CZ208598A3 - Nisin v kombinaci s glycerolmonolauratem aktivní proti rodu Helicobacter - Google Patents

Description

Nisin v kombinaci s glycerolmonolauratem aktivní proti rodu Helicobacter

Oblast techniky

Vynález se týká kompozic sestávajících v podstatě z bakteriocinu obsahujícího lanthionin, nisin, v kombinaci s glycerolmonolauratem a použití takové kompozice pro ošetření infekcí způsobených rodem Helicobacter.

Dosavadní stav techniky

Celá řada odborné literatury zabývající se antimikrobiálními aktivitami GML nebo nisinu popisuje jejich aktivitu proti grampozitivním bakteriím a neúčinnost proti gramnegativním bakteriím v nepřítomnosti chelatačního činidla nebo jiných potenciačních činidel.

Glycerolmonolaurat (GML), nazývaný též monolaurin, je laurylester glycerolu. Používá se jako povrchově aktivní činidlo, konzervační a natučňující činidlo v kosmetice a kosmetických čistících prostředcích a bylo také nalezeno jeho omezené použití jako potravinářské konzervans.

GML byl označen jako bezpečný úřadem FDA. Kapitola 21, část 184 směrnice Code of Federal Regulations (CFR) zahrnuje monoglyceridy mezi sloučeniny označované jako GRAS (generally recognized as safe - obecně shledané bezpečnými). Sekce 184.1505 kapitoly 21 CFR udává dále, že monoglyceridy, včetně GML, splňují podmínky Kodexu potravinářských chemikálií (Food Chemicals Codex) a mohou ·· · ··· · · φ φ · • φ φ φφφ φφφφ φ φφφφ φ φφ φφ φφφφ φ • · ··· ··· ·· · · · φ φ · · ·· φφ být použity v potravinách bez omezení jiného, než je stávající správná výrobní praxe.

GML a jiné přírodně se vyskytující nebo syntetické monoglyceridy obsahující nasycené nebo nenasycené mastné kyseliny, vykazují aktivitu proti grampozitivním bakteriím [Kabara, J.J., 1986. Dietary lipids as anticariogenic agents., J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 6: 87 - 113], ale obecně se soudí, že jsou neúčinné proti gramnegativním bakteriím [Schlievert a kol., 1992. Effect of glycerol monolaurate on bacterial growth and toxin production. Antimicrob. Ag. Chemother. 36: 626 - 631].

U esterů mastných kyselin s jinými vícefunkčními alkoholy, jako jsou cukry, bylo také popsáno, že mají antimikrobiální aktivitu proti grampozitivním bakteriím. [Conley, A.J. a J.J. Kabara, 1973. Antimicrobial action of esters of polyhydric alcohols. Antimicrob. Ag. Chemother. 4: 501 - 506].

Bylo popsáno, že v přítomnosti potenciátorů, jako jsou chelatační činidla, některé z těchto sloučenin včetně GML, mají inhibiční aktivitu proti některým běžným druhům gramnegativmín bakteriím, jako je Escherichia coli a jiným Enterobacetiaceae a Pseudomonas aeruginosa, které nejsou ovlivňovány estery v nepřítomnosti potenciačních činidel [Shibasaki, I. & N. Kato, 1978. Combined effects on antibacetrial activity of fatty acids and their esters against Gram-negative bacteria. v Kabara, J. J., Symposium on the Pharmacological Effect of Lipids. The American Oil Chemists' Society Champaign, Illinois, str. 15 - 24]. Někteří autoři popisují baktericidní aktivitu GML v přítomnosti citrátu jako chelatačního činidla proti Escherichia coli inkubované ve vodě.

• · • · · 9 9 ·

9999

99 9999 9 • 9 · · · • · · · ·«

Patent US 4 485 029, Kato a kol., popisuje použití glycerolmonolauratu v kombinaci s jedním nebo více antimikrobiálními činidly jako jsou estery kyseliny parahydroxybenzoové, případně s organickým povrchově aktivním činidlem, v kompozicích vhodných pro čištění, desinfekci a ochraně kontaktních čoček. Kato a kol. neuvádí, že kompozice GML mohou být vhodné pro ošetření infekcí způsobených gramnegativními bakteriemi nebo že GML může být použita v kombinaci s bakteriocinem obsahujícím lanthionin, jako je nisin.

Použití GML jako antimikrobiálního činidla bez potenciačních činidel proti gramnegativním pathogenům, jejichž primárními hostiteli jsou savci, nebylo do této doby popsáno. GML je vysoce lipofilní a špatně rozpustný ve vodě. Z tohoto důvodů studie jeho antimikrobiální aktivity uváděly obecně nutnost použití koncentrací ethanolu, které jsou nepřijatelné pro některé farmakologické aplikace.

Nisin je polypeptíd s antimikrobiálními účinky a je produkován v přírodě různými kmeny bakterií Lactococcus (Streptococcus) lactis. Nisin je používán jako konzervační činidlo u potravin pro inhibici bakteriálního růstu a klíčení spor určitých druhů grampozitivních bacilů. Byl nalezen přírodní výskyt nisinu v malých koncentracích v mléce a sýrech a má se za to, že je zcela netoxický a nezpůsobuje alergie u lidí.

Nisin byl shledán bezpečným úřadem FDA jako přímá složka potravin v pasterizovaných sýrových pomazánkách, pasterizovaných tavených sýrech, pasterizovaných tavených sýrech s ovocem, zeleninou nebo masy. Protože se jedná o polypeptid, jakékoli zbytky nisinu zbylé v potravinách jsou rychle rozloženy, jakmile vstoupí do tenkého střeva.

• · * · · · · · · · · • · · · · · · · · ····· · · · · ···· · • · · · · · · • ····· ·· ··

Přestože v dosavadním stavu techniky se předpokládalo, že nisin je neúčinný proti gramnegativním bakteriím a je účinný pouze proti velmi omezené skupině grampozitivních bakterií, kompozice obsahující nisin, zvláště v kombinaci s různými nebakteriálními činidly, byly uváděny jako velmi účinné proti různým druhům grampozitivních a gramnegativním bakteriím (US patenty číslo 5 135 910; 5 217 950 a 5 260 271). Později byly baktericidní účinky nisinu v přítomnosti chaletačních činidel popsány proti dalším gramnegativním bakteriím, včetně Helicobacter pylori (US patenty číslo 5 304 540 a 5 334 582).

Pat. přihlášky US 4 980 163; 5 135 910; 5 217 950;

260 271; 5 334 582 a 5 304 540 popisují povrchově aktivní látky včetně glyceridů jako látky zvyšující účinnost bakteriální aktivity bakteriocinů obsahujících lanthionin. Například US patenty číslo 5 135 910; 5 217 950 a 5 260 271 uvádí, že monolaurin nebo monooleat v kombinaci s bakteriocinem obsahujícím lanthionin, jako je nisin, je účinný při ničení grampozitivních bakteriálních druhů Streptococcus agalactiae a Listeria monocytogenes. Patent US 4 980 163 uvádí, že monoglycerid v kombinaci s lysostaphinem, bakteriocinem obsahujícím lanthionin, jako je nisin, a s chelatačním činidlem EDTA, zvyšuje baktericidní aktivitu kompozice proti Staphyloccoccus aureus a Streptococcus agalactiae. V patentech US 4 980 163, 5 135 910, 5 217 950 a 5 260 271 není zmínka o tom, že kompozice nisinu a glyceridů by mohly mít aktivitu proti gramnegativním bakteriím, jako je Helicobacter.

Mnoho gastrointestinálních patogenů jsou gramnegativní bakterie. Z pohledu stavu techniky lze předpokládat, že GML nebo povrchově aktivní činidla spolu budou proti těmto • ·

• · • <

»· · organismům neaktivní. Příkladem takového pathogenu je Helicobacter pylori (také uváděn ve stavu techniky jako Campylobacter pylori), gramnegativní mikroaerofilní bacil, který osidluje gastrickou mukosu (sliz). Je to velmi neobvyklý organismus, protože roste v drsných podmínkách kyselého prostředí lidského žaludku [Házeli a kol., 1986. Campylobaceter pyloris and gastritis: association wíth intracellular spaces and adaptation to an environment of mucus as important factors in colonization of the gastric epithelium. J. Infect. Dis. 153: 658 - 663]. Jiné druhy Helicobacter infikují žaludky různých savců.

Nyní je velmi dobře prokázáno, že Helicobacter pylori se podílí na pathogenesi různých gastrointestinálních chorob, včetně gastritidy, vředech a některých gastrointestinálních nádorech. Toto zjištění znamenalo převrat v přístupu k léčení těchto běžných chorob (Marshall, 1988. The Campylobacter pylori story. Scand. J. Gastroenterol. 146 : 58 - 66; Glise , 1990. Epidemiology in peptic ulcer disease. Current status and future aspects. Scand. J. Gastoenterol. 25: 13 - 18; Clarkson a kol., 1993. Gastric cancer and Helicobacter pylori infection. J. Clin. Pathol. 46: 997 - 999; Yamada a kol., 1994, Helicobacter pylori peptic ulcer disease. JAMA 272: 65 - 69). Kolonizace rodem Helicobacter byla také dána u predisponovaných jedinců do souvislosti s koronárními chorobami a infarktem.

Ačkoli je H. pylori citlivý na množství antimikrobiálních činidel, monoterapie nebyla zatím prokázána jako klinicky účinná. Navíc se již vyskytly kmeny rezistentní k metronidazolu a clarithromycinu, dvěma antibakteriálním činidlům (Boron a kol., 1994, Helicobacter pylori binds to blood group antigens. Scientific Amer.

• · > · ► · • · ·

Science & Med. 1: 28 - 37). V současnosti preferovaná léčba gastrických vředů zahrnuje terapii se třemi různými antimikrobiálními činidly, přičemž některá z nich mohou být velmi špatně tolerována (Marshall, 1993. Treatment strategies for Helicobacter pylori infection.

Gastroenterol. Clin. North. Am. 22: 183 - 198). Žádný z těchto postupů není zcela účinný pro dosažení vyhlazení H. pylori a mnoho pacientů nedokončí terapii díky špatnému snášení způsobu léčby (Bell a kol., 1993. Helicobacter pylori eradication: efficacy and side effect profile of a combination of omeprazole, amoxicillin and metronidazole compared with four alternativě regimens. Quart. J. Med. 86: 743 - 750). Je proto potřeba nalezení nových činidel. Je možné, že tento stav nepřinese jedno antibakteriální činidlo a proto může být nezbytné kombinovat nové způsoby ošetření s existujícími nebo jinými, novými činidly, aby se dosáhlo spolehlivého, dlouhodobého odstranění infekce s dobrou snášenlivostí a přizpůsobivostí.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že koncentrace GML a nisinu, které samostatně jsou pod optimálními hodnotami k jejich baktericidnímu účinku, vzájemně zvyšují baktericidní aktivitu jeden druhého v kombinaci proti kmenům rodu Helicobacter. Ačkoliv nisin při testování v nepřítomnosti GML vyžaduje přítomnost potenciačních činidel, jako jsou chelatační činidla, aby mohl vykázat účinnou baktericidní aktivitu proti Helicobacter pylori a proti většině jiných gramnegativních bakterií, společný synergický účinek nisinu spolu s GML nevyžaduje přítomnost chalatačních činidel nebo jiných potenciačních nebaktericidních činidel.

Silný synergický účinek nisinu v nepřítomnosti chalatačního činidla s nízkými koncentracemi GML proti H. pylori je proto překvapivý.

Helicobacter a jiné gastrointestinální bakterie se usidlují v prostředí mukosy. Mukus (sliz) je viskoelastická vrstva vylučovaná mukosálním epithelem a vytváří ochrannou bariéru mezi epithelem a jeho bezprostředním okolím. Jednou ze složek vrstvy slizu je mucin, komplex disulfidicky propojené polystilfonované glykoproteinové matrice. Ten tvoří polotekutou vrstvu, která představuje bariéru, přes kterou musí projít molekuly, aby dosáhly přístupu k podkladnímu epithelu. Průchod farmaceuticky účinných činidel přes tuto velmi exponovanou polysulfonátovou barieru může být problematický; negativně nabité molekuly mohou být odpuzovány mukosou, zatímco pozitivně nabité molekuly mohou být přitahovány a lze předpokládat, že jsou sekvestrovány tvorbou saturační vrstvy. Mukosní vrstva pokrývající mukosální epithel gastrointestinálního traktu tak může představovat překážku účinnosti baktericidních činidel.

V žaludku bakterie druhů Helicobacter kolonizují mukosní vrstvu. Bakterie Helicobacter uvnitř mukosní vrstvy jsou chráněny před obsahem žaludku, který může být jinak škodlivý pro přežití organismu. K vyhlazení H. pylori v žaludku musí být lokálně působící činidla proti rodu Helicobacter schopna procházet nebo obcházet jakoukoli bariéru představovanou mukosou. Alternativní přístup k léčení takových infekcí může spočívat v uvolnění bakterií Helicobacter ze slizového mikroprostředí narušením slizu mukolytickými činidly. Rozrušení slizu může vystavit bakterie obsahu žaludku zahrnujícího antimikrobiální • · · » · * ♦ * · ····· # 9 · · ··« · « « · · · · ··· • · » · ·· · ·· ·· ·· činidla, což činí bakterie přístupné působení lokálně působících antimikrobiálních činidel.

Činidla známá jako aktivní vůči mucinu zahrnují lytické enzymy jako glykohydrolasy, například a-amylasa popsaná v US patentu 5 328 846 nebo proteinasy, například pronasy (Kimura a kol. Am. J. Gastroenterol. 90: 60 - 63, 1995) a sulfhydrylové sloučeniny, například

N-alkylcysteiny, WR2721 a N-(2-merkaptopropionyl)glycin (MPG). Tento vynález se týká způsobu rozrušení mukosního prostředí žaludku a vystavení bakterií Helicobacter v žaludku účinnému množství kompozic nisinu a GML tak, aby byly vystavené bakterie zabity.

Vynález se týká kompozic zahrnujících v podstatě nisin a GML v koncentracích, které jsou pod optimální hranicí pro samotná odpovídající činidla, která ale v kombinaci jsou baktericidní vůči gramnega.tivním bakteriím rodu

Helicobacter a zvláště výhodně vůči druhu Helicobacter pylori. Kompozice nisinu a GML jsou vhodné pro vnitřní podávání savcům a jsou účinné pro vyhlazení kolonizace H. pylori a pro ošetření infekce jiných chorobných stavů jako následků kolonizace H. pylori. Vynález dále poskytuje způsoby vyhlazení kolonizace H. pylori a způsoby ošetření infekcí nebo jiných chorobných stavů jako následků kolonizace H. pylori, které zahrnují podávání nových kompozic GML - nisin samotných nebo v kombinaci s mukolytickými činidly.

Použití nisinu a GML nebo podobných sloučenin jako aktivních látek proti bakteriální infekci u savců má výhody z hlediska usnadnění podávání a dávkových forem a snášenlivosti.

• ·

I ·..

Detailní popis vynálezu

Vynález se týká farmaceutických kompozic a způsobů ošetření infekcí gastrointestinálního traktu způsobených gramnegativními bakteriemi rodu Helicobacter a zvláště H. pylori. Jiné bakterie citlivé na způsoby ošetření podle vynálezu jsou ty kmeny bakterií, které jsou blízce příbuzné rodu Helicobacter, jako je Campylobacter. Druhy Helicobacter zahrnují, ale nejsou limitovány na H. pylori (člověk), H. canis (pes), H. acinonyx, H. pullorum, H. muridarum, H. cinaedí, H. fennelilliae, H. nemestrinae, H. pumetensis. H. bizzozeronii, H. mustelae (fretka) a H. felis (kočka). Posledně dva jmenované druhy Helicobacter jsou častou používány v modelech infekce rodem Helicobacter u fretek a myší. Kompozice podle tohoto vynálezu mohou být také využity při ničení Helicobacter pylori kolonizující ústní dutinu a tak při metodách vyhlazení bakteriální kolonizace nebo pro ošetření infekce způsobené H. pylori v ústní dutině.

Koncentrace nisinu 30 - 100 pg/ml nebo koncentrace GML 10 pg/ml při podávání samostatně a nikoli v kombinaci mají malé účinky na životaschopnost H. pylori. Kombinace 10 pg/ml GML s 30 - 100 pg/ml nisinu však rychle vytváří podstatné snížení životaschopnosti tohoto mikroorganismu. Rozsah snížení životaschopnosti je úměrný koncentraci nisinu kombinovaného s GML. Synergický účinek nisinu v kombinaci s GML v koncentracích, které jsou pod optimální hladinou, když jsou podávány samostatně, nebyl odvoditelný ze stavu techniky, protože bylo dříve dokázáno, že samotný nisin v těchto koncentracích nebyl účinný proti

Helicobacter pylori.

i · · · · ·· · · *

Mohou být použity i jiné lanthioninové bakteriociny s vlastnostmi obdobnými, jako nisin. Další provedení vynálezu se týká kompozic a způsobů použití kompozic, které zahrnují jako aktivní složky molekuly chemicky podobné GML pro použití v kombinaci s nisinem. Tyto molekuly jsou ty, které jsou odvozeny od glycerolu (nebo jiných polyhydroxylových sloučenin, jako jsou cukry) a mastných kyselin.

Pro vyhlazení kolonizace H. pylori nebo ošetření infekcí nebo jiných chorobných stavů jako následků kolonizace H. pylori, GML a nisin mohou být podávány jako samostatné kompozice podávané společně nebo postupně, nebo jako složky jedné společné kompozice a mohou být podávány ve spojení s jinou farmaceuticky aktivní látkou, jako je sůl bismutu, například citrát bismutnatý nebo salicylát bismutnatý, pro ošetření gastrointestinální poruchy. Kompozice mohou být podávány ve spojení s jinými činidly jako je cimetidin, ranitidin, omeprazol, lansoprazol, antacidy, inhibitory ureasy nebo jejich kombinacemi za účelem ošetření některé z chorob nebo symptomů spojených s přítomnosti H. pylori v gastrointestinálním traktu. Má se za to, že v těchto terapeutických použitích mohou být přídavná aktivní farmaceutická činidla podávána současně nebo občas s kompozicemi GML - nisin a způsoby podávání se mohou lišit během průběhu ošetření podle potřeby.

Specifická provedení vynálezu se týkají způsobů ošetření, které zahrnují podávání kompozic GML - nisin a mukolytických činidel po sobě. Mukolytická činidla redukují nebo eliminují účinky slizu na činnost antibakteriálních činidel. Sliz může bránit činidlu dosažení míst infekce přítomných v mukosálním epithelu. Mukolytická činidla ·: i , * · ’ I · «·» · • · · snižují viskozitu a rozrušují integritu slizu různými mechanismy. Mukolytické sulfhydrylové sloučeniny jako jsou N-alkylcysteiny, Penicilamin, N-(2-merkaptopropionyl)glycin a WR2721 (thiofosfatový derivát merkaptoethyl-1,3diamínopropanu) redukují disulfidové můstky mucinové matrice. Sliz může být také rozrušen vystavením hydrolytickým enzymům, jako jsou glykohydrolasy a proteinasy, které rozrušují mucin, a nukleasy. Proteinasa pronasa, která je zvláště vhodná pro rozrušení mucinové matrice, je popsána v US patentech 4 440 749 a 4 485 095, na které se tímto odkazuje.

Činnost nisinu a GML působících lokálně buď individuálně nebo kolektivně, by mohla být pozitivně ovlivněna oproti normálu sníženou viskozitou vrstvy slizu nebo vrstvou slizu jinak narušenou mukolytickými činidly. Avšak podmínky optimální pro rozrušení vrstvy slizu mukolytickými činidly mohou být často neslučitelné s činností určitých činidel proti rodu Helicobacter.

Nisin by mohl být inaktivován zvláště štěpením pronasou a mohl by reagovat se sulfhydrylovými sloučeninami při neutrálním nebo mírně zásaditém optimu pH požadovaném pro tato mukolytická činidla. Na druhé straně pokud jsou nisin, nebo jiné dostupné bakteriocidy v kombinaci s nisinem podávány ve vhodném kyselém vehikulu takže se sníží pH v lumenu žaludku až po působení mukolytických činidel, aktivita sulfhydrylových skupin na jedné straně a aktivita enzymů na druhé mohou být inhibovány nebo inaktivovány v žaludku nízkým pH a reaktivací žaludečního pepsinu. Tato baktericidní činidla a jejich kombinace, které nejsou inaktivovány nebo inhibovány kyselinou nebo pepsinem, by mohly nyní působit účinněji proti rodu ·· «« • 9 · 4 • * *♦ • · * · 4 • « I ·· ··

Helicobacter a vykazovat účinnější ošetření infekcí způsobených rodem Helicobacter. Rozrušení bakteriálního mikroprostředí a vystavení kyselému pH může být samo o sobě škodlivé pro přežití bakterií Helicobacter citlivých na kyselinu, což ještě přispívá k působení baktericidního činidla.

Navíc použití pronasy, jak bylo popsáno Kimurou a kol., vyžaduje, aby antibiotika použitá v tomto případě byla odstraněna z žaludku nasogastrickou trubicí, aby se předešlo jejich průchodu za vzniku vedlejších účinků. Provedení podle vynálezu zahrnující použití bakteriocidů stabilních v kyselém prostředí, které jsou následně odstraněny ze zažívacího traktu absorpcí, jako v případě monoglyceridů, nebo zničeny pankreatickými enzymy, jako v případě nisinu, nevyžadují odstranění bakteriocidů z žaludku jinak než normálním vyprázdněním žaludku. To by mohla být zásadní výhoda, protože eliminuje potřebu odstranění činidla proti bakteriím Helicobacter ze žaludku nasogastrickou trubicí, nepříjemnou, nákladnou a u některých pacientů potenciálně nepřijatelnou procedurou.

Mukolytické sulfhydrylové sloučeniny optimálně redukují disulfidy při hodnotách pH 7,0 a vyšších.

Neutrální až zásadité prostředí žaludku může být získáno spolupodáváním sulfhydrylové sloučeniny s vhodným pufrem, jako je hydrogenuhličitan, nebo spolupodáváním s inhibitorem gastrické kyseliny. Protože málo mukolytických enzymů je schopno působit nebo přežít v drsném kyselém prostředí žaludku, kde jsou přístupné rozkladu v kyselině žaludečním pepsinem, musí být také podávány s činidlem, které zvyšuje pH obsahu žaludku. Proto při ošetření H. pylori proteinasou, jako je pronasa, by • * ·

« · ♦ • ···· » » · • 9 » · ·<· 99

9 ·

mělo být společně podáváno antisekreční činidlo, jako je H₂-antagonista nebo inhibitor protonové pumpy, pro inhibici sekrece kyseliny, tak, aby proteinasa byla podávána v neutrálním nebo slabě zásaditém prostředí. Alternativně nebo ve spojení s takovým ošetřením, může být proteinasa podávána v slabě zásaditém pufru, jako je hydrogenuhličitan, pro neutralizování gastrické kyseliny. Jako další alternativa může být podáván separátně před podáním mukolytického činidla pufr zvyšující pH nebo antisekreční činidlo.

Protože nisin je polypeptid obsahující sulfhydryl, mukolytická činidla, kterými jsou sulfhydrylové sloučeniny nebo proteinasy, by měly být podávány před a ne současně s kompozicí nisin - GML.

V jiném provedení vynálezu terapie kombinující ošetření GML - nisinem a ošetření mukolytickým činidlem může být rozšířena o zahrnují ošetření jinými baktericidními činidly. 0 bakteriocidech, které působí rychle a lokálně v žaludku vyhlazení bakterií Helicobacter se dá předpokládat, že mají méně vedlejších účinků než ty, které jsou spojeny s činidly, jako antibiotika, která jsou absorbována do systémového oběhu, nebo která procházejí do střev. Tato antibiotika mohou nepříznivě působit na normální střevní mikrofloru a tím umožňovat přizpůsobivým patogenům kolonizovat střeva. Společné podávání s antibiotiky není výhodně podstupováno, pokud není nejúčinnějším prostředkem eliminace infekce za daných podmínek.

Typické denní dávky složek kompozice se mohou měnit podle ošetřované infekce, místa infekce a symptomů ošetřované choroby. Účinné orální dávky nisinové složky • 9

999· · jsou v rozsahu od 0,5 mg do 5 000 mg a účinná denní dávka GML složky je v rozsahu od 0,1 mg do 2 000 mg. Výhodné dávky se pohybují pro nisin od 10 mg do 2 000 mg a pro GML od 10 mg do 1000 mg.

Mukolytická činidla, jako je pronasa, mohou být podávána v dávce od 18 000 až 36 000 tyrosinových jednotek pro jednotlivé podávání, jak je popsáno v Kimura a kol.,

Am. J. Gastroenterol. 90: 60 - 63, 1995, na jehož závěry se v plné šíři tímto odkazuje. N-alkycysteiny mohou být podávány v dávkách pohybujících se od 0,1 do 1,0 g pro jednotlivé podávání.

Způsoby vyhlazení kolonizace a ošetření infekce způsobené bakteriemi rodu Helicobacter podle vynálezu zahrnují podávání účinného množství kompozice GML - nisin pacientovi, který vyžaduje takovéto ošetření. V jednom provedení způsob zahrnuje podávání kompozice GML - nisin 1 až 4 hodiny po ošetření mukolytickým činidlem; mukolytické činidlo je podáváno v kombinaci s antacidem nebo slabě zásaditým pufrem jako je hydrogenuhličitan. V jiném provedení způsob využívající hydrolytický enzym nebo sulfhydrylovou sloučeninu jako mukolytické činidlo zahrnuje předchozí ošetření pacienta inhibitorem sekrece gastrické kyseliny nebo zásaditým pufrem k zvýšení pH v žaludečním obsahu před podávání mukolytického činidla; podávání posledně zmiňovaného předchází podávání kompozice nisin GML.

• * · ·· ·· ·· 99 9 9 9 · · · · · · • · * · · · 9 · ·· * «··· · 99·· 999 9 9

9 9 9 9 9 9 ·

999 9 999 »· ♦· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Synergická baktericidní aktivita nisinu a GML v nepřítomnosti chelatačních činidel proti H. pylori.

Všechny testy baktericidní aktivity v tomto případě byly prováděny po dobu 30 minut při 37 °C. Měřeným parametrem bylo přežití bakterií vystavených GML a/nebo nisinu, které bylo zjištěno odečtem životaschopných bakterií (kolony tvořící jednotky na ml CFU/ml) zjištěným standardním zředěním deskovými technikami. Média, podmínky kultivace a testů byly následující: Všechny kultury Helicobacter byly inkubovány za mikroaerobních podmínek v GasPak. H. pylori byl kultivován 2 až 4 dny na agaru Trypticase Soy + 5 % defibrinované ovčí krve a poté inokulován do NYCIII bujónu a kultivován přes noc za jemného protřepávání [NYCIII bujón obsahuje na litr: 1 g rozpustného škrobu (Difco), 15 g proteosového peptonu #3 (Difco) , 5 g NaCl, 4 g K₂HPO₄, 1 g KH₂PO₄, 5 g glukosy, 25 ml čerstvého kvasinkového extraktu (Gibco), 120 ml koního séra prostého gamaglobulinu (Sigma)]. Suspenze pro testování aktivity GML a nisinu byly v 10% sacharóze. Životaschopné buňky byly stanoveny po 3 - 5 dnech růstu na agaru Trypticase Soy + 5 % ovčí krve.

Obrázek 1 ukazuje účinek spojení různých koncentrací GML s různými koncentracemi nisinu na životaschopnost H. pylori kmene ATCC 43504. Suspenze bakterií byla rozdělena a vystavena různým koncentracím činidel, jednotlivě nebo v kombinaci. Přežití bakterií je vyjádřeno ve vztahu ke kontrolní neinkubované suspenzi (čas nula). Samotný nisin v koncentraci mezi 30 a 300 pg/ml má malý nebo žádný účinek • · ···· 9

99 99 99

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99

99 999 9 9

9 9 9 9 9 9 • 99 9 99 9 9 99 na životaschopnost H. pylori (přežití > 10 %).

V koncentracích 1 a 3 pg/ml GML v nepřítomnosti nisinu byla pozorována taká malá nebo nebyla pozorována žádná redukce životaschopnosti inokula (přežití > 10 %). Při vystavení této koncentraci GML a více než 300 pg/ml nisinu, byl pozorován další slabý pokles životaschopnosti kultur. Když byly bakterie vystaveny 10 pg/ml GML samotného/ opět více než 10 % bakterií přežívalo. Avšak přídavek zvýšeného množství nisinu (30, 100 nebo 300 pg/ml) k 10 pg/ml GML měl za následek velmi významný pokles životaschopnosti kultury; rozsah tohoto účinky se zvětšuje se zvyšující se koncentrací nisinu. Vyšší koncentrace samotného GML (30 nebo 100 pg/ml) sterilizovaly bakteriální suspenze.

Kompozice obsahující směs GML - nisin podle vynálezu jsou výhodně podávány orálně ve formě přípravků, které obsahují účinné množství jak aktivních činidel, tak farmaceuticky přijatelného nosiče. Farmaceutický mukolytický přípravek obsahující účinné množství mukolytického činidla a farmaceuticky přijatelný nosič může být podáván před přípravkem obsahujícím GML - nisin.

Kompozice podle vynálezu mohou být také formulovány jako antacidové kompozice, nebo podávány v kombinaci s antacidem, přičemž podávání může mít za následek například vyšší pH prostředí v žaludku, než jaké tam bylo před podáváním. Kompozice GML - nisin by mohly být ještě účinné proti pathogenním bakteriím za takových podmínek.

Preparáty obsahující GML - nisin dále zahrnující antacid mohou být také podávány následně po farmaceutickém mukolytickém preparátu obsahujícím účinné množství mukolytického činidla a farmaceuticky přijatelného nosiče.

• · • · · • · ·»

4 4 · • · ·*

Farmaceuticky přijatelný nosič může být ve formě pevného, polotekutého nebo kapalného ředidla. Farmaceuticky přijatelné nosiče mohou zahrnovat deriváty celulózy, želatinu, laktosu, škrob atd. Přípravky mohou být ve formě roztoků, koloidů nebo emulzí, prášků, tablet, kapslí nebo gelů.

Suché formy přípravků mohou být vylisovány do tablet, které mohou být potaženy farmaceuticky inertními složkami, jako je cukr, a které mohou obsahovat jiné farmaceuticky přijatelné substituenty, jako je arabská guma, želatina, mastek nebo oxid titaničitý a mohou být také potaženy různými barvivý. Mohou být připraveny tvrdé želatinové kapsle/ které obsahují granule aktivních činidel v kombinace s pevným nosičem, jako je laktóza, bramborový škrob, kukuřičný škrob, deriváty celulózy nebo želatina.

Kapalné přípravky pro orální podávání mohou být připraveny ve formě sirupů nebo suspenzí obsahujících kompozici GML - nisin a cukr, vodu a glycerol nebo propylenglykol. Pokud je to žádoucí, tyto kapalné přípravky mohou obsahovat barviva, aromata, sladidla, jako je sacharin, a zahušťovadla, jako jsou deriváty celulózy.

Dávkové jednotky může samozřejmě být dosaženo modifikací jednoduchých vodných kompozic zahrnutím zahušťovadel, emulgátorů nebo rozmělněním za vzniku koloidní suspenze. Použití emulgátorů, jako je lecithin, může mít zvláštní využití při vytváření stabilních emulzí vhodnějších pro podávání v místě kolonizace.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozice, vyznačující se tím, že sestává v podstatě z účinného množství GML, účinného množství nisinu v nepřítomnosti chaletačnícho činidla a farmaceuticky přijatelného nosiče.
2. 2. Způsob vyhlazení kolonizace nebo ošetření infekcí nebo jiného chorobného stavu vzešlého z kolonizace bakteriemi rodu Helicobacter v gastrointestinálním traktu savců, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání savcům, u kterých je třeba takového ošetření, účinného množství kompozice GML - nisin.
3. 3. Způsob vyhlazení kolonizace nebo ošetření infekcí nebo jiného chorobného stavu vzešlého z kolonizace bakteriemi rodu Helicobacter v ústní dutině savců, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání savcům, u kterých je třeba takového ošetření, účinného množství kompozice GML - nisin.
4. 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že GML je podáván v dávce v rozmezí od 0,1 mg do 2 000 mg a nisin je podáván v dávce v rozmezí od 0,5 mg do 5 000 mg.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že GML je podáván v dávce v rozmezí od 10 mg do 1 000 mg a nisin je podáván v dávce od 10 mg do 2 000 mg.
6. 6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že před podáváním kompozice GML - nisin předchází podávání účinného množství mukolytického činidla savci.

   φφ • · φφφ φ φ φ • φ φ φφ φφφ · φ φ ·« φφ
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že mukolytické činidlo je sulfhydrylová sloučenina.
8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že mukolytické činidlo je hydrolytický enzym.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že enzym je pronasa.
10. 10. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že mukolytické činidlo je podáváno v kombinaci s množstvím antacidu nebo pufru účinným k zvýšení pH v místě podávání na 7 nebo více.
11. 11. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že před podáváním mukolytického činidla předchází podávání množství antacidu nebo pufru účinného ke zvýšení pH v místě podávání na 7 nebo výše. ,