FI102171B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen olennaisen puhtaan polyamiin in ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 102171

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen olennaisen puhtaan polyamiinin ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta 902 139.

Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen olennaisen puhtaan indoli-3-asetamidi- tai bentsamidi-N-polyamiinijohdannaisen ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joka yhdiste 10 on jokin seuraavista:

H Ö? H

is

H

PH H H? H H H

f^jl , (Bi)

20 0 H

Z H H? H

OOH' ^ , (Aj) ;; 25 h PH H OH H H + ....

30 h

°H R H NH

5- (AJ

35 J

OH

2 102171

' -HO

5

Edellä mainitut yhdisteet ovat polyamiineja, joita on havaittu esiintyvän Agelenopsis aperta-hämähäkin myrkyssä. Polyamiinit ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat antagonisoivat kiihottavia aminohapponeurotransmitto-5 reita, jotka vaikuttavat soluihin, mm. hermosoluihin erilaisilla organismeilla, mukaan lukien selkärangattomat ja selkärangalliset. Eräs mainituista polyamiineista ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat salpaavat kalsiumkanavia soluissa, mukaan lukien hermosolut ja lihasso-10 luja erilaisilla organismeilla, mukaan lukien selkärangattomat ja selkärangalliset. Täten mainittuja polyamiineja ja niiden suoloja voidaan käyttää antagonisoimaan kiihottavia aminohapponeurotransmittoreita, jotka neurotransmit-torit vaikuttavat soluihin, kuten hermojärjestelmän solui-15 hin organismilla, sinänsä, kiihottavien aminohapponeuro-transmittorien välittämien sairausten ja tilojen hoidossa nisäkkäässä ja selkärangattomien tuholaisten kontrollissa. Lisäksi niitä voidaan käyttää sinänsä kalsiumkanavien sal-paamiseen soluissa, kuten organismin hermo- ja lihasjär-; 20 jestelmän soluissa, kalsiumkanavan välittämien sairauksien ja tilojen hoitoon nisäkkäässä, ja kontrolloimaan selkärangattomia tuholaisia.

On raportoitu, että Agelenopsis aperta-hämähäkin myrkky sisältää ainakin kahta toksiinia, jotka vaikuttavat 25 kalsiumvirtoihin. Jackson, H., et ai., Soc. Neu. Sei.

1 Abstr. 12 (1987) 1078. Nämä kirjoittajat kuvaavat toksii nin, jota julkaisussa kuvataan nimellä AG2, jonka molekyy-lipaino on alle 1000 daltonia, ja joka ilmeisesti estää kalsiumvirtoja laajassa joukossa kudoksia. Edelleen Jack-30 son, H., et ai., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12 (1986) 730 kuvaavat toisen toksiinin Agelenopsis apertasta, joka sisäl- 3 102171 tää komponentin, jonka mp. on noin 6000. Tämän toksiinin kuvataan saavan aikaan transmission presynaptisen salpauksen, ja on ehdotettu, että toksiini salpaa neurotransmit-torin vapautumiseen liittyviä kalsiumkanavia.

5 Yhdisteillä, jotka ovat kiihottavien aminohapponeu- rotransmittorien antagonisteja, on erilaisia käyttökohteita. Kiihottavien aminohapponeurotransmittorien antagonisteilla voi olla kliinistä sovellettavuutta hoidettaessa sellaisia tiloja, kuten aivohalvaus, halvaus, aivojen ve-10 rettömyys, hermosolujen rappeutumishäiriöitä, kuten Alzheimerin tauti ja epilepsia ja psykoterapeuttisina aineina ja vastaavat. Katso: Excitatory Amino Acids in Health and Disease, D. Lodge, Ed., John Wiley ja Sons Ltd., New York, NY 1988. Edelleen tällaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia 15 solujen fysiologiaa tutkittaessa, kuten hermosolujen, ja selkärangattomien tuholaisten kontrollissa.

Yhdisteillä, jotka ovat kalsiumantagonisteja, on erilaisia käyttökohteita. Kalsiumantagonisteilla voi olla kliinistä sovellettavuutta hoidettaessa sellaisia tiloja, 20 kuten sydänkouristus, liikajänteys, sydänlihassairaus, kammion yläpuoliset arytmiat, aesofogeaalinen kurojalihak-sen kouristus, ennenaikainen synnytys ja Raynaudin tauti ja vastaavat. Katso: W. G. Nayler; Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New ;; 25 York, NY 1988. Edelleen, tällaiset yhdisteet ovat käyttö kelpoisia solujen fysiologiaa tutkittaessa, kuten hermosto- ja lihassolujen, ja selkärangattomien tuholaisten kontrollissa.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavat polyamiinit ja 30 niiden farmaseuttisesti hyväksyttävä suolat antagonisoivat kiihottavia aminohapponeurotransmittoreita, jotka neuro-transmittorit vaikuttavat soluihin. Siten polyamiinit ovat sinänsä käyttökelpoisia mainittujen neurotransmittoreiden antagonisoimisessa. Tämän keksinnön mukaisesti saatavat 35 polyamiinit ovat käyttökelpoisia myös selkärangattomien 4 102171 tuholaisten kontrollissa ja tautien ja tilojen hoidossa nisäkkäässä, joita tauteja ja tiloja välittävät kiihottavat aminohapponeurotransmittorit. Polyamiinit ovat käyttökelpoisia myös psykoterapeuttisina aineina nisäkkäällä.

5 Edellä esitetty polyamiini Bx salpaa kalsiumkanavia soluissa. Siten polyamiini Bx on sinänsä käyttökelpoinen kalsiumkanavien salpauksessa soluissa. Mainittu polyamiini B1 on käyttökelpoinen myös selkärangattomien tuholaisten kontrollissa ja tautien ja tilojen hoidossa nisäkkäässä, 10 joita tauteja ja tiloja välittää kalsiumkanavan toiminta soluissa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle edellä mainittujen polyamiinien A', Alt A2, Blf B2 ja E ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi on 15 tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksen tunnusmerkkiosassa.

Myrkky saadaan Agelenopsis aperta-hämähäkistä lyp-sämismenetelmällä sähköisellä stimuloinnilla ammattimiesten tuntemilla tekniikan tason vakiomenetelmillä. Edulli-20 sesti käytetään menetelmää, joka turvaa kokomyrkyn konta-minoitumiselta vatsasta takaisinvalumisella tai hemolym-falla. Tällaiset menetelmät ovat ammattimiesten hyvin tuntemat. Näin saatua kokomyrkkyä säilytetään alla kuvatulla tavalla puhdistamisessa käyttöön asti pakastettuna noin -25 78 °C: ssa.

Kokomyrkyn osasten puhdistus suoritetaan käänteis-faasi-HPLC:llä (reverse phase high performance liquid chromatography) erilaisilla preparatiivisilla ja semipre-paratiivisilla kolonneilla, kuten C-4 ja C-18 VydacR-kolon-30 nit (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Mas- · sachusetts 01801). Huipun detektointi suoritetaan mono- kromaattisesti aallonpituudella 220 - 230 nm. Jakeiden analyysi edelleen voidaan suorittaa esimerkiksi, polykro-maattisista UV-tiedoista, jotka kerätään Waters 990 diode 35 array-detektorilla (Millipore Corporation, Waters Chroma- 5 102171 tography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Kolonnista tulevat jakeet kerätään tunnetuilla menetelmillä, kuten ISCO/"FOXY"-jaekerääjää ja ISCO 2159-huipun detektoria (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 5 68504) käyttäen. Jakeet kerätään sopivan kokoisiin astioi hin, kuten steriileihin polyetyleenisiin laboratorioas-tioihin. Sitten jakeet konsentroidaan lyofilisoimalla eluentista ja sen jälkeen lyofilisoimalla vedestä. Sitten saatujen aineosajakeiden puhtaus voidaan suorittaa kroma-10 tografoimalla analyyttisellä kolonnilla käyttäen gradient- tijärjestelmää, joka on isokraattisempi, kuin jakeiden lopulliseen puhdistukseen käytetty järjestelmä.

Kunkin jakeen rakenteet määritetään tunnetuilla analyyttisillä menetelmillä, kuten massaspektrometrialla 15 ja NMR:llä.

Tämän keksinnön toteuttamisessa ja edellä kuvattua yleistä tapaa käyttäen on keksitty, että myrkyn alustavaan fraktiointiin sopiva kolonni on C-18 VydacR-kolonni (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 μπι) . Tätä ko-20 lonnia eluoidaan virtausnopeudella 15 ml/min käyttäen lineaarista gradienttiohjelmaa 95 % -> 80 % A, 5 % -> 20 % B [0 -> 30 min] , sitten 80 % -> 30 % A, 20 % -> 70 % B [30 -> 55 min], jossa A on 0,1-% trif luorietikkahapon (TFA) vesiliuos ja B on asetonitriili. Jakeet kerätään '! 25 edellä kuvatulla tavalla. Kolme näin saatua jaetta, joita merkitään A, B ja E valittiin edelleen analysoitaviksi ja/tai puhdistettaviksi. Lisäksi on keksitty, että koko-myrkyn fraktiointi C-18 VydacR-kolonnia (22 mm x 250 mm, huokoskoko 3 0 nm, hiukkaskoko 10 μιη) käyttäen, jota eluoi-30 daan virtausnopeudella 15 ml/min käyttäen lineaarista gra-.· dienttiohjelmaa 5 % -> 10 % B, 95 % -> 90 % A [0 -> 30 min] , jolloin A ja B ovat edellä kuvatut, saadaan mm. jae, jota tässä merkitään A'. Jakeiden eluoitumisajat on esitetty alla esimerkeissä 1 ja 2.

β 102171

Jakeet A ja B puhdistetaan edelleen erilaisia ko-lonneja ja gradienttiohjelmia käyttäen. Kunkin alifrakti-oinnin ominaispiirteet ja niiden tulokset esitetään alla esimerkeissä 3 ja 4.

5 Kuten seuraavissa esimerkeissä osoitetaan, jakeet A', A1; A2, Blr B2 ja E sisältävät polyamiiniyhdisteitä.

Nämä yhdisteet ja jakeet, joissa ne esiintyvät, ovat seu-raavat.

Jae A' (AGEL 452): 10

HO

15

Jae Al (AGEL 468):

OH O

Nv^\/NH2 20 ^ H 6h “ »

OH

Jae A2 (AGEL 448): ;· 25

PH H H? H

U 0

H

30

Jae E1 (AGEL 505) :

X H "? H H

35

H

7 102171

Jae B2 (AGEL 504) : FAB MS: high resolution: 505,3861 laskettu C27H48N603: lie. Jae E (AGEL 489):

5 H H? H H

H

10 Tämän esityksen etujen avulla, jotka edut liittyvät Agelenopsis apertan myrkyn fraktioissa esiintyviin yhdisteisiin on nyt mahdollista saada mainittuja yhdisteitä muilla menetelmillä, kuin kokomyrkystä eristämällä/puhdis-15 tamalla. Kaikki tällaiset menetelmät kuuluvat tämän keksinnön suoja-alaan. Esimerkiksi polyamiinit, jotka koostuvat jakeista A1 , Alf A2, Β2, B2 ja E, voidaan valmistaa suoraan synteettisillä menetelmillä.

Synteesikaavio polyamiinien E (XVI) ja Bx (XXV) 20 tuottamiseksi, joilla polyamiineilla on kaava

f H H? H H

25 H

jossa R on H tai OH on esitetty alla reaktiokaavioissa A - D.

e 102171

Reaktiokaavio A

H2n/^^^NH2 + NC^^> -" ►

H

+ Br^^^N-BOC

2 H

(I) <11»

H

BOCCN H H

(III) [BOC]20 ▼

BOC

H BOC

(IV) ▼

BOC

_ + N(r O -►

Η,Νν/Ν/ N^/^^^n/^^N-BOC Δ · H

BOC

(V)

·. BOC

NC/^ N H

BOC

(VI) [BOC]20 'f 9 102171

BOC BOC

• «

H

BOC

(VII) ▼

BOC BOC

(VIII)

BOC BOC

H I I

• H

BOC

(IX) ’

T

BOC BOC

H » I

h2nn^/h^/ x^^-^n-boc (X) 10 102171

Reaktiokaavio B —*·

H H

(XI) [BOC]20 ▼

BOC

(XII) ▼ JJL jJ o

BOC

i (XIII)

Reaktiokaavio C

11 102171 r2OCH3 + H3CSnh [Λτ-π --- £ΪΠ) ^

L1JJ

N H

H

(XVII)

V

OCH2OCH3 I^n/CH3 (fll IJ ^CH-.

H

(XVIII) 'f och9och,

pcnj^nj I 2 3 OH

f^Si—h km iJ '0 K II '1 o -—► :. h

H

(XIX) (XX) ▼ *: . OCH^OCH^ och2och3 i och,ch=ch2 ΛγΑ". 6πΓϊ L II IJ o 4--—

I BOC

B0C, (XXI) (XXII) 12 1C2171

Reaktiokaavio D

X + XIII tai XXII -►

R' BOC BOC

I Π π , !

O BOC H

BOC

[R' = H(XIV)/ R' = OCH2OCH3(XXIII)] ▼

, OH BOC BOC

R H » » I

— L· Π IJ 'o BOC H

BOC

(R· = H(XV)/ R' = OCH2OCH3(XXIV)]

: R H ?H H H

H

[R = H(XVI), R = OH(XXV)] ▲

R* H ?H H H

wKi] il 11 H NH2 *-► o

O^-OH

(XXIV ) 13 102171

Reaktiokaavio E

0 0 \\

J* ^s/\OCH_CH=CH

H0 (XXVI) ^ 0

0 II

CH=CH2 rfjT /Q·

*“ CH-OCH-O

CH-OCH-O 3 2 3 , (XXVII) (XXVIII)

Reaktiokaavio F

OH ‘0

OH O I II

Γ ^Sy^och2ch-ch2 έΓ0Η v

\ OH

OH

(XXIX) ▼ OCH-OCH^ OCH,OCH3 I 2 3 i 2 -3 0 o I ii

I π A>vA^OCH0CH=CH

riA0H O

W ◄- I

I och_och3 OCH2OCH3 2 3 (XXX) (XXXI)

Reaktiokaavio G

14 102171 X + XXVIII tai XXXI -►

B0C

Il _ ^ ^ ^ ^ ,L ^.N-BOC

h « Le Le OCH2OCH3 (XXXII) tai

OCH-OCH

I O B0C

|_ji^ /n/\n/N/Xn/^v% /^^n^^n-boc H H BOC BOC

·: OCH2OCH3 (XXXIII)

▼ BOC

f? N-B0C

J<^JJ H OH BOC BOC

och2och3 (XXXIV) tai OCH-OCH-

1 J BOC

?, ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ns^^n-boc

V>jj H OH BOC BOC

OCH2OCH3 (XXXV)

T

is 102171

Reaktiokaavio G (.jatkoa) (XXXIV) tai (XXXV) AJJ '* 6h » »

HO

(XXXVI) tai

H L " H

OH

(XXXVII) 102171

Reaktiokaavlo H

16

BOC

.^^,Ν-BOC

VI H BOC

(XXXVIII) xxxviii + xxii * och2och3 H H ®°° C\ O o ®°c h

BOC

(XXXIX) ▼

OCH2OCH3 h OH BOC

fcir nr ®°c h

BOC

(XL) l

OH H ?H H

H

(XLI) t

PH H °H H

OcXV ' " * -

O'^OH

(XL* ) lv 102171

Reaktiokaavion A mukaisesti kaavan X mukainen poly-amiinivälituoteyhdiste valmistetaan joukolla vaiheita di-aminobutaanista alkaen. Sopivat reaktio-olosuhteet kaavan X mukaisen välituoteyhdisteen valmistamiseksi reaktiokaa-5 vion A mukaisesti on esitetty esimerkissä 6, osat A - I. Reaktiokaavio B kuvaa menetelmää kaavan XIII mukaisen välituoteyhdisteen valmistamiseksi. Sopivat reaktio-olosuhteet tämän välituotteen valmistamiseksi reaktiokaavion B mukaisesti on esitetty esimerkin 6 osissa J - L. Kaavan 10 XXII mukaisen välituoteyhdisteen valmistus on esitetty reaktiokaaviossa C. Sopivat reaktio-olosuhteet kaavan XXII mukaisen yhdisteen valmistamiseksi reaktiokaavion C mukaisesti on esitetty esimerkin 7 osissa A - F. Kaavojen XVI ja XXV mukaisten, tämän keksinnön polyamiiniyhdisteiden E 15 ja Bjvalmistus on esitetty reaktiokaaviossa D. Kaavojen X ja XIII tai X ja XXII mukaisten välituoteyhdisteiden liittämiseen ja seuraavaan kaavojen XVI ja XXV mukaisten yhdisteiden valmistukseen sopivat reaktio-olosuhteet on esi-, tetty esimerkin 6 osissa M - O ja esimerkin 7 osissa G - 20 I .

Reaktiokaavio E kuvaa menetelmää kaavan XXVII mukaisen välituoteyhdisteen valmistamiseksi, ja reaktiokaavio F kuvaa menetelmää kaavan XXXI mukaisen välituoteyhdisteen valmistamiseksi. Sopivat reaktio-olosuhteet väli-25 tuotteen valmistamiseksi reaktiokaavion E mukaisesti on esitetty esimerkin 8 osissa A - C. Sopivat reaktio-olosuhteet välituotteen valmistamiseksi reaktiokaavion F mukaisesti on esitetty esimerkin 9 osissa A - C. Kaavojen XXXVI ja XXXVII mukaisten, tämän keksinnön mukaisten poly-30 amiiniyhdisteiden A' ja Ai valmistus on esitetty reak- . tiokaaviossa G. Kaavojen X ja XXVIII mukaisten väli

tuoteyhdisteiden yhdistämiseen ja seuraavaan kaavan XXXVI mukaisen yhdisteen valmistamiseen sopivat reaktio-olosuhteet on esitetty esimerkin 8 osissa D - F, ja kaavojen X

1β 102171 ja XXXI mukaisten välituoteyhdisteiden yhdistämiseen ja seuraavaan kaavan XXXVII mukaisen yhdisteen valmistamiseen sopivat reaktio-olosuhteet on esitetty esimerkin 9 osissa D - F.

5 Reaktiokaavio H kuvaa menetelmää kaavan XLI mukai sen, tämän keksinnön mukaisen polyamiiniyhdisteen A2 valmistamiseksi. Kaavan XXXVIII mukaisen välituoteyhdisteen valmistukseen sopivat reaktio-olosuhteet, sen yhdistäminen kaavan XXII mukaiseen välituoteyhdisteeseen ja seuraava 10 kaavan XLI mukaisen, tämän keksinnön mukaisen polyamiiniyhdisteen A2 valmistus on esitetty esimerkissä 10.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavat polyamiinit an-tagonisoivat reversiibelisti kiihottavia aminohapponeuro-transmittoreita, jotka vaikuttavat soluihin, kuten hermo-15 järjestelmäsoluihin joukolla organismeja, selkärangatto milla ja selkärangallisilla mukaan lukien. Käsitteen sel-kärangalliset ajatellaan kaikkialla käytettynä sisältävän nisäkkäät. Käsitteen selkärangattomat ajatellaan kaikkial-. la käytettynä sisältävän esimerkiksi hyönteiset, ulkoloi- 20 set ja sisäloiset. Edellä kuvatut jakeen Bi polyamiinit salpaavat myös reversiibelisti kalsiumkanavia, joita esiintyy erilaisissa soluissa, kuten hermo- ja lihassoluissa, mukaan lukien selkärangattomien ja selkäranganis-ten sydän/verisuoni-järjestelmät.

25 Tämän keksinnön mukaiset! saatavien polyamiinien kyky antagonisoida kiihottavia aminohapponeurotransmitto-reita osoitetaan niiden kyvyllä salvata N-metyyli-D-aspa-ragiinihapon (NMDA) indusoimat cGMPm kohoamiset vastasyntyneiden rottien pikkuaivoissa seuraavan menetelmän mukai-30 sesti. Pikkuaivot leikataan nopeasti pois 10 Wistar-rotal-ta, jotka ovat 8-14 päivää vanhoja, ja sijoitetaan 4 °C lämpöiseen Krebs/bikarbonaattipuskuriin, pH 7,4 ja leikataan sitten kooltaan 0,5 mm x 0,5 mm kappaleiksi käyttäen Mcllwain-kudoskeikkuria (The Nickle Laboratory Engineering 35 Co., Gomshall, Surrey, England). Saadut pikkuaivopalaset 19 .102171 siirretään 100 ml:aan Krebs/bikarbonaatti-puskuria 37 °C:ssa, jota tasapainotetaan jatkuvasti 95:5 02/C02:lla. Pikkuaivopalasia inkuboidaan tällä tavalla 90 min vaihtaen puskuria 3 kertaa. Sitten puskuri dekantoidaan, kudos 5 sentrifugoidaan (1 min, 3200 r/min), ja kudos suspendoi-daan uudelleen 20 ml:aan Krebs/bikarbonaatti-puskuria. Sitten poistetaan 250-μ1 erät (noin 2 mg) ja lisätään 1,5-ml mikrofuugiputkiin. Näihin putkiin lisätään kantaliuok-sesta 10 μΐ tutkittavaa yhdistettä, ja sitten 10 μΐ 2,5 mM 10 NMDA-liuosta reaktion käynnistämiseksi. Lopullinen NMDA-konsentraatio on 100 μΜ. Kontrolleihin ei lisätä NMDA:ta. Putkia inkuboidaan 1 min 37 °C:ssa ravistelevassa vesi-hauteessa, ja sitten lisätään 750 μΐ 50 mM Tris-Cl, 5mM EDTA-liuosta reaktion pysäyttämiseksi. Putket asetetaan 15 välittömästi kiehuvaan vesihauteeseen 5 min ajaksi. Kunkin putken sisältöä sonikoidaan sitten 15 s näytesonikaatto-rilla virtatasoasetuksella 3. Poistetaan 10 μΐ, ja proteiini määritetään menetelmällä, jonka on kuvannut: Lowry; Anal. Biochem. 100 (1979) 201-220. Sitten putket sentrifu-20 goidaan (5 min, 10000 xg), poistetaan 100 μΐ supernatant-tia, ja syklisen GMP:n (cGMP) taso määritetään New England Nuclear (Boston, Massachusetts) cGMP RIA-määritystä toimittajan menetelmää käyttäen. Arvot ilmoitetaan yksikössä muodostunut cGMP:n määrä pmol/mg proteiinia.

: 25 Jakeen Bx polyamiinin kyky salvata kalsiumkanavia osoitetaan seuraavalla tavalla. Dissosioituja rotan neo-kortikaalisia hermosoluja suspendoidaan Krebs/bikarbonaat-ti-puskuriin, pH 7,4, joka sisältää 2 mM CaCl2 ja 1 % naudan seerumialbumiinia (BSA). Hermosolut kerrostetaan sent-30 rifugoimalla ja suspendoidaan uudelleen samaan puskuriin, joka lisäksi sisältää 1 μΜ fura2/AM (Sigma Chem. Co., P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178). Soluja inkuboidaan 15 min 37 °C:ssa, pestään ja inkuboidaan sitten toiset 15 min samassa puskurissa ilman fura2/AM:ää. Sitten solut 35 pestään edellä olevalla puskurilla, joka nyt sisältää 1,5 20 1C2171 mM CaCl2:ta, ja tasapainotetaan huoneenlämpötilassa konsentroituna solususpensiona noin 5-10 min. Kvartsikyvet-tiin lisätään 1,2 ml esilämmitettyä (37 °C) BSA-vapaata puskuria, joka sisältää 1,5 mM CaCl2 ja 10 mM glukoosia, ja 5 sitten 0,3 ml edellä valmistetusta konsentroidusta so-lususpensiosta. Kyvetti sijoitetaan termostoituun (37 °C) pidikkeeseen, joka on varustettu magneettisekoittajalla, ja fluoresenssi mitataan fluoresenssispektrofotometrillä, kuten Perkin Elmer 650-40 (Perkin Elmer, Wilton, Connec-10 ticut 06897). Fluoresenssisignaali saa stabiloitua noin 1 min ajan. Sitten kyvettiin lisätään 1 - 4 μΐ tutkittavan yhdisteen kantaliuosta Krebs/bikarbonaatti-puskurissa sopivissa konsentraatioissa. Fluoresenssisignaalien korjaus ja fura2-häviökorjaukset suoritetaan vakiintuneilla ta-15 voilla, jotka on kuvannut: Nemeth, et ai.; J. Biol. Chem. 262 (1987) 5188. Kunkin kokeen lopussa määritetään maksi-fluoresenssiarvo (Fmax) lisäämällä ionomysiiniä, ja mini-fluoresenssiarvo (Fmin) määritetään seuraavalla 5 mM EG-TA:n lisäyksellä kalsiumin kelatoimiseksi. Edellä esite-20 tyllä tavalla tutkittavan yhdisteen kalsiumkanavan salpaus osoitetaan tapahtuvalla fluoresenssin laskulla tarkasteltavaa yhdistettä lisättäessä.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavat polyamiinit ovat sinänsä käyttökelpoisia antagonisoimaan kiihottavia t 25 aminohapponeurotransmittoreita. Polyamiinit ovat sellaise naan käyttökelpoisia myös selkärangattomien tuholaisten kontrollissa ja hoitamaan kiihottavien aminohapponeuro-transmittoreiden välittämiä sairauksia ja tiloja nisäkkäässä, kuten aivohalvaus, halvaus, häiriöitä, kuten aivo-30 jen verettömyys, hermosolujen rappeustilat, kuten Alzhei- ! merin tauti ja epilepsia. Mainitut polyamiinit ovat käyt tökelpoisia myös psykoterapeuttisina aineina nisäkkäillä. Edelleen polyamiinit ovat käyttökelpoisia solujen fysiologiaa tutkittaessa, mukaan lukien, muttei rajoittavasti, 35 hermojärjestelmän solut.

21 .102171 Tämän keksinnön mukaisesti saatavat jakeen Bx poly-amiinit ovat sinänsä käyttökelpoisia kalsiumkanavan salpaajia soluissa. Sellaisenaan nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia myös selkärangattomien tuholaisten kontrollissa 5 ja tautien ja tilojen hoidossa, joita tauteja ja tiloja välittävät kalsiumkanavan toiminta nisäkkäiden soluissa, kuten sydänkouristus, liikajänteys, sydänlihassairaus, kammioiden yläpuoliset arytmiat, aesofogeaalinen kurojali-haksen kouristus, ennenaikainen synnytys ja Raynaudin tau-10 ti. Edelleen nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia solujen fysiologiaa tutkittaessa, mukaanlukien, muttei rajoittavasti, hermo- ja lihasjärjestelmän soluja.

Keksinnön suoja-alaan kuuluvat myös tämän keksinnön mukaisten polyamiinien farmaseuttisesti hyväksyttävät suo-15 lat. Tällaiset suolat muodostetaan ammattimiesten hyvin tuntemilla tavoilla. Esimerkiksi polyamiinien happoaddi-tiosuolat voidaan valmistaa tavanomaisten menetelmien mukaisesti .

Kun tämän keksinnön mukaisesti saatavaa polyamiinia 20 on annettava nisäkkäälle, se voidaan antaa yksinään tai yhdistelmänä farmaseuttisesti hyväksyttävien väliaineiden tai laimennusaineiden kanssa vakio farmaseuttisen käytännön mukaisissa farmaseuttisissa formulaatioissa. Poly-amiinit voidaan antaa oraalista tai parenteraalista reit-25 tiä. Parenteraalisia antomuotoja ovat mm. laskimonsisäi-nen, lihaksensisäinen, vatsaontelonsisäinen, ihonalainen ja paikallinen anto.

Tämän keksinnön mukaisesti saatavien polyamiinien oraaliseen käyttöön yhdisteet voidaan antaa esimerkiksi 30 tablettien tai kapseleiden muodossa, tai vesiliuoksena tai ! -suspensiona. Oraalisesti käytettävien tablettien tapauk sessa yleisesti käytettyjä väliaineita ovat mm. laktoosi ja maissitärkkelys, ja tavallisesti lisätään voiteluaineita, kuten magnesiumstearaatti. Kapselimuodossa tapahtuvaan 35 oraaliseen antoon käyttökelpoisia laimennusaineita ovat 22 -102171 laktoosi ja kuivattu maissitärkkelys. Kun oraaliseen käyttöön vaaditaan vesisuspensioita, aktiivinen valmistusaine yhdistetään emulgoimis- ja suspensioaineiden kanssa. Haluttaessa voidaan lisätä määrättyjä makeutus- ja/tai maku-5 aineita.

Lihaksensisäiseen, vatsaontelonsisäiseen, ihonalaiseen ja laskimonsisäiseen käyttöön aktiivisesta valmistusaineesta valmistetaan tavallisesti sreriilejä liuoksia, ja liuosten pH-arvo olisi säädettävä ja puskuroitava. Laski-10 monsisäiseen käyttöön liuenneiden aineiden kokonaiskon- sentraatio olisi kontrolloitava niin, että formulaatio on isotoninen.

Kun tämän keksinnön mukaisesti saatavia polyamiine-ja käytetään ihmishenkilöillä, päivittäisannoksen määrit-15 tää tavallisesti reseptin kirjoittava lääkärin. Edelleen annostus vaihtelee yksilöllisen potilaan iän, painon ja vasteen mukaan, kuten myös potilaan oireiden vakavuuden ja erityisen annettavan yhdisteen tehokkuudesta.

Kun tämän keksinnön mukaisesti saatavia polyamiine-20 ja tai niiden suolaa käytetään selkärangattomien tuholaisten kontrollissa, yhdistettä annetaan selkärangattomalle suoraan tai lisätään selkärangattoman ympäristöön. Tämän keksinnön mukaisesti saatavaa yhdistettä voidaan esimerkiksi suihkuttaa liuoksena selkärangattoman päälle. Selkä-25 rangattoman kontrolliin tarvittava yhdisteen määrä vaihte lee selkärangattoman ja ympäristöolosuhteiden mukaan, ja määrän määrittää yhdistettä käyttävä henkilö.

Kun tämän keksinnön mukaisesti saatavia polyamiine-ja tai niiden suoloja käytetään solujen fysiologisiin tut-30 kimuksiin, soluihin lisätään yhdistettä ammattimiesten hyvin tuntemilla menetelmillä. Yhdistettä voidaan esimerkiksi antaa soluille sopivassa fysiologisessa puskurissa. Tämän keksinnön mukaisesti saatavien yhdisteiden sopiva konsentraatio tällaisissa tutkimuksissa on 100 μΜ. Mainit-35 tujen yhdisteiden konsentraatio voi kuitenkin olla näissä 23 -102171 tutkimuksissa suurempi tai paljon pienempi, kuin 100 μΜ. Ammattimies määrittää käytettävän määrän hyvin tunnetuilla menetelmillä.

Esimerkki 1 5 Agelenopsis apertan kokomyrkyn alustava fraktiointi

Agelenopsis apertan kokomyrkky, joka saatiin yhtiöstä Natural Product Scieces Inc., Salt Lake City, Utah 84108, ja joka oli säilytetty pakastettuna noin - 78 °C:ssa, sulatettiin, ja 10- - 60-μ1 määrät sitä lai-10 mennettiin 200 μΐ-.aan, ja lisättiin C-18 VydacR-kolonniin (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 μιη) , ja eluoitiin käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min ja liuotin-järjestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % -> 20 % B, 95 % -> 80 % A [0 -> 30 min], sitten 20 % -> 70 % 15 B, 80 % -> 30 % A [30 -> 55 min], jossa A on 0,1-% TFA:n vesiliuos ja B on asetonitriili. Huipun detektointi suoritettiin monokromaattisesti aallonpituudella 220 230 nm, ja jakeita kerättiin ISCO/"FOXY"-jaekerääjällä ja IS CO 2159-huipun detektorilla. Jakeita kerättiin välillä 20 20-60 min. Seuraavat jakeet kerättiin huipun detektoin- nin perusteella: iae eluoitumisaika A noin 21 min B noin 22,75 min 25 E noin 27,5 min G noin 38 min H noin 39 min I noin 40 min J noin 40 min 30 L noin 43 min M noin 48,3 min

Esimerkki 2

Agelenopsis apertan kokomyrkyn fraktiointi jakeen A' saamiseksi 24 102171

Saatiin Agelenopsis apertan kokomyrkkyä, ja se lisättiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla C-18 VydacR-kolon-niin. Kolonnia eluoitiin käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min ja liuotinjärjestelmää lineaarisella gradienttioh-5 jelmalla 5 % -> 10 % B, 95 % -> 90 % A [0 -> 30 min] , jossa A on 0,1-% TFA:n vesiliuos ja B on asetonitriili. Huipun detektointi ja jakeiden keräys suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Saatiin jae A', joka eluoitui noin 12,5 min kohdalla. Sitten jae A' valmistettiin vakio-10 menetelmien mukaisesti spektrianalyysiä varten lyofilisoi-malla eluentista ja lyofilisoimalla sen jälkeen vedestä.

Yhdisteen rakenne, joka yhdiste muodostaa jakeen A', määritettiin sitten FAB MS:ää käyttäen. Saadut tiedot ja niistä johtuva rakenne ovat seuraavanlaiset: 15 A': FAB MS: M/Z 453 (M+l)

Rakenne: bentsamidi, N-(20-amino-4-hydroksi-4,8,12,17-tet-ra-atseikos-l-yyli)-4-hydroksi 20 iD* H iö H h

HO

Esimerkki 3

Jakeen A alifraktiointi ja sen sisältämien raken-. 25 teiden määritys

Jae A, joka saatiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, lisättiin C-4 VydacR-kolonniin (10 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 5 μχα) , ja eluoitiin siitä käyttäen virtausnopeutta 4,0 ml/min ja liuotinjärjestelmää lineaa-30 risella gradienttiohjelmalla 0 % -> 10 % B, 100 % -> 90 % A [0 -> 30 min], jossa A on 0,1-% TFA:n vesiliuos ja B on asetonitriili. Huippudetektointi suoritettiin Waters 990 diode array-detektoria käyttäen, ja jakeiden keräys suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Saatiin kaksi 35 seuraavanlaista jaetta: 25 102171 iae eluoitumisaika A1 noin 7 min A2 noin 9 min

Sitten jakeet A·^ ja A2 valmistettiin vakiomenetel-5 millä spektrianalyysiä varten lyofilisoimalla eluentista, ja sen jälkeen lyofilisoimalla vedestä.

Yhdisteiden rakenteet, jotka yhdisteet muodostavat jakeet Ατ ja A2, määritettiin sitten FAB MS:ää käyttäen. Näin saadut tiedot ja niistä johtuvat rakenteet ovat seulo raavat: A,: FAB MS:M/Z 469 (M+l) high resolution: 469,3863 laskettu C23H45N60: lie 2,0-mntyz virheellä 15 rakenne: bentsamidi, N-(20-amino-4-hydroksi- 4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)-2,5-dihydroksi

20 H ia “ H

OH

A2: FAB MS: M/Z 449 (M+l), 433, 376, 260, 203 25 rakenne: lH-indoli-3-asetamidi, N-(16-amino-4-hyd- roksi-4,8,13-triatsaheksadek-l-yyli)-4-hydroksi

°H H H? H

30 r->, :! h

Esimerkki 4

Jakeen B alifraktiointi ja sen sisältämien raken-35 teiden määrittäminen .102171 26

Jae B, joka saatiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, lisättiin C-4 VydacR-kolonniin (22 mm x 250 mm, huokoskoko 3 0 nm, hiukkaskoko 10 /im) , ja eluoitiin pois käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min ja liuotinjärjestelmää ei-line-5 aarisella gradienttiohjelmalla 0 % -> 0 % B, 100 % -> 100 % A [0 -> 5 min], sitten 0 % -> 10 % B, 100 % -> 90 % A [5 -> 20 min] (Waters-käyrä 1), sitten 10 % -> 20 % B, 90 % -> 80 % A [20 -> 30 min] (Waters-käyrä 6), sitten 20 % -> 50 % B, 80 % -> 50 % A [30 -> 40 min] (Waters- 10 käyrä 11), jossa A on 0,1-% TFA:n vesiliuos ja B on asetonitriili. Huipun detektointi suoritettiin Waters 990-diode array-detektoria käyttäen, ja jakeiden kerääminen suoritettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Saatiin kaksi seuraavanlaista jaetta: 15 iae eluoitumisaika Β: noin 18,5 min B2 noin 21,5 min

Sitten jakeet valmistettiin vakiomenetelmillä spektrianalyysiä varten lyofilisoimalla eluentista ja sit-20 ten lyofilisoimalla vedestä.

Yhdisteen rakenne, joka yhdiste muodostaa jakeen B1( määritettiin FAB MS:ää käyttäen, ja sen tulokset ovat seuraavanlaiset : FAB MS: M/Z 506 (M+l), 489, 461, 433, 378, 333, 260, 231, .; 25 215, 203, 155, 119 high resolution: 506,3810 laskettu C26H48N703 : lie rakenne: lH-indoli-3-asetamidi, N-(20-amino-4-hydroksi- 4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)-4-hydroksi

30 H H? H

H

35 Jakeessa B2 olevan yhdisteen molekyylipaino määri tettiin FAB MS:ää käyttäen, ja sen tulokset olivat seuraavanlaiset : 102171 27 FAB MS: high resolution: 505,3861 laskettu ¢-27^48^03 : lie. rakenne: 1H-indoli-3-asetamidi, N-(20-trimetyyliammonium- 4-hydroksi-4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)-4-hydroksi

5 JL n° H m . X

&nr—

H

Esimerkki 5 10 Jakeen E sisältämän yhdisteen rakenne

Jae E, joka saatiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, valmistettiin vakiomenetelmillä spektrianalyysiä varten lyofilisoimalla eluentista ja sitten lyofilisoimalla vedestä. Jakeen E sisältämän yhdisteen rakenne määritet-15 tiin FAB MS:ää, ^-NMF^ää ja 13C-NMR:ää käyttäen. Saadut tiedot ja näistä johdettu rakenne ovat seuraavat: FAB MS: M/Z 490 (M+l), 472, 433, 362, 333, 260, 215, 203, 177, 155, 119 high resolution: 490,3860 laskettu C26H48N702: lie 0,6-τηιημ 20 virheellä 3H-NMR (500 MHz, d6-DMSO): 10,89 (s, 1H), 8,90-7,85 (m, 6H) , 7,55 (d, J=8,0 Hz, 1H) , 7,34 (d, J=8,0 Hz, 1H) , 7,19 (s, 1H), 7,08 (dd, J=8,0 Hz, J=8,0 Hz, 1H), 6,98 (dd, J=8,0 Hz, J=8,0 Hz, 1H), 3,50 (s, 2H), 3,13 (m, 2H), 3,03-;; 25 2,82 (m, 18H) , 1,88 (m, 6H) , 1,78 (m, 2H) , 1,62 (m, 4H) 13C-NMR (125,76 MHz, d6-DMSO): 170,94, 136,10, 127,17, 123,75, 120,92, 118,67, 118,26, 111,33, 108,97, 57,39, 57,07, 46,12, 46,12, 44,06, 43,89, 43,89, 36,52, 36,22, 32,78, 26,71, 23,79, 23,06, 22,65, 22,65, 22,45 30 rakenne: lH-indoli-3-asetamidi, N-(20-amino-4-hydroksi- 4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)

H H? H H

©onr~---—.

35 H

102171 28

Vaihtoehtoisesti ja edullisesti kokomyrkky fraktioitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla liuotinjärjestel-mää lukuunottamatta, ja käytettiin lineaarista gradientti-ohjelmaa, jossa 0 % -> 20 % B, 100 % -> 80 % A [0 -> 5 30 min] huipun detektiolla aallonpituudella 220 nm. Jae, joka eluoitui noin 26,0 min kohdalla, lisättiin Dynamax Phenyl-kolonniin (4,6 mm x 250 mm, huokoskoko 6 nm, hiuk-kaskoko 8 μνα) ja eluoitiin käyttäen virtausnopeutta 1 ml/min ja isokraattisia olosuhteita 10 % B, 90 % A, jossa 10 A ja B ovat esimerkissä 1 kuvatut. Huipun detektio suoritettiin Waters 990-diode array-detektorilla (λ = 220 nm), ja jakeet kerättiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Jae, joka eluoitui noin 55,27 min kohdalla, lyofilisoitiin eluentista ja sitten vedestä vakiomenetelmillä, jolloin 15 saatiin esimerkin yhdiste.

Esimerkki 6 lH-indoli-3-asetamidi, N-(20-amino-4-hydroksi- 4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli

Otsikkoyhdisteen, jonka varmistettiin sisältyvän 20 jakeeseen E esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, synteesi suoritettiin alla kuvatulla tavalla.

25 A. + NC*^> -►

H

h2n/"\/n/ (I) 30 13,22 g (0,15 mol) diaminobutaania ja 3,5 ml meta-nolia sekoitettiin typpi-ilmakehässä, ja lisättiin 9,94 ml 35 (0,15 mol) akrylonitriiliä ruiskupumpun kautta 2 h aikana 102171 29 jäähdyttäen 0-5 °C:een. Seos kromatografoitiin noin 18 h kuluttua 600 g:11a silikageeliä käyttäen liuotinjärjestel-mänä 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta (2 1), ja sitten 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta, joka sisälsi 5 tilavuus-% isopropyyliamiinia (2 1). Yhdis-5 tetyn tuotteen sisältävät jakeet konsentroitiin haihduttamalla tyhjiössä, ja saatiin keltainen viskoosi öljy. NMR-analyysi varmisti tuotteen edellä olevan kaavan I mukaiseksi yhdistetyksi tuotteeksi.

10 H

B. H tK^"''^CN + Br/^-~\N_BOC ►

<«> H

H

B0C H h CN

(III) 20 5,78 g (0,041 mol) kaavan I mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä kohdassa A kuvatulla tavalla, lisättiin typpi-ilmakehässä 75 ml:aan CH3CN:ää ja 11,48 g:aan KF/seliittiä ja sekoitettiin. Sekoitettuun 25 seokseen lisättiin liuos, jossa oli 9,75 g (0,041 mol) kaavan II mukaista yhdistettä, joka valmistettiin valmistuksessa A kuvatulla tavalla, 25 ml:ssa CH3CN. Reaktioseos kuumennettiin refluksoitumaan ja seurattiin TLC:llä (3:1 CH2Cl2/MeOH) . 3 h kuluttua reaktioseos sai jäähtyä ja seis-30 tä huoneenlämpötilassa. Sitten seliitti suodatettiin pois ja suodatinkakku pestiin hyvin dikloorimetaanilla. Suodos konsentroitiin tyhjiössä. Konsentroidun suodoksen sisältämä raakatuote kromatografoitiin silikageelillä käyttäen 2 1 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta, sitten 2 1 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta ja 3 5 10 ml isopropyyliamiinia, sitten 2 1 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta ja 30 1 02 1 71 30 ml isopropyyliamiinia. Tuote eluoitui pylväästä, kun pylväs oli tullut kylläiseksi isopropyyliamiinilla, mutta se oli edelleen epäpuhdasta. Kaikki tuotejakeet yhdistettiin ja konsentroitiin. Silikageeli valmistettiin liettä-5 mällä 500 g silikageeliä CH2Cl2:aan ja 125 ml:aan isopro-pyyliamiinia, ja käytettiin sitten pylvään pakkaamiseen vakiomenetelmällä. Raakatuote lisättiin pylvääseen dikloo-rimetaania käyttäen. Sitten pylväs ajettiin 500 ml :11a dikloorimetaania, ja sitten 1 1:11a 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta.

10 Tuotejakeet yhdistettiin ja konsentroitiin tyhjiössä, jolloin saatiin 1,5 g edellä olevan kaavan III mukaista tuotetta. Toiset 2 g kaavan III mukaista tuotetta eluoitiin pylväästä käyttäen 1 1 3:1 CH2Cl2/MeOH:ta ja 30 ml isopropyyliamiinia .

15 c< m + iboc12o--►

BOC

H BOC

20 (IV) 3,5 g (11,8 mmol) kaavan III mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä olevassa osassa B kuvatulla tavalla, ja 150 ml dikloorimetaania sekoitettiin typpi-il-makehässä, ja lisättiin 5,2 g (23,6 mmol) di-t-butyylidi- 25 karbonaattia. Seosta sekoitettiin noin 68 h huoneenlämpö-tilassa. Sitten seos konsentroitiin tyhjiössä ja kromato-grafoitiin käyttäen 400 g silikageeliä ja 60:40 heksaani/-etyyliasetaatti-liuotinta, jolloin saatiin 5,62 g kaavan IV mukaista yhdistettä öljynä.

30 D. BOC

BOC H

(IV)

BOC

35 -------- * 11 BOC " (V) 31 1G2171 3,0 g kaavan IV mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa C kuvatulla tavalla, liuotettiin typpi-ilmakehässä 30 ml:aan etikkahappoa 250-ml ParrR-as-tiassa. Tähän liuokseen lisättiin 3,0 g Pd(OH) 2/hiiltä, ja 5 seosta hydrogenoitiin 2 h 345-kPa H2-paineessa. Katalysaattori poistettiin suodattamalla, ja kakku pestiin hyvin etikkahapolla. Suodos konsentroitiin, otettiin 75 ml:aan dikloorimetaania, pestiin kahdesti 75 ml :11a IN NaOH:ta ja kuivattiin K2C03:lla. Liuos konsentroitiin tyhjiössä, jolio loin saatiin 2,86 g edellä olevan kaavan V mukaista tuotetta .

E. V + NC^> -►

B0C

15 NC/\^N N

' H

BOC

(VI) 2,86 g (5,7 mmol) kaavan V mukaista yhdistettä, 20 joka valmistettiin edellä kohdassa D kuvatulla tavalla, liuotettiin typpi-ilmakehässä 75 ml:aan metanolia. Seokseen lisättiin sekoittaen 0,41 ml (6,3 mmol) akrylonitrii-liä, ja reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Sitten reak-tioseos konsentroitiin, konsentroitiin uudelleen kolmesti ; 25 30 ml:sta dikloorimetaania, ja liuotin stripattiin tyh jiössä, jolloin saatiin 3,18 g kaavan VI mukaista yhdistettä öljynä.

F. BOC BOC

3 0 VI * NC/^^Nn/^s/Nnv/S^—*N/n'>^\n-BOC

boc H

(VII) 3,18 g (5,7 mmol) kaavan VI mukaista yhdistettä, 35 joka valmistettiin edellä osassa E kuvatulla tavalla, yhdistettiin typpi-ilmakehässä 100 ml:n kanssa dikloorime- 1C 2171 32 taania ja sekoitettiin liuokseksi. Tähän liuokseen lisättiin 1,37 g (6,3 mmol) di-t-butyylidikarbonaattia, ja reaktioseosta sekoitettiin 90 min huoneenlämpötilassa. Sitten reaktioseos konsentroitiin ja kromatografoitiin 5 300 g:lla silikageeliä käyttäen 60:40 heksaani/etyyliase- taattia eluenttina. Tuotejakeet yhdistettiin, konsentroitiin, uutettiin 3 x 20 ml :11a dikloorimetaania ja liuotin stripattiin tyhjiössä, jolloin saatiin 3,12 g edellä olevan kaavan VII mukaista tuotetta.

10

r BOC BOC

VII -►

' H

BOC

(VIII) 15

Edellä kohdassa D kuvatulla tavalla 3,12 g (4,76 mmol) kaavan VII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä kohdassa F kuvatulla tavalla, liuotettiin 30 ml:aan etikkahappoa ja hydrogenoitiin 2 h 379 kPa:ssa 3,0 g 20 Pd (OH) 2/hiilen läsnäollessa, jolloin saatiin 3,02 g edellä olevan kaavan VIII mukaista tuotetta öljynä.

H. VIII + NC^> -►

25 _ BOC BOC

« I I

boc " B0C

(IX) 30 1,0 g (1,5 mmol) kaavan VIII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin osassa G kuvatulla tavalla, liuotettiin typpi-ilmakehässä 10 ml:aan metanolia. Tähän liuokseen lisättiin 0,1 ml (1,67 mmol) akrylonitriiliä, ja reaktio-35 seosta sekoitettiin yön yli. Sitten reaktioseos konsent- 1C2171 33 roitiin, konsentroitiin uudelleen kolmesti 20 ml:sta dik-loorimetaania, ja liuotin stripattiin tyhjiössä, jolloin saatiin 1,0 g edellä olevan kaavan IX mukaista tuotetta.

5 I. IX---

BOC BOC

H · i

2 N H

BOC

10 (X)

Edellä kohdassa D kuvatun menetelmän mukaisesti 1,0 g (1,4 mmol) kaavan IX mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä olevassa osassa H kuvatulla tavalla, 15 liuotettiin 30 ml:aan etikkahappoa ja hydrogenoitiin 2,5 h 345 kPa:ssa, jolloin saatiin 0,85 g edellä olevan kaavan mukaista tuotetta.

H H

(XI) 25

Valmistettiin liuos, joka sisälsi 6,78 g (20 mmol) tetrabutyyliammoniumvetysulfaattia ja 75 ml H20:ta sekoittamalla, ja lisättiin 3,36 g (40 mmol) NaHC03:a vaahtoami-sen sallimaa vauhtia. Sitten lisättiin 3,5 g (20 mmol) 30 indolietikkahappoa, seosta sekoitettiin 5 min, ja lisät-*: tiin 75 ml CHCl3:a. Seosta sekoitettiin toiset 5 min, ja pohjan 2 kerrosta erotettiin. Vesikerros suolattiin Na2-S04:llä ja uutettiin CHCl3:lla. Kaikki CHCl3-uutteet yhdistettiin ja kuivattiin Na2S04:llä. Muodostunut, väriltään 35 kirkkaan kullanruskea liuos konsentroitiin, haihdutettiin 34 1G2171 3 x 75 ml :11a asetonia, ja liuotettiin 75 ml:aan asetonia. Sitten lisättiin 1,9 ml (22 mmol) allyylibromidia, ja seos sai seistä 30 min. Sitten seos konsentroitiin ja kromato-grafoitiin silikageelillä käyttäen 3:1 heksaani/etyyliase-5 taattia, jolloin saatiin 3,57 edellä olevan kaavan XI mukaista tuotetta vaaleankeltaisena öljynä.

K· rOf XI -► °

10 I

BOC

(XII)

Menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Angew. 15 Chem. Int. Ed. Engl. 23 (1984) 298, 2,15 g (10 mmol) kaavan XI mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa J kuvatulla tavalla, yhdistettiin 20 ml:n kanssa asetonitriiliä, ja seokseen lisättiin 2,61 g (12 mmol) di-t-butyylidikarbonaattia. Sitten lisättiin 0,122 g (1 mmol) 20 4-(N,N-dimetyyliamino)pyridiiniä, ja reaktio sai edetä 15 min ajan. Sitten seos laimennettiin 125 ml:ksi etyyliasetaatilla, pestiin 2 x laimealla HCl:llä, 3 x 25 ml :11a H20, 1 x suolavedellä, kuivattiin ja konsentroitiin. Tuote puhdistettiin kromatografoimalla silikageelillä käyttäen 25 eluenttina 14,5:1 heksaani/etyyliasetaattia, jolloin saatiin 2,87 g edellä olevan kaavan XII mukaista yhdistettä värittömänä öljynä.

L. ^ 30 [il Π n xii -► 0

BOC

(XIII) 102171 35 3,27 g:aan (10,4 mmol) kaavan XII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä olevan osan K mukaisesti, 20 ml:ssa dikloorimetaania, lisättiin 7,4 ml natrium-2-etyyliheksanoaattia etyyliasetaatissa (0,231 g/ml). Sitten 5 lisättiin 0,5 g 0/3P:tä ja 0,5 g (0/3P)4Pd:tä, ja seosta sekoitettiin 60 min. Sitten seos konsentroitiin, otettiin 150 ml:aan etyyliasetaattia ja pestiin 5 x 25 ml :11a H20:lla. Vesiuutteet yhdistettiin ja uutettiin takaisin 1 x 25 ml :11a etyyliasetaattia ja 1 x 25 ml :11a dietyyli-10 eetteriä. Vesikerrokseen lisättiin 75 ml tuoretta etyyliasetaattia, ja säädettiin sitten pH happamaksi arvoon 3. Etyyliasetaattikerros erotettiin ja vesikerros uutettiin 1 x 50 ml :11a tuoretta etyyliasetaattia. 2 etyyliasetaatti-uutetta yhdistettiin ja pestiin 2 x 20 ml:11a H20:ta, sit-15 ten 1 x 20 ml :11a suolaliuosta, kuivattiin, konsentroitiin, haihdutettiin 3 x 30 ml :11a heksaania, jolloin toisen haihdutuksen aikana muodostui kiteitä. Seos laimennettiin 75 ml:ksi heksaanilla. Kiinteät aineet suodatettiin, pestiin hyvin heksaanilla ja kuivattiin ilmassa, jolloin 20 saatiin 1,37 g valkoista kiinteää ainetta. NMR varmisti kaavan XIII mukaisen otsikkoyhdisteen.

M. XIII + X ----

BOC BOC

25 π n | * ° B0C fl

BOC

(XIV) 30 200 mg (0,73 mmol) kaavan XIII mukaista yhdistettä yhdistettiin typpi-ilmakehässä 25 ml:n kanssa dikloorimetaania, 84 mg:n (0,73 mmol) kanssa N-hydroksisukkinimidiä ja 150 mg:n (0,73 mmol) kanssa disykloheksyylikarbodi-35 imidiä, jolloin muodostui sakka lähes välittömästi. Seosta 36 1 02 1 71 sekoitettiin 3 h. Sitten disykloheksyyliurea suodatettiin pois, ja suodokseen lisättiin tipoittain 40 ml kaavan X mukaisen yhdisteen dikloorimetaaniliuosta, joka yhdiste X valmistettiin esimerkin 6 osissa A - I kuvatulla tavalla.

5 Seosta sekoitettiin 12 h, ja pestiin sitten 0,1N NaOH:lla ja kuivattiin K2C03:lla, konsentroitiin ja kromatografoltiin käyttäen 150 g silikageeliä ja eluoimalla 9:1 dikloo-rimetaani/metanolia (0,5 1) epäpuhtauksien poistamiseksi, sitten 9:1:0,1 dikloorimetaani/metanoli/isopropyyliamii-10 nilla (2 1). Sitten tuote konsentroitiin, haihdutettiin dikloorimetaanilla, ja konsentroitiin edelleen, jolloin saatiin 400 mg kaavan XIV mukaista yhdistettä, joka varmistettiin 300 MHz-NMR:llä.

N. XIV--► 15

OH BOC BOC

BOC

20 (XV) 0,34 g (0,35 mmol) kaavan XIV mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä kuvatulla tavalla, yhdistettiin typpi-ilmakehässä 30 ml:n kanssa asetonia, sekoitettiin liuokseen ja jäähdytettiin noin 0 °C:een jää/asetoni-hau-25 teella. Sitten lisättiin tipoittain 0,212 g (1,05 mmol) 85-% 3-klooriperoksibenntsoehappoa 20 ml:ssa asetonia 8 -10 min aikana. Reaktioseosta sekoitettiin 30 min, ja laimennettiin sitten 150 ml:ksi dietyylieetterillä ja pestiin 2 x 25 ml:lla 10-% K2C03:a, 2 x 25 ml:lla H20:ta, 2 x 25 30 ml :11a 10-% K2C03:a, 2 x 25 ml :11a H20:ta ja kuivattiin J K2C03:lla. Seos konsentroitiin, haihdutettiin 2 x 30 ml :11a dikloorimetaania ja konsentroitiin tyhjiössä vakiopainoon O, 33 g. NMR-analyysi osoitti tuotteen olevan halutun kaavan XV mukaisen yhdisteen, lähtöaineen ja sivutuotteen 35 seos. Tuoteseos lisättiin 3 ml:aan etikkahappoa, johon lisättiin 20 mg NaCNBH3:a. Seosta sekoitettiin yön yli, etikkahappo stripattiin tyhjiössä, laimennettiin 50 ml:aan 37 1 02 1 71 dikloorimetaania ja pestiin 1 x 75 ml :11a vesipuskuria, pH 7. Tarvittaessa pH-arvo säädettiin arvoon 7 IN NaOH:lla, ja dikloorimetaanikerros erotettiin ja pestiin 1 x 50 ml :11a vesipuskuria, pH 7, ja 1 x 25 ml :11a suola-5 liuosta, kuivattiin Na2S04:llä, ja konsentroitiin tyhjiössä vakiopainoon 0,31 g. Saatu tuote kromatografoitiin 100 g: 11a silikageeliä käyttäen eluoimiseen 95:5 etyyliase-taatti/metanolia ja keräten 25-ml jakeita. Puhdistettu kaavan XV mukainen tuote tuli ulos jakeissa 18 - 25. Nämä 10 jakeet yhdistettiin, konsentroitiin, haihdutettiin 2x5 ml :11a dikloorimetaania ja konsentroitiin tyhjiössä valkoiseksi vaahdoksi, 68 mg, jota varastoitiin -80 °C:ssa Jakeet 26 - 40, jotka myös sisälsivät haluttua tuotetta, sisälsivät myös jonkin verran epäpuhtautta. Jakeet 26 - 40 15 yhdistettiin, konsentroitiin, haihdutettiin dikloorimetaa- nin kanssa ja konsentroitiin tyhjiössä vakiopainoon 66 mg. Jälkimmäinen tuote yhdistettiin 6 mg:n kanssa edellistä tuotetta, jota oli käytetty NMR-tutkimuksiin, ja seoksen kanssa, joka oli valmistettu edellä kuvatulla tavalla.

20 Saatu seos kromatografoitiin 75 g:11a silikageeliä käyttäen eluoimiseen 9:5 etyyliasetaatti/metanolia ja keräten 25-ml jakeita. Puhdistettu kaavan XV mukainen tuote oli jakeissa 16 - 21. Nämä jakeet yhdistettiin, konsentroi tiin, haihdutettiin 2 x 5 ml:n kanssa dikloorimetaania ja : 25 konsentroitiin tyhjiössä vakiopainoon 46 mg, jota säily tettiin -80 °C:ssa.

0. XV --->

30 H ?H H H

H

(XVI) 35 102171 38 108 mg (0,109 mmol) kaavan XV mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä kuvatulla tavalla, liuotettiin typpi-ilmakehässä 1,5 ml:aan dikloorimetaania. Sitten lisättiin 2 ml trifluoroetikkahappoa, ja seosta sekoitettiin 5 1 h huoneenlämpötilassa. Sitten reaktioseos konsentroitiin kalvoksi, ja lisättiin 15 ml dietyylieetteriä. Kalvo kiinteytyi ja, 30-min sekoituksen jälkeen, saatiin valkoista jauhetta. Jauhe suodatettiin, pestiin hyvin dietyylieet-terillä, kuivattiin typen alla, ja haihdutettiin sitten 10 vakiopainoon 109 mg tämän esimerkin otsikkoyhdistettä.

Esimerkki 7 lH-indoli-3-asetamidi, N-(20-amino-4-hydroksi-4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)-4-hydroksi

Otsikkoyhdiste, jonka varmistettiin sisältyvän esi-15 merkissä 3 kuvattuun jakeeseen syntetisoitiin alla kuvatulla tavalla.

20 A· OH OCHjOCHj —* ©σ

£ H

(XVII) 25

Argonilmakehässä käyttäen liekillä kuivattuja lasi-astioita 4,0 g (30 mmol) 4-hydroksi-indolia yhdistettiin 25 ml:n kanssa kuivaa DMFrää (Aldrich), ja sekoitettiin liuokseksi. Sitten lisättiin 1,44 g (30 mmol) NaH:ta 30 50-% öljydispersiona. Kun vaahtoaminen oli päättynyt, li- v sättiin 2,5 ml kloorimetyylimetyylieetteriä (Aldrich), ja muodostunutta tummanvihreää liuosta sekoitettiin yön yli. Sitten liuos laimennettiin 125 ml:ksi etyyliasetaatilla, pestiin 5 x 25 ml :11a HzO ja 1 x 25 ml :11a suolaliuosta, 35 kuivattiin Na2S04:llä ja kromatografoitiin käyttäen 4:1 102171 39 heksaani/etyyliasetaattia. Tuotteen sisältävät jakeet yhdistettiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin 2,70 g yhdistettä XVII öljynä.

B. OCH2OCH3 5 H3CN X _ .CH, XVII + N H -► (?>— R3C CH3

H

(XVIII) 10 50-ml, 3-kaulaisessa pyöreäpohjaisessa kolvissa, joka oli varustettu mekaanisella sekoittimella ja typpi-ilmakehällä, jäähdytettiin 1,3 g formaldehydin vesiliuosta (37-%) ja 2,28 g etikkahappoa. Sitten lisättiin 3,23 ml jäähdytettyä dimetyyliamiinia (25-% H20:ssa). Muodostunee-15 seen jäähdytettyyn liuokseen lisättiin 2,7 g (15,2 mmol) kaavan XVII mukaista yhdistettä käyttäen siirrossa liuottimena noin 1,5 - 2,0 ml tetrahydrofuraania. Reaktioseos lämmitettiin huoneenlämpötilaan ja sekoitettiin yön yli. Sitten lisättiin 40 ml 10-% NaOH:ta, jolloin muodostui 20 sakka. Sakka suodatettiin sekoittamisen jälkeen, pestiin H20:11a ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 3,26 g kaavan XVIII mukaista yhdistettä.

C. XVIII

OCH2OCH3 och2och3 I _ .OH + KTifY 8

N

30 H H

(XIX) <*x> 4,62 g KCN:ää yhdistettiin typpi-ilmakehässä 10 ml:n kanssa H20:ta ja sekoitettiin liuokseksi. Sitten lisättiin 30 ml etanolia ja 3,26 g (14 mmol) kaavan VIII 35 mukaista yhdistettä, ja seosta sekoitettiin ja kuumennet- 40 102171 tiin refluksoiden noin 65 h. Reaktioseos jäähdytettiin ja konsentroitiin. Kaavan XX mukaisen yhdisteen sisältävä sakka suodatettiin, pestiin H20:lla ja kuivattiin ilmassa. Vesikerros uutettiin 4 x 15 ml :11a dikloorimetaania, sääs-5 täen orgaaniset uutteet. Sitten vesikerroksen päälle lisättiin 50 ml etyyliasetaattia, ja säädettiin pH happamaksi arvoon 2. Etyyliasetaattikerros erotettiin, poistettiin kaasut ohjaamalla etyyliasetaattikerroksen läpi typpeä, kuivattiin ja konsentroitiin kiinteäksi aineeksi, joka 10 trituroitiin di-isopropyylieetterillä, jolloin saatiin 1,03 g kaavan XIX mukaista yhdistettä likaisenvalkoisena kiinteänä aineena. Sitten kaikki uutteet perusvesikerrok-sesta yhdistettiin, kuivattiin, yhdistettiin edellä saatujen suodosten kanssa ja konsentroitiin, jolloin saatiin 15 0,4 g kaavan XX mukaista yhdistettä kiinteänä aineena.

D.

XX -> XIX

20 1,6 g kaavan XX mukaista yhdistettä yhdistettiin typpi-ilmakehässä 7,5 ml:n kanssa etanolia, 30 ml:n kanssa H20:ta ja 1,3 g:n kanssa KOH:ta. Seosta kuumennettiin refluksoiden ja sekoitettiin yön yli. Sitten reaktioseos jäähdytettiin, uutettiin 2 x 15 ml :11a etyyliasetaattia, 25 lisättiin päälle tuoretta etyyliasetaattia ja säädettiin pH happamaksi arvoon 2. Yhdistetyt etyyliasetaatttkerrok-set kuivattiin ja konsentroitiin. Saatu kiinteä aine trituroitiin IPE:llä, jolloin saatiin 1,1 g kaavan XIX mukaista yhdistettä.

30 e. OCH2OCH3 ·· ^\/OCH2CH=CH2

f|l M

XIX -► °

BOC

35 (XXI) 41 102171 10 ml:aan H20:ta liuotettiin 1,44 g (4,25 mmol) TBAHS04:ää. Sitten lisättiin 714 mg (8,5 mmol) NaHC03:a. Vaahtoamisen loputtua lisättiin 1,0 g (4,25 mmol) kaavan XIX mukaista yhdistettä, ja seosta sekoitettiin 1 min en-5 nen kuin lisättiin 40 ml kloroformia. Reaktioseosta sekoitettiin 5 min, kloroformikerros erotettiin ja sitten vesi-seos uutettiin 1 x 15 ml:11a kloroformia. Yhdistetyt klo-roformiuutteet kuivattiin, konsentroitiin ja haihdutettiin 2 x 30 ml:11a asetonia. Sitten tuote liuotettiin uudelleen 10 30 ml:aan asetonia typpi-ilmakehässä, lisättiin 0,37 ml (4,25 mmol) allyylibromidia, ja reaktioseosta sekoitettiin 2 h. Seos konsentroitiin ja kromatografoitiin käyttäen etyyliasetaattia eluenttina. Tuote konsentroitiin, jolloin saatiin 1,1 g öljyä. Koko tuote yhdistettiin 25 ml:n kans-15 sa dikloorimetaania, ja lisättiin 0,98 g (4,5 mmol) di-t-butyylidikarbonaattia ja 51 mg (0,425 mmol) 4-(N,N-dime-tyyliamino)pyridiiniä. Reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Sitten reaktioseos konsentroitiin ja kromatografoitiin käyttäen 9:1 heksaani/etyyliasetaattia, jolloin konsent-20 roinnin jälkeen saatiin 1,33 g kaavan XXI mukaista yhdistettä viskoosina öljynä.

OCH-OCH

F· I * J

I ^ OH

ril— ^ U II M o 25 XXI----

BOC

(XXII) 64 mg (0,17 mmol) kaavan XXI mukaista yhdistettä 30 liuotettiin 2 ml:aan metanolia. Tähän liuokseen lisättiin 1,7 ml 0,IN NaOH:ta, ja muodostunutta reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Sitten reaktioseoksen pH säädettiin hap-pamaan arvoon, kuivattiin, uutettiin etyyliasetaatilla ja konsentroitiin. NMR-analyysi osoitti, että kaikki kaavan 35 XXI mukaisesta allyyliesteristä oli poistunut, mutta jon- 42 1 02 1 71 kin verran trans-esteröintiä oli tapahtunut, ja jonkin verran metyyliesteriä oli läsnä. Siksi tuote yhdistettiin jäljellä olevan kaavan XXI mukaisen yhdisteen määrän kanssa (noin 1,26 g), liuotettiin 5 ml:aan tetrahydrofuraania 5 ja jäähdytettiin 0 °C:een. Sitten lisättiin 3,8 ml IN NaOHrta, reaktioseosta sekoitettiin 5 min 0 °C:ssa, ja annettiin sitten lämmetä huoneenlämpötilaan. Reaktio tuotti kaksi kerrosta, joiden yhdistämiseen tarvittiin 5 ml metanolia. Reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Sitten tet-10 rahydrofuraani ja metanoli stripattiin pois, ja jäljellä olevan vesiliuoksen päälle lisättiin 50 ml etyyliasetaattia, ja säädettiin happamaan pH-arvoon 2. Etyyliasetaat-tikerros erotettiin, pestiin 1 x 20 ml :11a H20:ta, kerran suolaliuoksella, kuivattiin Na2S04:llä, suodatettiin ja 15 konsentroitiin kumiksi, joka kiteytyi heksaanilla tritu-roitaessa, jolloin saatiin 1,08 g valkoista kiinteää ainetta. Kiinteä aine kromatografoitiin käyttäen 70:30 etyy-liasetaatti/heksaania, ja puhtaat tuotejakeet yhdistettiin, konsentroitiin ja kiteytettiin etyyliasetaatti/hek-20 saanista, jolloin saatiin 0,884 g kaavan XXII mukaista yhdistettä.

G. XXII +

BOC

2 H i t

BOC BOC

(X)

30 OCH-OCH, „ _ BOC BOC

• i a j n n | | KTl—

O BOC

N— N

BOC

35 (XXIII) « 102171 271 mg (0,81 mmol) kaavan XXII mukaista yhdistettä liuotettiin typpi-ilmakehässä sekoittaen 4 ml:aan vedetöntä tetrahydrofuraania. Sitten lisättiin 93 mg (0,81 mmol) N-hydroksisukkinimidiä ja 167 mg (0,81 mmol) disyklohek-5 syylikarbodi-imidiä, ja seosta sekoitettiin. 1 h 15 min kuluttua lisättiin 30 ml:ssa dikloorimetaania 0,58 g (0,8 mmol) kaavan X mukaista yhdistettä, joka valmistettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, ja seosta sekoitettiin viikonlopun yli. Sitten disykloheksyyliurea suodatettiin 10 pois, ja seos uutettiin 2x3 ml :11a IN NaOH, kuivattiin K2C03:lla ja konsentroitiin. Sitten tuote kromatografoitiin 100 g:11a silikageeliä käyttäen 9:1 dikloorimetaani/me-tanolia eluoimaan kaiken, paitsi halutun tuotteen, ja sitten 90:10:1 dikloorimetaani/metanoli/isopropyyliamiinilla 15 tuotteen eluoimiseksi. Tuotteen sisältävät jakeet konsentroitiin, haihdutettiin useita kertoja dikloorimetaanin kanssa ja stripattiin liuotin, jolloin saatiin 349 mg kaavan XXIII mukaista yhdistettä valkoisena vaahtona.

Vaihtoehtoisesti, ja edullisesti, 50 ml liuosta, 20 joka sisälsi 0,480 g (1,43 mmol) kaavan XXII mukaista yhdistettä dikloorimetaanissa, käsiteltiin 0,165 g: 11a (1,43 mmol) N-hydroksisukkinimidiä, ja sitten 0,294 g:lla (1,43 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidiä, ja sekoitettiin 5 h. Reaktioseos suodatettiin, ja raa'an hydroksisuk-25 kinimidin sisältävä suodos lisättiin tipoittain 20 min aikana 100 ml:aan liuosta, jossa oli dikloorimetaanissa 1,03 g (1,43 mmol) kaavan X mukaista yhdistettä, joka valmistettiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Reaktioseosta sekoitettiin 72 h. Sitten raaka reaktioseos pestiin kah-30 desti 20 ml :11a IN NaOH, kuivattiin K2C03:lla, suodatettiin ja konsentroitiin. Sitten tuote kromatografoitiin silika- « geelillä käyttäen 4:1 dikloorimetaani/metanolia, ja sitten 9:1:1 dikloorimetaani/metanoli/diisopropyyliamiinia, jolloin saatiin 912 mg kaavan XXIII mukaista yhdistettä.

35 44 102171 H. XXIII -—-—►

OCH-OCH, p OH BOC BOC

5 i 2 3 n t i »

BOC " B0C

BOC

(XXIV) 10

Kaavan XXIII mukaista indoliasetamidia (900 mg, 0. 87 mmol) liuotettiin typen alla 40 ml:aan dikloorimetaa-nia. Tähän liuokseen lisättiin 2-(fenyylisulfonyyli)-3-fenyylioksatsiridiinia (500 mg, 1,92 mmol). Reaktion edis- 15 tyrnistä seurattiin ohutlevukromatografiällä. 1 h kuluttua reaktioseos konsentroitiin tyhjiössä, jolloin saatiin pääosin raakaa nitronia, joka liuotettiin 35 ml:aan etikka-happoa. Lisättiin suuri ylimäärä natriumsyaaniborohydridiä (1,00 g, 15,9 mmol), ja reaktioseosta sekoitettiin noin 20 2 h. Reaktioseos konsentroitiin tyhjiössä, otettiin dik- loorimetaaniin (50 ml) , pestiin pH 7-puskurilla (1 x 50 ml) säätäen pH:n arvoon 7 IN NaOH:lla. Orgaaninen kerros pestiin jälleen pH 7-puskurilla (1 x 50 ml) , kuivattiin kaliumkarbonaatilla ja konsentroitiin tyhjiössä, jol-25 loin saatiin raakatuote, joka kromatografoitiin silikagee-lillä käyttäen 95:5 etyyliasetaatti/metanolia, jolloin saatiin 612 mg (67 %) kaavan XXIV mukaista yhdistettä valkoisena vaahtona.

1. xxiv -► 30

°H H ?" H H

h NH2 (XXV)

35 H

102171 45

Imien vuorotellen tyhjiön ja päästäen argonia kolmesti 3 ml:sta trifluorietikkahappoa poistettiin kaasua. Sitten kolvi käärittiin alumiinifolioon, ja lisättiin 98 mg kaavan XXIV mukaista yhdistettä käyttäen noin 2,5 ml 5 dikloorimetaania siirtoreagenssina. Seos konsentroitiin 45 min kuluttua, jolloin saatiin öljy, josta saatiin di-etyylieetterillä trituroimalla 88 mg kaavan XXV mukaista yhdistettä valkoisena kiinteänä aineena, joka säilytettiin -80 °C:ssa.

10 Vaihtoehtoisesti, ja edullisesti, 100 ml:aan kyl läistä dioksaani/HCl-liuosta, joka oli puhallettu argonilla, lisättiin 10 ml:ssa dioksaania 1,5 min aikana 0,520 g (0,495 mmol) kaavan XXIV mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa H kuvatulla tavalla. Muodostui sakka 15 välittömästi, ja reaktioseosta sekoitettiin 1 h. Sitten lisättiin dietyylieetteriä, ja 5 min kuluttua liuos suodatettiin. Saadut kiinteät aineet pestiin dietyylieetteril-lä, kuivattiin typpi-ilmakehässä ja sitten alennetussa paineessa, jolloin saatiin 345 mg kaavan XXIV mukaista 20 happoa, jota voitiin säilyttää -78 °C:ssa. Sitten vesi-liuokseen, joka puhallettiin argonilla, lisättiin 150 mg (0,205 mmol) kaavan XXIV mukaista happoa. Reaktiota seurattiin HPLC:llä. Reaktion edettyä loppuun noin 7 h kuluttua reaktioseos pakastekuivattiin, jolloin saatiin 103 mg 25 kaavan XXV mukaista yhdistettä hydrokloridisuolanaan.

Esimerkki 8

Bentsamidi, N-(20-amino-4-hydroksi-4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)-4-hydroksi

Otsikkoyhdiste, jonka varmistettiin sisältyvän esi-30 merkissä 2 kuvattuun jakeeseen A' , syntetisoitiin alla ; kuvatulla tavalla.

46 102171

\\ . S

5 HO HO

(XXVI) 400-ml kolvissa yhdistettiin 6,78 g (20 mmol) tet-rabutyyliammoniumvetysulfaattia 60 ml:n kanssa H20:ta, ja 10 sekoitettiin liuokseksi. Sitten lisättiin vaahtoamisen sallimaan tahtiin 3,36 g (40 mmol) NaHC03:a, ja sitten 40 ml liuosta, joka sisälsi 2,76 g (20 mmol) p-hydroksi-bentsoehappoa, 0,8 g NaOHrta ja 40 ml H20:ta. Reaktioseosta sekoitettiin 5 min, ja sitten lisättiin 200 ml dikloorime-15 taania. Seosta sekoitettiin toiset 5 min, ja kerrosten annettiin erottua. Vesikerros uutettiin kahdesti 50 ml:11a dikloorimetaania. Yhdistetyt dikloorimetaaniuutteet kuivattiin Na2S04:llä, konsentroitiin, haihdutettiin kahdesti 75 ml:n kanssa asetonia, ja liuotettiin uudelleen 20 50 ml:aan asetonia. Sitten lisättiin 1,9 ml (22 mmol) al- lyylibromidia, ja seosta sekoitettiin. Sitten reaktioseos konsentroitiin, otettiin 100 ml:aan etyyliasetaattia, pestiin kahdesti 30 ml :11a H20:ta, kerran 50 ml :11a kylläistä bikarbonaattia, kerran 30 ml :11a H20:ta, kerran suola-; 25 liuoksella, kerran H20:lla ja kerran suolaliuoksella. Muo dostunut tuote kuivattiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin öljy. Öljyä trituroitiin 50 ml :11a petrolieetteriä 1 h ajan. Sitten seos suodatettiin, pestiin hyvin petroli-eetterillä ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 1,7 g 30 edellä olevan kaavan XXVI mukaista yhdistettä.

« B. 0

II

och2 ch=ch2 xxvi -► CH,0CH,0 35 i i (XXVII) 47 1C2171 1,7 g (9,55 mmol) kaavan XXVI mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä kohdassa A kuvatulla tavalla, yhdistettiin typen alla 50 ml:n kanssa kuivaa DMF:ää (Aldrich), ja sekoitettiin liuokseen. Sitten lisättiin 5 0,38 g (9,55 mmol) NaH:ta 60-% öljydispersiona ja reaktio- seosta sekoitettiin yön yli. Sitten lisättiin 0,76 ml kloorimetyylimetyylieetteriä (Aldrich), jolloin muodostui sakka välittömästi. Reaktioseos sekoitettiin 18 h. Reaktio sammutettiin seoksella, jossa oli 200 ml etyyliasetaat-10 tia/100 ml H20. Etyyliasetaattikerros erotettiin, pestiin 3: sti 50 ml :11a H20:ta, kerran 50 ml :11a IN NaOH, kerran 50 ml :11a H20:ta ja kerran suolaliuoksella. Saatu liuos kuivattiin, konsentroitiin ja kromatografoitiin silikageelil-lä käyttäen 4:1 heksaani/etyyliasetaattia, jolloin saatiin 15 1,63 g edellä olevan kaavan XXVII mukaista yhdistettä.

c. o 20 XXVII --► CH30CH20 (XXVIII) ;; 25 1,62 g (7,3 mmol) kaavan XXVII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa B kuvatulla tavalla, liuotettiin 75 ml:aan tetrahydrofuraania. Sitten lisättiin liuos, jossa oli 0,4 g (10 mmol) NaOH:ta 15 ml:ssa H20:ta, jolloin muodostui 2 kerrosta. Lisättiin metanoli, kunnes 30 saatiin tasainen seos. Sitten reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Tetrahydrofuraani ja metanoli stripattiin pois tyhjiössä, ja jäljelle jäänyt vesiliuos uutettiin kahdesti 15 ml :11a etyyliasetaattia. Sitten vesikerroksen päälle lisättiin 50 ml tuoretta etyyliasetaattia, ja pH säädet-35 tiin happamaksi pH-arvoon 2,5 6N HCl:llä. Sitten etyyli- 48 102171 asetaattikerros erotettiin, pestiin kerran 10 ml :11a H20:ta ja kerran 25 ml:11a suolaliuosta. Muodostunut liuos konsentroitiin, jolloin saatiin kiinteää ainetta, joka tritu-roitiin heksaanilla, suodatettiin ja kuivattiin ilmassa, 5 jolloin saatiin 1,2 g edellä olevan kaavan XXVIII mukaista yhdistettä.

D. X + XXVIII--►

10 BOC

9 Nv^X-v/N"B0C

H H BOC BOC

OCHjOCHj (XXXII)

Ib 20-ml dikloorimetaaniliuos, joka sisälsi 0,127 g (0,7 mmol) kaavan XXVIII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa C kuvatulla tavalla, käsiteltiin 20 0,081 g :11a (0,7 mmol) N-hydroksisukkinimidiä, ja sitten 0,144 g:lla (0,7 mmol) disyklohehsyylikarbodi-imidiä, ja sekoitettiin 4 h. Sitten reaktioseos suodatettiin, ja suo-dos, joka sisälsi raa'an hydroksisukkinimidin, lisättiin tipoittain 20 min aikana 80 ml:aan dikloorimetaaniliuosta, 25 joka sisälsi 0,50 g (0,7 mmol) kaavan X mukaista yhdistettä, joka valmistettiin tavalla, joka kuvattiin edellä esimerkin 6 osissa A - I. Sitten reaktioseosta sekoitettiin 17 h. Sitten reaktioseos pestiin IN NaOH:lla (2 x 20 ml), kuivattiin kaliumkarbonaatilla, suodatettiin ja konsent-30 roitiin. Konsentraatti kromatografoitiin silikageelillä käyttäen 9:1 dikloorimetaani/metanolia, ja sitten 9:1:0,25 dikloorimetaani/metanoli/di-isopropyyliamiinia, j olioin saatiin 370 mg edellä olevan kaavan XXXII mukaista yhdistettä .

35 49 102171 E. XXXII -►

B0C

^/0!* r^Lc och2och3 (XXXIV) 10 0,335 g (0,38 mmol) kaavan XXXII mukaista yhdistet

tä, joka valmistettiin edellä osassa D kuvatulla tavalla, liuotettiin typen alla 30 ml:aan dikloorimetaania. Tähän liuokseen lisättiin 0,230 g (0,88 mmol) 2-(sulfonyylife-nyyli)-3-fenyylioksatsiridiinia. 0,5 h kuluttua reaktio-15 seos konsentroitiin tyhjiössä, ja konsentraatti liuotettiin 15 ml:aan etikkahappoa. Lisättiin suuri ylimäärä syaaniborohydridiä (0,100 g, 1,6 mmol), ja reaktioseosta sekoitettiin 2 h. Sitten reaktioseos konsentroitiin tyhjiössä, otettiin 50 ml:aan dikloorimetaania, pestiin ker-20 ran 50 ml :11a pH 7-puskuria, säätäen pH:n arvoon 7 IN NaOH:lla. Orgaaninen kerros pestiin jälleen 50 ml :11a pH

7-puskuria, kuivattiin kaliumkarbonaatilla ja konsentroitiin tyhjiössä. Konsentraatti kromatografoitiin silikagee-lillä käyttäen 50:50 asetoni/heksaania, jolloin saatiin 25 253 mg edellä olevan kaavan XXXIV mukaista yhdistettä.

F. (XXXIV) -► 3 0 j? Nv^\/NH2 .·. /0®^ L ® ®

HO

(XXXVI) 102171 50

Yhdistettiin argon-ilmakehässä huoneenlämpötilassa 0,20 g (0,223 mmol) kaavan XXXIV mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa E kuvatulla tavalla, ja 5 ml trifluorietikkahappoa. Reaktioseosta sekoitettiin 1,5 h.

5 Lisättiin vielä 2 ml trifluorietikkahappoa kolvin seinämien huuhtomiseksi. Reaktio sai edetä vielä 1,5 h. Sitten reaktioseos konsentroitiin tyhjiössä, trituroitiin etyyli-eetterillä, suodatettiin ja kuivattiin typen alla, jolloin saatiin 218 mg kaavan XXXVI mukaista tämän esimerkin ot-10 sikkoyhdistettä.

Esimerkki 9

Bentsamidi, N-(20-amino-4-hydroksi-4,8,12,17-tetra-atseikos-l-yyli)-2,5-dihydroksi

Otsikkoyhdiste, jonka varmistettiin sisältyvän esi-15 merkissä 3 kuvattuun jakeeseen Alf syntetisoitiin alla kuvatulla tavalla..

A· ?H S f 8 XÄ.OH ^

OH 0H

(XXIX) 25 Käyttäen esimerkin 7 osassa A kuvattua menetelmää, mutta lähtien 3,08 g:sta (20 mmol) 2,5-dihydroksibentsoe-happoa saatiin 3,0 g edellä olevan kaavan XXIX mukaista yhdistettä.

102171 51 Β· OCH2OCH3 JL ^ och2ch»ch2 5 XXIX -»> OCH2OCH3 (XXX) 3,0 g (15,5 mmol) kaavan XXIX mukaista yhdistettä 10 yhdistettiin typen alla 50 ml:n kanssa kuivaa DMF:ää (Aldrich), ja sekoitettiin liuokseksi. Sitten lisättiin 1,24 g (31 mmol) NaH:ta 60-% öljydispersiona, ja seosta sekoitettiin. 3 h kuluttua lisättiin 2,5 ml (33 mmol) kloorimetyylimetyylieetteriä, ja reaktioseosta sekoitet-15 tiin 18 h. Sitten reaktioseos lisättiin 300 ml:aan etyyliasetaattia ja 100 ml:aan H20:ta. Sitten etyyliasetaattiker-ros erotettiin ja pestiin 3 kertaa 75 ml :11a H20:ta, kahdesti 75 ml :11a IN NaOH:ta, kahdesti 50 ml:lla HzO:ta ja kerran suolaliuoksella. Muodostunut liuos kuivattiin ja 20 konsentroitiin, jolloin saatiin 2,9 g öljyä, joka kromato-grafoitiin silikageelillä käyttäen 4:1 heksaani/etyyliase-taattia, jolloin saatiin 2 jaetta, joista toinen jae sisälsi 1,16 g edellä olevan kaavan XXX mukaista yhdistettä.

: 25 c# OCH2OCH3

O

I il ^ί^οΗ XXX -► 30 OCH2OCH3 (XXXI) « 10 ml:aan tetrahydrofuraania lisättiin 1,16 g (4,1 mmol) edellä olevan kaavan XXX mukaista yhdistettä. Sitten 35 lisättiin 0,24 g (6 mmol) NaOH:ta 10 ml:ssa HzO:ta, jolloin 52 102171 muodostui 2 faasia. Seokseen lisättiin metanolia, kunnes saatiin 1 faasi, ja sitten seosta sekoitettiin 18 h. Sitten liuottimet poistettiin, ja jäljelle jäänyt vesiliuos uutettiin kahdesti 15 ml :11a etyyliasetaattia. Sitten ve-5 sikerroksen päälle lisättiin 35 ml tuoretta etyyliasetaattia, ja pH säädettiin arvoon 2,5 6N HCl:llä. Sitten etyy-liasetaattikerros erotettiin, pestiin kerran 10 ml :11a H20:ta, ja kerran suolaliuoksella, kuivattiin ja konsentroitiin, jolloin saatiin 1,0 g edellä olevan kaavan XXXI 10 mukaista yhdistettä öljynä.

d. x + xxxi -► OCH-OCH,

| 2 3 BOC

H H BOC BOC

OCHjOCHj (XXXIII) 20 Käyttäen edellä esimerkin 8 osassa D kuvattua mene telmää ja käyttäen 0,17 g (0,7 mmol) kaavan XXXI mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä kohdassa C kuvatulla tavalla, 0,081 g (0,7 mmol) N-hydroksisukkinimidiä, 0,144 g (0,7 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidia ja 0,50 g (0,7 : 25 mmol) kaavan X mukaista yhdistettä, joka valmistettiin esimerkin 6 osissa A - I kuvatulla tavalla, saatiin kroma-tografian jälkeen 370 mg edellä olevan kaavan XXXIII mukaista yhdistettä.

E. XXXIII --—--► 30 *: OCH-OCH,

I * 3 BOC

H OH BOC BOC

35 OCHjOCHj (XXXV) 102171 53 Käyttäen esimerkin 8 osassa E kuvattua menetelmää ja käyttäen 0,308 g (0,33 mmol) kaavan XXXIII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa D kuvatulla tavalla, ja 0,250 g (0,96 mmol) 2-(sulfonyylifenyyli)-3-5 fenyylioksatsiridiinia, saatiin silikageelillä kromatogra-foimisen jälkeen etyyliasetaattia ja sitten 50:50 aseto-ni/heksaania käyttäen 210 mg edellä olevan kaavan XXXV mukaista yhdistettä.

10 f. XXXV -► f fl ____ Jv^^NH2 φ» L h h

OH

(XXXVII)

Esimerkin 8 osassa F kuvatulla tavalla, ja käyttäen 20 0,100 g (0,104 mmol) kaavan XXXV mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa E kuvatulla tavalla, saatiin 108 mg kaavan XXXVII mukaista tämän esimerkin otsikkoyh-distettä.

Esimerkki 10 : 25 lH-indoli-3-asetamidi, N-(16-amino-4-hydroksi- 4,8,13-triatsaheksadek-l-yyli)-4-hydroksi

Otsikkoyhdiste, jonka varmistettiin sisältyvän esimerkissä 3 kuvattuun jakeeseen A2, syntetisoitiin alla kuvatulla tavalla.

30

A* BOC

2 H '

BOC

(XXXVIII) 102171 54

Esimerkin 6 osassa D kuvatulla tavalla, ja käyttäen 1,15 g (2,07 mmol) kaavan VI mukaista yhdistettä, joka valmistettiin esimerkin 6 osissa A - E kuvatulla tavalla, saatiin 1,10 g edellä olevan kaavan XXXVIII mukaista raa-5 katuotetta.

B* XXXVIII + XXII--► JWCH3 H h f*

Ji jJ o BOC H

— N

BOC

(XXXIX) 15 Esimerkin 7 osassa G kuvatulla vaihtoehtoisella me netelmällä, ja käyttäen dikloorimetaaniliuosta (15 ml), joka sisälsi 0,228 g (6,8 mmol) kaavan XXII mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä esimerkin 7 osissa A - F kuvatulla tavalla, 0,380 g (6,8 mmol) kaavan XXXVIII 20 mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa A kuvatulla tavalla, 0,078 g (6,8 mmol) N-hydroksisukkinimi-diä ja 0,140 g (6,8 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidiä, saatiin silikageelillä kromatografoimalla 9:1 dikloorime-taani/metanolia ja sitten 9:1:0,5 dikloorimetaani/metano-25 li/di-isopropyyliamiinia käyttäen 0,407 g kaavan XXXIX mukaista yhdistettä.

C* XXXIX--►

30 OCHjOCHj H OH HOC

BOC

(XL) 102171 55

Esimerkin 7 osassa H kuvatulla tavalla, ja käyttäen 0,350 g (0,4 mmol) kaavan XXXIX mukaista yhdistettä ja 0,230 g (0,88 mmol) 2-(sulfonyylifenyyli)-3-fenyylioksat-siridiinia saatiin silikageelillä kromatografoinnin jäl-5 keen 50:50 asetoni/heksaania käyttäen 0,274 g edellä olevan kaavan XL mukaista yhdistettä. Tuote sisälsi pienen määrän fenyylisulfonamidia, ja sitä puhdistettiin sen vuoksi edelleen silikageelillä etyyliasetaattia, ja sitten 50:50 asetoni/heksaania käyttäen.

10 D# XL ---►

P* H ?H H

15 & ΓΤ

H

(XLI)

Esimerkin 7 osassa I kuvatulla vaihtoehtoisella me-20 netelmällä, ja käyttäen 0,166 g (0,186 mmol) kaavan XL mukaista yhdistettä, joka valmistettiin edellä osassa C kuvatulla tavalla, saatiin dioksaani/HCl-käsittelyn jälkeen raaka happo. Kaavan XL' mukainen happo liuotettiin veteen 8 h:ksi, ja pakastekuivattiin sitten, jolloin saa- : 25 tiin 88 mg kaavan XLI mukaista yhdistettä.

Valmistus A-3 0

H

« • 34,5 g (157,6 mmol) 3-bromipropyyliamiini*HBr:ää sekoitettiin typen alla 600 ml:aan N,N-dimetyyliformami-35 dia. Tähän liuokseen lisättiin 34,4 g (157,6 mmol) di-t- 102171 56 butyylidikarbonaattia, ja sitten 32,3 ml (236 mmol) tri-etyyliamiinia. Muodostui sakka välittömästi. Reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Sitten reaktioseos laimennettiin 1,5 l:ksi etyyliasetaatilla, pestiin kerran 500 ml :11a IN 5 HCl.-ää, kolmesti 500 ml:11a vettä, kerran suolaliuoksella, ja kuivattiin Na2S04:llä. Konsentroinnin jälkeen tuote kro-matografoitiin 800 g:11a silikageeliä 4:1 heksaani/-etyyliasetaattia käyttäen, ja jakeita seurattiin ohutker-roskromatografiällä (KMN04/l2). Tuotteen sisältävät jakeet 10 yhdistettiin, konsentroitiin tyhjiössä, haihdutettiin kahdesti 50 ml: n kanssa dikloorimetaania ja puhdistettiin suurtyhjiöllä, jolloin saatiin 25,8 g tämän valmistuksen tuotetta.

Claims (16)

102171 Patenttivaatimus Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen olennaisen puhtaan indoli-3-asetamidi- tai bentsamidi-N-poly-5 amiinijohdannaisen ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, joka yhdiste on jokin seuraa-vista:

10. H? H H JkN-x-X

15. H H? H H KY] , (B o H f" H B? H xAn/ H ,0H H OH H H H OH O g OH H H OH OH H H (A') HO 102171 tunnettu siitä, että (a) haluttaessa yhdiste, jolla on kaava A' il _ 5 hl HO Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan C-18 VydacR-kolon-nista (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 10 μπι) käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjär- jestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % - 10 % asetonitriili, 95 % - 90 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 12,5 min 15 kohdalla, kerätään, ja mahdollisesti, lyofilisoidaan, sus- pendoidaan uudelleen veteen ja lyofilisoidaan vedestä, tai vaihtoehtoisesti kaavan XXVIII mukainen yhdiste O II 20 (XXVIII) CH3OCH2C> saatetaan reagoimaan inertissä liuottimessa inertissä il-,; ' 25 makehässä N-hydroksisukkinimidin kanssa, ja sitten disyk- loheksyylikarbodi-imidin kanssa, ja sitten kaavan X mukaisen yhdisteen kanssa BOC BOC H i ^

30 H (X) BOC • < inertissä liuottimessa, tuote saatetaan sitten reagoimaan inertissä ilmakehässä 2-(sulfonyylifenyyli)-3-fenyylioks-35 atsiridiinin kanssa ja sitten syaaniboorihydridin kanssa, 102171 ja tämän tuote saatetaan reagoimaan inertissä ilmakehässä trifluorietikkahapon kanssa; (b) haluttaessa yhdiste, jolla on kaava Aj on CJ u OH Π H on Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan C-18 VydacR-kolon-10 nista (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 μτα) käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjär-jestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % - 20 % asetonitriili, 95 % - 80 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [0 - 30 min], sitten 20 % - 70 % asetonitriili, 80 15 % - 30 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [30 min - 55 min] ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 21 min kohdalla, kerätään ja lisätään C-4 VydacR-kolonniin (10 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 5 μπι) ja eluoidaan 20 käyttäen virtausnopeutta 4,0 ml/min, ja liuotinjärjestel-mää lineaarisella gradienttiohjelmalla 0 % -» 10 % asetonitriili, 100 % - 90 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesi-liuos ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 7 min koh-: 25 dalla, kerätään ja mahdollisesti lyofilisoidaan, suspen- doidaan uudelleen veteen ja lyofilisoidaan, tai vaihtoehtoisesti kaavan XXXI mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan OCH2OCH3 o 30 (XXXI) OP™ OCH2OCH3 inertissä liuottimessa inertissä ilmakehässä N-hydroksi-35 sukkinimidin, ja sitten disykloheksyylikarbodi-imidin 102171 kanssa, ja sitten kaavan X mukaisen yhdisteen kanssa H BOC BOC

5 BOC H sitten tuote saatetaan reagoimaan inertissä ilmakehässä 2-(sulfonyylifenyyli)-3-fenyylioksatsiridiinin ja sitten syaaniboorihydridin kanssa, ja tästä saatava tuote saate-10 taan sitten reagoimaan inertissä ilmakehässä trifluori-etikkahapon kanssa; (c) haluttaessa yhdiste, jolla on kaava A2 on H H? H 15 (\\ ίΓΤ JJ NH2 0 H Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan C-18 VydacR-kolon-nista (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 20 10 μη\) käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjär- jestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % - 20 % asetonitriili, 95 % -* 80 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [0 - 30 min], sitten 20 % - 70 % asetonitriili, 80 - 30 % 0,1-% trifluorihapon vesiliuos [30 - 55 min], ja 25 monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 21 min kohdalla, kerätään ja lisätään C-4 VydacR-kolonniin (10 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 5 μπι) ja eluoidaan käyttäen virtausnopeutta 4,0 ml/min, ja liuotinjärjestelmää lineaa-30 risella gradienttiohjelmalla 0 % - 10 % asetonitriili, ; 100 % -» 90 % 0,1-% trif luorietikkahapon vesiliuos ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 9 min kohdalla, kerätään ja mahdollisesti lyofilisoidaan, suspendoidaan uu 102171 delleen veteen ja lyofilisoidaan, tai vaihtoehtoisesti kaavan XXII mukainen yhdiste SV koe <XXII> 10 saatetaan reagoimaan inertissä liuottimessa inertissä ilmakehässä N-hydroksisukkinimidin, sitten disykloheksyyli-karbodi-imidin ja sitten kaavan XXXVIII mukaisen yhdisteen kanssa 15 ®0C H (xxxviii)

2 H · H BOC sitten tuote saatetaan reagoimaan inertissä ilmakehässä 20 2-(sulfonyylifenyyli)-3-fenyylioksatsiridiinin ja sitten syaaniboorihydridin kanssa, ja tämän tuote saatetaan sitten joko reagoimaan trifluorietikkahapon kanssa inertissä ilmakehässä, tai liuotetaan inertissä ilmakehässä kylläiseen dioksaani/HCl-liuokseen, otetaan sieltä talteen ja 25 lisätään inertissä ilmakehässä vesiliuokseen; (d) haluttaessa yhdiste, jolla on kaava Βχ X S «

30 U II • « Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan C-18 VydacR-kolon-nista (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 μπι) käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjär-35 jestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % -» 20 % 102171 asetonitriili, 95 % - 80 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [0 - 30 min], sitten 20 % - 70 % asetonitriili, 80 % - 30 % 0,1-% trif luorietikkahapon vesiliuos [30 - 55 min] ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituu-5 della 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 22,75 min kohdalla, kerätään, lisätään C-4 VydacR-kolonniin (22 mm x 250 mm, huokoskoko 3 0 nm, hiukkaskoko 10 μτη) ja eluoidaan käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjärjestelmää ei-lineaarisella gradienttiohjelmalla 0 % - 0 % asetonit-10 rilli, 100 % -» 100 % 0,1-% trif luorietikkahapon vesiliuos [0-5 min], sitten 0 % - 10 % asetonitriili, 100 % - 90 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [5 - 20 min] (Waters-käyrä 1) , sitten 10 % - 20 % asetonitriili, 90 % - 80 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [20 - 30 min] (Wa-15 ters-käyrä 6) , sitten 20 % - 50 % asetonitriili, 80 % -50 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [30 - 40 min] (Waters-käyrä 11) ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 18,5 min kohdalla, kerätään ja mahdollisesti lyofilisoi-20 daan, suspendoidaan uudelleen veteen ja lyofilisoidaan, tai vaihtoehtoisesti kaavan XXII mukainen yhdiste OCH2OCH3 !S 07^°" BOC saatetaan reagoimaan inertissä liuottimessa inertissä ilmakehässä N-hydroksisukkinimidin, sitten disykloheksyyli-karbodi-imidin ja sitten kaavan X mukaisen yhdisteen kans-30 sa i · ?°C (x) 2 |j , , Vs^>N· \\

35 BOC BOC “ 102171 sitten tuote saatetaan reagoimaan inertissä ilmakehässä 2-(sulfonyylifenyyli)-3-fenyylioksatsiridiinin ja sitten syaaniboorihydridin kanssa, ja tämän tuote saatetaan sitten joko reagoimaan trifluorietikkahapon kanssa inertissä 5 ilmakehässä tai liuotetaan inertissä ilmakehässä kylläiseen dioksaani/HCl-liuokseen, otetaan sieltä talteen ja lisätään inertissä ilmakehässä vesiliuokseen; (e) haluttaessa yhdiste, jolla on kaava E HO

10 H , H H H

15 Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan C-18 VydacR-kolon-nista (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 μτη) käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjär-jestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % - 20 % asetonitriili, 95 % - 80 % 0,1-% trifluorietikkahapon ve-20 siliuos [0 - 30 min] , sitten 20 % - 70 % asetonitriili, 80 % - 30 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [30 -55 min] ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 27,5 min kohdalla, kerätään, ja mahdollisesti jae lyofilisoidaan, 25 suspendoidaan uudelleen veteen ja lyofilisoidaan, tai vaihtoehtoisesti Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan mainitusta kolonnista käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjärjestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 0 % - 20 % asetonitriili, 100 % - 80 % 0,1-% tri- 30 fluorietikkahapon vesiliuos ja huipun detektointia aallonpituudella 220 nm, jae, joka eluoituu noin 26,0 min kohdalla, kerätään ja lisätään Dynamax Phenyl-kolonniin (4,6 mm x 250 mm, huokoskoko 6 nm, hiukkaskoko 8 μτη) ja eluoidaan käyttäen virtausnopeutta 1 ml/min, isokraattisia 35 olosuhteita, jolloin käytetään 10 % asetonitriiliä ja 90 % 102171 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuosta, ja huipun detek-tointia aallonpituudella 220 nm, jae, joka eluoituu noin 55,27 min kohdalla, kerätään, ja mahdollisesti lyofilisoi-daan, suspendoidaan uudelleen veteen ja lyofilisoidaan, 5 tai vaihtoehtoisesti kaavan XIII mukainen yhdiste (^Tl . (XIII)

10 B0C saatetaan reagoimaan inertissä liuottimessa inertissä ilmakehässä N-hydroksisukkinimidin, sitten disykloheksyyli-karbodi-imidin ja sitten kaavan X mukaisen yhdisteen kans-15 sa BOC BOC H li BOC H 20 sitten tuote saatetaan reagoimaan asetonissa inertissä ilmakehässä 3-klooriperoksibentsoehapon kanssa, otetaan talteen reaktiosta ja saatetaan reagoimaan syaaniboorihyd-ridin kanssa etikkahapon läsnäollessa, ja sitten siitä 25 saatava tuote saatetaan reagoimaan trifluorietikkahapon kanssa inertissä ilmakehässä; ja (f) haluttaessa yhdiste, jonka kaava on B2 °H h °h " , ·· &nr~ H Agelenopsis apertan kokomyrkky eluoidaan C-18 VydacR-kolon-35 nista (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 102171 10 μπι) käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjär-jestelmää lineaarisella gradienttiohjelmalla 5 % - 20 % asetonitriili, 95 % - 80 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [0 - 30 min], sitten 20 % - 70 % asetonitriili, 80 5 % - 30 % 0,1-% trif luorietikkahapon vesiliuos [30 - 55 min] ja monokromaattista huipun detektointia aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 22,75 min kohdalla, kerätään, lisätään C-4 VydacR-kolonniin (22 mm x 250 mm, huokoskoko 30 nm, hiukkaskoko 10 μπι) ja eluoidaan 10 käyttäen virtausnopeutta 15 ml/min, ja liuotinjärjestelmää ei-lineaarisella gradienttiohjelmalla 0 % - 0 % asetonitriili, 100 % - 100 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [0 -* 5 min] , sitten 0 % - 10 % asetonitriili, 100 % -* 90 % 0,1-% trif luorietikkahapon vesiliuos [5 - 20 min] (Waters-15 käyrä 1) , sitten 10 % - 20 % asetonitriili, 90 % - 80 % 0,1-% trif luorietikkahapon vesiliuos [20 - 30 min] (Wa-ters-käyrä 6), sitten 20 % - 50 % asetonitriili, 80 % - 50 % 0,1-% trifluorietikkahapon vesiliuos [30 - 40 min] (Wa-ters-käyrä 11) ja monokromaattista huipun detektointia 20 aallonpituudella 220 - 230 nm, jae, joka eluoituu noin 21,5 min kohdalla, kerätään ja mahdollisesti lyofilisoi-daan, jae suspendoidaan uudelleen veteen ja lyofilisoi-daan; j a mahdollisesti mainitut yhdisteet muutetaan sinänsä 25 tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti hyväksyttäviksi suoloikseen. 102171 Förfarande för framställning av ett terapeutiskt användbart, väsentligen rent indol-3-acetamid- eller 5 bensamid-N-polyaminderivat och farmaceutiskt godtagbara salter av detsamma, vilken förening är nägon av följande: H H? H H (E) 10 -1¾ · H Γ H “ (B.) H OH H R? H rii rOfwnj/nanh2 , 20 0 H i® H OH H H * - ~ H OH O ^ ^ . 30 (ψΓ^Η “ OH fl ^ '

35 JQJ 8 i« 8 " HO 102171 61 kännetecknat av att (a) dä en förening med formeln A' Π _ ” .. /NH- 5 Χίό ·„ HO önskas, helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän en C-18 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, 10 partikelstorlek 10 μτη) under användning av en ström- ningshastighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt gradientprogram 5 % - 10 % acetonitril, 95 % -» 90 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 -15 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 12,5 min tillvaratas och eventuellt lyofiliseras, suspenderas pä nytt i vatten och lyofiliseras frän vatten, eller alternativt en förening med formeln XXVIII « O 20. n CHjOCnjO^^ (XXVIII) 25 omsätts i ett inert lösningsmedel i en inert atmosfär med N-hydroxisuccinimid och därefter med dicyklohexylkarbodi-imid och därefter med en förening med formeln X BOC BOC H , · 30 (X) ; BOC i ett inert lösningsmedel, varefter produkten omsätts i en inert atmosfär med 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridin och därefter med cyanborhydrid och denna produkt omsätts i en 35 inert atmosfär med trifluorättiksyra; 102171 (b) dä en förening med formeln Ax Γ ^ ^ ^ ^ . .NH, φ^" Ii « OH önskas, helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän en C-18 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, partikelstorlek 10 μτη) under användning av en strömnings-10 hastighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt gradientprogram 5 % - 20 % acetonitril, 95 % -» 80 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluor-ättiksyra, [0 - 30 min], därefter 20 % - 70 % aceto nitril, 80 % - 30 % av en vattenlösning av 0,1-% 15 trifluorättiksyra [30 - 55 min] och monokromatisk topp-detektering pä en väglängd av 220 - 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 21 min tillvaratas och sätts tili en C-4 VydacR-kolonn (10 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, partikel-storlek 5 μιη) och elueras under användning av en 20 strömningshastighet av 4,0 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt gradientprogram 0 % -* 10 % acetonitril, 100 % - 90 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 - 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 7 25 min tillvaratas och eventuellt lyofiliseras, suspenderas pä nytt i vatten och lyofiliseras, eller alternativt en förening med formeln XXXI omsätts i ett inert lösnings- OCH2OCH3 o

30. II Ι^Υ^^ΟΗ (XXXI) OCH2OCH3 35 medel i en inert atmosfär med N-hydroxisuccinimid och 102171 därefter med dicyklohexylkarbodiimid och därefter med en förening med formeln X BOC BOC H , · 5 (X) 2 ' ~ H BOC varefter produkten omsätts i en inert atmosfär med 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridin och därefter med cyan-10 borhydrid, och den erhällna produkten omsätts därefter i en inert atmosfär med trifluorättiksyra; (c) dä en förening med formeln A2 jPH H H? H 15 (oT \Γί H NJ*2 H önskas, helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän en C-18 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, partikelstorlek 10 μιη) under användning av en strömnings-20 hastighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt gradientprogram 5 % - 20 % acetonitril, 95 % - 80 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [0 - 30 min], därefter 20 % -> 70 % acetonitril, 80 - 30 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [30 -: 25 55 min] och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 - 23 0 nm, fraktionen som elueras vid ca 21 min tillvaratas och sätts tili en C-4 VydacR-kolonn (10 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, partikelstorlek 5 μπι) och elueras under användning av en strömningshastighet av 30 4,0 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt ’> gradientprogram 0 % -* 10 % acetonitril, 100 % - 90 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 - 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 9 min tillvaratas och eventuellt 35 lyofiliseras, suspenderas pä nytt i vatten och 102171 lyofiliseras, eller alternativt en förening med formeln XXII OCH2OCH3 [ .. .OH 5 Γ\ΓΊ\" xAr 0 (xxii) BOC 10 omsätts i ett inert lösningsmedel i en inert atmosfär med N-hydroxisucciniraid, därefter med dicyklohexylkarbodiimid och därefter med en förening med formeln XXXVIII BOC

15 H2N^ ^ ^ S^H (XXXVIII) H BOC varefter produkten omsätts i en inert atmosfär med 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloxaziridin och därefter med cyan-20 bordydrid, varefter denna produkt antingen omsätts med trifluorättiksyra i en inert atmosfär eller upplöses i en inert atmosfär i en mätt dioxan/HCl-lösning, tillvaratas och sätts till en vattenlösning i en inert atmosfär; : (d) dä en förening med formeln Bx "? H H N N H 30 önskas, helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän en C-18 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, par-tikelstorlek 10 μπι) under användning av en strömningshas-tighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett 35 linjärt gradientprogram 5 % - 20 % acetonitril, 95 % - 102171 80. av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra, [0 -30 min], därefter 20 % - 70 % acetonitril, 80 % - 30 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [35 - 55 min] och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 -5 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 22,75 min tillvara- tas, sätts tili en C-4 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, por-storlek 3 0 nm, partikelstorlek 10 μπι) och elueras under användning av en strömningshastighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett icke-linjärt gradientprogram 10 0 % - 0 % acetonitril, 100 % - 100 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [0-5 min], därefter 0 % -10 % acetonitril, 100 % - 90 % av en vattenlösning av en 0,1-% trifluorättiksyra [5 - 20 min] (Waters-kurva 1), därefter 10 % - 20 % acetonitril, 90% - 80 % av en vat- 15 tenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra, [20 - 30 min] (Waters-kurva 6), därefter 20 % - 50 % acetonitril, 80 % - 50 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [30 - 40 min] (Waters-kurva 11) och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 - 230 nm, fraktionen som 20 elueras vid ca 18,5 min tillvaratas och eventuellt lyofi-liseras, suspenderas pä nytt i vatten och lyofiliseras, eller alternativt en förening med formeln XXII OCH2OCH3 25 ujT 0 o (xxii) BOC omsätts i ett inert lösningsmedel i en inert atmosfär med N-hydroxisuccinimid, därefter med dicyklohexylkarbodiimid « J 30 och därefter med en förening med formeln X BOC X-^Nv^^^N-BOC, (X) BOC BOC H 35 102171 varefter produkten omsätts i en inert atmosfär med 2-(sul-fonylfenyl)-3-fenyloxaziridin och därefter med cyanborhy-drid, varefter denna produkt antingen omsätts med trif-luorättiksyra i en inert atmosfär, eller upplöses i en 5 mätt dioxan/HCl-lösning i en inert atmosfär, tillvaratas och sätts till en vattenlösning i en inert atmosfär; (e) dä en förening med formeIn E H "? > H H önskas, helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän en 15 C-18 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, porstorlek 3 0 nm, par- tikelstorlek 10 μιη) under användning av en strömningshas-tighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt gradientprogram 5 % - 20 % acetonitril, 95 % - 80. av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [0 -20 30 min], därefter 20 % - 70 % acetonitril, 80 % - 30 % av en vattenlösning av 0,1-% trif luorättiksyra [30 -> 55 min] och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 -230 nm, fraktionen som elueras vid ca 27,5 min tillvaratas och eventuellt lyofiliseras, suspenderas pä nytt i vatten 25 och lyofiliseras eller alternativt helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän nämnda kolonn under användning av en strömningshastighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett linjärt gradientprogram 0 % - 20 % acetonitril, 100 % - 80 % av en vattenlösning av 0,1% tri-30 f luorättiksyra och toppdetektering pä en väglängd av 220 nm, fraktionen som elueras vid ca 26,0 min tillvaratas och sätts tili en Dynamax Phenyl-kolonn (4,6 mm x 250 mm, porstorlek 6 nm, partikelstorlek 8 μιη) och elueras under användning av en strömningshastighet av 1 ml/min, isokra-35 tiska förhällanden, varvid man använder 10 % acetonitril 102171 och 90 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra och toppdetektering pä en väglängd av 220 nm, fraktionen som elueras vid ca 55,27 min tillvaratas och eventuellt lyofiliseras, suspenderas pä nytt i vatten och lyofi-5 liseras, eller alternativt en förening med formeln XIII ί^ΐΐ 7 (XIII)

10 B0C omsätts i ett inert lösningsmedel i en inert atmosfär med N-hydroxisuccinimid, därefter med dicyklohexylkarbodiimid och därefter med en förening med formeln X 15 BOC BOC H N Nv BOC (X) 'v/Ss/ « H BOC 20 varefter produkten omsätts i aceton i en inert atmosfär med 3-klorperoxibensoesyra, tillvaratas frän reaktionen och omsätts med cyanborhydrid i närvaro av ättiksyra, varefter den erhällna produkten omsätts med trifluorättiksyra i en inert atmosfär; och 25 (f) dä en förening med formeln B2 ?H H 0 H H H ♦, ^jgnr——

30 H önskas, helgiftet hos Agelenopsis aperta elueras frän en C-18 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, porstorlek 30 nm, par-tikelstorlek 10 μτη) under användning av en strömningshas-35 tighet av 15 ml/min och ett lösningsmedelssystem med ett 102171 linjärt gradientprogram 5 % - 20 % acetonitril, 95 % - 80. av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [0 -30 min], därefter 20 % - 70 % acetonitril, 80 % - 30 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [30 - 55 min] 5 och monokromatisk toppdetektering pä en väglängd av 220 -230 nm, fraktionen som elueras vid ca 22,75 min tillvara-tas, sätts tili en C-4 VydacR-kolonn (22 mm x 250 mm, pors-torlek 30 nm, partikelstorlek 10 μπι) och elueras under användning av en strömningshastighet av 15 ml/min och ett 10 lösningsmedelssystem med ett icke-linjärt gradientprogram 0 % - 0 % acetonitril, 100 % - 100 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [0-5 min], därefter 0 % -10 % acetonitril, 100 % - 90 % av en vattenlösning av 0,1-% trif luorättiksyra [5 - 20 min] (Waters-kurva 1), 15 därefter 10 % - 20 % acetonitril, 90% - 80 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [20 - 30 min] (Waters-kurva 6), därefter 20 % - 50 % acetonitril, 80 % - 50 % av en vattenlösning av 0,1-% trifluorättiksyra [30 - 40 min] (Waters-kurva 11) och monokromatisk toppdetekte-2 0 ring pä en väglängd av 220 - 230 nm, fraktionen som elueras vid ca 21,5 min tillvaratas och eventuellt lyofi-liseras, fraktionen suspenderas pä nytt i vatten och lyofiliseras; och : nämnda föreningar omvandlas eventuellt medelst i 25 och för sig kända förfaranden tili sinä f armaceutiskt godtagbara salter.