v poměru 3 ; 1 obsahující 10 mililitrů isopropylaminu a následně 2 litrů směsi obsahující
CH2Cl2/MeOH v poměru 3 ; 1 a obsahující 30 mililitrů isopropylaminu. Produkt, byl eluován z této kolony poté, co byla kolona nasycena isopropylaminem, ovšem tento produkt nebyl stále čistý. Všechny frakce obsahující produkt byly spojeny a zkoncentrovány. Silikagel byl připraven tak, že bylo 500 gramů silikagelu suspendováno v ČH2CI2 a 125 mililitrech isopropylaminu a potom byl tento produkt použit jako náplň kolony, což bylo provedeno běžně známým způsobem. Surový produkt byl nanesen na kolonu pomocí dichlormethanu. Následně byla kolona eluovány 500 mililitry dichlormethanu a potom jedním litrem směsí Ct^C^/MeOH v poměru 3 : 1. Frakce obsahující produkt byly spojeny a zahuštěný*vé'vakuu? čímž bylo získáno 1,5 gramu produktu vzorce III. Další 2 gramy produktu vzorce III byly eluovány z kolony jedním litrem CH^C^/MeOH v poměru 3 : 1 a 30 mililitrů isopropylaminu.
Postup C :
III . + (BOC]2O -—-►
BOC
(IV)
Pod atmosférou dusíku byla potom promíchávána směs obsahující 3,5 gramu (11,8 mmoí) sloučeniny vzóřcé III, ' která byla připravena podle postupu B, viz. výše, a 150 ml dichlormethanu, načež bylo přidáno 5,2 gramu (23,6 mmol) di-t-butyldiuhličitanu. Takto získaná směs byla potom promíchávána po dobu přibližně 68 hodin při teplotě místnosti. V dalším postupu byla tato směs zkoncentrována ve vakuu a podrobena chromatografickému zpracování za použití 400 gramů silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexan/ethylacetát v poměru 60 : 40, a tímto způsobem bylo připraveno 5,62 gramu sloučeniny vzorce IV v podobě oleje.
Postup D :
BOC
(V)
Pod atmosférou dusíku byly rozpuštěny 3,0 gramy * sloučeniny vzorce IV, která byla připravena postupem C, viz. výše, ve 30 mililitrech, kyseliny octové ve 250-ti mililitrové Parrově baňce. K roztoku byly potom přidány 3,0 gramy Pd(OH)2/uhlíku a tato směs byla hydrogenována při tlaku 345 kPa vodíku po dobu dvou hodin. Následně byl katalyzátor odstraněn odfiltrováním a filtrační koláč byl dobře promyt kyselinou octovou. Takto získaný filtrát byl z k oncent r.o.v.án.,„_y.l oiea..d.o_7.5__ m i.l i 1 i.t rů_.d i chlořmethan upromyt dvakrát 75 mililitry lN NaOH a vysušen pomocí uhličitanu draselného B^COg. Roztok byl zkoncentrován ve vakuu za vzniku 2,86 gramu produktu vzorce V, viz výše.
Pod atmosférou dusíku bylo rozpuštěno 2,86 gramu (5,7 mmol) sloučeniny vzorce V, která byla připravena postupem D, «-v-i z —výš e.,—v.„7_ 5_.m i .1 i.l itrech jne than olu. Za míchá ní bylo potom přidáno 0,41 mililitru (6,3 mmol) akrylonitrilu a takto
5získaná reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována,. opětně koncentrována třikrát ze 30 mililitrů dichlormethanu a podrobena stripování rozpouštědla ve vakuu, přičemž tímto postupem bylo získáno 3,18 gramu sloučeniny vzorce, VI v podobě oleje.
Postup F :
BOC BOC i <
(VII)
—.-;pod—atmosférou—dusíku bylo smícháno 3,18 gramu (5,7 mmol) sloučeniny vzorce VI, připravené výše uvedeným postupem E, se 100 mililitry dichlormethanu a takto získaná reakční směs byla promíchávána až do rozpuštění. K takto získanému roztoku bylo potom přidáno 1,37 gramu (6,3 mmol)
-2di-τ-butyldiuhličitanu a takto získaná reakční směs byla promíchávána 90 minut při teplotě místnosti. Následně byla tato reakční směs zkoncentrována a podrobena chromatograf ickému zpracování na 300 gramech silikagelu,. přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexan/ethylacetát v poměru 60 : 40. Frakce obsahující produkt byly spojeny, zkoncentrovány, extrahovány třemi podíly dichlormethanu po 20 mililitrech a rozpouštědlo bylo odstraněno stripováním ve vakuu, přičemž tímto způsobem bylo získáno 3,12 gramu produktu vzorce VII.
Postup G :
VII
BOC r
(VIII)
Postupem podle schématu D bylo rozpuštěno 3;12 gramu (4,76 mmol) sloučeniny vzorce VII, připravené postupem F ve 30 mililitrech kyseliny octové a tato reakční směs byla hydrogenována při tlaku vodíku 380 kPa po dobu 2 hodin v přítomnosti 3,0 gramů PdfOH^/uhlíku, přičemž tímto postupem bylo získáno 3,02 gramu produktu vzorce VIII v podobě oleje.
Postup H :
. .. ....Vlil_______+_________________________________________
(IX)
- ΊΖ Pod atmosférou dusíku byl rozpuštěn 1,0 gram (1:5 ratnol) sloučeniny vzorce VIII, která byla připravena postupem podle postupu G, v 10 mililitrech methanolu. K tomuto roztoku bylo potom přidáno 0,1 mililitrů (1,.67 mmol) akryíonitrilu a takto získaná reakční směs byla promíchávaná ’ po dobu přes noc. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována,-opětně rozředěna a koncentrována,třikrát za pomoci 20 mililitrů diehlormethanu, přičemž použité rozpouštědlo bylo odstraněno stripováním ve vakuu a tímto postupem bylo připraveno 1,0 gramu produktu vzorce IX.
Postup Ϊ :
BOC BOC
I 1
BOC '(X)
Stejným způsobem jako je uvedeno v postupu D byl , rozpuštěn 1,0 gram,(1,4 mmol) sloučeniny vzorce IX, která byla připravena postupem H, ve 30 mililitrech kyseliny octové a takto získaný reakční směs byla potom hydrogenována po dobu 2,5 hodiny při tlaku vodíku 345 kPa za vzniku. 0,85 gramu produktu vzorce X, vi2 výše.
Postup J :
H
H (XI)
Podle tohoto provedení byl připraven roztok, který obsahoval 6,78 gramu (20 mmol) tetrabutylammoniumhydrogensíranu a 75 mililitrech vody. načež bylo přidáno 3.36 gramu (40 mmol) hydrogenuhličitanu sodného NaHCO^ a tato reakční směs byla ponechána napěnit. V dalším postupu bylo přidáno 3,5 gramu (20 mmol) kyseliny indoloctové, získaná reakční směs byla promíchávána po dobu 5 minut a potom bylo přidáno s 75 mililitrů CHCI·}. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu dalších 5 minut a dvě spodní vrstvy byly odděleny. Vodní vrstva se byla vysolena síranem sodným Na2S04 a extrahována trichlormethanem CHCl-χ. Všechny trichlormethanové extrakty byly spojeny a vysušeny za pomocí síranu sodného Na2S04- Výsledný čirý jantarově zbarvený roztok byl zkoncentrován. zpracován třemi podíly acetonu po . .. 75 mililitrech a nakonec byl tento podíl rozpuštěn v 75' mililitrech acetonu. Následně bylo přidáno 1,9 mililitru ...
(22 mmol) allybromidu a tato reakční směs byla ponechána stát po dobu 30 minut. Takto získaná reakční směs byla zkoncentrována a zpracována chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž eluování bylo prováděno směsí hexan/ethylacetát v poměru 3:1, přičemž tímto způsobeni λ..Ú bylo získáno 3,57 gramu produktu vzorce XI, viz výše, ve formě světle žlutého oleje.Postup K :
XI >
BOC (XII)
Podle tohoto postupu bylo postupem popsaným v publikaci : Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:298 (1984) smícháno 2,15 gramu (10 mmol) sloučeniny vzorce XI, která byla připravena postupem podle postupu J, viz výše, s 20 mililitry acetonitrilu a k takto získané směsi bylo potom přidáno 2,61 gramu (12 mmol) di-t-butyldiuhličitanu.
V dalším postupu bylo přidáno 0,122 g (1 mmol)
4-(Ν,N-dimethylamino)pyridinu a reakce byla ponechána probíhat po dobu 15 minut. V další fázi tohoto postupu byla tato reakční směs zředěna na objem 125 mililitrů ethylacetátem, promyta dvakrát zředěnou kyselinou chlorovodíkovou HCl, třemi podíly vody po 25 mililitrech, jednou solankou a potom byla usušena a zkoncentrována. Získaný produkt byl potom vyčištěn chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito za vzniku podobě směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 14,5 : 1 2,87 gramu sloučeniny vzorce XII, viz výše, v bezbarvého oleje.
Postup L :
XII
OH
Podle tohoto postupu bylo ke 3,27 gramu (10,4 mmol) sloučeniny vzorce XII, která byla připravena postupem K, ve 20 mililitrechdichlormethanu přidáno 7,4 mililitru 2-ethylhexanoátu sodného v etylacetátu (0,231 gramu/mililitr). V dalším postupu bylo přidáno 0,5 gramu
- χ-
potom promíchávána po dobu 60 minut. Tato reakční směs byla potom zkoncentrována, vložena do 150 mililitrů ethylacetátu a promyta pěti podíly 25 mililitrů vody. Vodné extrakty byly potom spojeny a tento spojený podíl byl potom znovu extrahován jedním podílem 25 mililitrů ethylacetátu a jedním podílem 25 mililitru diethyletheru. K vodné vrstvě bylo potom přidáno 75 mililitrů čerstvého ethylacetátu a tato směs byla potom okyselena na hodnotu pH 3. Ethylacetátová vrstva byla oddělena a vodná vrstva byla extrahována jedním podílem 50 mililitrů čerstvého ethylacetátu. Takto získané dva ethylacetátové extrakty byly spojeny a tento spojený podí 1 by l^ potom- promyt - dvěma podíTy -20-mi lilitrů -.v-ody.,—po.tom— jedním podílem 20 mililitrů, solanky, .vysušen, zkoncentrován a promyt třemi podíly 30 mililitrů hexanu, přičemž se během druhého promytí vytvořily krystaly. Tato reakční směs byla potom zředěna 75 mililitry hexanu. Podíly pevných látek byly zfiltrovány, dobře promyty hexanem a vysušeny na vzduchu, čímž bylo získáno 1,37 gramu bílé pevné látky. NMR analýzou byla potvrzena struktura sloučeniny uvedené v záhlaví, t? zn. sloučenina XIII1
Postup M :
XIII
BOC BOC
BOC (XIV)
Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku smícháno 200 miligramů (0,73 mmol) sloučeniny vzorce XIII s 25 mililitry dichlormethanu, 84 miligramy (0,73 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 150 miligramy (0,73 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu, načež se vytvořila téměř okamžitě sraženina. Takto získaná reakční směs byla potom promíchávána po dobu 3 hodin. V dalším postupu byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a k získanému filtrátu bylo potom přikapáváno 40 mililitrů roztoku sloučeniny vzorce X, připravené postupem podle příkladu 11, postupy A-T, v dichlormethanu. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 12 hodin a následně byla promyta 0,1 N roztokem hydroxidu sodného NaOH a usušena za pomoci uhličitanu draselného K2CO3, potom zkoncentrována a zpracována chromatografickým postupem za účelem odstranění nečistot na 150 g silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi dichlormethanu a methanolu (0,5 litru) v poměru. ,.
: 1. a potom za použití směsi dichlormethanu, methanolu a isopropylaminu (2 litry) v poměru 9 : 1 : 0,1. Získaný produkt byl potom v následujícím postupu zkoncentrován, promyt dichlormethanem a opět zkoncentrován, čímž bylo., získáno 400 miligramů sloučeniny vzorce XV, což bylo potvrzeno analýzou NMR 300 MHz.
Postup N :
XIV
BOC BOC
OH
H
N-BOC
H
BOC (XV) “ S'
Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku smícháno 0,34 gramu (0,35 mmol) sloučeniny vzorce XIV, která byla připravena postupem podle výše uvedeného schématu, se 30 mililitry acetonu, tato směs byla promíchána až do vzniku roztoku a ochlazena na . teplotu asi 0 C za použití lázně ledu a acetonu. V dalším postupu bylo po dobu 8 až 10 minut přikapáváno 0,212 gramu (1,05 mmol) 85 % kyseliny
3-chlorperoxybenzoové ve 20 mililitrech acetonů. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu asi 30 minut a následně zředěna na objem 150 mililitrů diethyletherem a potom promyta dvěma podíly 10j%^fiího| roztoku uhličitanu draselného K7C0-j o objemu 25 mililitrů, dvěma podíly vody po 25 mililitrech a potom opět dvěma podíly 101%pníh&| roztoku uhličitanu draselného o objemu 25 ’mililit'rů;“načež“byla““ vysušena uhličitanem draselným. Takto získaná reakční směs byla potom zkoncentrována, promyta dvěma podíly díchlormethanu po 30 mililitrech a zkoncentrována za použití vakua na stálou hmotnost 0,33 gramu. NMR analýza prokázala, že produkt byl směsí požadovaného produktu vzorce XV, výchozího materiálu a vedlejšího produktu. Tato směs obsahující produkt byla potom přidána ke 3 mililitrům kyseliny octové, načež bylo přidáno 20 miligramů NaCNBHj. Tato směs byla potom promíchávána po dobu přes noc, načež byla kyselina octová odstraněna stripováním ve vakuu a tato směs byla rozpuštěna v 50 mililitrech díchlormethanu a promyta jedním podílem vodného pufru po 75 mililitrech o hodnotě pH 7. V případě potřeby byla hodnota pH upravena na hodnotu 7 přídavkem 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH, přičemž dichlormethanová vrstva byla oddělena a promyta jedním podílem vodného pufru po 50 mililitrech'o'hodnotě pH 7 a jedním podílem 25 mililitrů solanky, přičemž tento produkt byl potom vysušen za pomoci síranu sodného ^28()4 a zkoncentrován za použití vakua až do získání konstantní hmotností 0,31 gramu. Takto získaný produkt byl potom zpracován chromatografickou metodou za použití 100 gramů silikagelu. přičemž jako elučního činidla'bylo použito směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 95 : 5, a eluovány a jímány frakce o objemu 25 mililitrů. Vyčištěný produkr vzorce XV byl přítomen v jímaných frakcích 18-25. Tyto frakce byly spojeny, přičemž spojený podíl byl zkoneentrován, promyt dvěma podíly dichlormethanu po 25 mililitrech a zkoneentrován ve vakuu, čímž bylo získáno 68 miligramů bílého pěnového produktu, který byl uchováván pří teplotě -80 ’C. Frakce 26-40, které rovněž obsahovaly požadovaný produkt, obsahovaly také určité nečistoty. Frakce 26-40 byly spojeny, zkoncentrovány, promyry dichlormethanem a zkoncentrovány za použití vakua do konstantní hmotnosti 66 miligramů. Takto získaný produkt byl potom spojen s předchozím produktem (6 miligramů), který byl použit pro NMR analýzu, a se směsí, připravenou výše uvedeným postupem. Výsledná směs byla zpracována chromatografickou metodou na 75 gramech silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 9:5 k eluování a zachycení frakcí o objemu 25 mililitrů. Vyčištěný produkt vzorce XV byl přítomen v frakcích 16-21. Tyto frakce byly spojeny, zkončeritrováný a promyty dvěma podíly dichlormethanu po 5 mililitrech a potom byl tento produkt znovu zkoneentrován ve vakuu do konstantní hmotnosti 46 miligramů. Takto získaný produkt byl potom uchováván při teplotě -80 eC.
PostupO:—----------—----—--------------—-----------------XV ---:-►
OH
NH (XVI·)
- 7? Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku rozpuštěno 108 miligramů (0,109 mmol) sloučeniny vzorce XV, připravené výše uvedeným postupem, v 1,5 mililitru dichlormethanu. V dalším postupu byly přidány 2 mililitry kyseliny trifluoroctové a tato reakční směs byla promíchávána po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Takto získaná reakční směs byla potom zkoncentrována do formy filmu a dále bylo přidáno 15 mililitrů diethyletheru. Tento film byl potom převeden na pevnou látku a po 30 minutách míchání vznikl bílý prášek. Tento prášek byl potom zfiltrován, dobře promyt diethyletherem, vysušen pod atmosférou dusíku a následně odplyněn ve vakuu do konstantní hmotnost i 10 ^jmiligramu, čímž byla, získána sloučenina uvedená v záhlaví tohoto příkladu.
Příklad 12
N- (20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl) - 4hydroxy-lH-indol-3-acetamidu.
Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, jejíž přítomnost byla předpokládána ve frakci , viz postup podle příkladu 3, byl proveden podle následujícího reakčního schématu :
Postup A :
(XVII) 'X Podle tohoto postupu byly pod dusíkovou atmosférou ve skleněné aparatuře, vysušené plamenem, smíchány 4,0 gramy (30 mmol) 4-hydroxyindolu s 25 mililitry Aldrichova bezvodého DMF a tato směs byla míchána za vzniku roztoku. Potom bylo přidáno 1,44 gramu (30 mmol) hydridu sodného NaH ve formě 50(%ýňí{ disperze v oleji. Po ukončení pěnění bylo přidáno - 2,5 mililitru chlormethylmethyletheru (Aldrich) a výsledný tmavo-zelený roztok byl promícháván po dobu přes noc. Potom byl ΐěnTo“řt)zτók'~zř^s^děn“na^objem--l-2-5-’mil·l·-l-i-t-rů_— ethylacetátem, promyt pěti podíly vody po 25 mililitrech a jedním podílem solanky o objemu 25 mililitrů, načež byl usušen síranem sodným Na2SO4 a zpracován chromatografickým postupem za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4 : 1 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt byly spojeny a zkoncentrovány, čímž bylo získáno 2,70 gramu sloučeniny XVII ve formě oleje.
Postup B :
XVII
H3C
H3C
NH /
(XVIII)
Podle tohoto provedení bylo v 50 mililitrové, tříhrdlové nádobě s kulatým dnem, která-byla vybavena mechanickým míchadlem, chlazeno 1,3 gramu vodného roztoku formaldehydu (37 %) a 2,28 gramu kyseliny octové. Potom bylo přidáno 3,23 mililitru chladného dimethylaminu (25^%|-&í| roztok ve vodě). K tomuto výslednému ochlazenému roztoku bylo přidáno 2,7 gramu (15,2 mmol) sloučeniny' vzorce XVII,
-ypřičemž bylo použito 1,5 až 2,0 mililitrů tetrahydrofuranu jako rozpouštědla pro převedení požadované látky. Tato reakční směs byla potom zahřívána při teplotě místnosti a promíchávána po dobu přes noc. Potom bylo přidáno 40 mililitrů 10 j ního(roztoku hydroxidu sodného NaOH, čímž bylo dosaženo vzniku sraženiny. Po promíchání byla tato sraženina odfiltrována, promyta vodou a usušena na vzduchu, přičemž tímto postupem bylo získáno 3,26 gramu sloučeniny vzorce XVIII.
Postup C :
• xviri
(XIX) (XX)
Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku smícháno 4,62 gramu KCN s 10 mililitry vody a tato směs byla promíchávána za vzniku roztoku. Potom bylo přidáno 30 mililitrů ethanolu a 3,26 gramu (14 mmol) sloučeniny vzorce XVIII a tato reakční směs byla promíchávána a zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu asi 65 hodin. Získaná reakční směs byla potom ochlazena a zkoncentrována. Výsledná sraženina obsahující sloučeninu XX byla , zfiltrována, promyta vodou a usušena na vzduchu. Vodná vrstva byla extrahována 4 podíly diehlormethanu po 15 mililitrech, přičemž byly uchovány organické extrakty. Vodná s~ vrstva byla potom překryta 50 mililitry ethylacetátu a okyselena na pH 2. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, odplyněna probubláváním dusíkem touto ethylacetátovou vrstvou, potom sušena a zkoncentrována, čímž byla získána pevná látka, která byla triturována diisopropyletherem, a.tímto způsobem bylo získáno 1,03 gramu sloučeniny XIX ve formě šedavé bílé pevné látky. Potom byly všechny extrakty ze základní vodné vrstvy spojeny a tento — - spojený-podíl—byl· usušen, -spojen- s -výše-uvedeným,,filtrátem, a zkoncentrován, čímž bylo získáno 0,4 gramu sloučeniny XX ve formě pevné látky.
Postup D :
XX ---> XIX Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku 1 ,'6 gramu sloučeniny vzorce XX spojeno se 7,5 mililitru ethanolu, 30 mililitry vody a 1,3 gramu hydroxidu -----draselného. Tato směs byla potom zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem a potom promíchávána po dobu přes noc. V další fázi byla potom tato reakční směs ochlazena, extrahována dvěma podíly ethylacetátu po 15 mililitrech, převrstvena čerstvým ethylacetátem a okyselena na hodnotu pH 2. Spojené ethylacetátové vrstvy byly usušeny a zkoncentrovány. Tímto způsobem byla získána pevná látka, která byla potom triturována IPE, čímž bylo získáno 1,1 gramu sloučeniny XIX,
Postup E :
BOC (XXI) xix
Podle tohoto provedení bylo v 10 mililitrech vody rozpuštěno 1,44 gramu (4,25 mmol) TBAHSO^. Potom bylo přidáno 714 miligramů (8.5 mmol) hydrogenuhličitanu sodného NaHCO^. Poté co ustalo pěnění byl přidán k této reakční směsi 1,0 gr.am (4,25 mmol) sloučeniny XIX a tato reakční ' směs byla potom promíchávána po dobu jedné minuty, načež bylo přidáno 40 mililitrů chloroformu. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu 5 minut, chloroformová vrstva byla oddělena a potom byla tato vodná směs extrahována jedním podílem chloroformu po 15 mililitrech. Chloroformové extrakty byly spojeny a tento spojený podíl byl usušen, zkoncentrován a zpracován dvěma podíly acetonu po 30 mili litrech... Potom byl takto získaný produkt opětně, rozpuštěn ve 30 mililitrech acetonu, což bylo provedeno pod atmosférou dusíku, a potom bylo přidáno 0,37 mililitrů (4,25 mmol) allylbromidu a tato reakční směs byla zkoncentrována a zpracována chromatografickým způsobem za použití ethylacetátu jako elučního činidla. Získaný produkt byl potom spojen s 25 mililitry dichlormethanu a potom bylo přidáno 0,98 gramu*(4,5 mmol) di-t-butyldiuhličitanua 51 miligramů(0,425 mmolu) 4-(N,N-dimethylaminó)pyridinu. Tato reakční směs byla potom zkoncentrována a zpracována chromatografickou metodou za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 9 : 1 jako elučního činidla, přičemž po zkoncentrován! bylo získáno 1,33 gramu požadované sloučeniny vzorce XXI ve formě viskózního oleje.
Postup F :
(XXII)
- XPodle tohoto postupu bylo ve 2 mililitrech methanolu rozpuštěno 64 miligramů (0,17 mmol) sloučeniny vzorce XXI.
K takto získanému roztoku bylo potom přidáno 1,7 mililitru 0,1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH a výsledná reakční směs byla promíchávána po dobu přes noc. Tato reakční směs byla potom okyselena, usušena, extrahována ethylacetátem a zkoncentrována. Analýzou metodou NMR bylo zjištěno, že veškerý allylester sloučeniny vzorce XXI vymizel, přičemž ovšem došlo do určité míry k transesterifikaci a určitý podíl methylesteru byl stále přítomen. Z tohoto důvodu byl tento produkt spojen se zbývajícím podílem sloučeniny vzorce XXI (přibližně 1,26 gramu)j tento podíl byl rozpuštěn v 5 mililitrech tetrahydrofuranu a ochlazen na teplotu 0 °C.
Potom bylo přidáno 3,8 mililitru 1 N roztoku hydroxidu sodného a tato reakční směs byla promíchávána po dobu 5 : minut při teplotě 0 *C, načež byla ohřátá na teplotu '· · místnosti. Po provedené reakci vznikly dvě fáze, přičemž ‘ k jejich eliminování bylo nutno přidat 5 mililitrů methanolu. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu * :ϊ· přes noc. Potom byly tetrahydrofuran a methanol odstraněny ? ’ stripováním a zbývající vodný roztok byl převrstven 50 mililitry ethylacetátu a okyselen na pH 2. Ethylacetátová vrstva-byla potom oddělena, promyta jedním podílem'20. ’ mililitrů vody, jednou solankou, a potom byl tento produkt usušen síranem sodným, zfiltrován a zkoneentrován na gumovitý produkt, který vykrystaloval po trituraci s hexanem, přičemž podle tohoto postupu bylo získáno 1,08 gramu bílé pevné látky. Tato pevná látka byla potom zpraco.vána.„chr.omatograficky ,.„.kdy__jako--elučního-činidl-a-by-l-o-----použito směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 70 : 30, načež frakce obsahující čistý produkt byly spojeny a tento spojený podíl byl zkoneentrován a vykrystalován ze směsi ethylacetátu a hexanu, a tímto shora uvedeným postupem bylo
- ρ získáno 0,884 gramu sloučeniny vzorce XXII.
Postup G :
XXII +
.....—- · ....... BOČ- -------- -^N-SOC
I , '
EOC BOC (X)
(XXIII)
Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku . rozpuštěno 271 miligramu (0,81 mmol) sloučeniny vzorce XXII za současného promíchávání ve 4 mililitrech bezvodého tetrahydrofuranu. Potom bylo přidáno 93 miligramů (0,81 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 167 miligramů (0,81 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a tato reakční směs byla potom promíchávána. Po asi jedné hodině a padesáti minutách bylo přidáno 0,58 gramu (0,8 mmol) sloučeniny vzorce X, která byla připravena postupem popsaným v příkladu 11, ve 30 mililitrech dichlormethanu a tato reakční směs byla potom promíchávána přes víkend. V dalším postupu byla odfiltrována
------ _dicyklohexylinočovina a vzniklá směs byla extrahována dvěma podíly 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH po 3 mililitrech, potom byla sušena uhličitanem draselným KjCO^ a zkoncentrována. Získaný produkt byl potom zpracován chromatografickým postupem na 100 gramech silikagelu, z
přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 9 : 1 k vymytí všech složek kromě požadovaného produktu, načež byla provedena eluce směsí obsahující dichlormethan, methanol a isopropylamin v poměru 90 : 10 : 1 za účelem eluování produktu. Frakce obsahující produkt byly potom zkoncentrovány, zpracovány několikrát dichlormethanem, přičemž rozpouštědlo bylo odstraněno stripováním, a tímto shora uvedeným postupem bylo získáno 349 miligramů sloučeniny vzorce XXIII ve formě bílé pěny.
V alternativním provedení, představujícímu výhodné provedení, bylo 50 mililitrů roztoku obsahujícího 0,480 gramu (což je 1,43 mmol) sloučeniny vzorce XXII v dichlormethanu zpracováno 0,165 gramu (1,43 mmol) N-hydroxysukcinimidu, načež následovalo přidání 0,294 gramu (1,43 mmol) dícyklohexylkarbodiimidu a tato reakční směs byla potom ponechána míchat po dobu 5 hodin. Tato reakční směs byla zfiltrována a filtrát obsahující surový hydroxysukcinimid byl potom,přidáván pomalu po kapkách během intervalu 20 minut do 100 mililitrů roztoku obsahujícího 1,03 gramu (1,43 mmol) sloučeniny vzorce X, která byla připravena postupem podle příkladu 11, y dichlormethanu.
Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 72 hodin. Potom byla tato surová reakční směs promyta dvakrát 20 mililitry 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH, načež byla usušena uhličitanem draselným K^CO^, zfiltrována a zkoncentrována. Získaný produkt byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla.bylo použito směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 4:1a potom směsi dichlormethanu, methanolu a diisopropylaminu v poměru 9:1:1, čímž bylo získáno 912 miligramů sloučeniny vzorce XXIII.
i*
Postup H :
OH BOC BOC
I I » v ří Ns.
^N-BOC
BOC (XXIV,
Při provádění tohoto postupu byl pod atmosférou dusíku rozpuštěn indolacetamid vzorce XXIII (900 miligramů, 0,87 mmol) ve 40 mililitrech dichlormethanu. K tomuto roztoku byl potom přidán 2-(fenylsulfonyl)-3-fenyloxaziridin (500 miligramů, což je 1,92 mmol). Reakční průběh byl monitorován chromatografickou metodou v tenké vrstvě; Po 1 hodině byla i· tato reakční směs zkoncentrována ve vakuu, přičemž tímto způsobem byl získán hlavně převažující nitron, který byl potom rozpuštěn ve 35 mililitrech kyseliny octové. K této reakční směsi byl přidán velký přebytek kyanoborohydridu . sodného (1,00 gram, což je 15,9 mmol) a tato reakční směs byla promíchávána po dobu asi 2 hodin. Získaná reakční směs byla potom zkoncentrována ve vakuu, potom byla vložena do dichlormethanu (50 mililitrů), promyta pufrem o pH 7 (jeden podíl po 50 mililitrech) a hodnota pH byla potom upravena na 7 za pomoci 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH. Organická vrstva_byla potom promyta znovu pufrem o pH 7 (jeden podíl po 50 mililitrech), usušená uhličitanem draselným a zkoncentrována ve vakuu, čímž byl získán surový produkt, který byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, při které bylo jako elučního činidla použito směsi »· ethylacetátu a methanolu v poměru 95 : 5, a tímto shora uvedeným postupem bylo připraveno 612 gramů (výtěžek 67 %) sloučeniny XXIV ve formě bílé pěny.
Postup I :
XXIV -—-'-►
Při provádění alternativního postupu byly při '& udržování vakua a trojím promytí argonem odplyněny 3 mililitry kyseliny trifluoroctové. Potom byla použitá nádobka obalena hliníkovou fólií a přidáno bylo 98 miligramů sloučeniny vzorce XXIV za použití asi 2,5 mililitru dichlormethanu jako převáděcího činidla. Po 45 minutách byla tato reakční směs zkoncentrována, čímž byl získán olejový produkt, ze kterého bylo po tríturaci diethyletherem získáno 88 miligramů-sloučeniny vzorce XXV ve formě bílé pevné látky, která byla uchovávána při teplotě -80 ’C.
V alternativním provedení, které představovalo výhodné provedení, bylo k roztoku obsahujícímu 100 mililitrů dioxanu nasyceného chlorovodíkem, který byl vyčištěn argonem, .j>řidáno_během__intervalu_1 „,.5_.minuty 0,5.2.0__gr.amu._(což___________ představuje 0,495 mmolu) sloučeniny vzorce XXIV, která byla připravena metodou podle postupu H, viz výše, v 10 mililitrech dioxanu. Po tomto přídavku se okamžitě vytvořila sraženina a tato reakční směs byla potom promíchávána po
- F dobu 1 hodiny. V dalším postupu byl přidán diethylether a po 5 minutách byl tento roztok zfiltrován. Tímto způsobem byla získána pevná látka, která byla promyta diethyletherem, usušena pod atmosférou dusíku a potom za sníženého tlaku, čímž bylo získáno 345 miligramu-kyseliny- vzorce..XX.IV., která byla uchovávána při teplotě -78 °C. V dalším postupu bylo k. vodnému roztoku, který byl čištěn argonem, přidáno 150 miligramů (což je 0,205 mmolu) této kyseliny vzorce XXIV. Reakční průběh byl monitorován metodou kapalinové chromatografie za vysokého tlaku HPLC. Po dokončení reakce po asi 7 hodinách byla tato reakční směs sušena vymražením, přičemž tímto způsobem bylo získáno 103 miligramu sloučeniny .vzorce.XXV ve formě hydrochloridové soli.
Příklad 13
N-(20-amino-4-hydroxy-48,12,17-tetraazeikos-1-yl)-4hydroxy-benzamid. :
Postup přípravy této sloučeniny uvedené, v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je přítomna ve frakci A’ jak je uvedeno .v .příkladu .2 , byl proveden-následujícím způsobem.
Postup A :
Podle tohoto provedení bylo ve 400 mililitrové baňce spojeno 6,78 gramu (20 mmolů) hydrogensíranu
-Atetrabutylamonného se 60 mililitry vody a tato směs byla promíchávána za vzniku roztoku'. Potom bylo přidáno 3,36 gramu (40 mmol) hýdrogenuhličitanu sodného NaHCO-j a jakmile to umožnilo pěnění bylo dále přidáno 40 mililitrů roztoku obsahujícího 2,76 gramu (20 mmolů) p-hydroxybenzoové kyseliny, 0,8 gramu hydroxidu sodného NaOH a 40 mililitrů vody. Takto získaná reakční směs byla potom promíchávána pc* dobu 5 minut a potom bylo přidáno 200 mililitrů dichlormethanu. Výsledná směs byla promíchávána po dobu dalších 5 minut, přičemž vzniklé vrstvy byly ponechány oddělit. Vodná vrstva byla extrahována dvakrát 50 mililitry dichlormethanu. Spojený podíl dichlormethanových extraktů byl potom usušen síranem sodným Na2SO4, zkoncentrován a zpracován dvakrát 75 mililitry acetonu a tento podíl byl potom opět rozpuštěn v 50 mililitrech acetonu. Potom bylo přidáno 1,9 mililitru (22 mmolů) allylbromidu a tato směs byla promíchána. Získaná reakční směs byla zkoncentrována, ·-··*.
vložena do 100 mililitrů ethylacetátu, promyta dvakrát 30 mililitry vody, jednou 50 mililitry nasyceného roztoku hýdrogenuhličitanu, jednou 30 mililitry vody, jednou solankou, jednou vodou a jednou solankou. Výsledný produkt XyŠf byl usušen a zkoncentrován za vzniku oleje. Tento olej byl potom triturován 50 mililitry petroletheru po dobu jedné hodiny. Potom byla tato reakční směs zfiltrována, dobře promyta petroletherem a usušena na vzduchu, čímž bylo získáno 1,7 gramu sloučeniny vzorce XXVI, viz výše.
Postup B :
(XXVII)
- yt Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku 1,7 gramu (9,55 mmolu) sloučeniny vzorce XXVI, která byla připravena podle postupu A, viz výše, spojeno s 50 mililitry Aldrichova vysušeného DMF a tato směs byla promíchávána až do vzniku roztoku. Potom bylo přidáno 0,38. gramu. (.9,55 mmolu) hydridu sodného NaH ve formě 60Jdisperze v oleji a tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc, V dalším postupu bylo přidáno 0,76 mililitru chlormethylmethyletheru (Aldrich), přičemž po tomto přídavku se okamžitě vytvořila sraženina. Získaná reakční směs byla promíchávána po dobu 18 hodin. Potom byla tato reakční směs zpracována 200 mililitry ethylacetátu ve 100 mililitrech vody.^Ethylacetátová vrstva byla oddělena, promyta třikrát 50 mililitry vody, jednou 50 mililitry 1 N roztoku hydroxidu^ sodného, jednou.50 mililitry vody a jednou .solankou. Výsledný roztok byl usušen, zkoneentrován a zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito v poměru 4:1, přičemž tímto získáno 1,63 gramu sloučeniny
Postup C :
XXVII směsi hexanu a ethylacetátu shora uvedeným postupem bylo vzorce XXVII, viz výše.
Při provádění tohoto postupu bylo v 75 mililitrech tetrahydrofuranu rozpuštěno 1,62 gramu (což je 7,3 mmolu) sloučeniny vzorce XXVII, která byla připravena metodou podle
ZA · postupu B, viz výše. Potom byl k této směsi přidán roztok obsahující 0,4 gramu (10 mmolů) hydroxidu sodného NaOH v 15 mililitrech vody. což se projevilo ve vytvoření dvou vrstev. Potom byl přidáván methanol tak dlouho, dokud nebyla získána homogenní směs. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc. Tetrahydrofuran a methanol byly potom odstraněny stripováním ve vakuu a zbývající vodný roztok byl extrahován dvakrát 15 mililitry ethylacetátu. Potom byla vodná vrstva převrstvena 50 mililitry čerstvého ethylacetátu a okyselena na pH 2,5 pomocí 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, promyta jednou 10 mililitry vody a jednou 25 mililitry solanky. Získaný roztok byl zkoncentrován, čímž byl získán podíl pevných látek, který byl triturován hexanem, zfiltrován a usušen na vzduchu, přičemž tímto postupem ;'bylo připraveno 1,2 gramu sloučeniny vzorce XXVIII, viz výše·.
Postup D :
X + XXVIII ---S>
‘j.
i- ‘Ít -V —i ./ií
(XXXII)
Podle tohoto postupu bylo 20 mililitrů dičhlormethanového roztoku, který obsahoval 0,127 gramu (0,7 mmolu) sloučeniny vzorce XXVIII, připravené postupem C. viz výše, zpracováváno 0,081 gramu (0,7 mmolu)
N-hydroxysukcinimidUi načež následoval přídavek 0,144 gramu
- /3 (0,7 mmolu) dicyklohexylkarbodiimidu a tato reakční směs byla promíchávána po dobu 4 hodin. Potom byla tato reakční směs zfiltróvána a filtrát obsahující surový hydroxysukcinimid byl přidáván pomalu po kapkách během intervalu 20 minut do 80 mililitrů-dichlorme.thanového. .
roztoku obsahujícího 0,50 gramu (0,7 mmolu) sloučeniny vzorce X, připravené postupem podle shora uvedeného příkladu 11, postupy A-I. Tato reakční směs byla potom promíchána. Získaná reakční směs byla promyta 1 N roztokem hydroxidu sodného NaOH (dva podíly po 20 mililitrech), usušena za pomoci uhličitanu draselného, zfiltróvána a zkoncentrována. Vzniklý koncentrát byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu za použití směsi diehiórmethanu a merhanolu v poměru 9 : 1 jako elučního činidla, přičemž následovalo eluování směsi, díchlormethanu, methanolu.'.a diisopropylaminu, v poměru. 9. : 1 : 0,25 a tímto postupem bylo připraveno, 370 miligramu sloučeniny XXXII, viz výše.
Postup: E .:
XXXII
(XXXIV)
BOC
N-BOC
H ___ Při tomto postupu bylo pod atmosférou dusíku 0,335 gramu (0,38 mmolu) sloučeniny vzorce XXXII, která byla připravena Shora ilustrovaným postupem D, rozpuštěno ve 30 mililitrech diehiórmethanu. K tomuto roztoku bylo potom přidáno 0,230 gramu (0,88 mmolu) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridinu. Po 0,5 hodině byla tato reakční směs zkoncentrována za použití vakua a získaný koncentrát byl rozpuštěn v 15 mililitrech kyseliny octové. K této reakční směsi byl přidán velký přebytek kyanoborohydridu (0,100 gramu, což je 1,6 mmoiu) a tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu 2 hodin. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována ve vakuu, produkt byl vložen do 50 mililitrů dichlormethanu, promyt jednou'50 mililitry pufru o hodnotě pH 7, načež byla hodnota pH upravena na 7 za pomoci 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH. Organická vrstva byla promyta znovu 50 mililitry pufru o hodnotě pH 7, usušena uhličitanem draselným a zkoncentrována ve vakuu.
Získaný koncentrát byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi acetonu a hexanu v poměru 50 : 50, a tímto způsobem VW bylo připraveno 253 miligramu sloučeniny vzorce XXXIV, viz ·:: Z výše. y ..·//
Postup F :
(XXXIV) ---► >’· · *J
(XXXVI)
... .λ.Podle .tphptp„_ppstupu bylo pod atmosférou dusíku při teplotě místností spojeno 0,20 gramu (0,223 mmoiu) sloučeniny vzorce XXXIV, která byla připravena postupem E, viz výše, s 5 mililitry kyseliny trifluoroctové. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 1,5 hodiny. K této reakční směsi byly přidány další 2 mililitry kyseliny trifluoroctové k omytí stěn této nádobky. Potom byla ponechána probíhat reakce po dobu 1,5 hodiny. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována ve vakuu, triturována ethyletherem, zfiltrována a usušena pod atmosférou dusíku, přičemž tímto postupem bylo připraveno 218 miligramů sloučeniny vzorce XXXIV, což je sloučenina uvedená v záhlaví tohoto příkladu.
Příklad 14
N-(20-amino-4-hydroxy-4.8,12,17-tetraazeikos-l-yl) -2,5dihydroxy-benzamid.
Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je obsažena:ve. frakci získanépostupem podle příkladu.3, byl proveden následujícím, způsobem.
Postup A :
OH 0
OCH2CH=CH2
Vtomto příkladu bylo použito stejného postupu jako v příkladu 12, postup A, přičemž se ovšem vycházelo ze 3,08 gramu (20 mmolů) 2,5-dihydroxybenzoové kyseliny a získány byly 3,0 gramy sloučeniny vzorce XXIX, viz výše.
Postup Β :
XXIX
(XXX)
Podle tohoto postupu byly pod atmosférou dusíku spojeny 3,0 gramy (15,5 mmoiu) sloučeniny vzorce XXIX s 50 mililitry Aldrichova suchého DMF a tato směs byla potom promíchávána tak dlouho, dokud nevznikl roztok1. V dalším+v** ’·* ? postupu bylo přidáno 1,24 gramu (31 mmolů) hydridu sodného. NaH ve formě 60 disperze v oleji a tato směs byla ; ., promíchána. Po 3 hodinách bylo přidáno 2,5 mililitru (33 mmolů) chlormethylmethyletheru a tato reakční směs byla. .., promíchávána po dobu 18 hodin. Získaná reakční směs bylar. potom přidána do 300 mililitrů ethylacetátu a 100 mililitrů vody. Vzniklá ethylacetátová vrstva byla potom oddělena' a promyta třikrát 75 mililitry vody, dvakrát 75 mililitry 1 N roztokem hydroxidu sodného, dvakrát 50 mililitry vody a jednou solankou. Výsledný roztok byl potom usušen a zkoneentrován, čímž bylo získáno 2,9 gramu oleje, který byl zpracován.chromátografickým postupem na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4 : 1 jako elučního činidla, čímž byly získány dvě frakce, přičemž druhá frakce obsahovala 1,16 gramu sloučeniny obecného vzorce XXX, viz výše.
Postup C :
XXX
(XXXI)
Podle tohoto postupu bylo do 10 mililitrů tetrahydrofuranu přidáno 1,16 gramu (což je 4,1 mmolu) slouč_eňiny_j/zorce XX, viz výše. Pot oni bylo přidáno 0γ24.....
gramu (což je 6 mmolů) hydroxidu sodného NaOH v 10“* ~ mililitrech vody, přičemž po tomto přídavku vznikly dvě fáze. V dalším postupu byl do této reakční směsi přidáván methanol tak dlouho, dokud se nevytvořila jedna fáze, načež byla tato směs promíchávána po dobu 18 hodin. Použitá rozpouštědla byla potom odstraněna a zbývající vodný roztok byl extrahován dvakrát za pomoci 15 mililitrů ethylacetátu. Vodná vrstva byla potom převrstvena 35 mililitry čerstvého ethylacetátu a hodnota pH byla upravena na 2,5 přídavkem 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, promyta1 jednou 10 mililitry vody a jednou solankou, usušena a zkoncentrována, přičemž tímto shora uvedeným postupem byl připraven 1,0 gram sloučeniny vzorce XXXI, ve formě oleje.
Z”
Postup D :
XXXI
X +
(XXXIII)
N—BOC H
V tomto provedení bylo využito stejného postupu jako v příkladu 13, postup D, přičemž bylo použito 0,17 gramu (0,7 mmolu) sloučeniny vzorce XXXI, která byla připravena postupem C uvedeným výše, 0,081 gramu (což je 0.7 mmolu)'* N-hydroxysukcinimidu, 0,144 gramu (0,7 mmol) + dicyklohexylkarbodiimidu a 0,50 gramu (0,7 mmol) sloučeniny vzorce X, která byla připravena postupem popsaným v příkladu 11, postupy A-I, přičemž tímto způsobem bylo po chromatografickém zpracování získáno 370 miligramů sloučeniny vzorce XXXIII, viz výše.
Postup E ; ' '
XXXIII --►
(XXXV)
V tomto provedení bylo využito stejného postupu jako v příkladu 13, postup E, přičemž bylo použito 0,308 gramu
- (0,33 mmol) sloučeniny vzorce XXXIII, která byla připravena postupem popsaným v postupu D, viz výše, a 0,250 gramu (0,96 mmol) 2-(sulfonylfenyl)- 3-fenyl-oxaziridinu a po chromatografickém zpracování na silikagelu, při kterém bylo použito jako elučního činidla nejdříve ethylacetátu a potom směsi acetonu a hexanu v poměru 50 : 50, bylo získáno 210 miligramů sloučeniny vzorce XXXV, viz výše.
Postup F :
XXXV --\ r--—►
(XXXVII)
Podle tohoto provedení bylo použito stejného postupu, který je popsán v příkladu 13, postup F, přičemž při tomto provedení bylo použito 0,100 gramu (0,104 mmol) sloučeniny vzorce XXXV, která byla připravena postupem E, viz výše, a tímto postupem bylo připraveno 108 miligramů sloučeniny vzorce XXXVII, což je požadovaná výsledná sloučenina uvedená v záhlaví tohoto příkladu.
Příklad 15
N-(16-aminů-4-hydroxy-4,8,13-triazahexadec-l-yl-4-hydroxylH-indol-3-acetamid.
Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je obsažena ve frakci A2 získané postupem podle příkladu 3, býl proveden následujícím
BOC
způsobem .
Postup A :
VI (XXXVIII)
Při tomto postupu bylo použito stejného postupu jako v příkladu 11, postup D, přičemž se ovšem vycházelo ze 1,15 gramu (což je 2,07 mmolu) sloučeniny vzorce VI, která byla připravena postupem podle příkladu 11, viz postupy A-E, přičemž tímto způsobem bylo získáno 1,10 gramu surové sloučeniny vzorce XXXVIII, viz výše.
Postup B :
XXXVIII + XXII
(XXXIX)
Podle tohoto provedení bylo použito alternativního provedení--postupu podle pří kladu 12 ,- -viz postup-G, -.přičemž ale byl použit dichlormethanový roztok (15 mililitrů) obsahující 0,228 gramu (6,8 mmol) sloučeniny vzorce XXII, která byla připravena postupem podle příkladu 12, viz postupy A až F, dále 0,380 gramu (6,8 mmol) sloučeniny
vzorce.XXXVIII, která byla připravena stejným způsobem jako v postupu A, viz výše, 0,078 gramu (6,8 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 0,140 gramu (6,8 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu, a tímto shora uvedeným způsobem bylo pó chromatografickém zpracování.ha sílikageTu, pr’i-’ kterém bylo použito jako elučního činidla směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 9...: 1 a. potom směsi dichlormethanu, methanolu a diisopropylaminu v poměru 9 ; 1 ; 0,5, připraveno 0,407 gramu sloučeniny vzorce XXXIX.
Postup C :
XXXIX
BOC (XL)
Podle tohoto provedení bylo použito stejného postupu jako v příkladu 12, viz postup.H, přičemž se vycházelo ze 0,350 gramu (0,4 mmol) sloučeniny vzorce XXXIX a 0,230 gramu (0,88 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridinu a tímto postupem bylo po chromatografickém zpracování na silikagelu, při kterém bylo použito jako elučního činidla směsi acetonu a hexanu v poměru 50 : 50, získáno 0,274 gramu sloučeniny vzorce XL, viz výše. Tento produkt obsahoval malé množství _feny 1 sul fonam idu a z .tohoto, důvodu bylo nutno_. j e j„ jd á 1 e ........
přečistit na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi acetonu a hexanu v poměru 50 : 50.
tohoto provedení bylo použito alternativního je postup uvedený v příkladu 12, postup I.
ycházelo z 0,166 gramu (0,186 mmol) sloučeniny terá byla připravena postupem C. viz výše, a po měsi dioxan/HCl byla získána surová kyselina.
V a vzorce XL’ byla potom rozpuštěna ve vodě, rozpouštění trvalo 8 hodiny, načež byla sušena , čímž bylo získáno 88 miligramů sloučeniny
N-BOC
H tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku.
gramu (157,6 mmol) hydrobromidové soli enaminu.,.. t.. zn.. 3-brompr.opylenamin.. HBr.,.. v .600 .. . N,N-dimethylformamidu. Do tohoto roztoku bylo o 34,4 gramu (157,6 mmol) uhličitanu, načež následoval přídavek 32,3 36 mmolů) triethylaminu. Tímto způsobem se ’ ί Ό — ytvořila sraženina. Taxo reakční směs byla potom na po dobu přes noc. V dalším postupu byla tato és zředěna na objem 1,5 litru ethylacetátem, potom dnou 500 mililitry 1 N roztoku kyseliny kove, třikrát 500 mililitry vódý. jednou solankou la usušena za pomoci síranu sodného Na2S04. Po vání byl získaný produkt zpracován afickou metodou na 800 gramech silikagelu, přičemž lího činidla bylo použito směsi hexanu tátu v poměru 4 : 1, a frakce byly monitorovány afickou analýzou v tenké vrstvě (KMNO^/^) Frakce produkt byly potom spojeny, tento spojený podíl :nt r.oyán .ve«vakuu, „zpracován ^dvakrát 5 0_ mi li litry hanu a přečištěn va vysokého vakua, přičemž tímto
Claims (7)
- PATENTOVÉ ΝΑΚΟΚΪ l* / těná polypeptidová sloučenina vybraná ze skupinyI i ptid (I), který má následující identifikační iky: : / přítomen ve frakci ze surového jedu pavouka aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, ilimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů velikost částic 10 μη, za použití průtočného mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému gradientovým programem 5 % -> 20 % B, > 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom > 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až e A je 0,l|vodný roztok kyseliny vé a B je acetonitril, při asi 38 minutách;přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše tavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac ilimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů velikost částic 10 gra, za použití průtočného mililitrů za minutu a rozpouštědlového systému n gradientovým programem 20 % -——> 30 % B, > 70 % A v průběhu 0 až 40 minut, Vatersova e A je 0,lj?6|-ftíj vodný roztok kyseliny vé a B je acetonitril, při asi 22 minutách;kvence aminokyselin s koncovou aminoskupinou je-w glu-iys-giy-ieu-pro-giu-giy-aia-giu-cys-aspasn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trplys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thrglu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyschr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-argglu-trp-leu-ser-;FAB MS: 7267;id, který má v podstatě stejnou sekvenci in a v podstatě stejnou účinnost týkající se vápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (I), “''“peptid (II) vzorce:“*' cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-alatrp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyrcys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cysasn-asn-asn-C0NH
- 2 id, který má v podstatě stejnou sekvenci in a v podstatě stejnou účinnost týkající se vápníkových kanálků jako uvedený polypeptid (II), peptid (III), který má následující identifikační štiky:je přítomen ve frakci ze surového jedu pavouka 5 aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, mi li metrů x 250 milimetrů; velikost' pórů m, velikost částic 10 gra, za použití průtokového 5 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému m gradientovým programem 5 % -> 20 % B,OU V pLUUCliU V U-·*- - .*1. i. —. 1- , > 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až /* e A je 0,1 vodný roztok kyseliny vé a B je acetonitril, při asi 39 minutách;přítomen ve frakci z frakce popsané výšea), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, tic 10 gm, za použití průtočného množství 10 nutu a rozpouštědlového systému s nelineárním programem 20 % -> 25 % B, > 75 % A v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova ‘tom 25 % -> 50 % B, 75 % -> 50 % A až 45 minut, Vatersova křivka 11, kde A je ný roztok trifluoroctové kyseliny a B je při asi 36 minutách, a ¥kvence aminokyselin s koncovou aminoskupinou je a-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys- y-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr- „, s-trp-hi s-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lyss-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cyss-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lyss-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu p-;spray MS: 7793 ;i, který má v podstatě stejnou sekvenci . a v podstatě stejnou účinnost při blokování kanálků jako uvedený polypeptid (III) , olypeptid (IV) vzorce:asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lyscys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-argthr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-argval-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONl·^, id, který má v podstatě stejnou sekvenci in a v podstatě stejnou účinnost při blokování h kanálku jako uvedený polypeptid (IV),-“~~peptid-(V) ,-kteřý-má^ následuj ící ..identifikační štiky:: přítomen ve frakci ze surového jedu pavouka s aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, . milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů ra, velikost částic 10 gm, za použití průtočného5 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému m gradientovým programem 5 % --—> 20 % B, —> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom —> 70 % B, 80 %.-> 30 % A v průběhu 30 až kde A je 0,1^96^-»^ vodný roztok kyseliny tové a B je acetonitril, při asi 43 minutách;je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac-------) milimetrů- x--250 milimetrů,- velikost ^pórů . . ... .;m, velikost částic 5 gm, za použití průtočného ,5 mililitru/minutu a rozpouštědlového systému m gradientovým programem 25 % -> 40 % Β, 60 % A. v průběhu O až 30 minut, kde A je oztok trifluoroctové kyseliny a B je při asi 20,25 minuty;γ» ;nce aminokyselin s koncovou aminovou!, skupinou jí :;-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-glyj-pro-trp-met-val-ser-ile-glu-glu-lyss-lys-gly-gly-phe-asp- ;Lekulová hmotnost je asi 20 000;, který má v podstatě stejnou sekvenci a v podstatě stejnou účinnost při blokování tanálků jako uvedený polypeptid (V), ptid (VI), který má následující identifikační iky: .· řítomen ve frakci surového jedu pavouka aperta, která se eluuje ná koloně C-18 Vydac, ilimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů velikost částic 10 gm, za použití průtočného mililitrů/minutu a rožpouštědlového systému gradientovým programem 5 % -> 20 % B, > 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom >. 70 % B, - 80 % ——>..30 % Avprůběhu .30. až a A je 0,1 vodný roztok kyseliny vé a B je acetonitril, při asi 48,3 minuty;ence aminokyselin s koncovou aminoveu^skupinou-ΑΧ cí :,lu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-sereu-asp-glu-thr-val-asp-pro- ;ekulová hmotnost asi 80 000 d, který má v podstatě stejnou sekvenci nav podstatě stejnou účinnost při blokování . kanálků jako uvedený polypeptid (VI), icky přijatelné soli odvozené od těchto sténá polypeptidová sloučenina podle nároku 1, brána ze skupiny zahrnuj ící eptid (I), který má následující identifikační tiky:e přítomen ve frakci surového jedu pavouka apeřta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů , velikost částic 10 gin, za použití průtočného mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému gradientovým programem 5 % —;-—> 20 % B,-> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom-> 70 % B, J30 % -—--> 30 % A v průběhu 30 ,až le - A* j e_0,l |%}«í|~vodný_r oztok-kysel'iny J >vé a B je acetonitril, při asi 38 minutách;i přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše ;tavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac103 rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 , 10® cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 30 % B,8Q % —.-> 70 % A v průběhu 0 až 40 minut, Vatersova křivka 6, kde A je 0,1 j vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 22 minutách;'Τ' (c) sekvence aminokyselin koncovou aminovou) skupinou je následující;H2N-glu-lyš-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-aspgly-asn-glu-ser-asp-cys-lys - cys-ala-gly-gln-trpile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyslys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-set-asp-pro-asn-argasn-glu-trp-leu-ser-;(d) FAB MS: 7267;polypeptid (II) vzorce:asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-alaasp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyrtyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cysval-asn-asn-asn-CONH2, polypeptid (III), který má následující identifikační char akteristiky:(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů104
- 3 . 10~6 cm, velikost částic 10 gra, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % Β,95 % -> go % A v průběhu 0 až 30 minut, potom20 % —;—:-“> 70 % B, 80 %.-—:—> 30 % A v průb.ěhu 30..až55 minut, kde A je O,l(%f-»ij vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 39 minutách;(b) je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10-ť> cm, velikost částic 10 gra, za použití průtočného množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % ——-> 25 % B,~~80 % -> 75 % A v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova křivka 6, a potom 25 % -> 50 % B, > 50 % A v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova λ křivka 11, kde A je 0,l|%^ai| vodný roztok trifluoroctové kyseliny a B je acetonitril, při asi 36 minutách, a /* ‘ (c) sekvence aminokyselin fť koncovou aminoveu^skupinou je následující:ř^N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cysasp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyrgly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lystrp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cysglu-lys-gly-raet-lys-his-thr-cys-ile-thr-lysleu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leuasp-trp-;(d) ion-spray MS: 7793,105 polypeptid (IV) vzorce:H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lysser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-argarg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-argphe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONl^, polypeptid (V), který má následující identifikační charakteristiky:(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10~6 cm, velikost částic 10 gm, za použití průtočného^ množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B,95 % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom20 % > 70 % B, 80 % > 30 % A v průběhu 30 až55 minut, kde A je 0,ll%V*4 vodný roztok kyseliny trif luoroctové á B je acetonitril, při asi 43 minutách;(b) je přítomen ve frakci z frakce popsané ve výše uvedeném odstavci (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10-^ cm, velikost částic 5 gm, za použití průtočného množství 3,5 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 25 % -> 40 % B,75 % -> 60 % A v průběhu 0 až 30 minut, kde A je07vodný roztok trif luoroctové' kyseliny a B je acetonitril, při asi 20,25 minuty;106 je následující:I^N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-glyasp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-glu-glu-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asp- ;a (d) molekulová hmotnost je asi 20 000, polypeptid (VI), který má následující identifikační charakter i s t i ky:(a) je přítomen ve frakci surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac, “ rozměry ''22''ini'limetrů*x “250 railimětrú“, velikost 'pórů''“*“ ’3 . 10“ cm, velikost částic 10 gra, za použití průtočného .množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % --> 20 % B,95 % -s—> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom20 % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 ažΛ 455 minut, kde A je 0,ll%^fti( vodný roztok kyseliny trif luoroctové a B je acetonitril, při asi 48,3 minuty;(b) sekvence aminokyselin s koncovou aminoveu^skupinou je následující:l^N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-serasn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro- ;a (c) molekulová hmotnost je asi 80 000, a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto látek.1073. Farmaceutický prostředek pro blokování vápníkových kanálků v buňkách savců, vyznačující se tím, že obsahuje čištěnou polypeptidovou sloučeninu podle nároku 1 nebo farmaceuticky přijatelnou sůl odvozenou od této sloučeniny v množství blokujícím vápníkové kanálky a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosičovou látku.
- 4. Farmaceutický prostředek pro blokování vápníkových kanálků v buňkách savců, vyznačující se tím, že obsahuje čištěnou polypeptidovou sloučeninu podle nároku 2 nebo farmaceuticky přijatelnou sůl odvozenou od této sloučeniny v množství blokujícím vápníkové kanálky a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosičovou látku.' t.
- 5. Způsob přípravy čištěné polypeptidové sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující polypeptidy (I), (II), (III), (IV), (V) a (VI) a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin, podle nároku 1, vyznačující se tím, žě (a) v případě, že je požadován čištěný polypeptid „(I) , se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na* koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 106 cm, velikost částic 10 pra za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem5 % -—> 20 % acetonitril, 95 % :—> 80 % 0,1 %-ní vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % ->70 % acetonitril,80 % -> 30 % 0, l| vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 38 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů108 χ 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic10 gm, a eluování se provádí za použití průtokového množství10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 30 % acetonitril,Λ .80 % --> 70 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 40 minut, Vatersova křivka
- 6, při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22 minutách, se jímá a potom se případně lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;(b) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (ΪΙ) , se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na^koloně' C-18 Vydac~o rozměrech *22Tnil’imětřů~x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10’^ cm, velikost částic 10 gm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu, a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % ->20 % acetonitril, 95 % -> 80 %0,l^%|r»4 vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -:—> 70 96 acetonitril,80 % --> 30 % 0,ΐ|%|-»^ vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 40 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10-ť> cm, velikost částic 10 gm, přičemž eluování se provádí za použití průtokového množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % ——-> 30 % ~ acetonitril, 80 ——> 70 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova křivka 6, potom 30 % —-—> 50 % acetonitril,70 ofo -> 5Q vodný roztok kyseliny109 trifluoroctové v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova křivka 11 a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22 minutách, se jímá a potom se případně lyofilizuje. opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;(c) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (III), se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 10 gm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému S lineárním gradientovým programem 5 % —-> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % vodný roztok trif luoroctové kyseliny v průběhu 0 až30 minut, potom 20 % —-> 70 % acetonitril, K80 % -:-> 30 % vodný roztok trif luoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 39 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10“^ cm, velikost částic *'10 gm, a eluování se provádí za použití průtokového množství1.0 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 % -> 25 % acetonitril,80 % -> 75 % 0,1 jvodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, Vatersova křivka 6, potom 25 % -> 50 % acetonitril, 75 % -> 50 %Λ0,11 vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova křivka 11 a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 36 minutách se jímá a potom se případně lyof ilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;110 (d) v případě, že je požadován čištěný polypeptid (IV), se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10’^ cm, velikost částic 10 pra za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 96 acetonitril, 95 96 -—> 80 $96 0, vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu0 až 30 minut, potom 20 96 —-> 70 96 acetonitril,80 96 --> 30 96 0,1J96J-eíJ vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 40 minutách se jímá a potom se vloží —,— - na - kolonu - C- 4 -Vydae -o -rozměrech~22~ mi limetr ů~x “250—---—---” milimetrů, velikost pórů 3 . 10”^ cm, velikost částic10 pm, přičemž eluování se provádí za použití průtokového množství 10 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 20 96 -:-—> 30 % λacetonitril, 80 96 --> 70 9b 0,ll 96(-e^ vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0. až 30 minutVatersova křivka 6, potom 30 % -> 50 96 acetonitril,Λ70 96 -> 50 % 0,1 \96}®^ vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 45 minut, Vatersova křivka11 a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 27,5 minuty se jímáI. a popřípadě lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě ·, j a lyofilizuje;Ή t
- 7 . ’’ · ' W (e) v případě, že je požadován v podstatě čistý .— .. polypeptid—(V-)-;- se-celý-podí-1-jedu^pavouka-Ageíenopsis - - -......aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10cm, velikost částic 10 μπ za použití průtočného množství11115 mililitrů/minutu a rozpoustědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril.95 % -> 80 % 0,li%}-n^ vodný roztok trif luoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, 80 % -> 30 % vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 43 minutách se jímá a potom se vloží na kolonu C-18 Vydac o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10“^ cm, velikost částic 5 gm, a eluování se provádí za použití průtokového množství 3,5 mililitru/minutu a rozpoustědlového systému s lineárním gradientovým programem25 %-> 40 % acetonitril, 75--> 60 % 0,l|%pw| vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut a při detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 20,25 minuty se jímá a potom případně lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofilizuje;(f) v případě, že je požadován čištěný poiypeptid t (VI), se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje.na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10“^ cm, velikost Částic Ϊ0 gm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % :-> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 %0,lj%^»í| vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril,Λ80%->- 30-% 0,1 vodný-roztok trifluoroctové .....kyseliny v průběhu 30 až 55 minut, při monochromatické detekci píku v rozsahu od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 48,3 minuty se jímá a potom se112 popřípadě lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje;nebo v alternativním provedení se kterýkoliv z výše uvedených polypeptidů synteticky připraví metodami samy o sobě známými;a v případě, kdy jsou požadovány polypeptidy, které mají v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako libovolný z výše uvedených polypeptidů, potom se tento polypeptid nebo polypeptidy synteticky připraví metodami samy o sobě známými;a případně se převedou výše uvedené polypeptidy na farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin metodami samy o sobě známými.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34618189A | 1989-04-28 | 1989-04-28 | |
| CS902157A CZ283830B6 (cs) | 1989-04-28 | 1990-04-28 | Polyaminy a polypeptidy vhodné jako antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů a/nebo blokující činidla vápníkových kanálů |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ282990B6 CZ282990B6 (cs) | 1997-12-17 |
| CZ21897A3 true CZ21897A3 (en) | 1997-12-17 |
Family
ID=25745576
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ97218A CZ21897A3 (en) | 1989-04-28 | 1990-04-28 | Purified polypeptide compound, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ21897A3 (cs) |
-
1990
- 1990-04-28 CZ CZ97218A patent/CZ21897A3/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ282990B6 (cs) | 1997-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ283830B6 (cs) | Polyaminy a polypeptidy vhodné jako antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů a/nebo blokující činidla vápníkových kanálů | |
| CA2033480C (en) | Indolyl-3 polyamines useful as antagonists of excitatory amino acid neurotransmitters | |
| DE3687380T2 (de) | 5-amino-2,5-disubstituierte 4-hydroxypentansaeureester enthaltende polypeptidderivate. | |
| HK97592A (en) | 3-(5-aminopentyl)-amino-1-benzazepin-2-one-1-alcanoic acids, process for their preparation, their pharmaceutical preparation as well as their therapeutic use | |
| EP0676411A2 (fr) | Peptides et pseudopeptides dérivés de tachykinines, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent | |
| DK166624B (da) | Analogifremgangsmaade til fremstilling af cis,endo-2-azabicyclo-oe3.3.0aa-octan-3-carboxylsyrer samt deres fysiologisk acceptable salte | |
| WO1992014709A2 (en) | Calcium channel antagonists and methodology for their identification | |
| IE51918B1 (en) | Bicyclic compounds their production and use | |
| DK164557B (da) | Derivater af cis,endo-2-azabicyclo-oe5.3.0aa-decan-3-carboxylsyre samt laegemiddel indeholdende dem | |
| TW202321272A (zh) | 肽衍生物和作為食慾激素促效劑之相關用途 | |
| US5599559A (en) | Calcium channel blocking polypeptide from agelenopsis aperta and therapeutic methods employing it | |
| US5227397A (en) | Polyamines and polypeptides useful as antagonists of excitatory amino acid neuro-transmitters and/or as blockers of calcium channels | |
| JPH04506525A (ja) | カッパオピオイド受容体に特異的なダイノルフィン類似体 | |
| CZ21897A3 (en) | Purified polypeptide compound, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof | |
| DE3850818T2 (de) | Fluor enthaltende Renin-Inhibitoren. | |
| EP0057998A1 (en) | Alicyclic compounds, their production and use | |
| FI102171B (fi) | Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen olennaisen puhtaan polyamiin in ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi | |
| KR20060111523A (ko) | Ｎ-아실-ｎ'-벤질-알킬렌디아미노 유도체 | |
| FR2601013A1 (fr) | Nouvelles quinazolinones tetracycliques, leur preparation et leur utilisation comme medicaments | |
| WO1992010510A1 (de) | Dithiolano- und dithianoglycinhaltige renininhibitorische peptide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in arzneimitteln | |
| NO315372B1 (no) | Vesentlig ren polyaminforbindelse, anvendelse derav og farmasöytiske sammensetninger | |
| FR2632861A1 (fr) | Derives d'amino-4 carboxy-3 quinoleines et naphtyridines, leur procede de preparation et leur application comme medicaments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090428 |