CZ283830B6

CZ283830B6 - Polyaminy a polypeptidy vhodné jako antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů a/nebo blokující činidla vápníkových kanálů

Info

Publication number: CZ283830B6
Application number: CS902157A
Authority: CZ
Inventors: Nicholas Alex Saccomano; Robert Alfred Volkmann
Original assignee: Pfizer Inc.; Natural Product Sciences Inc.
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-28
Publication date: 1998-06-17
Also published as: CN1038931C; JP2747279B2; JPH0774187B2; EP0395357B1; CS215790A3; JP2746359B2; NO901881D0; KR900015745A; JP2746361B2; IL94147A; PT93876A; DE69024253T2; JPH09118694A; JP2744904B2; JPH09118691A; FI902139A7; AU615144B2; NZ244480A; KR930000163B1; HU902610D0

Abstract

Řešení spočívá v polyaminech a polypeptidech z jedu pavouka Agelenopsis aperta. Tyto látky lze užít k blokování vápníkových kanálů v buňkách a tím k léčbě hypertenze, ischemické srdeční choroby, arythmií, Raynaudovy choroby a podobně. Řešení spočívá rovněž ve způsobu výroby těchto látek.ŕ

Description

(57) Anotace:

Čištěné polyaminové sloučeniny vzorců I až V, a sloučenina VI, specifikovaná fyzilkálně-chemickými charakteristikami postupu izolace, vyskytující se v Jedu pavouka Agelenopsis aperta, které jsou vhodné jako antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů a/nebo jako blokovací činidla vápníkových kanálků. Do rozsahu řešení rovněž náleží postup přípravy těchto čištěných polyaminových sloučenin.

» (i)

Čištěná polyaminová sloučenina a způsob její přípravy

Oblast techniky

Vynález se týká čištěných polyaminových sloučenin, vyskytujících se vjedu pavouka Agelenopsis aperta, které jsou vhodné jako antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů a/nebo jako blokovací činidla vápníkových kanálků. Tyto polyaminové sloučeniny a farmaceuticky jejich farmaceuticky přijatelné soli jsou dále vhodné k léčení stavů vyvolaných excitačními aminokyselinovými neurotransmitery u savců a k hubení bezobratlých škůdců. Vynález se rovněž týká postupu přípravy těchto čištěných polyaminových sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Podle dosavadního stavu techniky bylo zjištěno, že jed pavouka Agelenopsis aperta obsahuje přinejmenším dva toxiny, které působí na průchod vápníku, viz. publikace Jackson, H. a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:1078 (1987). Podle této publikace byl objeven toxin, označený jako AG2, který má molekulovou hmotnost menší než 1 000, přičemž se předpokládá, že tento toxin potlačuje průchod vápníku v mnoha tkáních. Kromě toho se v publikaci: Jackson, H., a kol., Soc. Neu. Sci. Abstr. 12:730 (1986), uvádí další toxin pavouka Agelenopsis aperta představující složku s molekulovou hmotnostní asi 6 000. Tento toxin způsobuje presynaptickou blokádu transmise a předpokládá se, že tento toxin blokuje vápníkové kanálky souvisící s uvolňováním neurotransmiterů.

Sloučeniny, které jsou antagonisty excitačních aminokyselinových neurotransmiterů, mají celou řadu použití. Antagonisté excitačních aminokyselinových neurotransmiterů nacházejí klinické použití při léčení takových stavů, jako jsou záchvaty, mrtvice, mozková ischemie, nervové degenerativní poruchy, jako je Alzheimerova choroba a epilepsie, a jako psychoterapeutika, viz. publikace: Excitatory Amino Acids in Health and Disease, D. Lodge, Ed., John Wiley and Sons Ltd., New York, NY 1988. Tyto sloučeniny jsou dále užitečné při studiu fyziologie buněk, například nervových buněk a při hubení bezobratlých škůdců a hmyzu.

Sloučeniny, které působí jako antagonisté vápníku, mají celou řadu použití. Například mohou antagonisté vápníku nelézat klinické využití při léčení angíny, hypertenze, kardiomyopathie, supraventrikulámí arytmie, ezofageální achalasie, předčasný začátek porodu, Raynaudovy choroby a dalších nemocí, viz. W.G.Nayler, Calcium Antagonists, Academie Press, Harcourt Brace Javanovich Publisher, New York, NY 1988, které zde slouží jako odkazový materiál. Kromě toho jsou tyto sloučeniny vhodné pro studium fyziologických procesů v buňkách, například v nervových a svalových buňkách a pro hubení bezobratlého hmyzu.

Podstata vynálezu

Podstatu předmětného vynálezu představují čištěné polyaminové sloučeniny vybrané ze skupiny zahrnující sloučeniny I až V:

-1 CZ 283830 B6

a sloučeninu (VI), která má následující identifikační charakteristiky:

(a) je přítomna ve frakci ze surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . lO^cm, velikost částic v koloně 10 pm, za použití průtokového množství 15 milimetrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, 95 % -> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1% ίο vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 22,75 minuty;

(b) je přítomna ve frakci z frakce uvedené v (a), která se eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . lO^cm, velikost částic v koloně 10 pm, za použití průtokového množství 15 milimetrů za minutu a rozpouštědlového systému s lineárním 15 gradientovým programem 0 %-> 0 % B, 100%->100% A v průběhu 0 až 5 minut, potom

0%->10%B, 100 % -> 90 % A v průběhu 5 až 20 minut, což je Watersova křivka 1, potom 10%->20%B, 90%->80% A v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20 % -> 50 % B, 80 % -> 50 % v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivky 11, kde A je 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 21,5 minuty; a (c) FAB MS: vysoká rozlišovací schopnost: 505,3861, a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin.

Podstata postupu přípravy čištěných polyaminových sloučenin a farmaceuticky přijatelných solí 25 odvozených od těchto sloučenin spočívá podle předmětného vynálezu v tom, že:

-2CZ 283830 B6 (a) v případě přípravy sloučeniny vzorce V:

se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^ cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočného množství 15 milimetrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 10 % acetonitril, 95 % -> 90 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a při detekci monochromatického píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 12,5 minuty se jímá a případně se tato frakce lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje z vody, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XXVIH:

OH uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k prováděné reakci, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom se sloučeninou obecného vzorce X:

(X), v rozpouštědle, které je inertní k průběhu prováděné reakce, přičemž takto získaný produkt potom reaguje pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyl-oxaziridinem, přičemž potom následuje reakce s kyanoborohydridem a vzniklý produkt potom reaguje pod inertní atmosférou s trifluoroctovou kyselinou;

(b) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce IV

(IV), potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10^-6 cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % —> 70 % acetonitril, 80 % -> 30 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 21 minutě se jímá a potom se nanese na kolonu C-4 Vydac, o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10'⁶ cm, velikost částic 5 pm, a potom se eluce provádí za použití průtokového množství 4,0 mililitry/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0 % -> 10 % acetonitril, 100 % -> 90 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové při monochromatické detekci píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce která se eluuje při asi 7 minutě se jímá a potom se případně tato frakce lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofllizuje, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XXXI:

(XXXI), uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k průběhu prováděné reakce, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom se sloučeninou obecného vzorce X:

(X), takto získaný produkt se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s 2-(sulfonyifenyl)-3fenyl-oxaziridinem, přičemž potom následuje reakce s kyanoborohydridem a takto získaný produkt potom reaguje pod inertní atmosférou s kyselinou trifluoroctovou;

(c) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce III:

-4CZ 283830 B6 r^₂

(ΠΙ), potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.1CT⁶ cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočné rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientem 5 %^·20% acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 %-> 70 % acetonitril, 80%->30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 minut až 55 minut a při monochromatické detekci píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 21 minutě se jímá a potom se vloží na kolonu C-4 Vydac, o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10“⁶ cm, velikost částic 5 pm, a potom se eluování provádí při průtokovém množství 4,0 mililitrů/minutu za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0%->10% acetonitril, 100%->90% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a při monochromatické detekci v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 9 minutách se jímá a potom se případně tato frakce lyofilizuje, potom se opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XXII:

BOC (ΧΧΠ), uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k prováděné reakci, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom reakce se sloučeninou obecného vzorce XXXVIII:

BOC

(XXXVDI), a takto získaný produkt se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylefenyl)-3fenyl-oxaziridinem, načež následuje reakci s kyanoborohydridem a takto získaný produkt se potom uvádí do reakce buďto s trifluoroctovou kyselinou pod inertní atmosférou, nebo se pod inertní atmosférou rozpustí v nasyceným roztoku dioxanu a kyseliny chlorovodíkové, oddělí se a přidá se do vodného roztoku pod inertní atmosférou;

-5CZ 283830 B6 (d) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce Π:

(Π), potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . lO^cm, velikost částic 10 μτη, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu, a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, 80 % -> 30 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku v rozmezí 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22,75 minuty se jímá a potom vloží na kolonu C—4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10“⁶ cm, velikost částic 10 gm, a eluování se nyní provádí při průtokovém množství 15 mililitrů/minutu a za použití rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 0 % -> 0 % acetonitril, 100 % -> 100 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 5 minut, potom 0 % -> 10 % acetonitril, 100 % -> 90 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 5 až 20 minut, Watersova křivka 1, potom 10% ->20% acetonitril, 90 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20%->50% acetonitril, 80%->50% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivka 11, a při monochromatické detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 18,5 minutě se jímá a potom se případně tato reakce lyofllizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofllizuje, nebo v alternativním provedení se sloučenina obecného vzorce XXII:

BOC (ΧΧΠ), uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem prováděné reakci, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom následuje reakce se sloučeninou obecného vzorce X:

-6CZ 283830 B6 (X),

BOC

N-BOC H přičemž takto získaný produkt se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyl-oxaziridinem, přičemž potom následuje reakce s kyanoborohydridem a takto získaný produkt se potom uvádí buďto do reakce s kyselinou trifluoroctovou pod inertní atmosférou, nebo se pod inertní atmosférou rozpustí v nasyceném roztoku dioxanu v kyselině chlorovodíkové, potom se produkt oddělí a přidá do vodného roztoku pod inertní atmosférou, (e) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce I:

HO

(I), potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . lO^cm, velikost částic 10 pm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % —> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, 80 % -> 30 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 27,5 minutě se jímá a potom se případně uvedená frakce lyofilizuje, nebo se v alternativním provedení celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na uvedené koloně za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0 % -> 20 % acetonitril, 100%->80% 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny a při detekci píku při 220 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 26,0 minutě se jímá a potom se vloží do kolony Dynamax Phenyl, rozměry 4,6 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 6.10'⁷cm, velikost částic 8 gm, přičemž eluování se provádí za průtočného množství 1 mililitr/minutu a isokratických podmínek za použití 10% acetonitrilu a 90% 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a při detekci píku 220 nm, přičemž frakce, které eluuje při asi 55,27 minutě se jímá a potom případně lyofilizuje, suspenduje ve vodě a lyofilizuje nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XIII:

BOC (ΧΙΠ),

-7CZ 283830 B6 uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k prováděné reakci, pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, potom dicyklohexylkarbodiimidem a potom se sloučeninou obecného vzorce X:

(X), přičemž takto získaný produkt v acetonu se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s kyselinou 3-chlorperoxybenzeovou, produkt se oddělí a potom se uvádí do reakce s kyanoborohydridem v přítomnosti kyseliny octové a potom se takto získaný produkt uvádí do reakce s trifluoroctovou kyselinou pod inertní atmosférou;

(f) v případě, že se připravuje sloučenina VI, která má následující identifikační charakteristiky:

(a) je přítomna ve frakci ze surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3. 10 ⁶ cm, velikost částic 10 pm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, 95 % —> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 22,75 minuty;

(b) je přítomna ve frakci z frakce, která je popisována v (a) viz výše, která se eluuje na koloně

C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . 10^-6 cm, velikost částic 10 pm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 0 % -> 0 % B, 100%->100% A v průběhu 0 až 5 minut, potom 0 % -> 10 % B, 100 % —> 90 % A v průběhu 5 až 20 minut, Watersova křivka 1, potom 10 % 20 % B, 90 % -> 80 % A v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20 % -> 50 % B, 80 % -> 50 % A v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivka 11, kde A je 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 21,5 minuty, a (c) FAB MS: vysoká rozlišovací schopnost: 505,3861, potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.1 θ’⁶ cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu, a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20%->70% acetonitril, 80%->30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22,75 minuty se jímá a potom se nanese na kolonu C-4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3 . ÍO⁶ cm, velikost částic 10 pm, přičemž eluování se provádí za průtokového množství 15 mililitrů/minutu s rozpouštědlovým systémem s nelineárním gradientovým programem 0 % -> 0 % acetonitril, 100 % —> 100 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 5 minut, potom 0%—> 10% acetonitril, 100 % —> 90 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 5 až 20 minut, Watersova křivka 1, potom 10 % -> 20 % acetonitril, 90 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20 % -> 50 % acetonitril, 80 % -> 50 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 40 minut, Watersova

-8CZ 283830 B6 křivka 11, a při monochromatické detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 21,5 minuty se jímá a potom se popřípadě uvedená frakce lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje, a potom se popřípadě převedou uvedené sloučeniny na farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin metodami běžně známými.

Obecně je vynález zaměřen na určité polyaminy a polypeptidy, vyskytující se vjedu pavouka Agelenopsis aperta. Tyto polyaminy a jejich farmaceuticky přijatelné soli antagonizují excitační aminokyselinové neurotransmitery, které působí na buňky, včetně nervových buněk, řady různých organizmů, včetně bezobratlých a obratlovců. Dále uvedené polypeptidy a jeden z výše uvedených polyaminů a jejich farmaceuticky přijatelné soli blokují vápníkové kanálky v buňkách, včetně nervových a svalových buněk různých organismů, včetně bezobratlých a obratlovců. Vynález je rovněž zaměřen na použití těchto polyaminů a jejich solí pro antagonistické působení na excitační aminokyselinové neurotransmiteiy, přičemž tyto aminokyselinové neurotransmitery působí na buňky nervového systému organismu, pro léčení chorob a stavů zprostředkovaných excitačními aminokyselinovými neurotransmitery u savců a k hubení bezobratlého hmyzu a škůdců. Vynález je rovněž zaměřen na prostředky obsahující uvedené polyaminy a jejich soli. Dále je vynález zaměřen na použití dále uvedených polypeptidů a jednoho z uvedených polyaminů a jejich solí k blokování vápníkových kanálků v buňkách nervového a svalového systému organismu pro léčení chorob a stavů zprostředkovaných vápníkovými kanálky u savců a při hubení bezobratlých škůdců a hmyzu a prostředků obsahujících uvedené polypeptidy, polyamin a jejich soli.

Jak již bylo uvedeno je vynález zaměřen na určité polyaminy a polypeptidy, přítomné vjedu pavouka Agelenopsis aperta. Polyaminy a frakce ve kterých jsou přítomny podle vynálezu jsou tyto:

Frakce A’ (AGEL 452):

HO

Frakce A_t (AGEL 468):

OH O I II

OH

-9CZ 283830 B6

Frakce A₂ (AGEL 448):

Frakce B₂ (AGEL 504):

FAB MS: vysoké rozlišení: 505,3861 vypočteno pro C^HteNgOí.

Frakce E (AGEL 489):

Polypeptidy a frakce ve kterých jsou tyto látky přítomny, jsou tyto:

Frakce G:

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-alagly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cysglu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-;

molekulová hmotnost celého peptidu podle FAB MS: 7267.

Frakce H₂:

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyrgly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cysglu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leuasp-trp-;

molekulová hmotnost celého peptidu podle zjištěná metodou Ion-Spray MS: 7793.

-10CZ 283830 B6

Frakce I:

H₂N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cys-asp-glytyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH₂;

FAB MS: 4158.

Frakce J:

H₂N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cyspro-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ilecys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONH₂;

molekulová hmotnost celého peptidu metodou FAB MS: 5506.

Frakce Lp

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-vaI-ser-ile-gln-gln-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-;

přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 20 000.

Frakce L₂:

Frakce získaná subfrakcionováním celé frakce L.

Frakce M:

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-;

přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 80 000.

Tyto polyaminy podle předmětného vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli antagonizují excitační aminokyselinové neurotransmitery, přičemž tyto neurotransmitery působí na buňky. To znamená, že uvedené polyaminy jsou sami o sobě vhodné k antagonizování neurotransmiterů. Tyto polyaminy jsou rovněž vhodné k hubení bezobratlých škůdců a hmyzu a k léčení chorob a stavů u savců zprostředkovaných excitačními aminokyselinovými neurotransmitery. Uvedené polyaminy jsou také vhodné jako psychoterapeuticky účinné látky pro savce.

Polyamin B_b uvedený výše, a výše specifikované polypeptidy blokují vápníkové kanálky v buňkách. To znamená, že uvedený polyamin B_t a polypeptidy jsou vhodné k blokování vápníkových kanálků v buňkách. Polyamin Bi a uvedené polypeptidy jsou dále vhodné k hubení bezobratlých škůdců a hmyzu a k léčení chorob a stavů u savců zprostředkovaných funkcí vápníkového kanálku v buňkách.

Jed pavouka Agelenopsis aperta se získává o sobě známým způsobem běžně známým a používaným z dosavadního stavu techniky vylučováním elektrickou stimulací. Je vhodné, aby se při použitém postupu získávání jedu zabránilo kontaminaci jedu obsahem žaludku nebo hemolymfou. Takové způsoby jsou odborníkům z dosavadního stavu techniky dobře známé. Získaný jed se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě přibližně -78 °C. Následně se před použitím jed vyčistí postupem, popsaným v dalším popisu.

-11CZ 283830 B6

Čištění jedu se provádí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s reverzní fází na různých preparativních nebo semipreparativních kolonách, jako jsou kolony C-4 a C-18 Vydac (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Wobum Massachusetts 01801). Stanovení píku se provádí monochromaticky při 220 až 230 nm. Další analýza frakcí se může provádět například pomocí polychromomatických hodnot UV, stanovených diodovým detektorem Waters 990 (Millipore Corporation, Waters Chromotography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts, 01757). Jednotlivé frakce ze sloupců se jímají známými postupy, například za pomoci frakčního kolektoru ISCO „FOXY“ a píkového detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Frakce se jímají do nádoby o vhodném objemu, například do nádob ze sterilního polyethylenu. Zahuštění frakcí se následně provádí lyofilizací eluovaného podílu, přičemž potom následuje lyofilizace z vody. Čistota výsledných frakcí se stanoví chromatografickou analýzou na analytické koloně s gradientovým systémem, který je isokratičtější než systém, používaný k finálnímu čištění frakcí.

Struktury odpovídajících frakcí se stanoví známými analytickými postupy, například hmotnostní spektrometrií a nukleární magnetickou resonancí. Polypeptidy podle vynálezu se sekvenují běžnými postupy známými z dosavadního stavu techniky. Například S-pyridyl-ethylace cystinového zbytku polypeptidu může probíhat v roztoku, načež se provede sekvenování aminokyselin polypeptidu. Příkladem takové S-pyridylethylace může být tento postup. Asi 1 až 10 pg polypeptidu se rozpustí nebo zředí v až 50 μΐ pufru, který se připraví smíšením 1 dílu 1M TrisHCl, pH 8,5, obsahující 4 mM EDTA a 3 dílů 8 M guanidin.HCI. Následně se přidá 2,5 μΐ 10% vodného roztoku 2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti ve tmě a pod argonem dvě hodiny. Po inkubaci se přidají 2 μΐ 4-vinylpyridinu (čerstvé látky, uchovávané pod argonem při teplotě -20 °C), a směs se inkubuje další dvě hodiny při teplotě místnosti ve tmě a pod atmosférou argonu. Následně se směs odsolí, výhodně chromatografickým zpracováním na krátkém koloně s reverzní fází. Regenerovaný alkylovaný polypeptid se potom sekvenuje o sobě známým způsobem.

Při provádění postupu podle vynálezu výše popsaným obecným způsobem se zjistilo, že vhodnou náplní kolony pro počáteční frakcionování jedu je náplň kolony C-18 Vydac 22 mm x 250 mm, o velikosti pórů 30 nm (300 Á) a o velikosti částic 10 pm. Tato kolona se eluuje rychlostí vymývání 15 mililitrů/minutu při použití lineárního gradientového programu 95%->80% A, 5 % -> 20 % B [0 -> minut] a dále 80 % 30 % A, 20 % -> 70 % B [0 -> minut] kde A je

0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové (TFA) a B je acetonitril. Tyto frakce byly shromážděny postupem uvedeným výše. Tímto způsobem bylo získáno 10 frakcí označených A, Β, E, G, Η, I, J, K, L a M, které byly vybrány pro další analýzu a/nebo vyčištění. Kromě toho bylo zjištěno, že fřakcionace celého podílu jedu při použití kolony C-18 Vydac 22 mm x 250 mm o velikosti pórů 30 nm (300 Á) a velikosti částic 10 pm, při eluování rychlostí 15 mililitrů/minutu a při použití lineárního gradientového programu:

% -> 10 % B, 95 % —> 90 % A [0 -> 30 minut], A a B mají výše uvedený význam, poskytla mimo jiné frakci označovanou v tomto popisu A’. Vymývací doby frakcí jsou uvedeny v příkladech 1 a 2.

Frakce A, B, G, H, I/J a L byly potom podrobeny čištění za použití různých kolon s různým gradientovým programem. Podrobné údaje pro každou subfrakcionaci a získané výsledky jsou uvedeny v příkladech 3,4, 6, 7, 8 a 10,

Jak je uvedeno v následujících příkladech, frakce A’, A_b A₂, Bi, B₂ a E obsahují polyaminové sloučeniny. Tyto sloučeniny a frakce ve kterých jsou obsaženy, jsou charakterizovány následujícím způsobem:

-12CZ 283830 B6

Frakce A] (AGEL 468):

nh₂

Frakce A₂ (AGEL 448):

(IV),

(ΠΙ),

Frakce B, (AGEL 505):

Frakce B₂ (AGEL 504):

(Π),

FAB MS: s vysokou rozlišovací schopností: 505,3861 vypočteno pro C^FLgNeOj.

Frakce E /AGEL 489/:

-13CZ 283830 B6

(I), Jak je uvedeno v následujících příkladech, frakce G, H₂, I, J, Li, L₂ a M obsahují polypeptidy. Tyto polypeptidy a frakce ve kterých se vyskytují, jsou charakterizovány následujícím způsobem:

Frakce G:

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-gly-asn-glu—ser-asp-cys-lys-cys-alagly-gln-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-glu-gly-pro-cys-thr-cysglu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-;

molekulová hmotnost celého peptidu podle FAB MS: 7267.

Frakce H₂: Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

Frakce I:

FAB MS: 4158.

Frakce J:

H₂N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cyspro-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-ilecy s-ser-gly-arg-ly s-tyr-CONH₂;

molekulová hmotnost celého peptidu metodou FAB MAS: 5506.

Frakce L_t: Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lysasn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-;

-14CZ 283830 B6 přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 20 000.

Frakce L₂:

Polypeptid získaný subfrakcionací celé frakce L.

Frakce M:

Aminokyselinová sekvence s koncovou aminoskupinou obsahuje:

H₂N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-;

přibližná molekulová hmotnost celého polypeptidu je asi 80 000.

Podle předmětného vynálezu, na základě výše uvedeného popisu a analyzovaných sloučenin přítomných ve frakcích jedu pavouka Agelenopsis aperta, je nyní možné získat tyto sloučeniny rovněž jinými postupy než izolací/vyčištěním ze surového jedu. Všechny takové postupy náleží do rozsahu předmětného vynálezu. Například polyaminy, obsažené ve frakcích A, A_t, A₂, B_b B₂a E, je možno připravit přímo syntetickými postupy. Polypeptidy, obsažené ve frakcích G, H₂,1, J, Li, L₂ a M a u kterých je popsána celá sekvence aminokyselin, mohou být připraveny synteticky in vitro o sobě známými postupy. Tyto polypeptidy mohou být připraveny například v peptidovém syntetizátoru na pevné fázi ABI 430A (Applied Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, Califomia 94404) při použití standardního postupu podle Merrifiela nebo jiných běžně známých postupů z dosavadního stavu techniky prováděných s pevnou fází. Polypeptidy je možno připravit rovněž pomocí rekombinantních DNA postupů klonováním kódovaných sekvencí pro polypeptidy nebo jejich části. Takové polypeptidy, u kterých je známa pouze část aminokyselinové sekvence, mohou být klonovány například hybridizačními sondami využívajícími informaci známé aminokyselinové sekvence. K. výrobě polypeptidů podle vynálezu je možno použít kombinaci DNA postupů a syntézy proteinu in vitro.

Z dosavadního stavu techniky je známo, že určité aminokyselinové substituce je možno v polypeptidech provádět tak, aby neovlivňovaly, nebo v podstatě neovlivňovaly funkci těchto polypeptidů. Přesné provedení těchto substitucí se mění v závislosti na určitém polypeptidu. Určeni možnosti provedení takovýchto substitucí se provádí o sobě známými postupy.

V následujícím popisu je uvedeno schéma syntetického postupu přípravy určitých polyaminů podle předmětného vynálezu obecného vzorce:

ve kterém R značí vodík nebo skupinu OH. Jednotlivé stupně tohoto reakčního schématu jsou označeny písmeny A až D.

-15CZ 283830 B6

Reakční schéma A

H

(III) [BOC]₂O ▼

BOC

(IV)

-16CZ 283830 B6

Reakční schéma A - pokračování

-17CZ 283830 B6

Reakční schéma B

(XI)

BOC (XII)

BOC (XIII)

-18CZ 283830 B6

Reakční schéma C

OH

H

H C_x + ⁴ NH

E^

(XVIII) ch₃ ch₃

(XXII) (xxv

-19CZ 283830 B6

Reakční schéma D

X + XIII nebo XXII ------------>

BOC (R' = H(XIV), R* = OCH₂OCH₃(XXIII) ]

(XXIV')

-20CZ 283830 B6

Reakční schéma E

RHAKČNÍSCHERA F

{XXIX)

OCH^OCHj (XXXX)

(XXX)

-21CZ 283830 B6

Reakční schéma G xsvxri nebo XXXI

ΪΧΧΧΙΧ)

fxxxriij

(XXXV)

I

-22CZ 283830 B6

Reakční schéma G - pokračování

HO . (xxxrv) ^nebo (XXXV)

(xxxvr) nebo

fXXXVII!

-23CZ 283830 B6

Reakční schéma H ví

BOC > N-BOC

(XXXVIII) • xxii

XXXVIII

BOC (XXXIX)

(XX) l

(XXI) ΐ

(XX*)

-24CZ 283830 B6

Podle reakčního schématu A se sloučenina polyaminového meziproduktu vzorce X připraví řadou kroků, začínající diaminobutanem. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu tohoto meziproduktu vzorce X podle reakčního schématu A jsou uvedeny v částech A až I příkladu 6.

V reakčním schématu B je ilustrován postup přípravy meziproduktu vzorce ΧΙΠ. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu tohoto meziproduktu podle reakčního schématu B jsou uvedeny v příkladu 6, částech J až L. Postup přípravy meziproduktu vzorce XXI je uveden v reakčním schématu C. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu sloučeniny vzorce XXI podle reakčního schématu C jsou uvedeny v částech A až F příkladu 7. Postup přípravy polyaminových sloučenin podle vynálezu vzorců XVI a XXV jsou uvedeny v reakčním schématu D. Reakční podmínky, vhodné pro vzájemné adování meziproduktů vzorce X a XIII nebo X a XXI a pro následující postup přípravy sloučenin vzorce XVI a XXV jsou uvedeny v příkladu 6, části M až 0 a příkladu 7, části G až I.

V reakčních schématech E a F jsou ilustrovány postupy přípravy meziproduktů XXVIII a XXXI. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktu podle reakčního schématu E jsou uvedeny v částech A až C příkladu 8. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktu podle reakčního schématu F jsou uvedeny v příkladu 9, částech A až C. Postupy přípravy polyaminových sloučenin podle vynálezu vzorce XXXVI a XXXVH jsou uvedeny v reakčním schématu G. Reakční podmínky, vhodné pro vzájemné adování meziproduktů vzorce X a XXVIII nebo X a XXXI a následnou přípravu sloučenin vzorce XXXVI a XXXVII jsou uvedeny v příkladu 8, částech D až F a v příkladu 9, částech D až F.

V reakčním schématu H je ilustrován postup přípravy polyaminové sloučeniny podle vynálezu vzorce XLI. Reakční podmínky, vhodné pro přípravu meziproduktu vzorce XXXVIII, adování této sloučeniny na meziprodukt vzorce XXII a následná příprava polyaminové sloučeniny podle vynálezu vzorce XLI jsou uvedeny v příkladu 10.

Jak již bylo uvedeno uvedené polyaminy antagonizují vratným způsobem excitační aminokyselinové neurotransmitery, které působí na buňky, například na buňky nervového systému řady organismů, včetně bezobratlých a obratlovců. Termín obratlovci zahrnuje savce. Termín bezobratlí zahrnuje vdaném případě například hmyz, ektoparazity a endoparazity. Polyaminy výše uvedené frakce Bi rovněž vratným způsobem blokují vápníkové kanálky, přítomné v řadě buněk, například v buňkách nervového systému a ve svalech, včetně kardiovaskulárního systému bezobratlých a obratlovců.

Schopnost těchto polyaminů antagonizovat excitační aminokyselinové neurotransmitery je prokázána jejich schopností blokovat zvyšování obsahu cGMP vyvolané kyselinou N-methylD-asparagovou v malém mozku neonatálních krys podle následujícího postupu. Malé mozky 8 až 14 dní starých krys Wistar se rychle vyjmou a umístí při teplotě 4°C v pufru, tvořeném Krebsovým roztokem a hydrogenuhličitanem sodným o pH 7,4 a následně se rozřežou na segmenty 0,5 mm x 0,5 mm pomocí přístroje Mcllwain na řezání tkání (The Nickle Laboratory Engineering Co., Gomshall, Surrey, Anglie). Segmenty malého mozku se vloží do Krebs/hydrogenuhličitanového pufru při teplotě 37 °C. Pufr se kontinuálně udržuje v rovnováze směsí O2/CO2 v poměru 95 : 5. Segmenty malého mozku se popsaným způsobem inkubují po dobu devadesáti minut pri třech výměnách pufru. Závěrem se pufr dekantuje, tkáň se odstředí (1 minutu pri 3200 otáčkách za minutu), načež se tato tkáň opětně suspenduje ve 20 mililitrech Krebs/hydrogenuhličitanového pufru. Následně se alikvotní podíl 250 μΐ (přibližně 2 mg) vyjme a umístí do

1,5 mililitrových mikrozkumavek. Přidá se 10 μΐ testované sloučeniny ze zásobního roztoku a potom 10 μΐ 2,5 mM roztoku NMDA k zahájení reakce. Finální koncentrace NMDA je 100 μΜ. Do kontrolních směsí se nepřidává NMDA. Zkumavky se inkubují jednu minutu při teplotě 37 °C na protřepávané vodní lázni a následně se k ukončení reakce přidá 750 μΐ 50 mM roztoku Tris-Cl, 5 mM EDTA. Zkumavky se okamžitě ponoří na pět minut do vroucí vodní lázně. Obsahy každé zkumavky se následně zpracovávají ultrazvukem 15 sekund pomocí ultrazvukové

-25CZ 283830 B6 sondy nastavené na výkonový stupeň tři. Dále se odebere deset mikrolitrů a obsah proteinu se stanoví postupem podle Lowryho, viz. Anal. Biochem. 100:201-220 (1979). Zkumavky se potom podrobí odstřeďování (po dobu 5 minut při 10 000 x g), 100 μΙ supematantu se odstraní a obsah cyklického CMP (cGMP) se stanoví postupem podle testu New Englcmd Nuclear cGMP 7řZ4-test (Boston, Massachusetts). Získané údaje se uvedou v pmol cGMP, generované jedním mg proteinu.

Uvedené polypeptidy nevratně blokují vápníkové kanálky, přítomné v různých buňkách, například v buňkách nervového a svalového systému bezobratlých a obratlovců.

Schopnost polyaminu frakce Bi a polypeptidů frakcí G, Hi, H₂, I, J, K, L_b L₂ a M blokovat vápníkové kanálky, se stanoví následujícím postupem. Disociované krysí neokortikální neurony se suspendují v Krebsově hydrogenuhličitanovém pufru o pH 7,4, obsahujícím 2 mM CaCl₂ a 1 % bovinního sérového albuminu (BSA). Neurony se odstředěním usadí a potom se opětně suspendují ve stejném pufru, který dále obsahuje 1 μΜ fura2/AM (Sigma Chem. Co., P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178). Buňky se inkubují po dobu dalších 15 minut ve stejném pufru ale bez fura2/AM. Následně se buňky promyjí v uvedeném pufru, ale tentokrát s obsahem

1,5 mM CaCl₂ a udržují v rovnováze při teplotě místnosti ve formě koncentrované buněčné suspenze 5 až 10 minut. Do kyvety z křemenného skla se nalije 1,2 ml předehřátého (37 °C) pufru prostého BSA obsahujícího 1,5 mM CaCl₂ a 10 mM glukózy a potom 0,3 ml koncentrované buněčné suspenze, připravené výše uvedeným postupem. Tato kyveta se umístí do termostatované (37 °C) jednotky opatřené magnetickým míchadlem a fluorescence se změří fluorescenčním spektrofotometrem, například Perkin Elmer 650-40 (Perkin Elmer, Wilton, Connecticut 06897). Fluorescenční signál se ponechá stabilizovat po dobu asi jedné minuty. Následně se do kyvety přidají 1 až 4 μΐ zásobního roztoku testované sloučeniny v Krebsově hydrogenuhličitanovém pufru o vhodné koncentraci. Kalibrace fluorescenčních signálů a korekce rozptylu fura-2 se provedou postupem podle Nemetha a kol., viz. J. Biol. Chem. 262:5188 (1987). Po ukončení každého testu se stanoví maximální hodnota fluorescence (Fmax) přídavkem ionomycinu a minimální hodnota fluorescence (Fmin) se stanoví následným přídavkem 5 mM EGTA k chelataci vápníku. Při použití popsaného postupu se blokování vápníkového kanálku účinkem testované sloučeniny projeví snížením fluorescence po přídavku testované sloučeniny.

Uvedené polyaminy působí antagonicky na excitační aminokyselinové neurotransmitery. Proto jsou tyto polyaminy vhodné k hubení bezobratlého hmyzu a k léčení chorob a stavů zprostředkovávaných excitačními aminokyselinovými neurotransmitery u savců, jako je mrtvice, záchvaty, mozková ischemie, nervové degenerační poruchy, například Alzheimerova choroba a epilepsie. Uvedené polyaminy je možno rovněž použít jako vhodná psychoterapeutická činidla u savců. Uvedené polyaminy jsou rovněž vhodné ke studiu fyziologie buněk, například buněk nervového systému, čímž ovšem není tento výčet nijak omezován.

Polyaminy frakce Bi a výše uvedené polypeptidy jsou vhodné k blokování vápníkových kanálků u savců, jako je angína, hypertenze, kardiomyopathie, supraventrikulámí arytmie, ezofageální achalasie, předčasný porod a Raynaudova choroba. Kromě toho jsou tyto sloučeniny vhodné při studiu fyziologie buněk, včetně buněk nervového a svalového systému.

Do rozsahu předkládaného vynálezu náleží rovněž farmaceuticky přijatelné soli polyaminů podle předmětného vynálezu. Tyto soli se připravují o sobě známými postupy. Běžnými metodami známými z dosavadního stavu techniky mohou být například tímto způsobem připraveny adiční soli s kyselinami odvozené od polyamidů podle vynálezu a bázické soli odvozené od výše uvedených polypeptidů.

-26CZ 283830 B6

Tento polyamin podle vynálezu nebo výše uvedený polypeptid může být savcům podáván jako samotný nebo ve směsi s farmaceuticky přijatelnou nosičovou látkou nebo ředidlem ve formě farmaceutických prostředků běžně používaných pro daný účel. Tyto polyaminy a polypeptidy mohou být podávány perorálně nebo parenterálně, přičemž v případě polypeptidů je dávána přednost parenterálnímu způsobu podávání. Parenterální podávání zahrnuje intravenózní, intramuskulámí, intraperitoneální, subkutánní a topické podávání.

Při perorálním způsobu podávání uvedeného polyaminu nebo polypeptidů mohou být uvedené sloučeniny například obsaženy v tabletách nebo kapslích nebo ve vodných roztocích nebo suspenzích. V případě tablet pro perorální aplikaci se běžně používají nosiče, jako je například laktóza a kukuřičný škrob a maziva, jako je například stearát hořečnatý. Při perorální aplikaci v podobě kapslí jsou vhodnými ředidly laktóza a sušený kukuřičný škrob. Ve vodných suspenzích je účinná složka smíšena s emulgačním prostředkem nebo suspendačním činidlem. Do výsledného přípravku je možno přidávat v případě potřeby sladidla a/nebo příchutě.

Pro intramuskulámí, intraperitoneální, subkutánní a intravenózní použití se připraví sterilní roztoky účinné složky a pH roztoků se upraví pufřem. Pro intravenózní použití je nutno zajistit, aby byl roztok isotonický.

Při použití polyaminu podle vynálezu nebo výše uvedených polypeptidů nebo jejich solí v humánní medicíně určí denní dávku ošetřující lékař. Dávka se bude měnit v závislosti na věku, hmotnosti a individuální odezvě každého pacienta, stejně jako v závislosti na symptomech pacienta a účinnosti konkrétního přípravku.

Při použití polyaminů podle vynálezu nebo specifikovaných polypeptidů nebo jejich solí k hubení bezobratlého hmyzu se uvedená sloučenina aplikuje přímo na hmyz nebo se umístí v prostředí výskytu tohoto bezobratlého hmyzu. Například může být sloučenina podle vynálezu nastříkána na hmyz ve formě roztoku. Množství sloučeniny, nezbytné k hubení bezobratlého hmyzu se bude měnit v závislosti na konkrétním typu bezobratlého organismu a okolních podmínkách, přičemž toto aplikované množství musí být určeno osobou odpovídající za aplikaci této sloučeniny.

Při použití polyaminů podle předmětného vynálezu nebo výše specifikovaných polypeptidů nebo jejich solí ke studiu fyziologie buněk se uvedené sloučeniny aplikují na buňky o sobě známými postupy. Například mohou být uvedené sloučeniny aplikovány ve vhodném fyziologickém pufru. Vhodná koncentrace sloučenin podle vynálezu pro taková studia je 100 μΜ. Koncentrace těchto látek však může být vyšší nebo naopak mnohem nižší než uvedených 100 μΜ. Konkrétní množství použité sloučeniny se pro daný účel stanoví individuálně.

Příklady provedení vynálezu

Čištěné polyaminy a polyamidy podle předmětného vynálezu a postupy jejich přípravy budou v dalším blíže popsány a vysvětleny pomocí následujících příkladů provedení, které jsou ovšem pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předmětného vynálezu.

Příklad 1

Počáteční frakcionace surového jedu pavouka Agelenopsis aperta.

Surová jed pavouka Agelenopsis aperta, získaný od firmy Natural Product Sciences lne., Salt Lake City, Utah 84108 a uchovávaný ve zmrazeném stavu při teplotě asi -78 °C byl rozmražen a

-27CZ 283830 B6 podíly 10 až 60 μΐ tohoto jedu, zředěné na 200 μΐ, byly vloženy na kolonu C-18 Vydac (22 mm x 250 mm, velikost pórů 3.10 ⁶ cm a velikosti částic 10 pm), přičemž eluování bylo prováděno při průtočném množství 15 mililitrů/minutu a za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, 95 % -> 80 % A (v průběhu 5 0 —> 30 minut) a následně 20 % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A (v průběhu 30 -> 55 minut) kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B značí acetonitril. Stanovení píku bylo prováděno monochromaticky při 220 až 230 nm a frakce byly jímány ve sběrači frakcí ISCO/“FOXY“ a detektoru píku ISCO 2159. Frakce byly jímány 20 až 60 minut. V závislosti na detekci píku byly jímány následující frakce:

Frakce	Doba eluování
A	asi 21 minut
B	asi 22,75 minut
E	asi 27,5 minut
G	asi 38 minut
H	asi 39 minut
I	asi 40 minut
J	asi 40 minut
L	asi 43 minut
M	asi 48,3 minut

Příklad 2

Frakcionace surového jedu pavouka Agelenopsis aperta.

Celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta, získaný stejným způsobem jako v příkladu 1, byl vložen na kolonu C-18 Vydac stejného typu jako v příkladu 1, přičemž eluování bylo prováděno při průtočném množství 15 mililitrů/minutu a za použití rozpouštědlového systému s lineárním 30 gradientovým programem 5 % -> 10 % B, 95 % -> 90 % A (v průběhu 0 -> 30 minut) kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B značí acetonitril. Detekce píku a jímání frakcí bylo provedeno stejným způsobem jako v příkladu 1. Získána byla frakce A’, která byla eluována asi

12,5 minuty. Tato frakce A’ byla potom připravena pro spektrální analýzu, přičemž byla lyofilizována z eluentu, načež následovala lyofilizace z destilované vody, což bylo provedeno 35 standardními metodami.

Struktura této sloučeniny, která byla obsažena ve frakci A’, byla potom určena za použití metody hmotové spektroskopie s rychlými atomy FAB MS. Data takto získaná a odvozená struktura jsou následující:

A’:

FAB MA: M/Z 453 (M+l)

Struktura: N-(2-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl)-4-hydroxy-benzamid.

-28CZ 283830 B6

Příklad 3

Subfrakcionace frakce A a stanovení její struktury.

Frakce A, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C-4 Vydac (10 mm x 250 mm, velikost pórů 3.10⁶ cm a velikost částic 5 μιη) a eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 4,0 mililitry/minutu rozpouštědlovým systémem s lineárním gradientovým programem 0%—> 10 %B, 100%—>90%A [v intervalu 0—>30 minut], kde A značí 0,1% vodný roztok TFA a B značí acetonitril. Stanovení píku bylo provedeno při použití ío diodového detektoru Waters 990 a jímání frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1. Tímto způsobem byly získány dvě frakce, které vykazovaly následující charakteristiky:

Frakce Doba eluování

Ai asi 7 minut

A₂ asi 9 minut

Frakce Ai a A₂ byly následně upraveny pro spektrální analýzu, přičemž byly lyofilizovány z eluentu a potom z vody podle standardních metod.

Struktura sloučenin, obsažených ve frakcích Ai a A₂ byla následně určena pomocí FAB MS. Získané hodnoty jsou následující:

Αμ

FAB MS: M/Z 469 (M+l), vysoké rozlišení: 469,3863 vypočteno pro C₂₃H4₅N₆O s chybou 2,0 πιπιμ;

Struktura: N-(20-amino—4-hydroxy-4,8,l2,17-tetraazeikos-l-yl)-2,5-dihydroxy-benzamid;

OH

A₂:

FAB MS: M/Z 449 (M+l), 433, 376, 260, 203;

Struktura: N-( 16-amino-4-hydroxy-4,8,13-triazahexadec-l-yl)-4-hydroxy-l H-indol-3acetamid

Příklad 4

Subfrakcionace frakce B a stanovení její struktury.

Frakce B, získaná stejným způsobem jako v příkladu 1 byla vložena na kolonu C—4 Vydac (22 mm x 250 mm, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikosti částic 10 μιη), přičemž eluování bylo

-29CZ 283830 B6 prováděno za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu rozpouštědlovým systémem s nelineárním gradientovým programem 0%—>0%B, 100%—>100% A [v intervalu

0->5 minut], potom 0%->10%B, 100%->90% A [v intervalu 5-> 20 minut] (Watersova křivka 1), potom 10 %—>20%B, 90%->80% A [v intervalu 20—> 30 minut] (Watersova křivka 6), a potom 20 % -> 50 % B, 80 % -> 50 % A [v intervalu 30 -> 40 minut] (Watersova křivka 11), kde A znamená 0,1% vodný roztok TFA a B je acetonitril. Stanovení píku bylo provedeno při použití diodového detektoru Waters 990 a jímáni frakcí bylo prováděno stejným způsobem jako v příkladu 1. Tímto způsobem byly získány dvě frakce, které vykazovaly následující charakteristiky:

Frakce Doba eluování

Bi asi 18,5 minuty

B₂ asi 21,5 minuty

Tyto frakce byly následně upraveny pro spektrální analýzu, přičemž byly lyofilizovány z eluentu a potom z vody podle standardních metod.

Struktura sloučeniny, která byla obsažena ve frakci Bi byla určena pomocí metody FAB MS. Získané hodnoty jsou následující:

FAB MS: M/Z 506 (M+l): 489,461, 433, 378, 333, 260, 231, 215, 203, 155, 119 vysoká rozlišovací schopnost: 506,3810 vypočteno pro C₂₆H4₈N₇O3,

Struktura:N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl)-4-hydroxy-l H-indol-acetamid

Molekulová hmotnost sloučeniny, obsažené ve frakci B₂ byla stanovena pomocí metody FAB MS, přičemž byly získány následující výsledky:

FAB MS: vysoké rozlišení: 505,3861 vypočteno pro C₂₇H4gN₆O₃.

Příklad 5

Struktura sloučenina obsažené ve frakci E.

Frakce E, získaná postupem podle příkladu 1, byla upravena pro spektrální analýzu lyofilizací z eluentu a následně lyofilizací z vody, přičemž bylo použito standardních postupů. Struktura sloučeniny, obsažené ve frakci E byla stanovena pomocí metody FAB MS, ’Η-NMR a ¹³CNMR. Získané hodnoty a odvozená struktura jsou následující:

FAB MS: M/Z 490 (M+l), 472,433, 362, 333, 260, 215, 203, 177, 155, 119, vysoké rozlišení: 490,3860 vypočteno pro C₂6H4₈N₇O₂, s chybou 0,6 mmp

-30CZ 283830 B6 ‘H-NMR (500 MHz, d6-DMSO); 10,89 (s, 1H), 8,90-7,85 (m, 6H), 7,55 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,34 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 7,08 (dd, J=8,0 Hz, J=8,0 Hz, 1H), 6,98 (dd, J=8,0 Hz, J=8,0 Hz, 1H), 3,50 (s, 2H), 3,13 (m, 2H), 3,03-2,82 (m, 18H), 1,88 (m, 6H), 1,78 (m, 2H), 1,62 (m, 4H), ^,3C-NMR (125,76 MHz, d6-DMSO): 170,94, 136,10, 127,17, 123,75, 120,92, 118,67, 118,26, 111,33, 108,97, 57,39, 57,07, 46,12, 46,12, 44,06, 43,89, 43,89, 36,52, 36,22, 32,78, 26,71, 23,79, 23,06, 22,65, 22,65,22,45.

Struktura: N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl)-lH-indol-3-acetamid

Alternativně, a podle výhodného provedení, byl surový jed frakcionován stejným způsobem postupem jako je uvedeno v příkladu 1 stou výjimkou, že bylo použito rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0 % —> 20 % B, 100%->80% A [v intervalu 0 -> 30 minut] a s detekcí píku při 220 nm. Frakce, která byla eluována přibližně během 26,0 minut, byla vložena na kolonu Dynamax Fenyl (4,6 mm x 250 mm, s velikostí pórů 6.10⁷ cm a velikostí částic 8 gm) a eluování bylo prováděno za použití průtočného množství 1 ml/minutu a při isokratických podmínkách 10 % B, 90 % A, kde A a B mají stejný význam, jako v příkladu 1. Stanovení píku bylo provedeno pomocí diodového detektoru Waters 990 (lambda = 220 nm) a frakce byly jímány stejným způsobem jako v příkladu 1. Frakce, která byla eluována přibližně během 55,27 minuty byla lyofilizována zvymývacího roztoku a potom z vody, přičemž bylo použito běžných standardních postupů, čímž byla získána požadovaná sloučenina podle tohoto příkladu.

Příklad 6

N-(20-amino-4-hydroxy-A,8,12,17-tetraazeikos-l-yl)-l H-indol-3-acetamid.

Syntetický postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je obsažena ve frakci E popsané v příkladu 4, byl proveden následujícím způsobem.

Postup A:

H

(I)

-31CZ 283830 B6

V atmosféře dusíku bylo promícháváno 13,22 gramu (0,15 mol) diaminobutanu a 3,5 ml methanolu, přičemž potom bylo přidáno 9,94 mililitru (0,15 mol) akrylonitrilu prostřednictvím injekční stříkačky, což bylo prováděno po dobu dvou hodin a při chlazení na 0 až 5 °C. Asi po 18 hodinách byla takto získaná reakční směs podrobena chromatografickému zpracování na 5 600 gramech silikagelu za použití systému rozpouštědel CffCb/MeOH v poměru 3 : 1 (2 litry) a následně směsi CH₂Cl₂/MeOH s obsahem 5 objemových procent isopropylaminu (2 litry). Frakce obsahující adovaný produkt byly zkoncentrovány odpařením ve vakuu za vzniku viskózního oleje. NMR analýza potvrdila, že získaným produktem byl adiční produkt obecného vzorce I, uvedený dále:

Postup B:

H N·

BOC-NH

Tř H (III)

Pod atmosférou dusíku bylo přidáno 5,78 g (0,041 mol) sloučeniny vzorce I, připravené postu15 pem A, viz. výše, k 75 mililitrům CH₃CN a 11,48 g KF Celitu a reakční směs byla promíchána.

K takto promíchané směsi byl potom přidán roztok obsahující 9,75 g (0,041 mol) sloučeniny vzorce II, která byla připravena postupem uvedeným v části A, ve 25 mililitrech CH₃CN. Takto získaná reakční směs byla potom zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem, přičemž monitorování reakčního průběhu bylo provedeno metodou TLC (CH₂Cl₂/MeOH v poměru 3:1).

Po třech hodinách byla ponechána reakční směs ochladit a stát při teplotě místnosti. Následně byl Celit odfiltrován a filtrační koláč byl dobře promyt dichlormethanem. Filtrát byl zkoncentrován ve vakuu. Surový produkt, obsažený ve zkoncentrovaném filtrátu byl podroben chromatografickému zpracování na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito 2 litrů směsi CH₂CI₂/MeOH v poměru 3:1, potom 2 litrů směsi CH₂Cl₂/MeOH v poměru 3 : 1 obsahující

10 mililitrů isopropylaminu a následně 2 litrů směsi obsahující CH₂Cl₂/MeOH v poměru 3:1a obsahující 30 mililitrů isopropylaminu. Produkt, byl eluován z této kolony poté, co byla kolona nasycena isopropylaminem, ovšem tento produkt nebyl stále čistý. Všechny frakce obsahující produkt byly spojeny a zkoncentrovány. Silikagel byl připraven tak, že bylo 500 gramů silikagelu suspendováno v CH₂C1₂ a 125 mililitrech isopropylaminu a potom byl tento produkt použit jako náplň kolony, což bylo provedeno běžně známým způsobem. Surový produkt byl nanesen na kolonu pomocí dichlormethanu. Následně byla kolona eluovány 500 mililitry dichlormethanu a potom jedním litrem směsi CH₂Cl₂/MeOH v poměru 3:1. Frakce obsahující produkt byly spojeny a zahuštěny ve vakuu, čímž bylo získáno 1,5 gramu produktu vzorce ΠΙ. Další 2 gramy produktu vzorce ΠΙ byly eluovány z kolony jedním litrem CH₂Cl₂/MeOH v poměru 3:1a

30 mililitrů isopropylaminu.

-32CZ 283830 B6

Postup C:

III + [BOC] ₂O --------------—►

BOC

(IV)

Pod atmosférou dusíku byla potom promíchávána směs obsahující 3,5 gramu (11,8 mol) slouče5 niny vzorce III, která byla připravena podle postupu B, viz. výše, a 150 ml dichlormethanu, načež bylo přidáno 5,2 gramu (23,6 mol) di-t-butyldiuhličitanu. Takto získaná směs byla potom promíchávána po dobu přibližně 68 hodin při teplotě místnosti. V dalším postupu byla tato směs zkoncentrována ve vakuu a podrobena chromatografickému zpracování za použití 400 gramů silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexan/ethylacetát v poměru 60 : 40, ío a tímto způsobem bylo připraveno 5,62 gramu sloučeniny vzorce IV v podobě oleje.

Postup D:

BOC

(IV)

Pod atmosférou dusíku byly rozpuštěny 3,0 gramy sloučeniny vzorce IV, která byla připravena 15 postupem C, viz. výše, ve 30 mililitrech kyseliny octové ve 250-ti mililitrové Parrově baňce.

K roztoku byly potom přidány 3,0 gramy Pd(OH)₂/uhlíku a tato směs byla hydrogenována při tlaku 345 kPa vodíku po dobu dvou hodin. Následně byl katalyzátor odstraněn odfiltrováním a filtrační koláč byl dobře promyt kyselinou octovou. Takto získaný filtrát byl zkoncentrován, vložen do 75 mililitrů dichlormethanu, promyt dvakrát 75 mililitry IN NaOH a vysušen pomocí 20 uhličitanu draselného K.₂CO₃. Roztok byl zkoncentrován ve vakuu za vzniku 2,86 gramu produktu vzorce V, viz výše.

-33CZ 283830 B6

Postup E:

Pod atmosférou dusíku bylo rozpuštěno 2,86 gramu (5,7 mmol) sloučeniny vzorce V, která byla připravena postupem D, viz. výše, v 75 mililitrech methanolu. Za míchání bylo potom přidáno 0,41 mililitru (6,3 mmol) akrylonitrilu a takto získaná reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována, opětně koncentrována třikrát ze 30 mililitrů dichlormethanu a podrobena stripování rozpouštědla ve vakuu, přičemž tímto postupem bylo získáno 3,18 gramu sloučeniny vzorce VI v podobě oleje.

Postup F:

Pod atmosférou dusíku bylo smícháno 3,18 gramu (5,7 mmol) sloučeniny vzorce VI, připravené výše uvedeným postupem E, se 100 mililitry dichlormethanu a takto získaná reakční směs byla promíchávána až do rozpuštění. K takto získanému roztoku bylo potom přidáno 1,37 gramu (6,3 mmol) di-t-butyldiuhličitanu a takto získaná reakční směs byla promíchávána 90 minut při teplotě místnosti. Následně byla tato reakční směs zkoncentrována a podrobena chromatografickému zpracování na 300 gramech silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexan/ethylacetát v poměru 60 : 40. Frakce obsahující produkt byly spojeny, zkoncentrovány, extrahovány třemi podíly dichlormethanu po 20 mililitrech a rozpouštědlo bylo odstraněno stripováním ve vakuu, přičemž tímto způsobem bylo získáno 3,12 gramu produktu vzorce VII.

Postup G:

(VIII)

Postupem podle schématu D bylo rozpuštěno 3,12 gramu (4,76 mmol) sloučeniny vzorce VII, připravené postupem F ve 30 mililitrech kyseliny octové a tato reakční směs byla hydrogenována při tlaku vodíku 380 kPa po dobu 2 hodin v přítomnosti 3,0 gramů Pd(OH)ýuhlíku, přičemž tímto postupem bylo získáno 3,02 gramu produktu vzorce VIII v podobě oleje.

-34CZ 283830 B6

Postup H:

VIII + NC^xZx>

(IX)

Pod atmosférou dusíku byl rozpuštěn 1,0 gram (1,5 mmol) sloučeniny vzorce VIII, která byla připravena postupem podle postupu G, v 10 mililitrech methanolu. K. tomuto roztoku bylo potom přidáno 0,1 mililitrů (1,67 mmol) akrylonitrilu a takto získaná reakční směs byla promíchávána po dobu přes noc. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována, opětně rozředěna a koncentrována třikrát za pomoci 20 mililitrů dichlormethanu, přičemž použité rozpouštědlo bylo odstraněno stripováním ve vakuu a tímto postupem bylo připraveno 1,0 gramu produktu vzorce IX.

Postup I:

IX

Stejným způsobem jako je uvedeno v postupu D byl rozpuštěn 1,0 gram (1,4 mmol) sloučeniny vzorce IX, která byla připravena postupem H, ve 30 mililitrech kyseliny octové a takto získaný reakční směs byla potom hydrogenována po dobu 2,5 hodiny při tlaku vodíku 345 kPa za vzniku 0,85 gramu produktu vzorce X, viz výše.

Postup J:

Podle tohoto provedení byl připraven roztok, který obsahoval 6,78 gramu (20 mmol) tetrabutylamoniumhydrogensíranu a 75 mililitrech vody, načež bylo přidáno 3,36 gramu (40 mmol) hydrogenuhličitanu sodného NaHCO₃ a tato reakční směs byla ponechána napěnit. V dalším postupu bylo přidáno 3,5 gramu (20 mmol) kyseliny indoloctové, získaná reakční směs byla

-35CZ 283830 B6 promíchávána po dobu 5 minut a potom bylo přidáno s 75 mililitrů CHCfí. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu dalších 5 minut a dvě spodní vrstvy byly odděleny. Vodní vrstva byla vysolena síranem sodným Na₂SO₄ a extrahována trichlormethanem CHCI3. Všechny trichlormethanové extrakty byly spojeny a vysušeny za pomocí síranu sodného Na₂SO₄. Výsledný čirý jantarově zbarvený roztok byl zkoncentrován, zpracován třemi podíly acetonu po 75 mililitrech a nakonec byl tento podíl rozpuštěn v 75 mililitrech acetonu. Následně bylo přidáno 1,9 mililitru (22 mmol) allybromidu a tato reakční směs byla ponechána stát po dobu 30 minut. Takto získaná reakční směs byla zkoncentrována a zpracována chromatografíckou metodou na silikagelu, přičemž eluování bylo prováděno směsí hexan/ethylacetát v poměru 3:1, přičemž tímto způsobem bylo získáno 3,57 gramu produktu vzorce XI, viz výše, ve formě světle žlutého oleje.

Postup K:

XI

BOC (XII)

Podle tohoto postupu bylo postupem popsaným v publikaci: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:298 (1984) smícháno 2,15 gramu (10 mmol) sloučeniny vzorce XI, která byla připravena postupem podle postupu J, viz výše, s 20 mililitry acetonitrilu a k takto získané směsi bylo potom přidáno 2,61 gramu (12 mmol) di-t-butyldiuhličitanu. V dalším postupu bylo přidáno 0,122 g (1 mmol) 4-(N,N-dimethylamino)pyridinu a reakce byla ponechána probíhat po dobu 15 minut. V další fázi tohoto postupu byla tato reakční směs zředěna na objem 125 mililitrů ethylacetátem, promyta dvakrát zředěnou kyselinou chlorovodíkovou HC1, třemi podíly vody po 25 mililitrech, jednou solankou a potom byla usušena a zkoncentrována. Získaný produkt byl potom vyčištěn chromatografíckou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 14,5 : 1 za vzniku 2,87 gramu sloučeniny vzorce XII, viz výše, v podobě bezbarvého oleje.

Postup

XII

Podle tohoto postupu bylo ke 3,27 gramu (10,4 mmol) sloučeniny vzorce ΧΠ, která byla připravena postupem K, ve 20 mililitrech dichlormethanu přidáno 7,4 mililitru 2-ethylhexanoátu sodného v ethylacetátu (0,231 gramu/mililitr). V dalším postupu bylo přidáno 0,5 gramu (CeHí^P a 0,5 gramu [(C₆H₅)₃P]₄Pd a takto získaná reakční směs byla potom promíchávána po dobu 60 minut. Tato reakční směs byla potom zkoncentrována, vložena do 150 mililitrů ethylacetátu a promyta pěti podíly 25 mililitrů vody. Vodné extrakty byly potom spojeny a tento spojený podíl byl potom znovu extrahován jedním podílem 25 mililitrů ethylacetátu a jedním podílem 25 mililitru diethyletheru. K vodné vrstvě bylo potom přidáno 75 mililitrů čerstvého ethylacetátu a tato směs byla potom okyselena na hodnotu pH 3. Ethylacetátová vrstva byla

-36CZ 283830 B6 oddělena a vodná vrstva byla extrahována jedním podílem 50 mililitrů čerstvého ethylacetátu. Takto získané dva ethylacetátové extrakty byly spojeny a tento spojený podíl byl potom promyt dvěma podíly 20 mililitrů vody, potom jedním podílem 20 mililitrů solanky, vysušen, zkoncentrován a promyt třemi podíly 30 mililitrů hexanu, přičemž se během druhého promytí vytvořily krystaly. Tato reakční směs byla potom zředěna 75 mililitry hexanu. Podíly pevných látek byly zfiltrovány, dobře promyty hexanem a vysušeny na vzduchu, čímž bylo získáno 1,37 gramu bílé pevné látky.

NMR byla potvrzena struktura sloučeniny uvedené v záhlaví, tzn. sloučenina XHI.

Postup M:

XIII + X

BOC (XIV)

Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku smícháno 200 miligramů (0,73 mmol) sloučeniny vzorce ΧΠΙ s 25 mililitry dichlormethanu, 84 miligramy (0,73 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 150 miligramy (0,73 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu, načež se vytvořila téměř okamžitě sraženina. Takto získaná reakční směs byla potom promíchávána po dobu 3 hodin. V dalším postupu byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a k získanému filtrátu bylo potom přikapáváno 40 mililitrů roztoku sloučeniny vzorce X, připravené postupem podle příkladu 11, postupy A-I, v dichlormethanu. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 12 hodin a následně byla promyta 0,1 N roztokem hydroxidu sodného NaOH a usušena za pomoci uhličitanu draselného K.2CO3, potom zkoncentrována a zpracována chromatografickým postupem za účelem odstranění nečistot na 150 g silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi dichlormethanu a methanolu (0,5 litru) v poměru 9:1. a potom za použití směsi dichlormethanu, methanolu a isopropylaminu (2 litry) v poměru 9 : 1 : 0,1. Získaný produkt byl potom v následujícím postupu zkoncentrován, promyt dichlormethanem a opět zkoncentrován, čímž bylo získáno 400 miligramů sloučeniny vzorce XV, což bylo potvrzeno analýzou NMR 300 MHz.

Postup N:

XIV

BOC (XV)

I

BOC H

N-BOC

-37CZ 283830 B6

Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku smícháno 0,34 gramu (0,35 mmol) sloučeniny vzorce XIV, která byla připravena postupem podle výše uvedeného schématu, se 30 mililitry acetonu, tato směs byla promíchána až do vzniku roztoku a ochlazena na teplotu asi 0 °C za použití lázně ledu a acetonu. V dalším postupu bylo po dobu 8 až 10 minut přikapáváno 0,212 gramu (1,05 mmol) 85 % kyseliny 3-chlorperoxybenzoové ve 20 mililitrech acetonu. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu asi 30 minut a následně zředěna na objem 150 mililitrů diethyletherem a potom promyta dvěma podíly 10% roztoku uhličitanu draselného K.2CO3 o objemu 25 mililitrů, dvěma podíly vody po 25 mililitrech a potom opět dvěma podíly 10% roztoku uhličitanu draselného o objemu 25 mililitrů, načež byla vysušena uhličitanem draselným. Takto získaná reakční směs byla potom zkoncentrována, promyta dvěma podíly dichlormethanu po 30 mililitrech a zkoncentrována za použití vakua na stálou hmotnost 0,33 gramu. NMR analýza prokázala, že produkt byl směsí požadovaného produktu vzorce XV, výchozího materiálu a vedlejšího produktu. Tato směs obsahující produkt byla potom přidána ke 3 mililitrům kyseliny octové, načež bylo přidáno 20 miligramů NaCNBH₃. Tato směs byla potom promíchávána po dobu přes noc, načež byla kyselina octová odstraněna stripováním ve vakuu a tato směs byla rozpuštěna v 50 mililitrech dichlormethanu a promyta jedním podílem vodného pufru po 75 mililitrech o hodnotě pH 7. V případě potřeby byla hodnota pH upravena na hodnotu 7 přídavkem 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH, přičemž dichlormethanová vrstva byla oddělena a promyta jedním podílem vodného pufru po 50 mililitrech o hodnotě pH 7 a jedním podílem 25 mililitrů solanky, přičemž tento produkt byl potom vysušen za pomoci síranu sodného Na₂SO₄ a zkoncentrován za použití vakua až do získání konstantní hmotností 0,31 gramu. Takto získaný produkt byl potom zpracován chromatografíckou metodou za použití 100 gramů silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 95 : 5, a eluovány a jímány frakce o objemu 25 mililitrů. Vyčištěný produkt vzorce XV byl přítomen v jímaných frakcích 18-25. Tyto frakce byly spojeny, přičemž spojený podíl byl zkoncentrován, promyt dvěma podíly dichlormethanu po 25 mililitrech a zkoncentrován ve vakuu, čímž bylo získáno 68 miligramů bílého pěnového produktu, který byl uchováván při teplotě -80 °C. Frakce 26-40, které rovněž obsahovaly požadovaný produkt, obsahovaly také určité nečistoty. Frakce 26-40 byly spojeny, zkoncentrovány, promyty dichlormethanem a zkoncentrovány za použití vakua do konstantní hmotnosti 66 miligramů. Takto získaný produkt byl potom spojen s předchozím produktem (6 miligramů), který byl použit pro NMR analýzu, a se směsí, připravenou výše uvedeným postupem. Výsledná směs byla zpracována chromatografíckou metodou na 75 gramech silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 9 : 5 k eluování a zachycení frakcí o objemu 25 mililitrů. Vyčištěný produkt vzorce XV byl přítomen v frakcích 16-21. Tyto frakce byly spojeny, zkoncentrovány a promyty dvěma podíly dichlormethanu po 5 mililitrech a potom byl tento produkt znovu zkoncentrován ve vakuu do konstantní hmotnosti 46 miligramů. Takto získaný produkt byl potom uchováván při teplotě -80 °C.

Postup O:

(XVI)

-38CZ 283830 B6

Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku rozpuštěno 108 miligramů (0,109 mmol) sloučeniny vzorce XV, připravené výše uvedeným postupem, v 1,5 mililitru dichlormethanu. V dalším postupu byly přidány 2 mililitry kyseliny trifluoroctové a tato reakční směs byla promíchávána po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Takto získaná reakční směs byla potom zkoncentrována do formy filmu a dále bylo přidáno 15 mililitrů diethyletheru. Tento film byl potom převeden na pevnou látku a po 30 minutách míchání vznikl bílý prášek. Tento prášek byl potom zfíltrován, dobře promyt diethyletherem, vysušen pod atmosférou dusíku a následně odplyněn ve vakuu do konstantní hmotnosti 109 miligramů, čímž byla získána sloučenina uvedená v záhlaví tohoto příkladu.

Příklad 7

N-(20-amino-4-hydroxy—4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl)-4-hydroxy-1 H-indol-3-acetamidu.

Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, jejíž přítomnost byla předpokládána ve frakci Bi, viz postup podle příkladu 3, byl proveden podle následujícího reakčního schématu:

Postup A:

OH

H

(XVII)

Podle tohoto postupu byly pod dusíkovou atmosférou ve skleněné aparatuře, vysušené plamenem, smíchány 4,0 gramy (30 mmol) 4-hydroxyindolu s 25 mililitry Aldrichova bezvodého DMF a tato směs byla míchána za vzniku roztoku. Potom bylo přidáno 1,44 gramu (30 mmol) hydridu sodného NaH ve formě 50% disperze v oleji. Po ukončení pěnění bylo přidáno 2,5 mililitru chlormethylmethyletheru (Aldrich) a výsledný tmavo—zelený roztok byl promícháván po dobu přes noc. Potom byl tento roztok zředěn na objem 125 mililitrů ethylacetátem, promyt pěti podíly vody po 25 mililitrech a jedním podílem solanky o objemu 25 mililitrů, načež byl usušen síranem sodným Na₂SO₄ a zpracován chromatografickým postupem za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4: 1 jako elučního činidla. Frakce obsahující produkt byly spojeny a zkoncentrovány, čímž bylo získáno 2,70 gramu sloučeniny XVII ve formě oleje.

Postup B:

XVII + NH

H₃C^x

ch₃

CH₃ (XVIII)

Podle tohoto provedení bylo v 50 mililitrové, tříhrdlové nádobě s kulatým dnem, která byla vybavena mechanickým míchadlem, chlazeno 1,3 gramu vodného roztoku formaldehydu (37 %) a 2,28 gramu kyseliny octové. Potom bylo přidáno 3,23 mililitru chladného dimethylaminu (25% roztok ve vodě). K. tomuto výslednému ochlazenému roztoku bylo přidáno 2,7 gramu (15,2 mmol) sloučeniny vzorce XVII, přičemž bylo použito 1,5 až 2,0 mililitrů tetrahydrofuranu

-39CZ 283830 B6 jako rozpouštědla pro převedení požadované látky. Tato reakční směs byla potom zahřívána při teplotě místnosti a promíchávána po dobu přes noc. Potom bylo přidáno 40 mililitrů 10% roztoku hydroxidu sodného NaOH, čímž bylo dosaženo vzniku sraženiny. Po promíchání byla tato sraženina odfiltrována, promyta vodou a usušena na vzduchu, přičemž tímto postupem bylo získáno 3,26 gramu sloučeniny vzorce XVIII.

Postup C:

(XIX)

(XX)

Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku smícháno 4,62 gramu KCN s 10 mililitry vody a tato směs byla promíchávána za vzniku roztoku. Potom bylo přidáno 30 mililitrů ethanolu a 3,26 gramu (14 mmol) sloučeniny vzorce XVIII a tato reakční směs byla promíchávána a zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem po dobu asi 65 hodin. Získaná reakční směs byla potom ochlazena a zkoncentrována. Výsledná sraženina obsahující sloučeninu XX byla zfiltrována, promyta vodou a usušena na vzduchu. Vodná vrstva byla extrahována 4 podíly dichlormethanu po 15 mililitrech, přičemž byly uchovány organické extrakty. Vodná vrstva byla potom překryta 50 mililitry ethylacetátu a okyselena na pH 2. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, odplyněna probubláváním dusíkem touto ethylacetátovou vrstvou, potom sušena a zkoncentrována, čímž byla získána pevná látka, která byla triturována diisopropyletherem, a tímto způsobem bylo získáno 1,03 gramu sloučeniny XIX ve formě šedavé bílé pevné látky. Potom byly všechny extrakty ze základní vodné vrstvy spojeny a tento spojený podíl byl usušen, spojen s výše uvedeným filtrátem a zkoncentrován, čímž bylo získáno 0,4 gramu sloučeniny XX ve formě pevné látky.

Postup D:

XX XIX

Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku 1,6 gramu sloučeniny vzorce XX spojeno se 7,5 mililitru ethanolu, 30 mililitry vody a 1,3 gramu hydroxidu draselného. Tato směs byla potom zahřívána při teplotě varu pod zpětným chladičem a potom promíchávána po dobu přes noc. V další fázi byla potom tato reakční směs ochlazena, extrahována dvěma podíly ethylacetátu po 15 mililitrech, převrstvena čerstvým ethylacetátem a okyselena na hodnotu pH 2. Spojené ethylacetátové vrstvy byly usušeny a zkoncentrovány. Tímto způsobem byla získána pevná látka, která byla potom triturována IPE, čímž bylo získáno 1,1 gramu sloučeniny XIX.

-40CZ 283830 B6

Postup E:

XIX

BOC (XXI)

Podle tohoto provedení bylo v 10 mililitrech vody rozpuštěno 1,44 gramu (4,25 mmol) TBAHSO4. Potom bylo přidáno 714 miligramů (8,5 mmol) hydrogenuhličitanu sodného NaHCOj. Poté co ustalo pěnění byl přidán k této reakční směsi 1,0 gram (4,25 mmol) sloučeniny XIX a tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu jedné minuty, načež bylo přidáno 40 mililitrů chloroformu. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu 5 minut, chloroformová vrstva byla oddělena a potom byla tato vodná směs extrahována jedním podílem chloroformu po 15 mililitrech. Chloroformové extrakty byly spojeny a tento spojený podíl byl usušen, zkoncentrován a zpracován dvěma podíly acetonu po 30 mililitrech. Potom byl takto získaný produkt opětně rozpuštěn ve 30 mililitrech acetonu, což bylo provedeno pod atmosférou dusíku, a potom bylo přidáno 0,37 mililitrů (4,25 mmol) allylbromidu a tato reakční směs byla zkoncentrována a zpracována chromatografíckým způsobem za použití ethylacetátu jako elučního činidla. Získaný produkt byl potom spojen s 25 mililitry dichlormethanu a potom bylo přidáno 0,98 gramu (4,5 mmol) di-t-butyldiuhličitanu a 51 miligramů (0,425 mmolu) 4-(N,Ndimethylamino)pyridinu. Tato reakční směs byla potom zkoncentrována a zpracována chromatografíckou metodou za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 9 : 1 jako elučního činidla, přičemž po zkoncentrování bylo získáno 1,33 gramu požadované sloučeniny vzorce XXI ve formě viskózního oleje.

Postup F:

XXI

BOC (XXII)

Podle tohoto postupu bylo ve 2 mililitrech methanolu rozpuštěno 64 miligramů (0,17 mmol) sloučeniny vzorce XXI. K. takto získanému roztoku bylo potom přidáno 1,7 mililitru 0,1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH a výsledná reakční směs byla promíchávána po dobu přes noc. Tato reakční směs byla potom okyselena, usušena, extrahována ethylacetátem a zkoncentrována. Analýzou metodou NMR bylo zjištěno, že veškerý allylester sloučeniny vzorce XXI vymizel, přičemž ovšem došlo do určité míry k transesterifikaci a určitý podíl methylesteru byl stále přítomen. Z tohoto důvodu byl tento produkt spojen se zbývajícím podílem sloučeniny vzorce XXI (přibližně 1,26 gramu), tento podíl byl rozpuštěn v 5 mililitrech tetrahydrofuranu a ochlazen na teplotu 0 °C. Potom bylo přidáno 3,8 mililitru 1 N roztoku hydroxidu sodného a tato reakční směs byla promíchávána po dobu 5 minut při teplotě 0 °C, načež byla ohřátá na teplotu místnosti. Po provedené reakci vznikly dvě fáze, přičemž k jejich eliminování bylo nutno přidat 5 mililitrů methanolu. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc. Potom byly tetrahydrofuran a methanol odstraněny stripováním a zbývající vodný roztok byl převrstven

-41CZ 283830 B6 mililitry ethylacetátu a okyselen na pH2. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, promyta jedním podílem 20 mililitrů vody, jednou solankou, a potom byl tento produkt usušen síranem sodným, zfíltrován a zkoncentrován na gumovitý produkt, který vykrystaloval po trituraci s hexanem, přičemž podle tohoto postupu bylo získáno 1,08 gramu bílé pevné látky. Tato pevná látka byla potom zpracována chromatograficky, kdy jako elučního činidla bylo použito směsi ethylacetátu a hexanu v poměru 70 : 30, načež frakce obsahující čistý produkt byly spojeny a tento spojený podíl byl zkoncentrován a vykrystalován ze směsi ethylacetátu a hexanu, a tímto shora uvedeným postupem bylo získáno 0,884 gramu sloučeniny vzorce ΧΧΠ.

Postup G:

(XXIII)

Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku rozpuštěno 271 miligramu (0,81 mmol) sloučeniny vzorce XXII za současného promíchávání ve 4 mililitrech bezvodého tetrahydrofuranu. Potom bylo přidáno 93 miligramů (0,81 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 167 miligramů (0,81 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a tato reakční směs byla potom promíchávána. Po asi jedné hodině a padesáti minutách bylo přidáno 0,58 gramu (0,8 mmol) sloučeniny vzorce X, která byla připravena postupem popsaným v příkladu 11, ve 30 mililitrech dichlormethanu a tato reakční směs byla potom promíchávána přes víkend. V dalším postupu byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a vzniklá směs byla extrahována dvěma podíly 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH po 3 mililitrech, potom byla sušena uhličitanem draselným K₂CO₃ a zkoncentrována. Získaný produkt byl potom zpracován chromatografickým postupem na 100 gramech silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 9 : 1 k vymytí všech složek kromě požadovaného produktu, načež byla provedena eluce směsí obsahující dichlormethan, methanol a isopropylamin v poměru 90 : 10: 1 za účelem eluování produktu. Frakce obsahující produkt byly potom zkoncentrovány, zpracovány několikrát dichlormethanem, přičemž rozpouštědlo bylo odstraněno stripováním, a tímto shora uvedeným postupem bylo získáno 349 miligramů sloučeniny vzorce XXIII ve formě bílé pěny.

V alternativním provedení, představujícím výhodné provedení, bylo 50 mililitrů roztoku obsahujícího 0,480 gramu (což je 1,43 mmol) sloučeniny vzorce XXII v dichlormethanu zpracováno 0,165 gramu (1,43 mmol) N-hydroxysukcinimidu, načež následovalo přidání 0,294 gramu (1,43 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a tato reakční směs byla potom ponechána míchat po dobu 5 hodin. Tato reakční směs byla zfiltrována a filtrát obsahující surový hydroxysukcinimid byl potom přidáván pomalu po kapkách během intervalu 20 minut do 100 mililitrů roztoku obsahujícího 1,03 gramu (1,43 mmol) sloučeniny vzorce X, která byla připravena postupem podle příkladu 11, v dichlormethanu. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 72 hodin. Potom byla tato surová reakční směs promyta dvakrát 20 mililitry 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH, načež byla usušena uhličitanem draselným K₂CO₃, zfiltrována a zkoncentro

-42CZ 283830 B6 vána. Získaný produkt byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 4:1a potom směsi dichlormethanu, methanolu a diisopropylaminu v poměru 9:1:1, čímž bylo získáno 912 miligramů sloučeniny vzorce ΧΧΙΠ.

Postup H:

XXIII

(XXIV)

Při provádění tohoto postupu byl pod atmosférou dusíku rozpuštěn indolacetamid vzorce ΧΧΙΠ (900 miligramů, 0,87 mmol) ve 40 mililitrech dichlormethanu. K. tomuto roztoku byl potom přidán 2-(fenylsulfonyI)-3-fenyloxaziridin (500 miligramů, což je 1,92 mmol). Reakční průběh byl monitorován chromatografickou metodou v tenké vrstvě. Po 1 hodině byla tato reakční směs zkoncentrována ve vakuu, přičemž tímto způsobem byl získán hlavně převažující nitron, který byl potom rozpuštěn ve 35 mililitrech kyseliny octové. K této reakční směsi byl přidán velký přebytek kyanoborohydridu sodného (1,00 gram, což je 15,9 mmol) a tato reakční směs byla promíchávána po dobu asi 2 hodin. Získaná reakční směs byla potom zkoncentrována ve, vakuu, potom byla vložena do dichlormethanu (50 mililitrů), promyta pufrem o pH 7 (jeden podíl po 50 mililitrech) a hodnota pH byla potom upravena na 7 za pomoci 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH. Organická vrstva byla potom promyta znovu pufrem o pH 7 (jeden podíl po 50 mililitrech), usušena uhličitanem draselným a zkoncentrována ve vakuu, čímž byl získán surový produkt, který byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, při které bylo jako elučního činidla použito směsi ethylacetátu a methanolu v poměru 95 : 5, a tímto shora uvedeným postupem bylo připraveno 612 gramů (výtěžek 67 %) sloučeniny XXIV ve formě bílé pěny.

Postup I:

XXIV ---------------------►

Při provádění alternativního postupu byly při udržování vakua a trojím promytí argonem odplyněny 3 mililitry kyseliny trifluoroctové. Potom byla použitá nádobka obalena hliníkovou fólií a přidáno bylo 98 miligramů sloučeniny vzorce XXIV za použití asi 2,5 mililitru dichlormethanu jako převáděcího činidla. Po 45 minutách byla tato reakční směs zkoncentrována, čímž byl

-43CZ 283830 B6 získán olejový produkt, ze kterého bylo po trituraci diethyletherem získáno 88 miligramů sloučeniny vzorce XXV ve formě bílé pevné látky, která byla uchovávána při teplotě -80 °C.

V alternativním provedení, které představovalo výhodné provedení, bylo k roztoku obsahujícím

100 mililitrů dioxanu nasyceného chlorovodíkem, který byl vyčištěn argonem, přidáno během intervalu 1,5 minuty 0,520 gramu (což představuje 0,495 mmolu) sloučeniny vzorce XXIV, která byla připravena metodou podle postupu H, viz výše, v 10 mililitrech dioxanu. Po tomto přídavku se okamžitě vytvořila sraženina a tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu 1 hodiny.

V dalším postupu byl přidán diethylether a po 5 minutách byl tento roztok zfiltrován. Tímto ίο způsobem byla získána pevná látka, která byla promyta diethyletherem, usušena pod atmosférou dusíku a potom za sníženého tlaku, čímž bylo získáno 345 miligramu kyseliny vzorce XXTV’, která byla uchovávána při teplotě -78 °C. V dalším postupu bylo k vodnému roztoku, který byl čištěn argonem, přidáno 150 miligramů (což je 0,205 mmolu) této kyseliny vzorce XXIV’. Reakční průběh byl monitorován metodou kapalinové chromatografie za vysokého tlaku HPLC. 15 Po dokončení reakce po asi 7 hodinách byla tato reakční směs sušena vymražením, přičemž tímto způsobem bylo získáno 103 miligramu sloučeniny vzorce XXV ve formě hydrochloridové soli.

Příklad 8

N-(20-amino-4-hydroxy—4,8,12,17-tetraazeikos-1 -yl)-4-hydroxy-benzamid.

Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je přítomna ve frakci A’ jak je uvedeno v příkladu 2, byl proveden následujícím způsobem.

Postup A:

OH

och₂ch=ch₂

Podle tohoto provedení bylo ve 400 mililitrové baňce spojeno 6,78 gramu (20 mmolů) hydrogensíranu tetrabutylamonného se 60 mililitry vody a tato směs byla promíchávána za vzniku roztoku. 30 Potom bylo přidáno 3,36 gramu (40 mmol) hydrogenuhličitanu sodného NaHCO₃ a jakmile to umožnilo pěnění bylo dále přidáno 40 mililitrů roztoku obsahujícího 2,76 gramu (20 mmolů) phydroxybenzoové kyseliny, 0,8 gramu hydroxidu sodného NaOH a 40 mililitrů vody. Takto získaná reakční směs byla potom promíchávána po dobu 5 minut a potom bylo přidáno 200 mililitrů dichlormethanu. Výsledná směs byla promíchávána po dobu dalších 5 minut, přičemž 35 vzniklé vrstvy byly ponechány oddělit. Vodná vrstva byla extrahována dvakrát 50 mililitry dichlormethanu. Spojený podíl dichlormethanových extraktů byl potom usušen síranem sodným Na₂SO₄, zkoncentrován a zpracován dvakrát 75 mililitry acetonu a tento podíl byl potom opět rozpuštěn v 50 mililitrech acetonu. Potom bylo přidáno 1,9 mililitru (22 mmolů) allylbromidu a tato směs byla promíchána. Získaná reakční směs byla zkoncentrována, vložena do 100 mililitrů 40 ethylacetátu, promyta dvakrát 30 mililitry vody, jednou 50 mililitry nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu, jednou 30 mililitry vody, jednou solankou, jednou vodou a jednou solankou. Výsledný produkt byl usušen a zkoncentrován za vzniku oleje. Tento olej byl potom triturován 50 mililitry petroletheru po dobu jedné hodiny. Potom byla tato reakční směs zfiltrována, dobře

-44CZ 283830 B6 promyta petroletherem a usušena na vzduchu, čímž bylo získáno 1,7 gramu sloučeniny vzorce XXVI, viz výše.

Postup B:

XXVI

och₂ch=ch₂

Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku 1,7 gramu (9,55 mmolu) sloučeniny vzorce XXVI, která byla připravena podle postupu A, viz výše, spojeno s 50 mililitry Aldrichova vysušeného DMF a tato směs byla promíchávána až do vzniku roztoku. Potom bylo přidáno 0,38 gramu (9,55 mmolu) hydridu sodného NaH ve formě 60% disperze v oleji a tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc. V dalším postupu bylo přidáno 0,76 mililitru chlormethylmethyletheru (Aldrich), přičemž po tomto přídavku se okamžitě vytvořila sraženina. Získaná reakční směs byla promíchávána po dobu 18 hodin. Potom byla tato reakční směs zpracována 200 mililitry ethylacetátu ve 100 mililitrech vody. Ethylacetátová vrstva byla oddělena, promyta třikrát 50 mililitry vody, jednou 50 mililitry 1 N roztoku hydroxidu sodného, jednou 50 mililitry vody a jednou solankou. Výsledný roztok byl usušen, zkoncentrován a zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4:1, přičemž tímto shora uvedeným postupem bylo získáno 1,63 gramu sloučeniny vzorce XXVII, viz výše.

Postup C:

XXVII

Při provádění tohoto postupu bylo v 75 mililitrech tetrahydrofuranu rozpuštěno 1,62 gramu (což je 7,3 mmolu) sloučeniny vzorce XXVII, která byla připravena metodou podle postupu B, viz výše. Potom byl k této směsi přidán roztok obsahující 0,4 gramu (10 mmolu) hydroxidu sodného NaOH v 15 mililitrech vody, což se projevilo ve vytvoření dvou vrstev. Potom byl přidáván methanol tak dlouho, dokud nebyla získána homogenní směs. Tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu přes noc. Tetrahydrofuran a methanol byly potom odstraněny stripováním ve vakuu a zbývající vodný roztok byl extrahován dvakrát 15 mililitry ethylacetátu. Potom byla vodná vrstva převrstvena 50 mililitry čerstvého ethylacetátu a okyselena na pH 2,5 pomocí 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, promyta jednou 10 mililitry vody a jednou 25 mililitry solanky. Získaný roztok byl zkoncentrován, čímž byl získán podíl pevných látek, který byl triturován hexanem, zfiltrován a usušen na vzduchu, přičemž tímto postupem bylo připraveno 1,2 gramu sloučeniny vzorce XXVIII, viz výše.

-45CZ 283830 B6

Postup D:

X + XXVIII —----------►

(XXXII)

Podle tohoto postupu bylo 20 mililitrů dichlormethanového roztoku, který obsahoval 0,127 gramu (0,7 mmolu) sloučeniny vzorce XXVHI, připravené postupem C, viz výše, zpracováváno 0,081 gramu (0,7 mmolu) N-hydroxysukcinimidu, načež následoval přídavek 0,144 gramu (0,7 mmolu) dicyklohexylkarbodiimidu a tato reakční směs byla promíchávána po dobu 4 hodin. Potom byla tato reakční směs zfiltrována a filtrát obsahující surový hydroxysukcinimid byl přidáván pomalu po kapkách během intervalu 20 minut do 80 mililitrů dichlormethanového roztoku obsahujícího 0,50 gramu (0,7 mmolu) sloučeniny vzorce X, připravené postupem pole shora uvedeného příkladu 11, postupy A-I. Tato reakční směs byla potom promíchána. Získaná reakční směs byla promyta 1 N roztokem hydroxidu sodného NaOH (dva podíly po 20 mililitrech), usušena za pomoci uhličitanu draselného, zfiltrována a zkoncentrována. Vzniklý koncentrát byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu za použití směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 9 : 1 jako elučního činidla, přičemž následovalo eluování směsi dichlormethanu, methanolu a diisopropylaminu v poměru 9:1: 0,25 a tímto postupem bylo připraveno 370 miligramu sloučeniny XXXII, viz výše.

Postup E:

XXXII ———-------------►

(XXXIV)

Při tomto postupu bylo pod atmosférou dusíku 0,335 gramu (0,38 mmol) sloučeniny vzorce XXXII, která byla připravena shora ilustrovaným postupem D, rozpuštěno ve 30 mililitrech dichlormethanu. K tomuto roztoku bylo potom přidáno 0,230 gramu (0,88 mmolu) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridinu. Po 0,5 hodině byla tato reakční směs zkoncentrována za použití vakua a získaný koncentrát byl rozpuštěn v 15 mililitrech kyseliny octové. Ktéto reakční směsi byl přidán velký přebytek kyanoborohydridu (0,100 gramu, což je 1,6 mmolu) a tato reakční směs byla potom promíchávána po dobu 2 hodin. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována ve vakuu, produkt byl vložen do 50 mililitrů dichlormethanu, promyt jednou 50 mililitry pufru o hodnotě pH 7, načež byla hodnota pH upravena na 7 za pomoci 1 N roztoku hydroxidu sodného NaOH. Organická vrstva byla promyta znovu 50 mililitry pufru o hodnotě

-46CZ 283830 B6 pH7, usušena uhličitanem draselným a zkoncentrována ve vakuu. Získaný koncentrát byl zpracován chromatografickou metodou na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi acetonu a hexanu v poměru 50: 50, a tímto způsobem bylo připraveno 253 miligramu sloučeniny vzorce XXXIV, viz výše.

Postup F:

(XXXIV)

(XXXVI)

Podle tohoto postupu bylo pod atmosférou dusíku při teplotě místnosti spojeno 0,20 gramu (0,223 mmolu) sloučeniny vzorce XXXIV, která byla připravena postupem E, viz výše, s 5 mililitry kyseliny trifluoroctové. Tato reakční směs byla promíchávána po dobu 1,5 hodiny. Ktéto reakční směsi byly přidány další 2 mililitry kyseliny trifluoroctové k omytí stěn této nádobky. Potom byla ponechána probíhat reakce po dobu 1,5 hodiny. V dalším postupu byla tato reakční směs zkoncentrována ve vakuu, triturována ethyletherem, zfiltrována a usušena pod atmosférou dusíku, přičemž tímto postupem bylo připraveno 218 miligramů sloučeniny vzorce XXXIV, což je sloučenina uvedená v záhlaví tohoto příkladu.

Příklad 9

N-(20-amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeikos-l-yl)-2,5-dihydroxy-benzamid.

Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je obsažena ve frakci Ai získané postupem podle příkladu 3, byl proveden následujícím způsobem.

Postup A:

(XXIX) och₂ch=ch₂

V tomto příkladu bylo použito stejného postupu jako v příkladu 12, postup A, přičemž se ovšem vycházelo ze 3,08 gramu (20 mmolů) 2,5-dihydroxybenzoové kyseliny a získány byly 3,0 gramy sloučeniny vzorce XXIX, viz výše.

-47CZ 283830 B6

XXIX

Postup B:

(XXX)

Podle tohoto postupu byly pod atmosférou dusíku spojeny 3,0 gramy (15,5 mmolu) sloučeniny vzorce XXIV s 50 mililitry Aldrichova suchého DMF a tato směs byla potom promíchávána tak dlouho, dokud nevznikl roztok. V dalším postupu bylo přidáno 1,24 gramu (31 mmolů) hydridu sodného NaH ve formě 60% disperze v oleji a tato směs byla promíchána. Po 3 hodinách bylo přidáno 2,5 mililitru (33 mmolů) chlormethylmethyletheru a tato reakční směs byla promíchávána po dobu 18 hodin. Získaná reakční směs byla potom přidána do 300 mililitrů ethylacetátu a 100 mililitrů vody. Vzniklá ethylacetátová vrstva byla potom oddělena a promyta třikrát 75 mililitry vody, dvakrát 75 mililitry 1 N roztokem hydroxidu sodného, dvakrát 50 mililitry vody a jednou solankou. Výsledný roztok byl potom usušen a zkoncentrován, čímž bylo získáno 2,9 gramu oleje, který byl zpracován chromatografickým postupem na silikagelu za použití směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4: 1 jako elučního činidla, čímž byly získány dvě frakce, přičemž druhá frakce obsahovala 1,16 gramu sloučeniny obecného vzorce XXX, viz výše.

Postup C:

(XXXI)

Podle tohoto postupu bylo do 10 mililitrů tetrahydrofuranu přidáno 1,16 gramu (což je 4,1 mmolu) sloučeniny vzorce XX, viz výše. Potom bylo přidáno 0,24 gramu (což je 6 mmolů) hydroxidu sodného NaOH v 10 mililitrech vody, přičemž po tomto přídavku vznikly dvě fáze. V dalším postupu byl do této reakční směsi přidáván methanol tak dlouho, dokud se nevytvořila jedna fáze, načež byla tato směs promíchávána po dobu 18 hodin. Použitá rozpouštědla byla potom odstraněna a zbývající vodný roztok byl extrahován dvakrát za pomoci 15 mililitrů ethylacetátu. Vodná vrstva byla potom převrstvena 35 mililitry čerstvého ethylacetátu a hodnota pH byla upravena na 2,5 přídavkem 6 N roztoku kyseliny chlorovodíkové. Ethylacetátová vrstva byla potom oddělena, promyta jednou 10 mililitry vody a jednou solankou, usušena a zkoncentrována, přičemž tímto shora uvedeným postupem byl připraven 1,0 gram sloučeniny vzorce XXXI, ve formě oleje.

-48CZ 283830 B6

Postup D:

X + XXXI ---------------->

(XXXIII)

V tomto provedení bylo využito stejného postupu jako v příkladu 13, postup D, přičemž bylo použito 0,17 gramu (0,7 mmolu) sloučeniny vzorce XXXI, která byla připravena postupem C uvedeným výše, 0,081 gramu (což je 0,7 mmolu) N-hydroxysukcinimidu, 0,144 gramu (0,7 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu a 0,50 gramu (0,7 mmol) sloučeniny vzorce X, která byla připravena postupem popsaným v příkladu 11, postupy A-I, přičemž tímto způsobem bylo po 10 chromatografíckém zpracování získáno 370 miligramů sloučeniny vzorce ΧΧΧΠΙ, viz výše.

Postup E:

XXXIII

(XXXV)

V tomto provedení bylo využito stejného postupu jako v příkladu 13, postup E, přičemž bylo 15 použito 0,308 gramu (0,33 mmol) sloučeniny vzorce XXXIII, která byla připravena postupem popsaným v postupu D, viz výše, a 0,250 gramu (0,96 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridinu a po chromatografíckém zpracování na silikagelu, při kterém bylo použito jako elučního činidla nejdříve ethylacetátu a potom směsi acetonu a hexanu v poměru 50 : 50, bylo získáno 210 miligramů sloučeniny vzorce XXXV, viz výše.

-49CZ 283830 B6

Postup F:

XXXV

(XXXVII)

Podle tohoto provedení bylo použito stejného postupu, který je popsán v příkladu 13, postup F, přičemž při tomto provedení bylo použito 0,100 gramu (0,104 mmol) sloučeniny vzorce XXXV, která byla připravena postupem E, viz výše, a tímto postupem bylo připraveno 108 miligramů sloučeniny vzorce XXXVII, což je požadovaná výsledná sloučenina uvedená v záhlaví tohoto příkladu.

Příklad 10

N-( 16-amino-4-hydroxy-4,8,13-triazahexadec-l-yl-4-hydroxy-l H-indol-3-acetamid.

Postup přípravy této sloučeniny uvedené v záhlaví, o které bylo předpokládáno, že je obsažena ve frakci A₂ získané postupem podle příkladu 3, byl proveden následujícím způsobem.

Postup A:

•VI

BOC i

•N-BOC > h₂

BOC (XXXVIII)

Při tomto postupu bylo použito stejného postupu jako v příkladu 11, postup D, přičemž se ovšem vycházelo ze 1,15 gramu (což je 2,07 mmolu) sloučeniny vzorce VI, která byla připravena postupem podle příkladu 11, viz postupy A-E, přičemž tímto způsobem bylo získáno 1,10 gramu surové sloučeniny vzorce XXXVIII, viz výše.

-50CZ 283830 B6

Postup B:
XXXVIII	+	XXII

BOC (XXXIX)

Podle tohoto provedení bylo použito alternativního provedení postupu podle příkladu 12, viz postup G, přičemž ale byl použit dichlormethanový roztok (15 mililitrů) obsahující 0,228 gramu (6,8 mmol) sloučeniny vzorce ΧΧΠ, která byla připravena postupem pole příkladu 12, viz postupy A až F, dále 0,380 gramu (6,8 mmol) sloučeniny vzorce XXXVIH, která byla připravena stejným způsobem jako v postupu A, viz výše, 0,078 gramu (6,8 mmol) N-hydroxysukcinimidu a 0,140 gramu (6,8 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu, a tímto shora uvedeným způsobem bylo po chromatografickém zpracování na silikagelu, při kterém bylo použito jako elučního činidla směsi dichlormethanu a methanolu v poměru 9:1a potom směsi dichlormethanu, methanolu a diisopropylaminu v poměru 9 : 1 : 0,5, připraveno 0,407 gramu sloučeniny vzorce XXXIX.

Postup C:

XXXIX

BOC (XL)

Podle tohoto provedení bylo použito stejného postupu jako v příkladu 12, viz postup H, přičemž se vycházelo ze 0,350 gramu (0,4 mmol) sloučeniny vzorce XXXIX a 0,230 gramu (0,88 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridinu a tímto postupem bylo po chromatografickém zpracování na silikagelu, při kterém bylo použito jako elučního činidla směsi acetonu a hexanu v poměru 50: 50, získáno 0,274 gramu sloučeniny vzorce XL, viz výše. Tento produkt obsahoval malé množství fenylsulfonamidu a z tohoto důvodu bylo nutno jej dále přečistit na silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi acetonu a hexanu v poměru 50 : 50.

-51CZ 283830 B6

Postup D:

XL

OH

H

OH (XLI)

Podle tohoto provedení bylo použito alternativního postupu jako je postup uvedený v příkladu 12, postup I, přičemž se vycházelo z 0,166 gramu (0,186 mmol) sloučeniny vzorce XL, která byla připravena postupem C, viz výše, a po zpracování směsi dioxan/HCl byla získána surová kyselina. Tato kyselina vzorce XL’ byla potom rozpuštěna ve vodě, přičemž toto rozpouštění trvalo 8 hodiny, načež byla sušena vymražováním, čímž bylo získáno 88 miligramů sloučeniny vzorce XLI.

Příprava A 'N-BOC H

Podle tohoto provedení bylo pod atmosférou dusíku smícháno 34,5 gramu (157,6 mmol) hydrobromidové soli 3-brompropylenaminu, tzn. 3-brompropylenamin.HBr, v 600 mililitrech N,Ndimethylformamidu. Do tohoto roztoku bylo potom přidáno 34,4 gramu (157,6 mmol) di—t— butyldiuhličitanu, načež následoval přídavek 32,3 mililitru (236 mmolů) triethylaminu. Tímto způsobem se okamžitě vytvořila sraženina. Tato reakční směs byla potom promíchávána přes noc. V dalším postupu byla tato reakční směs zředěna na objem 1,5 litru ethylacetátem, potom promyta jednou 500 mililitry 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové, třikrát 500 mililitry vody, jednou solankou a potom byla usušena za pomoci síranu sodného Na₂SO4. Po zkoncentrování byl získaný produkt zpracován chromatografickou metodou na 800 gramech silikagelu, přičemž jako elučního činidla bylo použito směsi hexanu a ethylacetátu v poměru 4:1, a frakce byly monitorovány chromatografickou analýzou v tenké vrstvě (ΚΜΝΟ₄/Ι₂). Frakce obsahující produkt byly potom spojeny, tento spojený podíl byl zkoncentrován ve vakuu, pracován dvakrát 50 mililitry dichlormethanu a přečištěn za vysokého vakua, přičemž tímto způsobem bylo připraveno 25,8 gramu produktu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY a sloučeninu (VI), která má následující identifikační charakteristiky:

(a) je přítomna ve frakci ze surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10“⁶ cm, velikost částic v koloně 10 pm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % B, 95 % —> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % B, 80 % -> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 22,75 minuty;

(b) je přítomna ve frakci z frakce uvedené v (a), která se eluuje na koloně C-l 8 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10’⁶ cm, velikost částic v koloně 10 pm, za použití průtokového množství 15 mililitrů za minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0%->0%B, 100%->100% A v průběhu 0 až 5 minut, potom 0 % -> 10 % B, 100 % -> 90 % A v průběhu 5 až 20 minut, což je Watersova křivka 1, potom 10 % —> 20 % B, 90 % —> 80 % A v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom

-53CZ 283830 B6

20 % -> 50 % B, 80 % -> 50 % v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivka 11, kde A je 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 21,5 minuty; a (c) FAB MS: vysoká rozlišovací schopnost: 505,3861, a farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin.
2. Způsob přípravy čištěné polyaminové sloučeniny podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelných solí této sloučeniny, vyznačující se tím, že (a) v případě přípravy sloučeniny vzorce V:

(V)

HO se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, rozměry 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10^-6 cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 10 % acetonitril, 95 % -> 90 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a při detekci monochromatického píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje pri asi 12,5 minuty se jímá a případně se tato frakce lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje z vody, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XXVIII:

OH (XXVIII) uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k prováděné reakci, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom se sloučeninou obecného vzorce X: v rozpouštědle, které je inertní k průběhu prováděné reakce, přičemž takto získaný produkt potom reaguje pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyl-oxaziridinem, přičemž potom následuje reakce s kyanoborohydridem a vzniklý produkt potom reaguje pod inertní atmosférou s trifluoroctovou kyselinou;

(b) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce IV:

-54CZ 283830 B6 (IV) potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10 ⁶ cm, velikost částic 10 μ, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, 80 % -> 30 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 21 minutě se jímá a potom se nanese na kolonu C-4 Vydac, o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10 ⁶ cm, velikost částic 5 pm, a potom se eluce provádí za použití průtokového množství 4,0 mililitry/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0%->10% acetonitril, 100 % -> 90 % 0,1 % vodný roztok kyseliny trifluoroctové při monochromatické detekci píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce která se eluuje při asi 7 minutě se jímá a potom se případně tato frakce lyofílizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XXXI:

(XXXI) uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k průběhu prováděné reakce, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom se sloučeninou obecného vzorce X: takto získaný produkt se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylfenyl)-3fenyl-oxaziridinem, přičemž potom následuje reakce s kyanoborohydridem a takto získaný produkt potom reaguje pod inertní atmosférou s kyselinou trifluoroctovou;

(c) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce ΠΙ:

-55CZ 283830 B6 (in.) potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10^-6 cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočné rychlosti 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, potom 20%->70% acetonitril, 80 % —> 30 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 minut až 55 minut a při monochromatické detekci píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 21 minutě se jímá a potom se vloží na kolonu C-4 Vydac, o rozměrech 10 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10^-6 cm, velikost částic 5 pm, a potom se eluování provádí při průtokovém množství 4,0 mililitrů/minutu za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0 % -> 10 % acetonitril, 100% ->90% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a při monochromatické detekci v rozmezí od 220 do 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 9 minutách se jímá a potom se případně tato frakce lyofllizuje, potom se opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XXII:

BOC (XXII) uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k prováděné reakci, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom reakce se sloučeninou obecného vzorce XXXVIII:

BOC (XXXVIII) a takto získaný produkt se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylfenyl)-3fenyl-oxaziridinem, načež následuje reakci s kyanoborohydridem a takto získaný produkt se potom uvádí do reakce buďto s trifluoroctovou kyselinou pod inertní atmosférou, nebo se pod inertní atmosférou rozpustí v nasyceném roztoku dioxanu a kyseliny chlorovodíkové, oddělí se a přidá se do vodného roztoku pod inertní atmosférou;

(d) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce II:

-56CZ 283830 B6 (II) potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikost částic 10 pm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu, a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, 80 % -> 30 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku v rozmezí 220 až 230 nm, přičemž frakce která se eluuje při asi 22,75 minuty se jímá a potom vloží na kolonu C—4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikost částic 10 pm, a eluování se nyní provádí při průtokovém množství 15 mililitrů/minutu a za použití rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 0 % -> 0 % acetonitril, 100 % -> 100 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 0 až 5 minut, potom 0%->10% acetonitril, 100%->90% 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 5 až 20 minut, Watersova křivka 1, potom 10 % —> 20 % acetonitril, 90 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20 % -> 50 % acetonitril, 80 % -> 50 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivka 11, a při monochromatické detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 18,5 minutě se jímá a potom se případně tato frakce lyofilizuje, opětně se suspenduje ve vodě a lyofílizuje, nebo v alternativním provedení se sloučenina obecného vzorce XXII:

BOC (XXII) uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem prováděné reakci, a pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, přičemž potom následuje reakce s dicyklohexylkarbodiimidem a potom následuje reakce se sloučeninou obecného vzorce X: přičemž takto získaný produkt se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyl-oxaziridinem, přičemž potom následuje reakce s kyanoborohydridem a takto získaný produkt se potom uvádí buďto do reakce s kyselinou trifluoroctovou pod inertní atmosférou, nebo se pod inertní atmosférou rozpustí v nasyceném roztoku dioxanu v kyselině chlorovodíkové, potom se produkt oddělí a přidá do vodného roztoku pod inertní atmosférou,

-57CZ 283830 B6 (e) v případě, že se připravuje sloučenina vzorce I:

2 (I) potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac, o rozmě5 rech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikost částic 10 gm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % -> 70 % acetonitril, 80 % —> 30 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku v rozsahu ío 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 27,5 minutě se jímá a potom se případně uvedená frakce lyofilizuje, nebo se v alternativním provedení celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na uvedené koloně za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu za použití rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 0 % -> 20 % acetonitril, 100 % —> 80 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny a při detekci píku při 220 nm, přičemž 15 frakce, která se eluuje při asi 26,0 minutě se jímá a potom se vloží do kolony Dynamax Phenyl, rozměry 4,6 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 6.10’⁷ cm, velikost částic 8 gm, přičemž eluování se provádí za průtočného množství 1 mililitr/minutu a isokratických podmínek za použití 10% acetonitrilu a 90 % 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a při detekci píku 220 nm, přičemž frakce, které eluuje při asi 55,27 minutě se jímá a potom případně 20 lyofilizuje, suspenduje ve vodě a lyofilizuje, nebo se v alternativním provedení sloučenina obecného vzorce XIII:

BOC (XIII)

25 uvádí do reakce v rozpouštědle, které je inertní vzhledem k prováděné reakci, pod inertní atmosférou s N-hydroxysukcinimidem, potom dicyklohexylkarbodiimidem a potom se sloučeninou obecného vzorce X:

přičemž takto získaný produkt v acetonu se potom uvádí do reakce pod inertní atmosférou s kyselinou 3-chlorperoxybenzeovou, produkt se oddělí a potom se uvádí do reakce s kyanoborohydridem v přítomnosti kyseliny octové a potom se takto získaný produkt uvádí do reakce s trifluoroctovou kyselinou pod inertní atmosférou;

(f) v případě, že se připravuje sloučenina VI, která má následující identifikační charakteristiky:

-58CZ 283830 B6 (a) je přítomna ve frakci ze surového jedu pavouka Agelenopsis aperta, která se eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikost částic 10 pm za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % —> 20 % B, 95 % —> 80 % A v průběhu 0 až 30 minut, potom 20 % —> 70 % B, 80 % —> 30 % A v průběhu 30 až 55 minut, kde A je 0,1% vódný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 22,75 minuty;

(b) je přítomna ve frakci z frakce, která je popisována v (a) viz výše, která se eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikost částic 10 pm, za použití průtokového množství 15 mililitrů/minutu a rozpouštědlového systému s nelineárním gradientovým programem 0%->0%B, 100%->100% A v průběhu 0 až 5 minut, potom 0 % —> 10 % B, 100 % -> 90 % A v průběhu 5 až 20 minut, Watersova křivka 1,potom 10%->20%B, 90% ->80% A v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20 % -> 50 % B, 80 % —> 50 % A v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivka 11, kde A je 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B je acetonitril, při asi 21,5 minuty, a (c) FAB MS: vysoká rozlišovací schopnost: 505,3861, potom se celý podíl jedu pavouka Agelenopsis aperta eluuje na koloně C-18 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶cm, velikost částic 10 pm, za použití průtočného množství 15 mililitrů/minutu, a rozpouštědlového systému s lineárním gradientovým programem 5 % -> 20 % acetonitril, 95 % -> 80 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 30 minut, potom 20% ->70% acetonitril, 80%-> 30% 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 55 minut a při monochromatické detekci píku při 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 22,75 minuty se jímá a potom se nanese na kolonu C-4 Vydac o rozměrech 22 milimetrů x 250 milimetrů, velikost pórů 3.10⁶ cm, velikost částic 10 pm, přičemž eluování se provádí za průtokového množství 15 mililitrů/minutu s rozpouštědlovým systémem s nelineárním gradientovým programem 0 % -> 0 % acetonitril, 100 % -> 100 % 0,1% vodný roztok trifluoroctové kyseliny v průběhu 0 až 5 minut, potom 0%->10% acetonitril, 100 % -> 90 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 5 až 20 minut, Watersova křivka 1, potom 10 % -> 20 % acetonitril, 90 % -> 80 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 20 až 30 minut, Watersova křivka 6, potom 20 % -> 50 % acetonitril, 80 % -> 50 % 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové v průběhu 30 až 40 minut, Watersova křivka 11, a při monochromatické detekci píku v rozsahu 220 až 230 nm, přičemž frakce, která se eluuje při asi 21,5 minuty se jímá a potom se popřípadě uvedená frakce lyofilizuje, opětně suspenduje ve vodě a lyofilizuje, a potom se popřípadě převedou uvedené sloučeniny na farmaceuticky přijatelné soli odvozené od těchto sloučenin metodami běžně známými.