NO315372B1 - Vesentlig ren polyaminforbindelse, anvendelse derav og farmasöytiske sammensetninger - Google Patents

Description

Det er beskrevet polyaminer og polypeptider funnet å være tilstede i giften til Afieleno<p>sis a<p>erta-edderko<pp>en. Polyaminene og saltene derav atagoniserer eksitatoriske aminosyreneurotransmittere, og neurotransmitterne påvirker cellene til forskjellige organismer og som er nyttige for antagonisering av nevnte neurotransmittere per se, ved behandling av eksitatoriske aminosyreneurotransmittermedierte sykdommer og tilstander, og for kontrollering av virvelløse dyr. Polypeptidene og saltene derav blokkerer kalsiumkanaler i cellene til forskjellige organismer og er nyttige for blokkering av nevnte kalsiumkanaler i celler per se, ved behandling av kalsiumkanalmedierte sykdommer og tilstander, og ved kontroll av sykdommer hos virvelløse dyr. Det er videre beskrevet farmasøytiske sammensetninger.

Denne oppfinnelse vedrører en vesentlig ren forbindelse, farmasøytisk sammensetning for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr, farmasøytisk sammensetning for blokkering av kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr, og farmasøytisk sammensetning for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr og blokkerer kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av den ovennevnte forbindelse for fremstilling av et medikament for antagonisering av eksitatorisker aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr. Polyaminene er funnet å være tilstede i giften fra Agelenopsis aperta edderkoppen. Polyaminene og de farmasøytisk akseptable salter av disse virker antagonistisk mot eksitatoriske aminosyreneurotransmittere, og disse aminosyreneurotransmittere påvirker celler innbefattet nerveceller i en rekke organismer innbefattet virvelløse dyr og virveldyr. Polypeptidene og ett av nevnte polyaminer og de farmasøytisk akseptable salter av disse blokkerer kalsiumkanaler i celler innbefattet nerve- og muskelceller fra forskjellige organismer inkludert virvelløse dyr og virveldyr.

Det er blitt rapportert at giften fra edderkoppen Agelenopsis aperta inneholder minst to toksiner som påvirker kalsiumstrømmer. Jackson, H., et al., Soc, Neu. Sei. Abstr. 12:1078 (1987). Disse forfattere beskriver et toksin, referert til der som AG2, som har en molekylvekt på mindre enn 1,000 dalton og viser seg å undertrykke kalsiumstrømmer i et bredt område av vev. Videre rapporterer Jackson, H., et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:730 (1986) om et annet toksin fra Agelenopsis aperta som omfatter en komponent på omtrent 6,000 M.W. Dette toksinet er rapportert å påvirke presynaptisk blokkade av transmisjon og det er blitt foreslått at toksinet blokkerer kalisumkanaler forbundet med frigjøring av neurotransmitter.

Forbindelser som er eksitatoriske aminosyreneurotransmitterantagonister, har en rekke anvendelser. Eksitatoriske aminosyreneurotransmitterantagonister kan finne klinisk anvendelse i behandling av slike tilstander som plutselig sykdoms-utbrudd, slag, cerebral ischemia, degenerative nervelidelser slik som Alzheimers sykdom og epilepsi og som psykoterapeutiske midler, blant andre. Se Excitatory Amino Acids in Health and Disease, D. Lodge, Ed., John Wiley og Sons Ltd., New York, NY 1988, hvis beskrivelser er inkorporert her ved referanse. Videre er slike forbindelser anvendbare i studie av fysiologien tit celler slik som nerveceller og i kontroll av sykdommer i virvelløse dyr.

Forbindelser som er kalsiumantagonister, har en rekke anvendelser. Kalsiumantagonister kan finne klinisk anvendelse i behandling av slike tilstander som angina, hypertensjon, kardiomyopatier, supraventrikulære arytmier, aesophogeal achalasia, fødselsveer og Raynauds sykdom blant andre. Se W. G. Navler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1988, hvis beskrivelser er inkorporert her ved referanse. Videre er slike forbindelser anvendbare i studie av fysiologien av celler slik som nerve- og muskelceller og i kontroll av sykdommer i virvelløse dyr.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig vesentlig ren forbindelse, kjennetegnet ved at den er valgt fra gruppen

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Denne oppfinnelse vedrører følgelig polyaminer funnet å være tilstede i giften fra Agplfinnpsis apejia-edderkoppen. Polyaminene i henhold til denne oppfinnelse og fraksjonene som de er tilstede i i henhold til denne oppfinnelse, er som følger:

Fraksjon A' (AGEL 452):

Fraksjon Ai (AGEL 468):

Fraksjon A2 (AGEL 448):

Fraksjon Bi (AGEL 505):

Fraksjon B2 (AGEL 504):

FAB MS: høy oppløsning: 505.3861 kals. for C27H48N6O3. Fraksjon E (AGEL 489):

Polyaminene i henhold til denne oppfinnelse og de farmasøytisk akseptable salter av disse virker antagonistisk mot eksitatoriske aminosyreneurotrasmittere, og disse neurotransmittere påvirker celler. Således er nevnte polyaminer anvendbare i antagonistisk virkning mot nevnte neurotransmittere, per se. Polyaminene i henhold til denne oppfinnelse er også anvendbare i kontroll av sykdommer i virvelløse dyr og i behandling av sykdommer og tilstander i et pattedyr formidlet ved eksitatoriske aminosyreneurotransmittere. Nevnte polyaminer er anvendbare også som psykoterapeutiske midler til et pattedyr.

Polyamin Bi ovenfor i henhold til denne oppfinnelse blokkerer kalsiumkanaler i celler. Således er nevnte polyamin Bi anvendbare i blokkering av kalsiumkanaler i celler, per se. Nevnte polyamin Bi er også anvendbare til kontroll av sykdommer i virvelløse dyr og til behandling av sykdommer og tilstander i et pattedyr formidlet ved kalsiumkanalfunksjon i celler.

Denne oppfinnelse vedrører også farmasøytiske sammensetning for antagonisering av eksitatoriske aminosyre-neurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr, kjennetegnet ved at den omfatter en eksitatorisk aminosyreneurotransmitter antagoniserende mengde av en forbindelse ifølge krav 1 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

Det er også beskrevet farmasøytisk sammensetning for blokkering av kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr, kjennetegnet ved at en kalsiumkanalblokkerende mengde av en forbindelse ifølge krav 1, med formel

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytisk sammensetning for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr og blokkerer kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr, kjennetegnet ved at nevnte sammensetning omfatter en eksitatorisk aminosyreneurotransmitter-antagoniserende og kalsiumkanalblokkerende mengde av en forbindelse ifølge krav 1 med formel

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr.

Det er videre beskrevet anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, med formel

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for blokkering av kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr. Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 med formel

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr og som blokkerer kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr.

Gift oppnås fra Agelenopsis aperta-edderkoppen gjennom en fremgangsmåte hvor man melker ved elektrisk stimulering i henhold til standard metoder vel kjent for fagmenn på området. Det er foretrukket at fremgangsmåten som anvendes, er en som gir beskyttelse mot forurensning av fullgiften ved abdominalt oppstøt eller hemolymfe. Slike fremgangsmåter er vel kjent for fagmenn på området. Fullgiften som oppnås på denne måte, lagres i frossen tilstand ved omtrent -78°C inntil anvendt til rensing som beskrevet nedenfor.

Rensing av bestanddelene fra fullgiften utføres ved revers fase høyeffekti-vitetsvæskekromatografering (HPLC) på en rekke preparative og semi-preparative kolonner slik som C-4 og C-18 Vydac<®->kolonner (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachussetts 01801). Topp-påvisning utføres monokromatisk ved 220-230 nm. Videre analyse av fraksjonene kan utføres med f.eks. polykrome UV-data oppsamlet med en Waters 990 diode-ordensdetektor (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757). Fraksjonene fra kolonnene oppsamles ved kjente fremgangsmåter slik som gjennom anvendelse av en ISCOrFOXY" fraksjons-oppsamler og en ISCO 2159 topp-detektor (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504). Fraksjonene oppsamles i passende store kar slik som sterilt polyetylenlaboratorieutstyr. Konsentrasjon av fraksjonene blir så utført ved lyofilisering fra elueringsmidlet fulgt av lyofilisering fra vann. Renhet av de resulterende bestående fraksjoner kan så bestemmes ved kromatografisk analyse ved å anvende en analytisk kolonne med et gradientsystem som er mer isokratisk enn systemet anvendt i den endelige rensing av fraksjonene.

Strukturene omfattet av de henholdsvise fraksjonene bestemmes i henhold til kjente analytiske metoder slik som ved massespektrometri og nukleær magnetisk resonans.

I utførelse av denne oppfinnelsen og anvendelse av den generelle fremgangsmåte beskrevet ovenfor, er det blitt funnet at en egnet kolonne for initiell

fraksjonering av giften er en C-18 Vydac® 22 mm x 250 mm, 300 Å porestørrelse, 10 i^m partikkelstørrelseskolonne. Denne kolonne elueres ved en strømhastighet på 15 ml/min. ved å anvende et lineært gradientprogram på 95% -> 80% A, 5% -> 20% B [0 -> 30 min.] så 80% -> 30% A, 20% -> 70% B [30 -> 55 min.] hvor A er

0,1% vandig trifluoreddiksyre (TFA) og B er acetonitril. Fraksjonene oppsamles

som beskrevet ovenfor. Ti fraksjoner oppnådd på denne måten, merket A, B, E, G, H, I, J, K, L og M, ble valgt for videre analyse og/eller rensing. 1 tillegg er det blitt funnet at fraksjonering av fullgiften ved å anvende en C-18 Vydac® 22 mm x 250 mm, 300 A porestørrelse, 10 um partikkelstørrelseskolonne, som elueres ved en strømhastighet på 15 ml/min. ved å anvende et lineært gradientprogram på 5% -> 10% B, 95% 90% A [0 -> 30 min.], hvor A og B er som beskrevet ovenfor, gir, inter alia, en fraksjon merket A' her. Elueringstidene for fraksjonene er gitt nedenfor i eksempler 1 og 2.

Fraksjonene blir underkastet videre rensing ved å anvende en rekke kolonner og gradientprogrammer. De spesielle beskrivelser for hver subfraksjonering og resultatene fra disse er gitt i eksempler 3, 4, 6, 7, 8 og 10 nedenfor.

Som vist i de følgende eksempler omfatter fraksjoner A', Ai, A2, Bi, B2 og E polyaminforbindelser. Disse forbindelser og fraksjonene som de finnes i, er som følger.

Fraksjon A<*> (AGEL 452):

Fraksjon Ai (AGEL 468):

Fraksjon A2 (AGEL 448):

Fraksjon Bi (AGEL 505):

Fraksjon B2 (AGEL 504):

FAB MS: høy oppløsning: 505.3861 beregn, for C27H48N6O3.

Fraksjon E (AGEL 489):

Gitt fordelen av beskrivelsen her med henblikk på forbindelsene tilstede i fraksjonene fra giften fra Agelenopsis aperta, er det nå mulig å oppnå nevnte forbindelser ved fremgangsmåter forskjellige fra gjennom isolering/rensing fra fullgift. F.eks. kan polyaminene som er omfattet av fraksjoner A", Ai, A2, Bi, B2 og E laget direkte ved syntetiske metoder.

Et syntetisk skjema for produksjon av visse polyaminer i henhold til denne oppfinnelse med formel

hvor R er H eller OH, er vist i reaksjonsskjemaer A tii D nedenfor.

I henhold til reaksjonsskjema A fremstilles polyaminintermediatforbindelsen med formel X gjennom en sekvens av trinn som begynner med diaminobutan. Reaksjonsbetingelser egnet til å fremstille intermediatforbindelsen med formel X i henhold til reaksjonsskjema A er gitt i eksempel 11, deler A till. Reaksjonsskjema B illustrerer en fremgangsmåte for fremstilling av intermediatforbindelsen med formel XIII. Reaksjonsbetingelser egnet til å fremstille dette intermediat i henhold til reaksjonsskjema B er gitt i eksempel 11, deler J til L. Fremstilling av intermediatforbindelsen med formel XXI er vist t rekasjonsskjema C. Reaksjonsbetingelser egnet til fremstilling av forbindelsen med formel XXI i henhold til reaksjonsskjema C er gitt i eksempel 12, deler A til F. Fremstilling av poly-aminforbindelsene i henhold til denne oppfinnelsen med formler XVI og XXV er vist i reaksjonsskjema D. Reaksjonsbetingelser egnet til bindingen av intermediat-forbindelser med formler X og XIII eller X og XXI og den videre fremstilling av forbindelser med formlene XVI og XXV er gitt i eksempel 11, deler M til O og eksempel 12, deler G til I.

Reaksjonsskjema E og F illustrerer fremgangsmåter for fremstilling av intermediatforbindelsene hhv. XXVIII og XXXI. Reaksjonsbetingelsene egnet til å fremstille intermediatet i henhold til reaksjonsskjema E er gitt i eksempel 13, deler A til C. Reaksjonsbetingelser egnet til fremstilling av intermediatet i henhold til reaksjonsskjema F er gitt i eksempel 14, deler A til C. Fremstilling av polyamin-forbindelsene i henhold til denne oppfinnelse med formler XXXVI og XXXVII er vist i reaksjonsskjema G. Reaksjonsbetingelser egnet til bindingen av intermediatforbindelsene med formel X og XXVIII eller X og XXXI og den videre fremstilling av forbindelser med formler XXXVI og XXXVII er gitt i hhv. eksempel 13, deler D til F og eksempel 14, deler D til F.

Reaksjonsskjema H illustrerer en fremgangsmåte for fremstilling av poly-aminforbindelsen i henhold til denne oppfinnelse med formel XLI. Reaksjonsbetingelser egnet til fremstilling av intermediatforbindelsen med formel XXXVIII, bindingen av denne til intermediatforbindelsen med formel XXII og den videre fremstilling av polyaminforbindetsen i henhold til denne oppfinnelse med formel XLI er vist i eksempel 15.

Polyaminene i henhold til denne oppfinnelse virker reverst antagonistisk overfor eksitatoriske aminosyreneurotransmittere, og disse neurotransmittere påvirker celler slik som celler i nervesystemet i en rekke organismer, inkludert virvelløse dyr og virveldyr. Begrepet virveldyr som anvendt helt igjennom er ment å inkludere pattedyr. Begrepet virvelløse dyr som anvendt helt igjennom er ment å inkludere f.eks. insekter, ektoparasitter og endoparasitter. Polyaminet fra fraksjon Bi, som beskrevet ovenfor, blokkerer også reversibelt kalsiumkanaler tilstede i en rekke celler slik som celler i nerve- og muskel-, inkludert det kardio-vaskulære system i virvelløse dyr og virveldyr.

Evnen til polyaminene i henhold til den foreliggende oppfinnelse til å virke antagonistisk mot eksitatoriske aminosyreneurotransmittere vises ved deres evne til å blokkere N-metyl-D-asparaginsyre-induserte (NMDA) forhøyelser av cGMP i neonatal rottecerebellum i henhold til følgende fremgangsmåte. Cerebellum fra ti 8-14 dagers gamle Wistar-rotter blir raskt skåret ut og plassert i 4°C kreps/bi-karbonatbuffer, pH 7,4 og så kuttet t 0,5 mm x 0,5 mm snitt ved å anvende en Mcllwain vivskkutter (The Nickle Laboratory Engineering Co., Gomshall, Surrey, England). De resulterende stykker av cerebellum overføres til 100 ml kreps/- bikarbonatbuffer ved 37°C som ekvilibreres kontinuerlig med 95:5 O2/CO2. Stykkene av cerebellum inkuberes på en slik måte i 90 min. med tre forandringer av bufferen. Bufferen blir så helt av, vevet sentrifugeres (1 min., 3200 rpm.), og vevet resuspenderes i 20 ml av kreps/bikarbonatbufferen. Så fjernes 250 ^ alikvote mengder (omtrent 2 mg) og plasseres i 1,5 ml mikrofugerør. Til disse rør tilsettes det 10 (il av forbindelsen som studeres, fra en stamløsning fulgt av 10 ^l av en 2,5 mM løsning av NMDA for å starte reaksjonen. Slutt NMDA-konsentrasjonen er 100 u.M. Kontroller har ikke NMDA tilsatt. Rørene inkuberes i 1 min. ved 37°C i et rystende vannbad og så blir 750 |J av en 50 mM Tris-CI, 5mM EDTA-løsning tilsatt for å stoppe reaksjonen. Rørene plasseres umiddelbart i et kokende vannbad i 5 min.. Innholdene i hvert rør blir så ultralyd behandlet i 15 sekunder ved å anvende en probe ultralydbehandler satt på kraftnivå tre. Ti mikroliter fjernes, og proteinet bestemmes ved fremgangsmåten til Lowry, Anal. Biochem. l£Q:201-220 (1979). Rørene blir så sentrifugert (5 min., 10,000 xg), 100 fj.l av supernatanten fjernes, og nivået av cyklisk GMP (cGMP) måles ved å anvende en New England Nuclear (Boston, Massachusetts) cGMP RIA-måling i henhold til fremgangsmåten til produsenten. Data gjengis som pmol cGMP dannet pr. mg. protein.

Polypeptidene i henhold til denne oppfinnelse blokkerer irreversibelt kalsiumkanaler tilstede i en rekke celler slik som celler i nerve- og muskelsystemet i virvelløse dyr og virveldyr.

Evnen til polyaminet fra fraksjon Bi til å blokkere kalsiumkanaler vises ved følgende fremgangsmåte. Adskilte rotteneokortikale neuroner suspenderes i krepsbikarbonatbuffer, pH 7,4, som inneholder 2mM CaCk og 1% okseserum-albumin (BSA). Neuronene sedimenteres ved sentrifugering og resuspenderes i den samme buffer som i tillegg inneholder 1 uM fura2/AM (Sigma Chem. Co., P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178). Cellene inkuberes i 15 min. ved 37°C, vaskes og inkuberes så i 15 min. til i den samme buffer uten fura2/AM. Cellene vaskes så i bufferen ovenfor som nå inneholder 1,5 mM CaCb og ekvilibreres ved romtemperatur som en konsentrert cellesuspensjon i omtrent 5 til 10 min.. Til en kvartskuvette tilsettes det 1,2 ml forvarmet (37°C) BSA-fri buffer som inneholder 1,5 mM CaCI2 og 10 mM glukose, så 0,3 ml av den konsentrerte cellesuspensjon fremstilt ovenfor. Kuvetten plasseres i en termostatstyrt (37°C) holder utstyrt med en magnetisk rører, og fluorescensen måles med et fluorescensspektrofotometer slik som en Perkin Eimer 650-40 (Perkin Eimer, Wilton, Connecticut 06897). Fluorescenssignalet tillates å stabilisere i omtrent 1 min.. Så tilsettes 1-4 p\ av en stokkløsning av forbindelsen under studium i krepsbikarbonatbuffer ved passende konsentrasjoner til kuvetten. Kalibrering av de fluorescerende signaler og fura-2 lekkasjekorreksjon utføres ved å anvende de fremsatte fremgangsmåter til Nemeth, et al., J. Biol. Chem. 262:5188 (1987). Ved fullførelsen av hvert forsøk blir den maksimale fluorescensverdi (Fmax) bestemt ved tilsetning av ionomycin og den minimale fluorescensverdi (Fmin) bestemmes ved den påfølgende tilsetning av 5 mM EGTA for å chelatere kalisum. Ved å anvende den foregående fremgangsmåte er kalsiumkanalblokkering ved en gjeldende forbindelse vist å forekomme ved en nedgang i fluorescens ved tilsetning av den gjeldende forbindelse.

Polyaminene i henhold til denne oppfinnelse er anvendbare i antagonistisk virkning mot eksitatoriske aminosyreneurotransmittere, per se. Som sådanne er polyaminene anvendbare til kontroll av sykdommer i virvelløse dyr og til behandling av eksitatoriske aminosyreneurotransmitterformidlede sykdommer og tilstander i et pattedyr slik som plutselig sykdomsutbrudd, slag, cerebial ischemia, degenerative nervelidelser slik som Alzheimers sykdom og epilepsi. Nevnte polyaminer er også anvendbare som psykoterapeutiske midler i et pattedyr. Videre er polyaminene anvendbare i studiet av fysiologien av celler inkludert, men ikke begrenset til, celler i nervesystemt.

Polyaminet i fraksjon Bi og polypeptidene i henhold til denne oppfinnelse er anvendbare som kalsiumkanalblokkere i celler per se. Som sådanne er disse forbindelser også anvendbare i kontroll av sykdommer i virvelløse dyr og til behandling av sykdommer og tilstander formidlet ved kalsiumkanalfunksjon i celler i et pattedyr slik som angina, hypertensjon, kardiomyopatier, supraventrikulære arytmier, aesophogeal achalasia, fødselsveer og Raynauds sykdom. Videre er disse forbindelsene anvendbare i studiet av fysiologien av celler inkludert, men ikke begrenset til, celler fra nerve- og muskelsystemet.

Også innen rekkevidden av denne oppfinnelsen er de farmasøytisk-akseptåble salter av polyaminene i henhold til denne oppfinnelsen. Slike salter dannes ved fremgangsmåter vel kjent for fagmenn på området. F.eks. kan syretilsetningssalter av polyaminene og basesalter av polypeptidene fremstilles i henhold til konvensjonelle fremgangsmåter.

Når et polyamin i henhold til denne oppfinnelse skal administreres til et pattedyr, kan det administreres alene eller i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere eller fortynningmidler i en farmasøytisk sammensetning i henhold til standard farmaøsytisk praksis. Polyaminene kan administrers oralt eller parenteralt med den parenterale administreringsmåte som foretrukket for polypeptidene. Parenteral administrering inkluderer intravenøs, intramuskulær, intraperitoneal, subkutan og topisk administrering.

For oral anvendelse av et polyamin i henhold til denne oppfinnelse kan forbindelsen administreres f.eks. i form av tabletter eller kapsler eller som en vandig løsning eller suspensjon. I tilfelle av tabletter for oral anvendelse inkluderer bærere som er vanlig anvendt, laktose og maisstiveise, og smøre-midler, slik som magnesiumstearat, blir vanligvis tilsatt. Til oral administrering i kapselform er anvendbare fortynningsmidler laktose og tørket maisstiveise. Når vandige suspensjoner er påkrevet for oral anvendelse, blir den aktive bestanddel kombinert med emulgerende og suspenderende midler. Om ønsket, kan visse søtnings- og/eller aromastoffer tilsettes.

For intramuskulær, intraperitoneal, subkutan og intravenøs anvendelse, blir sterile løsninger av den aktive bestanddel vanligvis fremstilt, og pH i løsningene bør være justert og bufret på passende måte. For intravenøs anvendelse bør den totale konsentrasjon av de oppløste stoffer kontrolleres for å gjøre preparatet isotont.

Når et polyamin eller salt derav i henhold til denne oppfinnelse anvendes i et humant individ, vil den daglige dosering normalt bestemmes av den fore-skrivende lege. Videre vil doseringen variere i henhold til alder, vekt og respons i den individuelle pasient, så vel som alvorlighetsgraden av pasientens symptomer og styrken av den spesielle forbindelse som blir administrert.

Når et polyamin eller salt derav i henhold til denne oppfinnelsen anvendes i kontroll av sykdommer i virvelløse dyr, blir nevnte forbindelse admininstrert til nevnte virvelløse dyr direkte eller blir gitt tit omgivelsene til nevnte virvelløse dyr. F.eks. kan en forbindelse i henhold til denne oppfinnelse sprayes som en løsning på nevnte virvelløse dyr. Mengden av forbindelse nødvendig for å kontrollere nevnte virvelløse dyr varierer i henhold til det virvelløse dyr og omgivelsenes betingelser og vil bestemmes av personen som anvender forbindelsen.

Når et polyamin eller salt derav disse i henhold til denne oppfinnelsen anvendes i det fysiologiske studium av celler, blir nevnte forbindelse administrert til cellene i henhold til fremgangsmåter vel kjent for fagmenn på området. F.eks. kan nevnte forbindelse administreres til celler i en passende fysiologisk buffer. En passende konsentrasjon av forbindelsene i henhold til denne oppfinnelse til anvendelse i slike studier er 100 p,M. Imidlertid kan konsentrasjonen av nevnte forbindelser i slike studier være større enn eller mye mindre enn 100 UM. Mengden av forbindelsen som blir administrert, vil bestemmes av personen som er fagmann på området i henhold til velkjente fremgangsmåter.

FKSFMPF1 1

In<i>tiell fraksjonering av full gift fra Agelennpfiis aperta

Fullgift fra Agelenopsis aperta, oppnådd fra Natural Product Sciences Inc., Salt Lake City, Utah 84108 og som var blitt lagret i den frosne tilstand ved omtrent

-78°C, ble tint, og 10 til 60 ul mengder av dette, fortynnet til 200 ul, og satt på en C-18 Vydac® (22 mm x 250 mm, 300 A porestørrelse, 10 u partikkelstørrelse)

kolonne og eluert ved å anvende en strømhastighet på 15 ml/min. og et løsnings-middelssytem hvor man anvendte et lineært gradientprogram på 5% -> 20% B, 95% -> 80% A t0 -» 30 min.] så 20% 70% B, 80% 30% A [30 -> 55 min.] hvor A er 0,1 % vandig TFA og B er acetonitril. Topp-påvisning ble utført monokromatisk ved 220 - 230 nm, og fraksjoner ble oppsamlet med en ISCOrFOXY"-fraksjonoppsamler og en ISCO 2159 toppdetektor. Fraksjoner ble oppsamlet fra 20 min. til 60 min. Basert på topp-påvisning ble de følgende fraksjoner oppsamlet:

FKSFMPFI ?

Fraksjonering av fullgift fra Agelenopsis aperta for fl oppnå fraksjon A' Fullgift fra Agelenopsis apejla ble oppnådd og satt på en C-18 Vydac®-kolonne som beskrevet i eksempel 1. Kolonnen ble eluert ved å anvende en strømhastighet på 15 ml/min. og et løsningsmiddelsystem hvor man anvendte et lineært gradientprogram på 5% -> 10% B, 95% -» 90% A [0 -> 30 min.] hvor A er 0,1 % vandig TFA og B er acetonitril. Topp-påvisning og fraksjonsoppsamling ble utført som beskrevet i eksempel 1. Fraksjon A" som eluerte ved omtrent 12,5 min. ble oppnådd. Fraksjon A' ble så fremstilt for spektralanalyse ved lyofilisering fra elueringsmidlet fulgt av lyofilisering fra destillert vann, i henhold til standard metoder.

Strukturen av forbindelsen som er omfattet av fraksjon A', ble så bestemt ved anvendelse av FAB MS. De således oppnådde data og strukturen utledet fra disse er som følger:

A': FAB MS: M/Z 453 (M+1)

Struktur: Benzamid, N-(20-aminc-4-hydroksy-4,8,12,17-tetraazeicos-1 -yl)-4-hyd roksy

FKSEMPEL 3

fiiihfrakifjnnering av fraksjon A ng bestemmelse av stmkturer i dertne

Fraksjon A, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble satt på en C-4 Vydac® (10 mm x 250 mm, 300 Å porestørrelse, 5 u artikkelstørrelse) kolonne og eluert fra denne ved å anvende en strømhastighet på 4,0 mt/min., og et løsningsmiddeisystem hvor man anvendte et lineært gradientprogram på 0% 10% B, 100% -» 90% A [0 -> 30 min.] hvor A er 0,1 % vandig TFA og B er acetonitril. Topp-påvisning ble utført ved å anvende en Waters 990 diode-ordensdetektor og fraksjonsoppsamling ble utført som beskrevet i eksempel 1. To fraksjoner ble oppnådd som følger:

Fraksjoner Ai og A2 ble så fremstilt for spektralanalyse ved lyofilisering fra elueringsmidlet fulgt av lyofilisering fra vann, i henhold til standardmetoder.

Strukturen av forbindelsene som er omfattet av fraksjoner Ai og A2, ble så bestemt ved anvendelse av FAB MS. De således oppnådde data og strukturer utledet fra disse er som følger:

Ai: FAB MS:M/Z 469 (M+1), høy oppløsning:

469.3863 beregn, for C23H45N6O med 2,0 mmu feil

struktur: benzamid, N-(20-amino-4-hiydroksy-4,8,12,17-tetra-azeicos-1-yl )-2,5-dihyd roksy

A2: FAB MS:M/Z 449 (M+1), 433, 376, 260, 203 Struktur: 1H-indol-3-acetamid, N-(16-amino-4-hydroksy-4,8,13-triazaheksadek-1 -yl)-4-hydroksy

FKSFMPFI 4

Siihfraksjnnering av fraksjon B og hestemmelse av strukturer deri Fraksjon B, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble satt på en C-4 Vydac® (22 mm x 250 mm, 300 Å porestørrelse, 10 u partikkelstørrelse) kolonne og eluert av ved å anvende en strømhastighet på 15 mt/min. og et løsnings-middelsystem hvor man anvendte et ikke-lineært gradientprogram på 0% -> 0% B, 100% 100% A [0 -> 5 min.], så 0% -> 10% B, 100% -+ 90% A [5 -> 20 min.]

(LWaters kurve 1) så 10% 20% B, 90% -> 80% A [20 -> 30 min.] (Waters kurve 6) så 20% _> 50% B, 80% 50% A [30 40 min.] (Waters kurve 11) hvor A er 0,1% vandig TFA og B er acetonitril. Topp-påvisning ble utført ved å anvende en Waters 990 diodeordensdetektor og fraksjonsoppsamling ble utført som beskrevet i eksempel 1. To fraksjoner ble oppnådd som følger:

Fraksjonene ble så fremstilt for spektralanalyse ved lyofilisering fra elueringsmidlet fulgt av lyofilisering fra vann i henhold til standard metoder.

Strukturen av forbindelsen som er omfattet av fraksjon Bi, ble bestemt ved anvendelse av FAB MS, og resultatene fra dette er som følger:

FAB MS:M/Z 506 (M+1), 489, 461, 433, 378, 333, 260, 231, 215, 203, 155, 119 høy oppløsning: 506.3810 beregn, for C26H48N7O3 Struktur: 1H-indol-3-acetamid, N-(20-amino-4-hydroksy-4,8,12,17-tetraazercos-1 -yl)-4-hydroksy

Molekylvekten av forbindelsen som er omfattet av fraksjon B2, ble bestemt ved anvendelse av FAB MS, og resultatene fra dette er som følger:

- FAB MS:

høy oppløsning: 505.3861 beregn, for

C27H48N6O3.

FKSFMPFI S

Struktur av forhinrielse omfattet av fraksjon F

Fraksjon E, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble fremstilt for spektralanalyse ved lyofilisering fra elueringsmidlet fulgt av lyofilisering fra vann i henhold til standard metoder. Strukturen av forbindelsen omfattet av fraksjon E ble bestemt ved å anvende FAB MS, <1>H-NMR og nC-NMR. De således oppnådde data og strukturen utledet fra dette er som følger: FAB MS.M/Z 490 (M+1), 472, 433, 362, 333, 260, 215, 203, 177, 155, 119 høy oppløsning: 490.3860 beregn, for C26H48N7O2 med 0,6 mmu feil <1>H-NMR (500 Mhz, d6-DMSO): 10.89 (s, 1H), 8.90-7.85 (m, 6H), 7.55 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.34 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.08 (dd, J=8.0 Hz, J=8.0 Hz, 1H), 6.98 (dd, J=8.0 Hz, J=8.0 Hz, 1H), 3.50 (s, 2H), 3.13 (m, 2H), 3.03-2.82 (m, 18H), 1.88 (m, 6H), 1.78 (m, 2H), 1.62 (m, 4H) <13>C-NMR (125.76 Mhz, d6-DMSO): 170.94, 136.10, 127.17, 123.75, 120.92, 118.67, 118.26, 111.33, 108.97, 57.39, 57.07, 46.12, 46.12,44.06, 43.89, 43.89, 36.52, 36.22, 32.78, 26.71, 23.79, 23.06, 22.65, 22.65, 22.45

Struktur. 1H-indol-3-acetamid, N-(20-amino-4-hydroksy-4,8,12,17-tetraazeicos-1 -yl)

Alternativt og foretrukket ble fullgift fraksjonert som beskrevet i eksempel 1 med unntak av at løsningsmiddelsystemet og det lineære gradientprogram som ble anvendt, var 0% -> 20% B, 100% -> 80% A [0 30 min.] med topp-påvisning ved 220 nm. Fraksjonen som eluerte ved omtrent 26.0 min., ble satt på en Dynamax fenylkolonne (4,6 mm x 250 mm, 60 A porestørrelse, 8 u partikkel-størrelse)rog eluert ved å anvende en strømhastighet på 1 ml/min. og isokratiske betingelser på 10% B, 90% A hvor A og B er som beskrevet i eksempel 1. Topp-påvisning ble utført ved å anvende en Waters 990 diodeordensdetektor (A=220 nm) og fraksjoner ble oppsamlet som beskrevet i eksempel 1. Fraksjonen som eluerte ved omtrent 55,27 min., ble lyofilisert fra elueringsmidler fulgt av lyofilisering fra vann i henhold til standard metoder for å gi forbindelsen i dette eksempel.

EKSEMEL 6

fiiihfraksjonarinq av fraksjon fi

Fraksjon G, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble satt på en C-18 Vydac® (22 mm x 250 mm, 300 A porestørrelse, 10 u, partikkelstørrelse) kolonne og eluert av ved å anvende en strømhastighet på 10 ml/min. og et løsningsmiddel-system hvor man anvendte et ikke-lineært gradientprogram på 20% -> 30% B, 80% 70% A [0 -> 40 min.] (Waters kurve 6) og ved å anvende en Waters 990 diodeordensdetektor med fraksjoner som ble oppsamlet som beskrevet i eksempel 1. Fraksjon G, etter subfraksjonering som beskrevet ovenfor, eluerte fra kolonnen ved omtrent 22 min.. Denne fraksjon, som omfatter et polypeptid, ble så fremstilt for sekvensering ved lyofilisering fra elueringsmidlet fulgt av lyofilisering fra vann, i henhold til velkjente fremgangsmåter.

Aminosyreanalyse av det alkylerte polypeptid av fraksjonen ble oppnådd ved å anvende Waters Pico-Tag-metoden i henhold til produsentens beskrivelser. Sekvensdata ble oppsamlet fra en Applied Biosystems model 470A Protein/- Peptide sequencer (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404) med vandig TFA-omdannelse. Analyse av de resulterende fenyltiohydantoinaminosyrer ble utført på linje med en Applied Biosystems model 120A PTH analysator eller utenfor linje på en DuPont Zorbax PTH kolonne (Biomedical Product Department, Chromatography Products, E. I. duPont de Nemours and Co., Inc., 1007 Market Street, Wilmington, Delaware 19898).

Som et resultat av aminosyreanalyse og FAB MS av hele polypeptidet ble det bestemt at den amino-terminale aminosyresekvens av en del av polypeptidet omfattet av fraksjon G ble bestemt som :

EKSEMPEL 7

Subfraksionerin<q> av fraksjon H oa bestemmelse av strukturer i denne

Fraksjon H, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble satt på en C-18 Vydac<®> (22 mm x 250 mm, 300 A porestørrelse, 10 u partikkelstørrelse) kolonne og eluert av ved å anvende en strømhastighet på 10 ml/min. og et løsningsmiddel-system hvor man anvendte et ikke-lineært gradientprogram på 20% -> 25% B, 80% -> 75% A [0 -+ 30 min.] (Waters kurve 6) så 25% 50% B, 75% -» 50% A [30 -> 45 min.] (Waters kurve 11), hvor A er 0,1% TFA og B er acetonitril, og ved å anvende en Waters 990 diodeordensdetektor med fraksjoner som ble oppsamlet som beskrevet i eksempel 1. Av de oppsamlede fraksjoner var fraksjonene av interesse:

Fraksjoner H2 og H3, som omfatter polypeptider, ble så fremstilt for sekvensering og sekvensert i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 6.

Den aminoterminale aminosyresekvens av en del av polypeptidet omfattet av fraksjon H2 ble bestemt som:

og molekylvekten av hele polypeptidet ble bestemt ved lone-Spray MS til å være lik 7793.

fksfm<p>el a

Suhfraksjnnering av fraksjoner I og .1 ng hestemmelse av strukturer i disse Fraksjoner t og J, oppnådd som beskrevet i eksempel 1 og som ikke var tilstrekkelig separert p.g.a. de like elueringstider som vist i eksempel 1, ble satt sammen på en C-4 Vydac<®> (22 mm x 250 mm, 300 A porestørrelse, 10 p. partikkelstørrelse) kolonne og eluert av ved å anvende en strømhastighet på

10 ml/min. og et løsningsmiddelsystem hvor man anvendte et ikke-lineært gradientprogram på 20% -> 30% B, 80% 70% A [0 ^ 30 min.] (Waters kruve 6), så 30% _> 50% B, 70% -> 50% A [30 45 min.] (Waters kurve 11) hvor A er 0,1% vandig TFA og B er acetonitril. Topp-påvisning og fraksjonsoppsamling ble utført i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 6. Av de oppsamlede fraksjoner var fraksjonene av interesse:

Fraksjoner I og J, som omfatter polypeptider, ble fremstilt for sekvensering og sekvensert i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 6.

Aminosyresekvensen og FAB MS for polypeptidet omfattet av fraksjon I, ble bestemt som:

FAB MS: 4158.

Den amino-terminale aminosyresekvens av en del av polypeptidet og FAB MS for hele polypeptidet omfattet av fraksjon J ble bestemt som:

og FAB MS: 5506.

EKSFMPFI 9

Subfraksjonering av fraksjon L og hestemmelse ay strukturer i denne

Fraksjon L, oppnådd som beskrevet i eksempel 1, ble satt på en C-18 Vydac® (10 mm x 250 mm, 300 Å porestørrelse, 5 u partikkelstørrelse) kolonne og eluert av ved å anvende en strømhastighet på 3,5 ml/min. og et løsnings-middelsystem hvor man anvendte et lineært gradientprogram på 25% -> 40% B, 75% -v 60% A [0 -» 30 min.] hvor A er 0,1% vandig TFA og B er acetonitril. Topp-påvisning og fraksjonsoppsamling ble utført i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 6. Av de oppsamlede fraksjoner var fraksjonene av interesse:

Fraksjoner Li og L2, som omfatter polypeptider, ble fremstilt for sekvensering og sekvensert i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 6.

Den amino-terminale aminosyresekvens av en det av polypeptidet omfattet av fraksjon L? ble bestemt som:

og molekylvekten av hele polypeptidet ble bestemt ved gelelektroforese i henhold til kjente fremgangsmåter til å være omtrent 20.000.

EKSFMPFI m

Bestemmelse av struktur av fnrhinrielse snm omfatter fraksjon M Fraksjon M, oppnådd som beskrevet i eksempel 1 og som omfatter et polypeptid, ble fremstilt for sekvensering og sekvensert i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 6.

Den amino-terminale aminosyresekvens av en del av polypeptidet omfattet av fraksjon M ble bestemt som: H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-

og molekylvekten av hele polypeptidet ble bestemt ved gelelektroforese i henhold til kjente fremgangsmåter til å være omtrent 80.000.

FKSFMPFI 11

1 H-inriol-3-anetamiri, N-{? 0- aminn- 4- hyrimksy- 4 8, 12 17- tetraa7eir. os- 1 - yl

Syntese av tittelforbindelsen, som er forsikret å være omfattet av fraksjon E som beskrevet i eksempel 4, ble utført som beskrevet nedenfor.

Under nitrogenatmosfære ble 13,22 g (0,15 mol) diaminobutan og 3,5 mi metanol rørt og 9,94 ml (0,15 mol) akrytonitril ble tilsatt via en sprøytepumpe over en to timers periode med avkjøling til 0-5°C. Blandingen ble etter omtrent 18 timer kromatografert på 600 g silisiumdioksydgel ved å anvende et løsningsmiddel-system på 3:1 CHaCla/MeOH (2 liter) fulgt av 3:1 CH2CI2/MeOH som inneholdt 5% i volum av isopropylamin (2 liter). Fraksjonene som inneholdt det bundete produkt, ble konsentrert ved avdampning under vakuum og ga en gul viskøs olje. NMR-analyse verifiserte at produktet var det bundete produkt med formel (I) vist ovenfor.

Under nitrogenatmosfære ble 5,78 g (0,041 mol) av forbindelsen med formel l, fremstilt som beskrevet i del A ovenfor, tilsatt til 75 ml CH3CN og 11,48 g KF Celite og rørt. Til den rørte blanding ble det tilsatt en løsning av 9,75 g (0,041 mol) av forbindelsen med formel II, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i fremstilling A, i 25 ml CH3CN. Reaksjonen ble oppvarmet under tilbakeløp og målt ved TLC (3:1 CH2CI2/MeOH). Etter 3 timer ble reaksjonen tillatt å avkjøles og stå ved romtemperatur. Celite ble så filtrert av, og filterkaken ble vasket godt med diklormetan. Filtratet ble konsentrert under vakuum. Råproduktet inneholdt i det konsentrerte filtrat ble kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 2 liter 3:1 ChkCb/MeOH, så 2 liter 3:1 CH2CI2/MeOH og 10 ml isopropylamin, så 2 liter 3:1 CHzCb/MeOH og 30 ml isopropylamin. Produktet eluerte fra kolonnen etter at kolonnen ble mettet med isopropylamin, men var fortsatt urent. Alle produktfraksjoner ble kombinert og konsentert. Silisium-diokskydgel ble fremstilt ved å oppslemme 500 g silisiumdioksydgel i CH2CI2 og 125 ml isopropylamin og så anvendt for å pakke en kolonne på standard måte. Råproduktet ble satt på kolonnen ved å anvende diklormetan. Så ble 500 ml diklormetan kjørt gjennom kolonnen, fulgt av 1 liter 3:1 CH2Cl2/MeOH. Produktfraksjonene ble kombinert og konsentrert under vakuum for å gi 1,5 g produkt med formel III ovenfor. 2 g til av produktet med formel III ble eluert fra kolonnen ved å anvende 1 liter 3:1 CH2CI2/MeOH og 30 ml isopropylamin.

Under nitrogenatmosfære ble 3,5 g (11,8 mmol) av forbindelsen med formel Ml, fremstilt som beskrevet i del B ovenfor og 150 ml diklormetan rørt, og 5,2 g (23,6 mmol) di-t-butyldikarbonat ble tilsatt. Blandingen ble rørt i omtrent 68 timer ved romtemperatur. Blandingen ble så konsentret under vakuum og kromatografert ved å anvende 400 g silisiumdioksydgel og en 60:40 heksan/etylacetat-løsningsmiddel for å gi 5,62 g av forbindelsen med formel IV som en olje.

Under nitrogenatmosfære ble 3,0 g av forbindelsen med formel IV, fremstilt som beskrevet i del C, ovenfor, løst i 30 ml eddiksyre i en 250 ml Pan-® flaske. Til denne løsning ble det tilsalt 3,0 g Pd(OH)2/karbon og blandingen ble hydrogenert ved 50 p.s.i. H2-trykk i 2 timer. Katalyatoren ble fjernet ved filtrering, og kaken ble vasket godt med eddiksyre. Filtratet ble konsentrert, tatt opp i 75 ml diklormetan, vasket to ganger med 75 ml 1N NaOH og tørket over K2CO3. Løsningen ble konsentrert under vakuum for å gi 2,86 g produkt med formel V ovenfor.

Under nitrogenatmosfære ble 2,86 g (5,7 mmol) av forbindelsen med formel V, fremstilt som beskrevet r del D ovenfor, løst i 75 ml metanol. Under røring ble 0,41 ml (6,3 mmol) akrylonitril tilsatt til blandingen, og reaksjonen ble rørt over natten. Reaksjonsblandingen ble så konsentrert, konsentrert på nytt tre ganger fra 30 ml diklormetan og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum for å gi 3,18 g av forbindelsen med formel VI som en olje.

Under nitrogenatmosfære ble 3,18 g (5,7 mmol) av forbindelsen med formel VI, fremstilt som beskrevet i del E ovenfor, kombinert med 100 ml diklormetan og rørt i løsning. Til denne løsning ble det tilsatt 1,37 g (6,3 mmol) av di-t-butyldikarbonat, og reaksjonen ble rørt i 90 min. ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble så konsentrert og kromatografert på 300 g silisiumdioksydgel ved å anvende 60:40 heksan/etylacetat som elueringsmiddel. Produktfraksjonene ble kombinert, konsentrert, ekstrahert med 3 x 20 ml diklormetan, og løsningsmidlet ble fjernet under vakuum for å gi 3,12 g produkt med formel VII ovenfor:

Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i del D ovenfor ble 3,12 g (4,76 mmol) av forbindelsen med formel VII, fremstilt som beskrevet i del F ovenfor, løst i 30 ml eddiksyre og hydrogenert ved 55 p.s.i. i 2 timer i nærvær av 3,0 g Pd(OH)2/karbon for å gi 3,02 g av produkt med formel VIII ovenfor som en olje.

Under nitrogenatmosfære ble 1,0 g (1,5 mmol) av forbindelsen med formel VIII fremstilt som beskrevet i del G, løst i 10 ml metanol. Til denne løsning ble det tilsatt 0,1 "ml (1,67 mmol) akrylonitril, og reaksjonen ble rørt over natten. Så ble reaksjonsblandingen konsentrert, konsentrert på nytt tre ganger fra 20 ml diklormetan, og løsningsmidlet fjernet under vakuum for å gi 1,0 g produkt med formel IX ovenfor.

Ved å følge fremgangsmåten beskrevet i del D ovenfor ble 1,0 g (1,4 mmol) av forbindelsen med formel IX, fremstilt som beskrevet i del H ovenfor, løst i 30 ml eddiksyre og hydrogenert ved 50 p.s.i. i 2,5 timer for å gi 0,85 g av produkt med formel X ovenfor.

Enjøsning som inneholdt 6,78 g (20 mmol) tetrabutylammoniumhydrogensulfat og 75 ml H20 ble fremstilt ved å røre, og 3,36 g (40 mmol) NaHC03 ble tilsatt etter som skummingen ville tillate. Så ble 3,5 g (20 mmol) indoleddiksyre tilsatt, blandingen ble rørt i 5 min., og 75 ml CHCI3 ble tilsatt. Blandingen ble rørt i 5 min. til, og de to bunnlagene ble separert. Det vandige lag ble saltet med Na2S04 og ekstrahert med CHCI3. Alle CHCb-ekstrakter ble kombinert og tørket over Na2S04. Den resulterende klare, ravfargede løsning ble konsentrert, renset med 3 x 75 ml aceton og til slutt løst i 75 ml aceton. Så ble 1,9 ml (22 mmol) allylbromid tilsatt, og blandingen ble tillatt å stå i 30 min.. Blandingen ble så konsentrert og kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 3:1 heksan/ etylacetat for å gi 3,57 g produkt med formel XI, ovenfor, som en lysegul olje.

Ved å følge fremgangsmåten i Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:298 (1984) ble 2,15 g (10 mmol) av en forbindelse med formel XI, fremstilt som beskrevet i del J ovenfor, kombinert med 20 ml acetonitril, og 2,61 g (12 mmol) di-t-butyldikarbonat ble tilsatt til blandingen. Så ble 0,122 g (1 mmol) 4-(N,N-dimetyl-amino)pyridin tilsatt, og reaksjonen tillatt å pågå i 15 min.. Blandingen ble så fortynnet til 125 ml med etylacetat, vasket 2 ganger med fortynnet HCI, 3 x 25 ml H20,1 x saltvann, tørket og konsentrert. Produktet ble renset ved kromatografering på silisiumdioksydgel ved å anvende 14,5:1 heksan/etylacetat som elueringsmiddel for å gi 2,87 g av forbindelse med formel XII ovenfor, som en fargeløs olje.

Til 3,27 g (10,4 mmol) av forbindelse med fomrel XII, fremstilt i henhold til del K ovenfor, i 20 ml diklormetan ble det tilsatt 7,4 ml natrium 2-etylheksanoat i etylacetat (0,231 g/ml). Så ble 0,5 g 03P og 0,5 g (03P)4Pd tilsatt, og blandingen ble rørt i 60 min.. Blandingen ble så konsentrert, tatt opp i 150 ml etylacetat og vasket 5 x 25 ml H2O. De vandige ekstraktene bie kombinert og ekstrahert tilbake med 1 x 25 ml etylacetat og 1 x 25 ml dietyleter. Til det vandige lag ble det tilsatt 75 ml fersk etylacetat og så surgjort til pH 3. Etylacetatlaget ble separert, og det vandige lag ble ekstrahert med 1 x 50 ml fersk etylacetat. De to etylacetat-ekstrakter ble kombinert og vasket med 2 x 20 ml H2O, så 1 x 20 ml saltvann, tørket, konsentrert, renset med 3 x 30 ml heksan hvor krystaller dannet seg under den andre skylling. Blandingen ble fortynnet til 75 ml med heksan. De faste stoffer ble filtrert, vasket godt med heksan og lufttørket for å gi 1,37 g hvite faste stoffer. NMR bekreftet trttelstrukturen med formel XIII.

Under nitrogenatmosfære ble 200 mg (0,73 mmol) av forbindelsen med formel XIII kombinert med 25 ml diklormetan, 84 mg (0,73 mmol) N-hydroksysuccinimid og 150 mg (0,73 mmol) dicykloheksylkarbodiimid hvorved et prestpitat dannet seg nesten umiddelbart. Blandingen ble rørt i 3 timer. Så ble dicykloheksylurea filtrert av, og til filtratet ble det tilsatt dråpevis en 40 ml løsning av forbindelsen med formel X, fremstilt som beskrevet i eksempel 11, deler A-I i diklormetan. Blandingen ble rørt i 12 timer, så vasket med 0,1 NaOH og tørket over K2CO3, konsentrert og kromatografert ved å anvende 150 g silisiumdioksydgel og eluere med 9:1 diklormetan/metano (0,51) for å fjerne urenheter, så med 9:1:0,1 diklormetan/metanol/isopropylamin (2 liter). Produktet ble så konsentrert, renset med diklormetan og videre konsentrert for å gi 400 mg av forbindelsen med formel XIV, bekreftet ved 300 MHz NMR.

Under nitrogenatmosfære ble 0,34 g (0,35 mmol) av forbindelsen med formel XIV, fremstilt som beskrevet ovenfor, kombinert med 30 ml aceton, rørt i løsning og avkjølt til omtrent 0°C i et is/acetonbad. Så ble 0,212 g (1,05 mmol) 85% 3-klorperoksybenzosyre i 20 ml aceton tilsattt dråpevis over 8-10 min.. Reaksjonen ble rørt i 30 min., så fortynnet til 150 ml med dietyleter og vasket med 2 x 25 ml 10% K2CO3, 2 x 25 ml H20, 2 x 25 ml 10% K2CO3, 2 x 25 ml H20 og tørket over K2CO3. Blandingen ble konsentrert, renset med 2 x 30 ml diklormetan og konsentrert under vakuum til en stabil vekt på 0,33 g. NMR-analyse viste at produktet var en blanding av det ønskede produkt med formel XV, startmateriale og biprodukt. P rod uktb land ingen bie tilsatt til 3 ml eddiksyre hvortil det ble tilsatt 20 mg NaCNBH3. Blandingen ble rørt over natten, eddiksyre ble fjernet under vakuum, blandingen ble løst i 50 ml diklormetan og vasket 1 x 75 ml med vandig buffer, pH 7. Hvis nødvendig ble pH justert til pH 7 med 1IM NaOH, og diklor-metanlaget ble separert og vasket med 1 x 50 ml vandig buffer, pH 7 og 1 x 25 ml saltvann, tørket over Na2S04 og konsentrert under vakuum til en stabil vekt på 0,31 g. Det resulterende produkt ble kromatografert på 100 g silisiumdioksydgel ved å anvende 95:5 etylacetat/metanol for å eluere og oppsamle 25 ml fraksjoner. Det rensede produkt med formel XV kom av i fraksjoner 18-25. Disse fraksjoner ble kombinert, konsentrert, renset med 2 x 5 ml diklormetan og konsentrert under vakuum til et hvitt skum på 68 mg som ble lagret ved -80°C. Fraksjoner 26-40 som også inneholdt det ønskede produkt, inneholdt også noe urenhet. Fraksjoner 26-40 ble kombinert, konsentrert, renset med diklormetan og konsentrert under vakuum til en stabil vekt på 66 mg. Det sistnevnte produktet ble kombinert med 6 mg av det førstnevnte produkt, som var blitt anvendt til NMR-studier og med en blanding som var blitt fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Den resulterende blanding ble kromatografert på 75 g silisiumdioksydgel ved å anvende 9:5 etylacetat/metanol for å eluere og oppsamling av 25 ml fraksjoner. Renset produkt med formel XV var tilstede i fraksjoner 16-21. Disse fraksjoner ble kombinert, konsentrert, renset med 2 x 5 ml diklormetan og konsentrert under vakuum til en stabil vekt på 46 mg som ble lagret ved -80°C.

Under nitrogenatmosfære ble 108 mg (0,109 mmol) av forbindelsen med formel XV, fremstilt som beskrevet ovenfor, løst i 1,5 ml diklormetan. Så ble 2 ml trifluoreddiksyre tilsatt, og blandingen ble rørt i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble så konsentrert til en film, og 15 ml dietyleter ble tilsatt. Filmen ble fast, og etter 30 min. røring, ble den til et hvitt pulver. Pulveret ble filtrert, vasket godt med dietyleter, tørket under nitrogen, så avdampet til en stabil vekt på 109 mg av tittelforbindelsen i dette eksempel.

FKfiFMPFI 17

1H-indnl-3-acatamiH, N-(Pu-amino-4- hyrt roksy- 4, 8, 12, 17- tetra-a7fiioos-1 -yl)-4-hyrirnksy

Syntese av tittelforbindelsen, forsikret å være omfattet av fraksjon Bi som beskrevet i eksempel 3, ble utført som beskrevet nedenfor

Under argonatmosfære ved å anvende flammetørket glass, ble 4,0 g (30 mmol) 4-hydroksyindol kombinert med 25 ml Aldrich tørr DMF og rørt i løsning. Så ble 1,44 g (30 mmol) NaH som en 50% oljedispersjon tilsatt. Etter at skummet var sunket sammen, ble 2,5 ml klormetylmetyleter (Aldrich) tilsatt, og den resulterende mørkegrønne løsning ble rørt over natten. Så ble løsningen fortynnet til 125 ml med etylacetat, vasket med 5 x 25 ml H2O og 1 x 25 ml saltvann, tørket over Na2SC>4 og kromatografert ved å anvende 4:1 heksan/etylacetat. De produktinneholdende fraksjoner ble kombinert og konsentrert for å gi 2,70 g av forbindelse XVII som en olje.

I en 50 ml 3 halset rundbundet kolbe utstyrt med mekanisk rører og nitrogenatmosfære ble det avkjølt 1,3 g vandig formaldehyd (37%) og 2,28 g eddiksyre. Så ble 3,23 ml avkjølt dimetylamin (25% i H20) tilsatt. Til den resulterende avkjølte løsning ble det tilsatt 2,7 g (15,2 mmol) av en forbindelse med formel XVII ved å anvende omtrent 1,5-2,0 ml tetrahyd raf uran som overføringsløsningsmiddel. Reaksjonen ble oppvarmet til romtemperatur og rørt over natten. Så ble 40 ml 10% NaOH tilsatt, hvoretter det ble dannet et presipitat. Etter røring ble presipitatet filtrert, vasket med H2O og lufttørket for å gi 3,26 g av forbindelse med formel XVIII.

Under nitrogenatmosfære ble 4,62 g KCN kombinert med 10 ml H2O og rørt i løsning. Så ble 30 ml etanol og 3,26 g (14 mmol) av forbindelse XVIII tilsatt, og blandingen ble rørt og oppvarmet under tilbakeløp i omtrent 65 timer. Reaksjonen ble avkjølt og konsentrert. Det resulterende presipitat som omfattet forbindelse XX, ble filtrert, vasket med H2O og lufttørket. Det vandige lag ble ekstrahert med 4 x 15 ml diklormetan, idet man sparte de organiske ekstrakter. Det vandige lag ble så overlagt med 50 ml etylacetat og surgjort til pH 2. Etylacetatlaget ble separert, avgasset med boblende nitrogen gjennom etylacetatlaget, tørket og konsentrert til et fast stoff som ble triturert med diisopropyleter for å gi 1,03 g av forbindelse XIX som et gulhvitt fast stoff. Så ble alle ekstrakter fra det vandige grunn-lag kombinert, tørket, kombinert med filtratene fra ovenfor og konsentrert for å gi 0,4 g av forbindelse XX som et fast stoff.

Under nitrogenatmosfære ble 1,6 g av forbindelse XX kombinert med 7,5 ml etanol, 30 ml H20 og 1,3 g KOH. Blandingen ble oppvarmet under tilbakeløp og rørt over natten. Så ble reaksjonen avkjølt, ekstrahert med 2 x 15 ml etylacetat, overlagt med fersk etylacetat og surgjort til pH 2. De kombinerte etylacetatlag ble tørket og konsentrert. Det resulterende faste stoff ble triturert med IPE for å gi 1,1 g av forbindelse XIX.

110 ml H20 ble det løst 1,44 g (4,25 mmol) TBAHSO4. Så ble 714 mg (8,5 mmol) NaHC03 tilsatt. Etter at skummingen hadde avtatt, ble 1,0 g (4,25 mmol) av forbindelsen med formel XIX tilsatt, og blandingen ble rørt i 1 min. før 40 ml

kloroform ble tilsatt. Reaksjonen ble rørt i 5 min., kloroformlaget ble separert, og så ble den vandige blanding ekstrahert med 1 x 15 ml kloroform. De kombinerte kloroformekstrakter ble tørket, konsentrert og renset med 2 x 30 ml aceton. Så ble produktet gjenoppløst i 30 ml aceton under nitrogenatmosfære, 0,37 ml (4,25 mmol) allylbromid ble tilsatt, og reaksjonen ble rørt i 2 timer. Blandingen ble konsentrert og kromatografert ved å anvende etylacetat som elueringsmiddel. Produktet ble konsentrert for å gi 1,1 g av en olje. Hele produktet ble kombinert med 25 ml diklormetan, og 0,98 g (4,5 mmol) di-t-butyldikarbonat og 51 mg (0,425 mmol) 4-(N,N-dimetylamino)pyridin ble tilsatt. Reaksjonen ble rørt over natten. Så ble reaksjonsblandingen konsentrert og kromatografert ved å anvende 9:1 heksan/etylacetat for etter konsentrasjon å gi 1,33 g av forbindelsen med formel XXI som en viskøs olje.

I 2 ml metanol ble det løst 64 mg (0,17 mmol) av en forbindelse med formel XXI. Til denne løsningen ble det tilsatt 1,7 ml 0,1 NaOH, og den resulterende reaksjonsblanding ble rørt over natten. Reaksjonen ble så surgjort, tørket, ekstrahert med etylacetat og konsentrert. NMR-analyse viste at all allylesteren i forbindelse XXI var blitt fjernet, men noe transesterifisering hadde forekommet, og noe metylester var tilstede. Derfor ble produktet kombinert med den gjenværende mengde av forbindelse XXI (omtrent 1,26 g), løst i 5 ml tetrahydrofuran og avkjølt til 0°C. Så ble 3,8 ml 1N NaOH tilsatt, reaksjonen ble rørt i 5 min. ved 0°C, så tillatt å varmes opp til romtemperatur. Reaksjonen resulterte i to faser som krevde tilsetning av 5 ml metanol for å eliminere fasene. Reaksjonen ble rørt over natten. Så ble tetrahydrofuran og metanol fjernet, og den gjenværende vandige løsning ble overlagt med 50 ml etylacetat og surgjort til pH 2. Etylacetatlaget ble separert, vasket med 1 x 20 ml H20, én gang med saltvann, tørket med Na2S04, filtrert og konsentrert til en gummi som krystalliserte når den ble triturert med heksan for å gi 1,08 g av et hvitt fast stoff. Det faste stoff ble kromatografert ved å anvende 70:30 etylacetat/heksan, og de rene produktfraksjoner ble kombinert, konsentrert og krystallisert fra etylacetat/heksan for å gi 0,884 g av forbindelse med formet XXII.

Under nitrogenatmosfære ble 271 mg (0,81 mmol) av forbindelsen med formel XXII løst under røring i 4 ml vannfri tetrahydrofuran. Så ble 93 mg (0,81 mmol) N-hydroksysuccinimid og 1,67 mg (0,81 mmol) dicykloheksylkarbodiimid tilsatt, og blandingen ble rørt. Etter 1 time og 50 min. ble 0,58 g (0,8 mmol) av forbindelsen med formel X, fremstilt i hehold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11, i 30 ml diklormetan tilsatt, og blandingen ble rørt over helgen. Så ble dicykloheksylurea filtrert av, og blandingen ble ekstrahert med 2 x 3 ml 1N NaOH, tørket over K2CO3 og konsentrert. Produktet ble så kromatografert på 100 g silisiumdioksydgel ved å anvende 9:1 diklormetan/metanol for å eluere alt bortsett fra det ønskede produkt, så med 90:10:1 diklormetan/metanol/isopropylamin for å eluere produktet. De produktinneholdende fraksjoner ble konsentrert, renset flere ganger med diklormetan, og løsningsmidlet ble fjernet for å gi 349 g av forbindelse med formel XXIII som et hvitt skum.

Alternativt, og foretrukket, ble en 50 ml løsning som inneholdt 0,480 g (1,43 mmol) av forbindelsen med formel XXII i diklormetan behandlet med 0,165 g (1,43 mmol) N-hydroksysuccinimid fulgt av 0,294 g (1,43 mmol) dicykloheksylkarbodiimid og tillatt å røres i 5 timer. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet som inneholdt rå hydroksysuccinimid, ble tilsatt dråpevis over en 20 min. periode til en 100 ml løsning av 1,03 g (1,43 mmol) av en forbindelse med formel X, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11, i diklormetan. Reaksjonen ble rørt i 72 timer. Så ble den rå reaksjonsblandingen vasket to ganger med 20 ml 1N NaOH, tørket over K2CO3, filtrert og konsentrert. Produktet ble så kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 4:1 diklormetan/- metanol fulgt av 9:1:1 diklormetan/metanol/diisopropylamin fora gi 912 mg av forbindelsen med formel XXIII.

Under en nitrogenatmosfære ble indolacetamid XXIII (900 mg, 0,87 mmol) løst i 40 ml diklormetan. Til denne løsningen ble det tilsatt 2-(fenylsolfonyl)-3-fenyloksaziridin (500 mg, 1,92 mmol). Reaksjonens forløp ble målt ved tynn-sjiktskromatografering. Etter 1 time ble reaksjonsblandingen konsentrert under vakuum for å gi overveiende rå nitron som ble løst i 35 ml eddiksyre. Et stort overskudd av natriumcyanoborhydrid (1,00 g, 15,9 mmol) ble tilsatt, og reaksjonen ble tillatt å røres i omtrent 2 timer. Reaksjonen ble konsentrert under vakuum, tatt opp i diklormetan (50 ml), vasket med pH 7 buffer (1 x 50 ml), idet man justerte pH til 7 med 1N NaOH. Det organiske lag ble vasket igjen med pH 7 buffer (1 x 50 ml), tørket over kaliumkarbonat og konsentrert under vakuum for å danne rå-produkt som ble kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 95:5 etylacetat/metanol for å gi 612 mg (67%) av XXIV som et hvitt skum.

Ved vekselvis å dra ut et vakuum og å lufte med argon tre ganger ble 3 ml trifluoreddiksyre avgasset. Så ble kolben pakket inn i aluminiumsfolie, og 98 mg av forbindelse XXIV ble tilsatt med anvendelse av omtrent 2,5 ml diklormetan som et overføringsmiddel. Etter 45 min. ble blandingen konsentrert for å gi en olje, som ved triturering med dietyleter ga 88 mg av forbindelse XXV som et hvitt fast stoff sorrrble lagret ved -80°C.

Alternativt og foretrukket ble det til en mettet 100 ml dioksan-HCI-løsning, renset med argon, tilsatt over 1,5 min., 0,520 g (0,495 mmol) av forbindelsen med formel XXIV, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i del H ovenfor, i 10 ml dioksan. Et presipitat dannet seg umiddelbart, og reaksjonen ble rørt i 1 time. Så ble dietyleter tilsatt, og etter 5 min. ble løsningen filtrert. De resulterende faste stoffer ble vasket med dietyleter, tørket under nitrogenatmosfære og så under redusert trykk for å gi 345 mg av syren med formel XXIV som kunne lagres ved 78°C. Så ble det til en vandig løsning, renset med argon, tilsatt 150 mg (0,205 mmol) av syren med formel XXIV. Reaksjonen ble målt ved HPLC. Ved fullførelse av reaksjonen etter omtrent 7 timer ble reaksjonsblandingen frysetørket for å gi 103 mg av forbindelsen med formel XXV som dets hydrokloridsalt.

EKSEMPEL 13

Benzamid, N-(20-amino-4-hydroksy-4,8,12,17-tetraazeicos-1 -yl)-4-hydroksy

Syntese av tittelforbindelsen, forsikret å være omfattet av fraksjon A<1> som beskrevet i eksempel 2, ble utført som beskrevet nedenfor.

I et 400 ml beger ble 6,78 g (20 mmol) tetrabutylammoniumhydrogensulfat kombinert med 60 ml H20 og rørt i løsning. Så ble 3,36 g (40 mmol) NaHC03 tilsatt som skumming ville tillate det, fulgt av tilsetning av 40 ml av en løsning som inneholdt 2,76 g (20 mmol) p-hydroksybenzosyre, 0,8 g NaOH og 40 ml H20. Reaksjonsblandingen ble rørt i 5 min., og så ble 200 ml diklormetan tilsatt. Blandingen ble rørt i 5 min. til, og lagene ble tillatt å separere. Det vandige lag ble ekstrahert to ganger med 50 ml diklormetan. De kombinerte diklormetan-ekstraktes ble tørket over Na2S04, konsentrert, renset to ganger med 75 ml aceton og gjenoppløst i 50 ml aceton. Så ble 1,9 ml (22 mmol) allylbromid tilsatt, og blandingen ble rørt. Reaksjonsblandingen ble så konsentrert, tatt opp i 100 ml etylacetat, vasket to ganger med 30 ml H20, én gang med 50 ml mettet bi-karbonat, én gang med 30 ml H20, én gang med saltvann, én gang med H20 og én gang med saltvann. Det resulterende produktet ble tørket og konsentrert for å gi en olje. Oljen ble triturert med 50 ml petroleumeter i 1 time. Så ble blandingen filtrert, vasket godt med petroleumeter og lufttørket for å gi 1,7 g av forbindelsen med formel XXVI, ovenfor.

Under nitrogenatmosfære ble 1,7 g (9,55 mmol) av forbindelsen med formel XXVI, fremstilt som beksrevet i del A ovenfor, kombinert med 50 ml Aldrich tørr DMF og rørt i løsning. Så ble 0,38 g (9,55 mmol) NaH som en 60% oljedispersjon tilsatt, og reaksjonen ble rørt over natten. Så ble 0,76 ml klormetylmetyleter (Aldrich) tilsatt, hvorved et presipitat dannet seg umiddelbart. Reaksjonsblandingen ble rørt i 18 timer. Reaksjonen ble stoppet i 200 ml etylacetat/100 ml H20. Etylacetatlaget ble separert, vasket 3 ganger med 50 ml H20, én gang med 50 ml 1N NaOH, én gang med 50 ml H20 og én gang med saltvann. Den resulterende løsning ble tørket, konsentrert og kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 4:1 heksan/etylacetat for å gi 1,63 g av forbindelse med formel XXVII, ovenfor.

« —

I 75 ml tetrahydrofuran ble det løst 1,62 g (7,3 mmol) av forbindelse med formel XXVII, fremstilt som beskrevet i del B, ovenfor. Så ble en løsning som inneholdt 0,4 g (10 mmol) NaOH i 15 ml H20 tilsatt, hvilket resulterte i dannelse av to lag. Metanol ble tilsatt inntil det ble oppnådd en homogen blanding. Reaksjonen ble så rørt over natten. Tetrahydrofuran og metanol ble fjernet under vakuum, og den gjenværende vandige løsning ble ekstrahert to ganger med 15 ml etylacetat. Så ble det vandige lag overlagt med 50 ml fersk etylacetat og surgjort til pH 2,5 med 6N HCI. Så ble etylacetatlaget separert, vasket én gang med 10 ml H20 og én gang med 25 ml saltvann. Den resulterende løsning ble konsentrert for å gi faste stoffer som ble triturert med heksan, filtrert og lufttørket for å gi 1,2 g av forbindelse med forme! XXVIII, ovenfor.

En 20 ml diklormetanløsning som inneholdt 0,127 g (0,7 mmol) av forbindelse med formel XXVIII, fremstilt som beskrevet i del C ovenfor, ble behandlet med 0,081 g (0,7 mmol) N-hydroksysuccinimid fulgt av 0,144 g (0,7 mmol) dieykloheksylkarbodiimid og tillatt og røres i 4 timer. Så ble reaksjonsblandingen filtrert og filtratet som inneholdt rå hydroksysuccinimid, ble tilsatt dråpevis over en 20 min. periode til en 80 ml diklormetanløsning som inneholdt 0,50 g (0,7 mmol) av forbindelse med formet X, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11, deler A-I, ovenfor. Reaksjonen ble så rørt i timer. Reakjsonsblandingen ble så vasket med 1N NaOH (2 x 20 ml), tørket over kaliumkarbonat, filtrert og konsentrert. Konsentratet ble kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 9:1 diklormetan/metanol fulgt av 9:1:0,25 diklormetan/metanol/diisopropylamin for å gi 370 mg av forbindelsen med formel XXXI! ovenfor.

Under nitrogenatmosfære ble 0,335 g (0,38 mmol) av forbindelse med fomrel XXXII, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i del D ovenfor, løst i 30 ml diklormetan. Til denne løsning ble det tilsatt 0,230 g (0,88 mmol) 2-(surfonylfenyl)-3-fenyl-oksaziridin. Etter 0,5 timer ble reaksjonen konsentrert under vakuum, og konsentratet ble løst i 15 ml eddiksyre. Et stort overskudd av cyanoborhydrid (0,100 g, 1,6 mmol) ble tilsatt, og reaksjonen ble rørt i 2 timer. Så ble reaksjonen konsentrert under vakuum, tatt opp i 50 ml diklormetan, vasket én gang med 50 ml pH 7 buffer, idet man justerte pH til 7 med 1N NaOH. Det organiske lag ble vasket igjen med 50 ml pH 7 buffer, tørket over kaliumkarbonat og konsentrert under vakuum. Konsentratet ble kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 50:50 aceton/heksan for å gi 253 mg av forbindelsen med formel XXXIV ovenfor.

Under argonatmosfære ved romtemperatur ble det kombinert 0,20 g (0,223 mmol) av forbindelsen med formel XXXIV, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i del E ovenfor, og 5 ml trifluoreddiksyre. Reaksjonen ble rørt i 1,5 timer. Det ble tilsatt 2 ml trifluoreddiksyre til, for å vaske veggene i kolben. Reaksjonen ble tillatt å pågå i 1,5 timer til. Så ble reaksjonen konsentrert under vakuum, triturert med etyleter, filtrert og tørket under nitrogenatmosfære for å gi 218 mg av forbindelsen med formel XXXVI, tittelforbindelsen i dette eksempel.

FKRFMPFI 14

Benzamid. N-(?0-aminn-4-hydmksy-4 8,19,17-tlftraa7eims-1 -yl)-7,fi-dihyrirnksy

Syntese av tittelforbindelsen, forsikret å være omfattet av fraksjon Ai som beskrevet i eksempel 3, ble utført som beskrevet nedenfor.

V8d~~å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 12, del A, men ved å starte med 3,08 g (20 mmol) 2,5-dihydroksybenzosyre, fikk man 3,0 g av forbindelsen med formel XXIX ovenfor.

Under nitrogenatmosfære ble 3,0 g (15,5 mmol) av forbindelsen med formel XXIX kombinert med 50 ml Aldrich tørr DMF og rørt i løsning. Så ble 1,24 g (31 mmol) NaH som en 60% oljedispersjon tilsatt, og blandingen ble rørt. Etter 3 timer ble 2.5 ml (33 mmol) klormetylmetyleter tilsatt, og reaksjonen ble rørt i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble så tilsatt til 300 ml etylacetat og 100 ml H2O. Etylacetatlaget ble så separert og vasket 3 ganger med 75 ml H2O, to ganger med 75 ml 1N NaOH, to ganger med 50 ml H20 og én gang med saltvann. Den resulterende løsning ble tørket og konsentrert for å gi 2,9 g av en olje som ble kromatografert på silisiumdioksydgel ved å anvende 4:1 heksan/etylacetat for å gi to fraksjoner, hvorav den andre fraksjon inneholdt 1,16 g av en forbindelse med formel XXX ovenfor.

Til 10 ml tetrahydrofuran ble det tilsatt 1,16 g (4,1 mmol) av forbindelsen med formel XXX ovenfor. Så ble 0,24 g (6 mmol) NaOH i 10 ml H20 tilsatt, hvilket resulterte i dannelse av to faser. Metanol ble tilsatt til blandingen inntil det ble oppnådd én fase, og så ble blandingen rørt i 18 timer. Løsningsmidlene ble så fjernet, og den resulterende vandige løsning ble ekstrahert to ganger med 15 ml etylacetat. Det vandige lag ble så overlagt med 35 ml fersk etylacetat, og pH ble justert til 2,5 med 6N HCI. Etylacetatlaget ble så separert, vasket én gang med 10 ml H20 og én gang med saltvann, tørket og konsentrert for å gi 1,0 g av forbindelsen med formel XXXI ovenfor som en olje.

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 13, del D, og ved å anvende 0,17 g (0,7 mmol) av forbindelsen med formel XXXI, fremstilt som beskrevet i del C ovenfor, 0,081 g (0,7 mmol) N-hydroksysuccinimid, 0,144 g (0,7 mmol) dicykloheksylkarbodiimid og 0,50 g (0,7 mmol) av forbindelsen med formel X, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11, deler A-I, fikk man etter kromatografering 370 mg av forbindelsen med formel XXXIII, ovenfor.

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 13, del E, og ved å anvende 0,308 g (0,33 mmol) av forbindelsen med formel XXXIII, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i del D ovenfor, og 0,250 g (0,96 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyl-oksaziridin fikk man etter silisiumdioksydgelkromatografering ved å anvende etylacetat fulgt av 50:50 aceton/heksan, 210 mg av forbindelse med formel XXXV ovenfor.

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 13, del F, og ved å anvende 0,100 g (0,104 mmol) av forbindelsen med formel XXXV, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i del E ovenfor, fikk man 108 mg av forbindelsen med formel XXXVII, tittelforbindelsen i dette eksempel.

EKSEMPEL 15

1 H-indol-3-acetamid, N-(16-amino-4-hydroksy-4,8,13-triazaheksadek-1 -yl)-4-hydroksy

Syntese av titterforbindelsen, forsikret å være omfattet av fraksjon A2 som beskrevet i eksempel 3, ble utført som beskrevet nedenfor.

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11, del D, og ved å anvende 1,15 g (2,07 mmol) av forbindelsen med formel VI, fremstilt som beskrevet i eksempel 11, deler A-E, fikk man 1,10 g av den rå forbindelse med formel XXXVIII ovenfor.

Ved å anvende den alternative fremgangsmåten beskrevet i eksempel 12, del G, og ved å anvende en diklormetanløsning (15 ml) som inneholdt 0,228 g (6,8 mmol) av forbindelsen med formet XXII, fremstilt som beskrevet i eksempel 12, del A til F ovenfor, 0,380 g (6,8 mmol) av forbindelsen med formel XXXVIII, fremstilt som beskrevet i del A, ovenfor, 0,078 g (6,8 mmol) N-hydroksysuccinimid og 0,140 g (6,8 mmol) dicykloheksylkarbodiimid, fikk man 0,407 g av forbindelsen med formel XXXIX etter silisiumdioksydgelkromatografering ved å anvende 9:1 diklormetan/metanol fulgt av 9:1:05 diklormetan/metanol/diisopropylamin.

Anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 12, del H, og anvendelse av 0,350 g (0,4 mmol) av forbindelsen med formel XXXIX og 0,230 g (0,88 mmol) 2-(sulfonylfenyl)-3-fenyloksziridin ga 0,274 g av forbindelsen med formel XL ovenfor, etter silisiumdioksydgelkromatografering hvor man anvendte 50:50 aceton/heksan. Produktet inneholdt en liten mengde fenylsulfonamid og ble derfor videre renset på silisiumdioksydgel ved å anvende etylacetat fulgt av 50:50 aceton/heksan.

Ved å anvende den alternative fremgangsmåte i eksempel 12, del I, og ved å anvende 0,166 g (0,186 mmol) av forbindelsen med formel XL, fremstilt i henhold til fremgangsmåten beskrevet i del C ovenfor, fikk man etter dioksan/HCI-behandling rå syre. Syren med formel XL' ble løst i vann i 8 timer, fulgt av frysetørking for å gi 88 mg av forbindelsen med formel XLI.

FREMSTILLINGA

Under nitrogenatmosfære ble 34,5 g (157,6 mmol) 3-brompropylamin.HBr i 600 ml M-N-dimetylformamid rørt. Til denne løsning ble det tilsatt 34,4 g (157,6 mmol) di-t-butyldikarbonat fulgt av 32,3 ml (236 mmol) trietylamin. Et presipitat dannet seg umiddelbart. Reaksjonen ble rørt over natten. Reakjsonsblandingen ble så fortynnet til 1,5 liter med etylacetat, vasket én gang med 500 ml 1N HCI, tre ganger med 500 ml vann, én gang med saltvann og tørket over Na2S04. Etter konsentrasjon ble produktet kromatografert på 800 g silisiumdioksydgel ved å anvende 4:1 heksan/etylacetat, og fraksjonene ble målt ved tynnsjiktskromato-grafering (KMN04/l2). Fraksjonene som inneholdt produktet, ble kombinert, konsentrert under vakuum, renset to ganger med 50 ml diklormetan og skylt med høyt vakuum for å gi 25,8 g av produktet i henhold til denne fremstilling.

Claims (8)

1. Vesentlig ren forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Farmasøytisk sammensetning for antagonisering av eksitatoriske aminosyre-neurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr, karakterisert ved at den omfatter en eksitatorisk aminosyreneurotransmitter antagoniserende mengde av en forbindelse ifølge krav 1 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

3. Farmasøytisk sammensetning for blokkering av kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr, karakterisert ved at en kalsiumkanalblokkerende mengde av en forbindelse ifølge krav 1, med formel eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

4. Farmasøytisk sammesetning for antagonisiering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr og blokkerer kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr, karakterisert ved at nevnte sammensetning omfatter en eksitatorisk aminosyreneurotransmitter-antagoniserende og kalsiumkanalblokkerende mengde av en forbindelse ifølge krav 1 med formel eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer.

5. Forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1-3 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at den er for anvendelse som et medikament.

6. Anvendelse av en forbindelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 -3 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr.

7. Anvendelse av en forbindelse ifølge Krav 1 med formel eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for blokkering av kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr. i

8. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 med formel eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for antagonisering av eksitatoriske aminosyreneurotransmittere som påvirker en celle i nervesystemet til et pattedyr og som blokkerer kalsiumkanaler i en celle i nervesystemet til et pattedyr.