PL165148B1

PL165148B1 - Method of obtaining polyamines and polypeptides

Info

Publication number: PL165148B1
Application number: PL90284973A
Authority: PL
Inventors: Nicholas A Saccomano; Robert A Volkmann
Original assignee: Nps Pharma Inc; Pfizer
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1994-11-30
Also published as: AU615144B2; CN1038931C; CN1136960A; HU223593B1; NO901881D0; JPH09132596A; NZ244480A; KR920007554B1; JP2691141B2; JP2746360B2; CA2015505A1; KR930000163B1; CA2194103C; JPH0314551A; EG19311A; JPH09118692A; FI902139A0; CZ283830B6; CN1047078A; NO901881L

Abstract

1 Sposób wyodrebniania z jadu pajaka Agelenopsis aperta substancji o wlasciwosciach farmakologicznych o strukturach peptydów zawierajacej peptyd (I), peptyd (II), peptyd (III), peptyd (IV), peptyd (V), peptyd (VI), peptyd (VII) oraz dopuszczalnych w farmacji soli tych peptydów, znamienny tym, ze pelny jad z Agelenopsis aperta eluuje sie z kolumny C -18 Vydac® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkosci porów 30 nm i wielkosci ziarna 10 µm, z szybkoscia 15 ml/minute, stosujac program liniowego gradientu rozpuszczalników od 5% - 20% acetonitrylu, 95% - 80% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego (0 - 30 minut), nastepnie 20% - 70% acetonitrylu, 80% - 30% 0,1 procentowego wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego (30 - 55 minut) i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera sie frakcje G schodzaca z kolumny w 38 minucie i wprowadza sie ja na kolumne C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkosci porów 30 nm i wielkosci ziarna 10 µm, kolumne eluuje sie z szybkoscia 10 ml/minute, stosujac program nieliniowego gradientu ukladu rozpuszczalników od 20% - 30% acetonitrylu, 80% - 70% 0,1 wodnego roztworu kwasu trójfluorooc- towego (0 - 40 minut), krzywa "Waters" 6 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera sie frakcje schodzaca z kolumny w 22 minucie i ewentualnie liofilizuje sie ja, a nastepnie zawiesza w wodzie i ponownie liofilizuje, przy czym otrzymuje sie frakcje G,-peptyd (I), zbiera sie frakcje H pelnego jadu schodzaca z kolumny w okolo 39 minucie i wprowadza sie ja na kolumne C-18 Vydac® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkosci porów 30nm i wielkosci ziarna 10 µ m, kolumne eluuje sie z szybkoscia 10 ml/minute, stosujac program nieliniowego gradientu ukladu rozpuszczalników od 20% - 25% acetonitrylu, 80% - 75% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego (0 - 30 minut), krzywa "Waters" 6, nastepnie 25% - 50% acetonitrylu, 75% - 50% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorootowego (30 - 45 minut), krzywa "Waters" 11 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera sie frakcje schodzaca z kolumny w okolo 36 minucie i ewentualnie liofilizuje sie ja, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje sie frakcje H 2 - peptyd (III), zbiera sie frakcje I pelnego jadu schodzaca z kolumny w okolo 40 minucie i i wprowadza sie ja na kolumne C-4 Vydac® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkosci porów 30 nm i wielkosci ziarna 10 µm, kolumne eluuje sie z szybkoscia 10 ml/minute, stosujac program nieliniowego gradientu ukladu rozpuszczalników od 20% - 30% acetonitrylu,. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............................................ PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrębniania z jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o właściwościach farmakologicznych, o strukturze peptydu. Występujące w tym jadzie polipeptydy oraz ich sole dopuszczalne w farmacji, blokują kanały wapniowe w komórkach, w tym również w komórkach nerwowych i mięśniowych różnych organizmów kręgowców i bezkręgowców.

Peptydy oraz ich sole mają zastosowanie jako blokery kanałów wapniowych w komórkach, między innymi w komórkach układu nerwowego i mięśniowego oraz do leczenie chorób i etanów, w których zaangażowane są kanały wapniowe oraz do zwalczania szkodliwych bezkręgowców.

Jackson 1 wsp. [~Soc.Neu.Sci.Abstr.12, 1078 /1987/_7 donoszą, że jad pająka Agelenopsis aperta zawiera co najmniej dwie toksyny wpływające na przepływ jonów wapniowych. Autorzy ci ujawnili toksynę oznaczaną jako AG2, o ciężarze cząsteczkowym poniżej 1000 daltonów, hamującą przepływ jonów wapniowych w różnych rodzajach tkanek. Następnie, Jackson H. i wsp. [Soc.Neu.Sci.Abstr. 12, 730 /1985/_/ opisali inną toksynę z Agelenopsis aperta zawierającą komponentę o ciężarze cząsteczkowym około 6000. Donoszą oni, że toksyna ta wpływa na blokadę pre-synaptycznę przewodzenia, i wysuwają przypuszczenie, że blokuje ona kanały wapniowe powiązane z uwalnianiem neuroprzekażników.

Z publikacji międzynarodowego zgłoszenia WO 89/07608 znane jest chromatograficzne rozdzielanie jadu, między innymi Agelenopsis aperta. Otrzymane produkty wykazuję zdolność blokowania kanałów wapniowych, według wspomnianego zgłoszenia otrzymuje się składniki czynne jadu pająka oczyszczone tylko w pewnym stopniu, stąd ich inna zdolność do blokowania niż w przypadku frakcji jadu wyodrębnionych sposobem według wynalazku.

Związki będące antagonistami neuroprzekażników z grupy pobudzających aminokwasów mają różnorodne zastosowania. Mogą one znaleźć zastosowanie kliniczne do leczenia takich stanów jak napad padaczkowy, udar mózgu, niedotlenienie mózgu, choroby polegające na degeneracji neuronów, takie jak choroba Alzheimera i padaczka oraz, między innymi. Jako psychoterapeutyki. Szersze wiadomości na ten temat zawarte są w wydawnictwie Excitatory Amino Acids in Health and Disease', wyd. D.Lodge, John Wiley and Sons, Ltd, New York, NY 1988. Ponadto, związki te są użyteczne w badaniach fizjologii komórek oraz do niszczenia szkodników bezkręgowych .

Związki będące antagonistami wapnia posiadają wiele zastosowań. Mogą one znaleźć zastosowania kliniczne do leczenia takich stanów jak dusznica, nadciśnienie, choroby mięśnia sercowego, arytmia nadkomórkowa, brak rozluźnienia skurczu przełyku, przedwczesny poród czy choroba Raynauda. Dane na ten temat zawarte są w publikacji W.G. Nayler* w Calcium Antagonists, wyd. Academic Press, Harcourt Brace Janovich Publishers, New York, NY 1988. Ponadto, związki te są użyteczne w badaniach fizjologii komórek, między innymi komórek nerwowych i mięśniowych oraz do zwalczania szkodników bezkręgowych.

Peptydy wyodrębniane sposobem według wynalazku znajdujące się w poszczególnych frakcjach są nowe, a ich budowa jest następujące:

Frakcja G: Sekwencja z amino-terminalnym aminokwasem - peptyd /1/ H2N-glu-lye-g^|y-^leu-pro-g^lu-g^ay-ala-glu-cys-^w8p-g^|yaen-glu-eer-aep-cys-a^ye-c^ys-ala-gl^y-gln-trp-ile-lyecy^e-arg-c^ye-pro-trp-^lye-t^rp-his-ile-thr-gly-g^|u^-g^|ypro-c^ye-thr-c^ye-g^lu-arg-g^ay-^aeu-lys s-th r-cy^^e^eer-l^ye-leu-eer-wep-pro-wsn-^wrg-asn-g^lu-trp^-a.eu-^eerCiężar cząsteczkowy całego peptydu oznaczony metodę FAB MS wynosi 7267.

165 146

Frakcja Hgt Sekwencja z amino-terminalnym aminokwasem - peptyd /III/

H₂N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val- cys-aspgly-ans-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-hislys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glugly-pro-cys-thr-cys-glu-lya-gly-met-lys-his-thr-cysile-thr-lys-leu-his-cys-pro-ans-lys-ala-glu-trp-glyleu-asp-trpCiężar cząsteczkowy całego paptydu oznaczony technikę z rozpylaniem jonów lon-spray MS” wynosi 7793.

Frakcja It /peptyd II/

H₂N-asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trpala-gly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cysarg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-ans-asn-CONH₂ ciężar cząsteczkowy według FAB wynosi 4158.

Frakcja 3: /peptyd IV/

H2N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-sertrp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-pro-aspasp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-serarg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONH2

Ciężar cząsteczkowy całego peptydu wynosi 5506 według FAB MS.

Frakcja Lp Sekwencja z amino-terminalnym aminokwasem - peptyd /V/

H2N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyrpro-trp-met-val-ser-ile-gln-gln-lys-asn-lys-lys-glygly-phe-aspCiężar cząsteczkowy całego peptydu wynosi około 20 000.

Frakcję L2 jest peptyd wyodrębniony w punkcie d/ przykładu /peptyd VI/.

Frakcja Mt Sekwencja z amino-terminalnym aminokwasem - peptyd /VII/

H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leuasp-glu-thr-val-asp-proCiężar cząsteczkowy dla całego peptydu wynosi około 80 000.

Wyodrębnione peptydy mogą być przekształcone w dopuszczalna w farmacji ich sole.

Sposób wyodrębniania według wynalazku polega na tym, że pełny jad z Agelenopsis aperta eluuje się z kolumny C-18 Vydac ® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkocci pórów 30 na i wielkości ziarna 10 μm, z szybkością 15 ml/ainutę, stosując program Clckrwgoo adiei^ntu rozpuszczalników od 5% - 20% aceton^^lu, 95% - 80% 0,1% wodnego roztworu kwasu trój fluo^^towego /0 - 30 minut/, następnie 20% - 70% aceton^^lu, 80% - 30% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójflukrkkctowagk /30 - 55 minut/ i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję G schodzącą z kolumny w 38 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-18 Vydac ® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 10 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 30% acetonic^lu, 80% - 70% 0,1% wodnego roztworu kwasu trój^o^o^owego /0 - 40 minut/, krzywa Waters” 6 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w 22 minucie i ewentualnie liofilizuje eię ja,

165 148 a następnie zawiesza w wodzie i ponownie liofilizuje, przy czym otrzymuje się peptyd /I/, zbiera się frakcję H pełnego jadu schodzącą z kolumny w około 39 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-18 Vydac 'S® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 10 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 25% acetonitrylu, 80% - 75% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/, krzywa Waters 6, następnie 25% - 50% acetonitrylu, 75% - 50% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego, /30 - 45 minut/, krzywa Waters 11 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 36 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje się frakcję Hg-peptyd /III/, zbiera się frakcję J pełnego jadu schodzącą z kolumny w około 40 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-4 Vydac o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 10 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 30% acetonitrylu, 80% - 70% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/, krzywa Waters 6, następnie 30% - 50% acetonitrylu, 70% - 50% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /30 - 45 minut/, krzywa Waters 11 i wykrywanie piku przy 220 - 230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 22 minucie i ewentualnie liofilizuje się ję, zawiesza w wodzie i ponownie liofilizuje, przy czym otrzymuje się peptyd /II/, zbiera się frakcję J pełnego jadu schodzącą z kolumny w około 40 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-4 Vydac ® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i o wielkości ziarna 10 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 30% acetonitrylu, 80% - 70% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/, krzywa Waters* 6, następnie 30% - 50% acetonitrylu, 70% - 50% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /30 - 45 minut/, krzywa Waters 11 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w 27,5 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje się peptyd /IV/, zbiera się frakcję L pełnego jadu schodzącą z kolumny w 43 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-18 Vydac o wymiarach 10 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 5 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 3,5 ml/minutę, stosując program liniowego gradientu układu rozpuszczalników od 25% - 40% acetonitrylu, 75% - 60% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/ i wykrywanie piku przy 220 - 230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 20,25 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją--zawiesza w wodzie i liofilizuje ponownie, przy czym otrzymuje się frakcję L^-peptyd /V/, zbiera się frakcję L pełnego jadu schodzącą z kolumny w około 43 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-18 Vydac ₀ wymiarach 10 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 5 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 3,5 ml/minutę, stosując program liniowego gradientu układu rozpuszczalników od 25% - 40% acetonitrylu, 75% - 60% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/ i wykrywanie piku przy 220 - 230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 22,5 minucie i ewentualnie frakcję tę liofilizuje się, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje się frakcję Lg-peptyd /VI/, zbiera się frakcję M pełnego jadu schodzącą z kolumny w 48,3 minucie, i ewentualnie frakcję tę liofilizuje się, zawiesza w wodzie i liofilizuje ponownie, przy czym otrzymuje się peptyd /VII/, i ewentualnie przeprowadza się wyodrębnione peptydy w ich sole dopuszczalne w farmacji.

Kompozycje farmaceutyczne zawierają omawiane peptydy.

Jad uzyskuje się z pająka Agθlemopsis aperta metodę dojenia wywołanego stymulowaniem elektrycznym w znany sposób. Metoda ta jest korzystna z tego względu, gdyż zabezpiecza przed zanieczyszczeniem pełnego jadu cofająca się treścią pokarmową lub hemolimfę. Tego typu metody są ogólnie znane specjalistom. Uzyskany pełny jad przechowuje się w stanie zamrożonym w temperaturze około -78°C aż do oczyszczania, które jest opisane poniżej.

Oczyszczanie składników pełnego jadu prowadzi się metodę.wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami /HPLC/, stosując różne kolumny do chromatografii preparatywnej i semi-preparatywnej, takie jak kolumny C-4 1 C-18 Vydac ® /Rainin Instrument Co.Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801/. Wykrywanie piku prowadzi się w świetle monochroma165 148 tycznym, przy długości fali 220-230 nm. Dalszą analizę frakcji prowadzi się na przykład na podstawie danych polichromatycznych widm uv oznaczonych detektorem z szeregowym układem diod firmy Waters, typ 990 /Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757/. Frakcje zbiera się z kolumn w znany sposób, na przykład z użyciem kolektora frakcji ISCO FOXY“ i detektora pików ISCO 2159 /ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504/. Frakcje zbiera się do pojemników o odpowiedniej pojemności, na przykład do sterylnych, laboratoryjnych naczyń polietylenowych. Frakcje zatęża się przez liofilizację z cieczy wymywającej w następnie przez liofilizację z wody. Czystość uzyskanych składników frakcji określa się metodę analizy chromatograficznej, stosując kolumnę analityczną z układem gradientu bardziej izokratycznym niż układ stosowany do końcowego oczyszczania frakcji.

Struktury związków zawartych w poszczególnych frakcjach oznacza się znanymi metodami analitycznymi, takimi jak spektrometria masowa i rezonans magnetyczny jądrowy. Analizę sekwencji peptydów wyodrębnionych sposobem według wynalazku prowadzi się znanymi metodami.

Przykładowo, prowadzi się S-pirydyloetylowanie reszt cystyny w oznaczanym peptydzie w roztworze, po czym oznacza się sekwencję aminokwasów w tym peptydzie. Jedną z procedur S-pirydyloetylowania prowadzi się następująco i Ilość około 1 do 50 /ug rozpuszcza się lub rozcieńcza do objętości 50 /ul w buforze przygotowanym przez zmieszanie 1 części 1 M Tris HCl /pH»8,5/ zawierającego 4 mM EDTA z 3 częściami 8 M roztworu chlorowodorku quanidyny. Następnie dodaje się 2,5 /ul 10% wodnego roztworu 2-merkaptoetanolu i mieszaninę inkubuje się w temperaturze pokojowej w ciemności, w atmosferze argonu, przez 2 godziny. Po inkubacji dodaje się 2 /ul 4-winylopirydyny /świeży odczynnik, przechowywany w atmosferze argonu w tem peraturze -20°C/ i mieszaninę inkubuje się przez następne 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, w atmosferze argonu. Następnie mieszaninę odsala się, korzystnie metodę chromatografii na krótkiej kolumnie z fezami odwróconymi. Odzyskany alkliowany peptyd poddaje się następnie sekwencjonowaniu w znany sposób.

Peptydy wyodrębnione sposobem według wynalazku odwracalnie blokuję kanały wapniowe w wielu różnych komórkach, takich jak komórki układu nerwowego i mięśniowego bezkręgowców i kręgowców.

Zdolność peptydów z frakcji G, H^, H₂, I, J, L1, L₂ i M do blokowania kanałów wapniowych oznacza się następująco i

Rozdzielone neurony okołokorowe szczura zawiesza się w dwuwęglanowym buforze Krebsa /pH=7,4/ zawierającym 2 mM CaC^ i 1% albuminy surowicy bydlęcej /BSA/. Neurony osadza się przez wirowanie po czym zawiesza w tym samym buforze zawierającym dodatkowo 1 /uM fura 2/AN/ Sigma Chem. Co., P.O.Boc.14508, St.Louis, Missouri 63178/. Komórki inkubuje się przez 15 minut w temperaturze 37°C, przemywa, po czym inkubuje przez następne 15 minut w tym samym buforze ale bez fura2/AM. Następnie komórki przemywa się w tym samym buforze obecnie zawierającym 1,5 CwCI₂ i w czasie 5 do 10 minut doprowadza się do stanu równowagi w temperaturze pokojowej jako stężoną zawiesinę komórek. Do kwarcowej kuwety dodaje się 1,2 ml ogrzanego do temperatury 37°C, wolnego od BSA buforu zawierającego 1,5 mM CwCI₂ i 10 mM glukozy, po czym dodaje się 0,3 ml przygotowanej powyżej, stężonej zawiesiny komórek. Kuwetę umieszcza się w termostatowym /37°C/ statywie wyposażonym w mieszadło magnetyczne i wykonuje się pomiar fluorescencji w spektrofotometrze fluoroscencyjnym typu Perkin Elmer 650-40 /Perkin Elmer, Wilton, Connecticut 06897/. W czasie około minuty stabilizuje się sygnał fluoroscencji. Następnie do kuwety dodaje się 1-4 gl roztworu podstawowego badanego związku w dwuwęglanowym buforze Krebsa w odpowiednich stężeniach. Kalibrowanie sygnałów fluoroscencyjnych i korekcję zaniku fura-2 prowadzi się technikę Nameth*w i wsp. /J.Biol.Chem. 262, 5188 /1987/. Przy zakończeniu każdej próby oznacza się wartość maksymalnej fluoroscencji /Fmax/ przez dodanie jonomycyny i wartość minimalnej fluoroscencji /Fmin/, dodając 5 mM EDTA dla związania wapnia w formie chelatu. W powyższej technice, blokowanie kanałów wapniowych przez badany związek uwidacznia się przez spadek fluororescencji w wyniku dodania tego związku.

Zgodnie z wynalazkiem wyodrębnia się ewentualnie dopuszczalna w farwacji sole otrzymanych peptydów. Sole te tworzy się w znamy sposób.

165 148

Peptydy podaje się ssakom w formie czystych związków albo w kombinacji z dopuszczalnymi w farmacji nośnikami lub rozcieńczalnikami, w formie kompozycji farmaceutycznych przygotowywanych z zastosowaniem standardowej praktyki farmaceutycznej. Związki te można podawać doustnie lub perenteralnie, przy czym perenteralna droga podania jest korzystna dla peptydów. Podanie perentaralne obejmuje tu podanie dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe, podskórne i miejscowe.

Przy doustnym stosowaniu peptydu, związek ten podaje się przykładowo w formie tabletek lub kapsułek albo jako roztwory wodne lub zawiesiny wodne. W przypadku tabletek do podawania doustnego stosuje się powszechnie używane nośniki, takie jak laktozę i skrobię kukurydzianą oraz środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezowy. Przy podawaniu doustnym w formie kapsułek użytecznymi rozcieńczalnikami są laktoza i suszona skrobia kukurydziana. Jeśli przy podawaniu doustnym wymagane są zawiesiny wodne, sporządza się je przez połączenie składnika aktywnego ze środkiem emulgującym lub suspendującym. 0 ile to potrzebne, dodaje się środki słodzące i/lub zapachowe.

Podawanie domięśniowe, dootrzewnowe, podskórne i dożylne wymaga przygotowania roztworów sterylnych składnika aktywnego o odpowiednio dobranej wartości pH i zbuforowanych. Przy przygotowywaniu roztworów do podawania dożylnego należy kontrolować całkowite stężenie rozpuszczonych składników w celu uzyskania izotoniczności preparatu.

W przypadku stosowania poliemlny, peptydu lub soli tych związków dla ludzi, dzienna dawka będzie podana przez lekarza. Ponadto, dawka ta będzie się różnić w zależności od wieku, wagi, wrażliwości poszczególnego pacjenta jak również od ciężkości objawów u pacjenta i siły działania konkretnego podawanego związku.

Jeśli peptyd lub sól tego związku stosuje się do niszczenia szkodników bezkręgowych, to związek ten podaje się bezpośrednio na szkodnika albo dostarcza się go do jego środowiska. Przykładowo, rozpyla się roztwór tego związku na szkodnika. Ilość związku potrzebna do niszczenia szkodnika zależy od rodzaju szkodnika oraz warunków otoczenia i będzie określona przez osobę stosującą związek.

W przypadku stosowania peptydu lub jego soli do badań fizjologii komórek, zwiazek ten podaje się do komórek zgodnie z metodami znanymi w tej dziedzinie. Przykładowo, związek może być podany do komórek w odpowiednim buforze fizjologicznym. Odpowiednie stężenie związku użytego do tego typu badań wynosi 100 /uM, jednak może ono być większe lub znacznie mniejsze od tej wartości. Ilość podawanego związku będzie określona przez specjalistę zgodnie ze znanymi metodami.

Przykład. Wstępne frakcjonowanie pełnego jadu Agelenopsis aperta

Pełny jad z Agelenopsis aperta, otrzymany z Natural Product Sciences Inc., Salt Lake City, Utah 84108, przechowywany w stanie zamrożonym w temperaturze -78°C rozmraża się. Ilość 10 do 60 /ul tego jadu rozcieńcza się do 200 /ul i wprowadza na kolumnę N-18 Vydac ® o wymiarach 22 mm x 250 mm /wielkość porów - 30 mm, rozmiary ziarna - 10 /urn/. Eluowanie prowadzi się z szybkością 15 ml/minutę stosując program liniowego gradientu układu rozpuszczalników» 5% - 20% B, 95% - 80% A /0 - 30 minut/, następnie 20% - 70% B, 80% - 30% A /30 - 55 minut/, gdzie A oznacza 0,1 procentowy wodny roztwór kwasu trójfluorooctowego /TPA/ a B oznacza acetonitryl. Wykrywanie piku wykonuje się w świetle monochromatycznym przy długości fali 220-230 no. Zbieranie frakcji odbywa się z użyciem kolektora frakcji ISCI *POXY* i detektora pików ISCO 2159. Frakcje zbiera się w odstępach od 20 minut do 60 minut. W oparciu o wykrywanie piku zbiera się następujące frakcje i

Fraksis-	Cza9 i	sluowanla
A	około	21 minut
B	około	2,75 minut
E	około	7,5 minut
G	około	38 minut
H	oko ło	39 mimi^
I	około	40 mimin
J	około	40 mimin
L	około	43 minuty
M	około	48,3 minut

165 148 a/ Subirakcjonowanie frakcji G

Frakcję G wprowadza się na kolumnę C-l8 Vydac o wymiarach 22 mm x 250 mm, o rozmiarach porów 30 nm 1 wielkość ziaren 10 ^im, Kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników: 20% - 30% B, 80% - 70% A /0 - 40 minut/ /krzywa waters 6/ oraz detektor z szeregowym układem diod Waters 990. Frakcję zbiera się jak to opisano wyżej. Po subfrakcjonowaniu w sposób podany powyżej frakcja G wycieka z kolumny w 22 minucie. Tę frakcję, która zawiera peptyd przygotowuje się do analizy sekwencji przez liofilizację z cieczy eluujęcej a następnie przez liofilizację z wody, w znany sposób.

Analizę aminokwasową alkilowanego peptydu z tej frakcji prowadzi się metodę Waters Pico-Tag, postępując według instrukcji producenta aparatury. Dane dotyczące sekwencji zbiera się na podstawie analizy wykonanej w aparaturze do sekwencjonowania Applied Bioeystems model 470A Protein Peptide euquencer /Applied Bioeystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404/ z konwersję w wodnym roztworze kwasu trójfluorooctowego. Analizę wytworzonych fenylotiohydamtoimo-aminokwαsów prowadzi się w systemie on-line stosując analizator Appliad Biosystems model 120A PTH albo w systemie off-line, na kolumnie DuPont Zorbax PTH /Biomedical Product Departament, Chromatography Products, E.I.duPont de Namours and Co., Inc., 1007 Marker Street, Wilmington, Delaware, 19898/.

W wyniku analizy aminokwasowej i spektrometrii masowej FAB MS całego peptydu określono, że amino-terminalna część sekwencji peptydu zawartego we frakcji G ma następującą budowę:

H2N-glu-lye-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cye-aep-glyasn-glu-ser-aep-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trp-ile-lyecys-arg-cye-pro-trp-lye-trp-his-ile-thr-gly-glu-glypro-cys-thr-cys-glu-αrg-gly-leu-lye-lys-thr-cye-ileeer-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asm-glu-trp-leu-serciężar cząsteczkowy oznaczony metodą FAB MS =7267.

b/ Subfrakcjomowanie frakcji B i oznaczenie struktur zawartych w niej związków Frakcję H wprowadza iię aa kolumnę C-18 Vydac ® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o roorniarach porów 30 nm i iUiZ^ci0 zarenn 00 mu o. lomno!oe eluu Os si ę z szobkoOclę 10 ml/minutę stosując program nieliniowego gradientu układu okzpleikzalmlkówo 20% - 25% B, 80% - 75% A /0 - 30 minut/ krzywa Waters 6/, następnie 25% - 50% B, 75% - 50% /30 - 45 minut/ /krzywa Waters 11/, gdzie A ozmaki- 0,1 procentowy roztwór TFA a B kimαkza -cutomatryO. Jako detektor stosuje się detektor firmy Waters, typ 990, z szeregowym układem diod. Frakcje zbiera się w sposób podany poprzednio. Spośród zebranych frakcji interesujące były:

£ο-Ζ^- czas oU0uo£-!!12

H2 około 36 minut

H3 około 41 minut.

Frakcje H₂ i H3 zawiuo-jęku peptydy przygotowuje się do sukwencjomkwama- i -m-Oaioje metodami podanymi w punkcie a/. Ustalono, że część αuino-turmlnαln- sekwencji -minokw-eowuj peptydu zawartego we frakcji H2 ma następującą budowę:

H2N-αla-lye-a0--0uo-pro-pro-gly-ser-val-kye--epgly-aem-glo-suo-asp-kye-lye-kye-tyr-gly-lye-tophle-lys-kye-arg-kye-pok-trp-lye-top-hie-phe-tho-gOyglo-gly-pok-cye-tho-kye-glu-lys-gly-uet-lys-hae-thocys-ile-tho-lye-luu-hae-kye-pok--ne-lys-al--glu-topgly-luu-aep-top-.

165 148

Ciężar cząsteczkowy całego peptydu oznaczony metodę spektrometrii masowej lon-Spray wynosi 7793.

c/ Subfrakcjonowanie frakcji I i J i oznaczanie struktur zawartych w niej związków. Uzyskane frakcje I .i J, które nie zostały odpowiednio rozdzielone z powodu zbliżonych czasów eluowanla, co podano poprzednio, wprowadza się łącznie na kolumnę C-4 Vydwc ® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o rozmiarach porów 30 nm i wielkości ziaren 10 /um. Kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników: 20% - 30% B, 80% - 70% A /0 - 30 minut/ /krzywa Waters 6/, następnie 30% - 50% B, 70% - 50% A /30 - 50 minut/ /krzywa Waters 11/, gdzie A oznacza 0,1 procentowy wodny roztwór TFA w B oznacza acetonitryl. Wykrywanie piku i zbieranie frakcji prowadzi się w sposób podany w punkcie w/. Spośród zebranych frakcji dwie były interesujące , frakcja £222—Słysiasiii®

I około 22 minuty

J okooo 27,5 minuyy.

Frakcje I i J zawierające peptydy przygotowuje się do analizy sekwencji i analizuje się w sposób podany w punkcie a/.

Na podstawie analizy sekwencji i FAB MS ustalono, że peptyd zawarty we frakcji I ma następującą budowę:

H2N-asp-cye-vea-gly-gau-eer-gan-gli-cye-aaa-esp-trpela-gly-pro-his-cye-cys-esp-gat-ttr-tyr-cte-thr-cyeerg-tyr-phe-pro-aye-cys-iae-cye-vel-aei-eei-aei-CONH2

Ciężar cząsteczkowy oznaczony metodą FAB MS wynosi 4158.

Oznaczono ponadto amiio-terminaaią część sekwencji aminokoaeowei peptydu zawartego we frakcji J :

^N-asp—gln-pro-cye-ile-pro-aeu-gay-lye-ser-cye-eertrp-aye-ile-gly-thr-pro-ttr-cte-cts-pro-hie-pro-aepasp-eaa-gly-wrg-arg-thr-trp-cts-aeu-vel-asp-tyr-serarg-phe-val-thr-iae-cys-ser-gay-arg-lte-tyr-CONH2

Ciężar cząsteczkowy całego peptydu zawartego w tej frakcji, oznaczony metodę FAB MS, wynosi 5506.

d/ Subfrekcionowaiie frakcji L i oznaczanie struktur zawartych w niej związków Frakcję L wprowadza się na kolumnę C-18 Vydwc ® o wymiarach 10 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości porów 30 nm i wielkości ziaren 5 nm. Erewanie prowadzi się z szybkością 3,5 ml/minutę, stosując program liniowego gradientu układu rozpuszczalników:

25% - 40% B, 75% - 60% A /0 - 30 minut/, gdzie A oznacza 0,1 procentowy wodny roztwór TFA w B oznacza aceton^^l. Wykrywanie piku i zbieranie frakcji prowadzi się w sposób podany w punkcie a/. Spośród zebranych frakcji dwie były interesujące:

frakcja. czas

L1 około 20,25 minut

L2 około 22,5 minuty

Frakcje i L2 zawierające peptydy przygotowuje się do eekweicioiooania i analizuje się w sposób podany w punkcie w/.

Część amino-terminalna sekwencji peptydu zawartego we frakcji L1 ma następującą budowę:

H2N-ile-val-gay-gly-lye-thr-aaa-lye-phe-gly-wep-tyrpro-trp-Inet-vaa-ser-ile-gai-gli-aye-aei-lye-lye-glygly-phe-asp165 148 ciężar cząsteczkowy całego pgptyZu oznaczony metodę elektroforezy żelowej w znany sposób wynosi 20 000.

e/ Oznaczenie struktury związku zawartego we frakcji M

Frakcję M zawierającą egptyZ, przygotowuje się do cgkwgπąjoπowkπia i analizuje się w spo sób podany w punkcie a/·

Oznaczono, że część an1no-tgeniπalnα pgptyUJ zawartego we frakcji M na następującą budowę i ^N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-Yal-leu-ser-asn-leuasp-glu-thr-val-asp-proCiężar cząsteczkowy całego peptydu oznaczony metodą elektroforezy żelowej w znany sposób wynosi około 80 000.

165 148

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims

Zastrzeżenie patentowa

1. Sposób wyodrębniania z Jadu pająka Agelenopsis aperta substancji o właściwościach farmakologicznych o strukturach peptydów zawierającej peptyd /1/ o amino-terminalnej sekwencji aminokwasowej:

H₂N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-glyasn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-giy-gln-trp-ile-lyscys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-glyglu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thrcys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trpleu-serpeptyd /II/ o wzorze/:

asp-cys-val-gly-glu-ser-gln-gln-cys-ala-asp-trp-alagly-pro-his-cys-cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-argtyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH2 peptyd /III/ o aminoterminalnej sekwencji aminokwasowej t

H₂N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-glyasn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lyscys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-glypro-cys-thr-cys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ilethr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leuasp-trppeptyd /IV/ o wzorze:

H^N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-sertrp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-pro-aspasp-sls-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-serarg-phe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONH₂ peptyd /V/ o amino-terminalnej sekwencji aminokwasowej:

H₂N'ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-protrp-met-val-ser-ile-glu-glu-lys-asn-lys-lys-gly-gly-pheaeporaz peptyd /VI/: peptyd /VII/ o amino-terminalnej sekwencji aminokwasowej:

H2N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-leu-ser-asn-leuasp-glu-thr-val-asp-prooraz dopuszczalnych w farmacji soli tych peptydów, znamienny tym, że pełny jad z Agelenopsis aperta eluuje się z kolumny C-18 Vydaa® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wiel165 148 kości porów 30 πια 1 wielkości ziarna 10 /um, z szybkością 15 ml/minute* stosując program liniowego gradientu rozpuszczalników od 5% - &0% aeetonitryłu, 9E5K - 8(0% O^^li wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /O - 30 minut/, następnie 20% - 70% acetonitrylu, 80% - 30%

0,1 procentowego wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /30 - 55 minut/ i monochromatyczne wykrywanie piku przy 220 - 230 nm, zbiera się frakcję G schodzącą z kolumny w 38 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-18 Vydac ® o wymiarach 22 me x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 10 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 30% acetonitrylu,

80% - 70% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 40 minut/, krzywa “Waters

6 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w 22 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, a następnie zawiesza w wodzie i ponownie liofilizuje, przy czym otrzymuje się frakcję G, - peptyd /I/, zziire psi frakkjj H pełnngg Jjdu schhoząąą z koo lumny w około 39 minucie i wprowadza się ją nn Poluunn fcl8 Hyyda ® o wyeiikeaą 22 mm z 220 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 10 kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gredientu układu rozpuszczalników od 20% - 25% acetonltrylu, 80% - 75% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/, krzywa Waters” 6, następnie 25% - 50% aceton^^lu, 75% - 5(%f 0,1% zπgnθz r rozteufu kwuz u tąrjJluorooctowego /30 - 45 minut/, krzywa Waters 11 i wykrywania piku przy 220-230 niif zbfaia się frakcję schodzącą z kolumny w około 36 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje się frakcję ^-peptyd /III/, zbiera się frakcję I pełnego jadu schodzącą z kolumny w około 40 minuπJą e wpafę Jp na kolumnę C-4 yydac ® o wymiarach 22 mm x 250 mm, o w^k^cik porów 10 nm f w lelkoćśc z iarna 10 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 30% aceton^r/lu, 80% - 70% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/, krzywa Waters 6, następnie 30% - 50% acetoni^ylu, 70% - 50% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /30 - 45 minut/, krzywa Waters 11 1 wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 22 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, zawiesza w wodzie i ponownie liofilizuje, przy czym otrzymuje się pretyU /II/, zbiera się frakcję J pełnego jodu schodzącą z kolumny w około 40 minucie i wprowedza się ją na kolumnę C-4 yydac o wymiarach 22 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i o wielkości ziarna 10 μ-im, kolumnę eluuje się z szybkością 10 ml/minutę, stosując program nieliniowego gradientu układu rozpuszczalników od 20% - 30% aąrtoπ1trylu,

80% - 70% 0,1% wodnego roztworu kwasu trrjflJorooctowrgo /0 - 30 minut/, krzywa Waters 6, następnie 30% - 50% aąetoπltrylJ, 70% - 50% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /30 - 45 minut/, krzywa Waters 11 i wykrywanie piku przy 220-230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w 27,5 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje się peptyd /IV/, zbiera się frakcję Lpełnego jodu schodzącą z kolumny w 43 minucie i wprowadza się ja na kolumnę c-18 yydac & o wymiarach 10 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i o wielkości ziarna 5 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 3,5 ml/minutę, stosując program liniowego gradientu układu rozpuszczalników od 25% - 40% acetoniteylu, 75% - 60% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/ i wykrywanie piku przy 220 - 230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 20,25 minucie i ewentualnie liofilizuje się ją, zawiesza w wodzie i liofilizuje ponownie, przy czym otrzymuje się frakcję Lj, paptyd /V/, zbiera się frakcję L pełnego jadu schodzącą z kolumny w około 43 minucie i wprowadza się ją na kolumnę C-18 yydac ® o wymiarach 10 mm x 250 mm, o wielkości porów 30 nm i wielkości ziarna 5 /um, kolumnę eluuje się z szybkością 3,5 ml/minutę, stosując program liniowego gradientu układu rozpuszczalników od 25% - 40% acetonitrylu, 75% - 60% 0,1% wodnego roztworu kwasu trójfluorooctowego /0 - 30 minut/ i wykrywanie piku przy 22^ - 230 nm, zbiera się frakcję schodzącą z kolumny w około 22,5 minucie i ewentualnie frakcję tą liofilizuje się, zawiesza w wodzie i powtórnie liofilizuje, przy czym otrzymuje się frakcję L₂ erptyZ /VI/, zbiera się frakcja M pełnego jadu schodzącą z kolumny w 48,3 minucie, i ewentualnie frakcję tę liofilizuje się.

165 148 zawiesza w wodzie i liofilizuje ponownie, przy czyn otrzymuje się peptyd /VII/, i ewentualnie przeprowadza się wyodrębnione peptydy w ich sole dopuszczalne w farmacji.