CZ201346A3 - Polymorfismy v sekvenci NHE1 kura domácího asociované s rezistencí nebo sníženou senzitivitou k ALV-J - Google Patents

Abstract

Řešení se týká oblasti veterinární virologie, konkrétně senzitivity a rezistence k infekci ALV-J u kura domácího a vybraných druhů hrabavých ptáků. Byly identifikovány polymorfismy DNA v oblasti ECL1 genu chNHE1 asociované s rezistencí nebo sníženou senzitivitou k ALV-J, konkrétně delece W38 asociovaná s ALV-J rezistentním fenotypem a substituce W38G nebo W38E asociovaná s fenotypem se sníženou senzitivitou vůči ALV-J. Řešení se tedy zejména týká izolované molekuly DNA kódující mutovaný protein chNHE1 nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je deletován, a dále izolované molekuly DNA kódující mutovaný protein chNHE1 nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je nahrazen glycinem nebo glutamátem.

Description

Polymorfismy v sekvenci NHE1 kúra domácího asociované s rezistencí nebo sníženou senzitivitou k ALV-J

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti veterinární virologie, konkrétně senzitivity a rezistence k infekci ALV-J u kúra domácího a vybraných druhů hrabavých ptáků. Byly nalezeny polymorfismy v sekvenci NHE1 rozlišující senzitivní a rezistentní druhy. Experimentálně bylo ověřeno, že sekvence NHE1 kúra domácího obsahující AW38 mutantu poskytuje úplnou rezistenci k infekci ALV-J.

Dosavadní stav techniky

První krokem retrovirové infekce je navázání glykoproteinů virového obalu na specifické receptory buněčného povrchu. Tudíž senzitivita každé buňky vůči infekci přísně závisí na expresi a prezentaci náležité receptorové molekuly. Toto navázaní, stejně jako následující fáze vstupu viru do buňky, vyžaduje naprostou shodu receptorů a obalových glykoproteinů a strukturní změny ve variabilní a hypervariabilní oblasti obalového glykoproteinů mohou zrušit infekčnost nebo dokonce změnit využití receptorů a rozšířit hostitelský rozsah. To lze ukázat na příkladu ptačích sarkomových a leukotických virů (ASLV), skupiny blízce příbuzné retrovirům, která se vyvinula do pěti podskupin A až E, které využívají tři odlišné receptory kódované třemi genetickým lokusy, tva, tvb a tvc (Barnard et al., 2006). Podskupina J viru ptačí leukózy (ALV-J), jejímž prototypem je virový izolát HPRS103, je nezávislá obalová podskupinu, která neinterferuje s podskupinami A až E a nemůže být neutralizována antisérem vyvolaným proti podskupině A až E (Payne et al., 1991). ALV-J byl původně popsán ve Velké Británii jako virus vyvolávající chronickou myelocytomatózu u komerčních linií masného typu (Payne et al., 1992a), ale postupně se vyvinul do všeobecně rozšířeného patogenu s širokým spektrem dalších indukovaných poruch, jako je například histiocytická sarkomatóza, hemangiomy, erytroblastóza aj. (Payne a Nair 2012). Z rozsáhlého seznamu druhů hrabavých ptáků pouze kur domácí, kur bankivský a krocan domácí jsou senzitivní k infekci ALV-J (Payne et al., 1992b). Unikátní interferenční vlastnosti a hostitelský rozsah ALV-J jsou určeny povrchovou podjednotkou obalového glykoproteinů gp85, který sdílí ·* · • · · · · • ·

pouze 40% identitu s obaly podskupin A až E (Bai et al., 1995) a který vznikl mnohonásobnými rekombinacemi mezi exogenním ptačím leukózovým virem a endogenním retrovirem (Benson et al., 1998).

Receptor pro ALV-J u kúra domácího byl identifikován jakožto kuřecí iontový kanál Na⁺/H⁺ typu 1 (chNHEl) kódovaný tvj lokusem na chromosomu 23 (Chai a Bates, 2006). Ačkoli ALV-J je vysoce diverzifikovaný, chNHEl váže všechny kmeny. Důkazem toho je geneticky upravená kuřecí buněčná linie DF-1\J, kde exprese obalového glykoproteinu z ADOL-Hcl kmene interferuje s infekcí šesti ALV-J izoláty, ale nikoliv s ASLV typu A až E (Lov et al., 1999). cDNA a aminokyselinová sekvence chNHEl byly publikovány (Chai a Bates, 2006) a na základě této sekvence a známé struktury odpovídajího iontového kanálu lidských buněk lze předpovědět, že chNHEl obsahuje 12 transmembránových segmentů, šest extracelulárních smyček a dlouhý intracelulární C-konec. Na základě odlišnosti jinak konzervovaných aminokyselinových sekvencí mezi chNHEl, který slouží jako receptor pro virus, a lidským NHE1, na který se virus neváže, byla poloha vazebného místa pro virus predikována v N-koncové části vyčnívající extracelulární smyčky 1 (Chai a Bates, 2006).

Cílem práce popsané v předložené přihlášce bylo identifikovat funkční determinanty chNHEl zodpovědné za ALV-J receptorovou aktivitu a polymorfismy v této sekvenci. To je naléhavě potřebné vzhledem k závažným ekonomickým ztrátám, které způsobuje ALV-J v drůbežářském průmyslu.

Podstata vynálezu

Pro identifikaci aminokyselinových zbytků rozhodujících pro interakci NHEl-EnvJ byly srovnány aminokyselinové sekvence NHE1 různých druhů hrabavých ptáků s cílem identifikovat polymorfismy trvale přítomné v rezistentních druzích. Srovnání ukázalo překvapivé zjištění v levé části extracelulární smyčky ECL1, jedné ze dvou velkých smyček ECL1 a ECL5. Srovnání odhalilo odlišnosti mezi senzitivními a rezistentními druhy na úrovni několika aminokyselin, přičemž tryptofan v poloze 38 (W38, viz sekvence id. č. 1, EMBL-EBI, UNIPROT č. Q1PS52) se jevil jako rozhodující aminokyselina pro senzitivitu k ALV-J.

··· .·· · · ······ ·· · · ······ · · · ···· ·· ·· ··· ·· · · ·

Důležitost W38 pro vstup viru podskupiny J ALV do buňky byla testována tak, že v rezistentních buňkách křepelky japonské QT6 byla exprimována tv/ cDNA (sekvence id. č. 2), jak divokého typu tak mutovaná v kodónu pro W38, a byla analyzována následná infekce chimérickým virem RCAS(J)GFP (obsahuje env gen ALV-J a zelený fluorescenční protein jako markér). Pro tento účel byl připraven expresní vektor kódující celý chNHEl a série mutant chNHEl nesoucích jednoaminokyselinové změny v doméně ECL1 (AW38, W38G a W38E). Transfekce QT6 buněk s konstruktem exprimujícím chNHEl divokého typu (wt chNHEl) navodila senzitivitu k infekci RCAS(J)GFP. Překvapivě bylo zjištěno, že exprese mutanty AW38 (delece tryptofanu v poloze 38) chNHEl nenavodila senzitivitu k ALV-J infekci a nevedla k tvorbě žádných GFP-pozitivních buněk, podobně jako kontrolní transfekce QT6 buněk prázdným vektorem. Buňky exprimující mutantu AW38 byly tedy nadále plně rezistentní. Bylo tím zjištěno, že W38 je rozhodující aminokyselinový zbytek nutný pro receptorovou funkci chNHEl a jeho delece vysvětluje rezistenci k ALV-J u příslušných ptáků. Další mutanty chNHEl, a sice W38G (náhrada tryptofanu v poloze 38 glycinem) a W38E (náhrada tryptofanu v poloze 38 glutamátem), překvapivě vykazovaly přechodný fenotyp projevující významně nižší receptorovou aktivitu ve srovnání swt chNHEl. Bylo tedy zjištěno a prokázáno, že delece nebo substituce jedné aminokyseliny v sekvenci chNHEl, konkrétně W38 v ECL1 doméně, buďto zcela ruší nebo alespoň silně snižuje funkci chNHEl jakožto receptoru pro ALV-J.

ALV-J způsobuje značné ekonomické ztráty v drůbežářském průmyslu. Přitom dosud nebyla popsána žádná ALV-J rezistentní kuřecí linie. Identifikace receptorových determinant chNHEl zodpovědných za senzitivitu k ALV-J bude využita k nalezení přirozených polymorfismů v chNHEl, které pak mohou sloužit jako potenciální zdroj hostitelské rezistence. Nalezené polymorfismy DNA v oblasti ECL1 genu chNHEl asociované s rezistencí nebo sníženou senzitivitou k ALV-J tedy jsou delece W38 asociovaná s ALV-J rezistentním fenotypem a substituce W38G nebo W38E asociovaná s fenotypem se sníženou senzitivitou vůči ALV-J.

Jestliže alela chNHEl s W38 delecí nebo substitucí v populaci kúra domácího neexistuje, může být připravena uměle současnými nástroji editace genomu, jako je například sekvenčně specifická TALE nebo ZnF nukleáza, a vnesena do hospodářsky užívaných plemen.

• ··· • ·* · • · · ·· • · · · ·· • · · ·« ···· · · ···

Předložený vynálezu se tedy týká izolované molekuly DNA kódující mutovaný protein chNHEl nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je deletován. Aminokyselinová sekvence chNHEl divokého typu je uvedena v seznamu sekvencí jako sekvence id. č. 1, sekvence cDNA je uvedena jako sekvence id. č. 2. Přitom delece tryptofanu v poloze 38 ((AW38) je spojena se zrušením funkce chNHEl jakožto receptoru pro ALV-J, čili s fenotypem rezistentním vůči ALV-J.

Dále se týká Izolované molekula DNA kódující mutovaný protein chNHEl nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je nahrazen glycinem (W38G) nebo glutamátem (W38E). Tyto mutace jsou spojeny s fenotypem významně snížené senzitivity vůči ALV-J.

Vynález se týká i mutantních proteinů chNHEl kódovaných výše uvedenými sekvencemi DNA.

Vynález se dále týká rekombinantního vektoru obsahujícího výše uvedenou DNA a řídicí sekvence pro její expresi v buňce, výhodně ptačí buňce, výhodněji buňce kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagris gallopavo).

Dále se vynález týká hostitelské buňky obsahující molekulu DNA podle vynálezu, přičemž buňka je výhodně ptačí buňka, výhodněji buňka kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagris gallopavo), a zejména transfekované hostitelské buňky kúra domácího (Gallus gallus) exprimující výše uvedený mutantní protein chNHEl.

Výše uvedená molekula DNA podle vynálezu nebo uvedený vektor jsou výhodně určeny pro použití při přípravě transgenního jedince kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagris gallopavo) s rezistencí nebo sníženou senzitivitou vůči ALV-J.

Vynález se dále týká použití genetického markéru spočívajícího v deleci tryptofanu v poloze 38 (AW38) nebo substituci tryptofanu v poloze 38 glycinem (W38G) nebo glutamátem (W38E) v proteinu chNHEl pro selekci kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagris gallopavo) s rezistencí nebo sníženou senzitivitou vůči ALV-J, kde delece tryptofanu v poloze 38 je asociována s rezistencí vůči ALV-J a substituce tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem je asociována se sníženou senzitivitou vůči ALV-J.

» >

Dále se vynález týká i způsobu detekce genetického markéru asociovaného s rezistencí nebo sníženou senzitivitou vůči ALV-J u kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagris gallopavo), který zahrnuje kroky, kdy se a) izoluje genomová DNA ze vzorku z kúra domácího, a b) případně se z DNA podle bodu a) izolují fragmenty obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2, charakterizovaného tím, že způsob dále zahrnuje kroky, kdy se v DNA pro chNHEl detekuje nepřítomnost kodonu pro tryptofan v poloze 38 nebo přítomnost kodonu zodpovědného za substituci tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem, přičemž delece tryptofanu v poloze 38 je asociována s rezistencí vůči ALV-J a substituce tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem je asociována se sníženou senzitivitou vůči ALV-J.

Přehled obrázků

Obr. 1. Schematické znázornění A) parentálního viru RCAS(A)GFP (bílý), B) HPRS-103 (šedý) a C) chimérického reportérového viru RCAS(J)GFP (bílý a šedý). Restrikční místa použitá pro substituci env genu jsou označena šipkami. LTR je dlouhá terminální repetice; rTM je redundantní transmembránová doména; DR je přímá repetice; GFP je zelený fluorescenční protein; SA je akceptorové místo pro sestřih GFP mRNA.

Obr. 2. Sekvence proteinu chNHEl odpovídající aminokyselinám 1 až 803 sekvence id. č. 1 vyjádřená pomocí jednopísmenného kódu.

Obr. 3. NHE1 alely z různých druhů hrabavých ptáků obsahují polymorfismy v první extracelulární smyčce ECL1. Dedukované aminokyselinové sekvence TMI a ECL1 odpovídající aminokyselinám 9-82 chNHEl jsou vzájemně odpovídajícím způsobem přiřazeny a porovnány. Vnímavost nebo rezistence studovaných druhů hrabavých ptáků je označena (+), respektive (-). Hranice mezi ECL1 a předpokládanou transmembránovou doménou TMI je označena vodorovným šipkami. Kritický aminokyselinový zbytek W38 je označen svislou šipkou. Aminokyseliny odpovídající konsenzuální sekvenci jsou v šedém rámečku.

Obr. 4. Aminokyselinové sekvence mutovaných fragmentů odpovídající aminokyselinám 9-82 wt chNHEl s mutacemi AW38, W38E a W38G.

• · · · • · • ·

Obr. 5. Exprese klonovaného wt chNHEl a jeho mutant ŮW38, W38E, W38G nebo P52H poskytuje v QT6 buňkách různé hladiny senzitivity k ALV-J. QT6 buňky byly transfekovány s konstrukty exprimujícími wt a mutantní formy chNHEl, infikovány RCAS(J)GFP 1 den po transfekci a procento GFP-pozitivních buněk bylo analyzováno průtokovou cytometrií 2 dny po infekci.

A. Senzitivita mutant k RCAS(J)GFP v příkladném experimentu je srovnána s divokým typem (wt), který představuje 100%. Výsledky jsou vypočteny jako průměr ze dvou experimentů, každý se třemi paralelními jamkami.

B. Příklady FACS histogramů ukazující procenta GFP-pozitivních buněk po transfekci Q.T6 buněk wt chNHEl (vlevo), mutantou P52H (uprostřed) a mutantou AW38 (vpravo) a po infekci RCAS(J)GFP.

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1

MATERIÁLY A METODY

Konstrukce reportérového vektoru podskupiny J a množení viru

Retrovirový vektor RCAS(A)GFP podskupiny A (Federspiel a Hughes, 1997; Hughes 2004), transdukující reportérový gen pro zelený fluorescenční protein (GFP), byl štěpen Kpnl a Stul (oba od New England Biolabs) a byl tak odstraněn fragment o velikosti 1853 bp obsahující 3' konec pol genu a celý env gen. Molekulární klon HPRS103 ALV-J byl získán od V. Naira (Institute for Animal Health, Compton, GB) a Kpnl - BsaBI (New England Biolabs) fragment délky 2120 bp, který obsahoval 3' konec pol, celý env, redundantní TM oblast a přímou repetici, byl vložen do RCAS skeletu (obr. 1). Takto připravený vektor RCAS(J)GFP produkoval GFP-transdukující virus podskupiny J v DF-1 buňkách, které neobsahují žádné ALV- příbuzné endogenní retrovirovové lokusy. Plazmid DNA RCAS(J)GFP byl transfekován do DF-1 buněk s použitím transfekčního činidla XtremeGENE (Roche) a virové preparáty (supematant z kultivovaných buněk) byly sklizeny 9 nebo 10 dnů po transfekci (pt). Buněčné supernatanty • · · ·

9 byly zbaveny debrisu centrifugací při 2000 x g po dobu 10 minut v 10 °C a rozděleny do alikvotů virových preparátů a byly uloženy v -80 °C. Virový titr byl určen terminálním ředěním a následnou infekcí DF-1 buněk a dosahoval 10⁶ infekčních jednotek (IU) na 1 ml.

Příprava embryonálních fibroblastů a buněčná kultura

Kuřecí embryonální fibroblasty (CEF) byly připraveny z deseti 10-denních embryí inbredních linií L15 a H6, outbrední populace BL a individuálně ze čtyř embryí kúra bankivského, poddruhu Gallus gallus murghi (GGM). L15, H6 a BL kuřata byla chována v Ústavu molekulární genetiky, Praha (Plachý, 2000), embryonovaná vejce GGM byla získána ze zoologické zahrady Ohrada u Hluboké (Ohrada u Hluboké, Česká republika). Postup byl již dříve popsán (Federspiel a Hughes, 1997). Pro srovnání byly použity embryonální fibroblasty dalších hrabavých ptáků: perlička kropenatá (Numida meleagris, NM), krocan domácí (Meleagris gallopavo, MG), křepelka japonská (Coturnix japonica, CJ), orebice čukar (Alectorís chukar, AC), koroptev šedá (Perdix perdix, PP), bažant obecný (Phasianus colchicus, PC) a bažant královský (Syrmaticus reevesi, SR). Oplozená vejce byla získána z Veterinární a farmaceutické Univerzity Brno (perlička, krocan, orebice čukar a křepelka japonská), Lesního závodu Židlochovice (bažant obecný a bažant královský) nebo od soukromého chovatele (koroptev šedá) a embryonální fibroblasty byly připraveny uprostřed inkubace, tj. 8. den (křepelka japonská), 11. den (bažant obecný a bažant královský), 12. den (koroptev šedá a orebice) nebo 14. den (perlička a krocan) stejným způsobem jako CEF. Embryonální fibroblasty kachny domácí (Anas platyrhynchos), semiinbrední linie Khaki Campbell chované v Ústavu molekulární genetiky, Praha (Nehyba et al., 1990), byly připraveny z 12-denních embryí a použity jak kontrolní skupina v infekčních experimentech. Všechny embryonální fibroblasty, stejně jako kuřecí permanentní buněčná linie DF-1 (Himly et al., 1998) a transformované křepelčí buněčné linie QT6 (Murphy et al., 1977; Moscovici et al 1977) byly kultivovány ve směsi dvou částí média D-MEM a jedné části média F-12 s přídavkem 8% fetálního telecího séra, 2% kuřecího séra a 1 x roztoku antibiotika-antimykotika (Sigma) v 5% CO₂ atmosféře ve 40 °C.

• · · · • »

Test šíření RCAS(J)GFP viru pomocí průtokové cytometrie

Ptačí embryonální fibroblasty nebo Q.T6 buňky byly nasazeny na 24jamkové destičky vdenzitě 5 x 10⁴ na jamku a infikovány 5 x 10⁵ IU RCAS(J)GFP virem 24 hodin po nasazení. Virus byl aplikován v 0,25 ml média po dobu 1 hodiny. Procento GFP-pozitivních buněk bylo kvantifikováno pomocí fluorescenčně-aktivovaného buněčného třídění (FACS) použitím analyzátoru LSRII (Beckton Dickinson) 1, 2, 3 a 4 dny po infekci (p.i.). Buňky byly před analýzou trypsinovány a promyty ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem.

Amplifikace a analýza tvj alel různých ptačích druhů

Byla připravena celková RNA z Q.T6 buněk a kultivovaných embryonálních fibroblastů panelu druhů hrabavých ptáků s použitím činidla TRI (Sigma). cDNA byla připravena z 1 pg celkové RNA reverzní transkripcí užitím reverzní transkriptázy z viru Moloneyho myší leukémie a oligo(dT)₁₅ primerů (obě reagencie od Promega). Amplifikována byla levá část tvj kódující sekvence obsahující všechny predikované transmembránové domény, extra- a intracelulární smyčky (Chai a Bates, 2006) s použitím „forward primeru chTVJÍL 5'CTTCCCTGGGCTCTGCTG3', nukleotidy 25 až 42, po směru od iniciačního kodonu ATG, a „reverse primeru chTVJR6 5'CAGGAACTGCGTGTGGATCTC3', komplementárního k nukleotidům 1537 až 1557 kuřecího tvj (tj. chNHEl DNA, viz sekvence id. č. 2). Podmínky pro PCR byly následující: 98 °C po 180 s, 35 cyklů - 98 °C po 10 s, 67,6 °C po 30 s a 72 °C po 100 s, závěrečná extenze v 72 °C po 7 minut s Taq polymerázou (TaKaRa). Výsledný PCR produkt délky 1533 bp byl ošetřen s ExoSAP-IT (USB) a pak přímo sekvencován z chTVJ5'RACEl primeru 5'TCATCAGGCAGGCCAGCAGGAT3' komplementárního k nukleotidům 301 až 322 s použitím soupravy pro sekvencování BigDye Terminátor v3.1 (PE Applied Biosystems).

Konstrukce expresního vektoru chNHEl, mutageneze a transfekční experimenty pg celkové RNA připravené z L15 CEF byl reverzně transkribován užitím soupravy

AccuScript High Fidelity lst Strand cDNA Synthesis Kit (Agilent Technologies). Úplná kódující • · · ·

sekvence chNHEl (sekvence id. č. 2) byla amplifikována z takto připravené cDNA užitím DNA polymerázy Phusion Hot Start (Finzymes) a primerů TVJ5'UTRXhol, 5'TACTCGAGATCTCCTCGCAGCGTCTCTG3', odpovídajícího nukleotidům 44 až 25 v protisměru od ATG a TVJ3'UTRXhol, 5'TACTCGAGAAACCAGAGGAGGGGCC3', komplementárního k nukleotidům 2426 až 2445 po směru od ATG (netraslatované sekvence neuvedeny). Podmínky PCR byly následující: 98 °C po 30 s, 30 cyklů - 98 °C po 7 s, 67,5 °C po 30 s, 72 °C po 100 s a závěrečná extenze v 72 °C po dobu 7 minut. Výsledný PCR produkt délky 2489 bp byl klonován do vektoru pGEM-T Easy (Promega), celý otevřený čtecí rámec tvj byl vystřižen použitím Xhol (New England Biolabs) a ligován do Xhol-linearizovaného vektoru pVitrotdTomato pod hFerL promotor. Výsledný expresní konstrukt byl nazván pVitrotdT-tvj. Vektor pVitrotdTomato byl vytvořen již dříve (Šenigl et al., 2012) z expresního plazmidu pVitro (InvivoGene) nahrazením GFP kódující sekvence fluorescenčním markérem tdTomato v první expresní kazetě, aby bylo možné sledovat účinně transfekované buňky.

Mutageneze byla prováděna na subgenovém fragmentu chNHEl s použitím soupravy Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech). PCR produkt velikosti 1533 bp amplifikovaný užitím primerů chTVJÍL a chTVJR6, jak byl popsán výše, byl štěpen Apa\ a BamHI (oba New England Biolabs) a výsledná kazeta velikosti 244 bp obsahující celou ECL1 byla klonována do Apal - BamHl-linearizovaného vektoru pcDNA3 (Invitrogen). Tento vektor byl dále zkrácen na 1,4 kbp odstraněním SexAI-fistZ17l (oba enzymy New England Biolabs) fragmentu s regulačními sekvencemi neoR a SV40. Mutageneze a selekce s Scal/H/ndlII selekčními primery byla prováděna způsobem, jaký byl již dříve popsán (Plachý et al., 2001). Použitím příslušných primerů byly vneseny následující změny, přičemž byla de novo vytvořena (+), případně zrušena (-), vhodná diagnostická místa, jak je přehledně uvedeno v následující tabulce 1:

• · · · • ·

Tabulka 1

Oligonukleotidové primery použité pro mutagenezi

Mutace Primer Diagnost. místo

AW38 AW38mut: 5'TCCGAGCCCACCGAGCAGCCATGGGGAGAGCCC3' + Nco\

W38G W38Gmut: 5'TCCGAGCCCACCGGTGAGCAGCCGTGG3' + Agel

W38E W38Emut: 5'TCCGAGCCCACCGAGGAGCAGCCATGGGGAGAGCCC3' + A/col

P52H P52Hmut: 5'ATCACCGCCGCCCACCTGGCTACGGCCCAGGAG3' - Msc\

Tučně jsou v sekvenci AW38mut vyznačeny nukleotidy sousedící s deletovaným kodonem. V ostatních sekvencích je podtržen kodon pro novou aminokyselinu. Vzhledem k degeneraci genetického kódu může být glycin alternativně kódován GGC, GGA nebo GGG, glutamát GAA, histidin CAT.

Pro přenos Apal-fiamHI kazet po mutagenezi do expresního konstruktu pVitrotdT-tvj, byl uzpůsoben pTagBFP-N vektor (Evrogen) tak, že byl odstraněna Apa\ a SamHI místa zatupením pomocí nukleázy mung-bean a self-ligací linearizovaného plazmidu. Xhoi fragment obsahující celý otevřený čtecí rámec tvj pak byl ligován doXhol místa pTagBFP-N a mutagenizované Apal-BomHI kazety byly klonovány do výsledného adaptérového vektoru, kde nahradily Apal-8amHI sekvence divokého typu. Mutantní tvj kódující sekvence byly pak přeneseny jakožto Xho\ fragmenty do expresního vektoru pVitrotdT-tvj.

Expresní konstrukty divokého typu (kódující wt chNHEl) a mutované tvj (kódující AW38, W38G, W38E a P52H mutanty chNHEl) byly transfekovány do QT6 buněk. 5 χ 10⁴ buněk bylo nasazeno na 24-jamkové destičky s kultivačním médiem a transfekce byla provedena o 12 hodin později Ca²⁺ fosfátovou precipitací 2 pg plazmidové DNA. Pět hodin po transfekci byl precipitát odmyt a 24 hodin po transfekci byly buňky použity pro infekci RCAS(J)GFP a test šíření viru. Fluorescenční protein TdTomato byl použit jako markér úspěšně transfekovaných buněk a účinnost infekce byla vyjádřena jako procento GFP-pozitivních buněk z tdTomatopozitivních buněk.

• · · ·

• · · · • » · • 9 ♦ • · · • · · · · ·

VÝSLEDKY

Konstrukce reportérového viru podskupiny J

Pro zjednodušení studia infekce a zlepšení kvantitativního hodnocení ALV-J infekce byl zkonstruován GFP-transdukující reportérový virus s J specificitou na základě retrovirového vektoru RCAS (Federspiel a Hughes, 1997; Hughes 2004). Gen env RCAS(A)GFP byl substituován úplným env genem z klonovaného HPRS-103 včetně redundantní části transmembránové domény a přímé repetice (Chesters et al., 2002). Výsledný replikačně kompetentní virus RCAS(J)GFP produkovaný v DF-1 buňkách dosáhl titru 10⁵ IU na 1 ml. Podskupinová specificita RCAS(J)GFP viru byla ověřena infekcí kuřecích DF-1 buněk a křepelčích Q.T6 buněk. Virem infikované DF-1 buňky a podíl GFP-pozitivní buněk postupně stoupaly v čase, což dokazovalo replikaci viru. Naproti tomu bylo pozorováno méně než 0,05 % GFP-pozitivních buněk v infikovaných i neinfikovaných QT6 buňkách, což lze považovat za autofluorescenci pozadí (data nejsou ukázána).

Hostitelský rozsah RCAS(J)GFP viru u ptačích druhů

Užitím reportérového viru RCAS(J)GFP byla hodnocena senzitivita k ALV-J u panelu osmi druhů hrabavých ptáků a kachny domácí jakožto referenčního druhu. Embryonální fibroblasty byly infikovány RCAS(J)GFP a šíření viru bylo sledováno jako procento GFPpozitivní buněk kvantifikované pomocí FACS. Výsledky (tabulka 2) doložily data získaná již dříve (Payne et al., 1992) s RSV pseudotypovaným pomocí HPRS-103. Konkrétně bylo pozorováno, že pouze kur domácí, kur bankivský a krocan domácí byly senzitivní; jiné druhy nevykazovaly žádné známky RCAS(J)GFP infekce dokonce ani po čtyřech dnech p.i.

• · · ·

TABULKA 2

Časový průběh RCAS(J)GFP infekce embryonálních fibroblastů senzitivních a rezistentních ptačích druhů

Druh/inbrední linie procento GFP-pozitivní buněk v dnech p.i.*

l.den 2.den 3.den 4.den

Kur domácí/L15	4,1/32,5	18,3/88,8	52,8/95,1	69,8/97,6
Kur domácí/H6	2,9/26,4	6,9/50,5	9,0/56,1	11,3/61,4
Kur domácí/BL	6,1/42,7	21,8/86,1	36,9/90,9	43,9/91,2
Kur bankivský	7,7/63,6	16,9/90,7	18,1/93,7	20,6/96,9
Krocan domácí	2,9/18,0	11,4/64,4	16,6/84,4	20,1/90,6
Bažant obecný	<0,05**	<0,05	<0,05	<0,05
Bažant královský	<0,05	<0,05	<0,05	<0,05
Křepelka japonská	<0,05	<0,05	<0,05	<0,05
Koroptev šedá	<0,05	<0,05	<0,05	<0,05
Orebice čukar	<0,05	<0,05	<0,05	<0,05
Perlička kropenatá	<0,05	<0,05	<0,05	<0,05
Kachna domácí/Khaki Campbell	<0,05	<0,05	<0,05	<0,05
★Embryonální fibroblasty byly infikovány s MOI =	1 a MOI =	10. Hodnoty jsou uvedeny jako
procento při MOI 1/procento při MOI 10
**0,05 % GFP-pozitivních buněk představuje přirozenou auto-fluorescenci pozorovanou u

kontrolních neinfikovaných buněk

Testován byl panel osmi inbredních linií kúra domácího (v tabulce 2 jsou uvedeny pouze linie H6 a L15, navíc outbrední linie BL) a byly pozorovány drobné rozdíly v časovém průběhu infekce mezi různými liniemi. To nasvědčuje tomu, že mohou být mírné rozdíly vsenzitivitě vůči viru, linie H6 je méně senzitivní, L15 je více senzitivní.

• ·

Polymorfismy v NHE1 rozlišující senzitivní a rezistentní druhy

Srovnání aminokyselinové sekvence NHE1 různých druhů hrabavých ptáků vedlo k identifikaci jednotlivých míst, tj. aminokyselin, lišících se mezi senzitivními a rezistentními druhy (obrázek 3). První, W38, je buď deletován u orebice a bažantů nebo změněn u křepelky a perličky. NHE1 z orebice vykazuje jednoduchou aminokyselinovou deleci, AW38, zatímco jiné rezistentní druh nesou delece nebo změny několika aminokyselin, v bezprostředním nebo širším okolí W38. Další aminokyselinové změny rozmístěné podél NHE1 jsou přítomné buďto u jednoho rezistentního druhu, jako je P52H u orebice, nebo nejsou společné pro všechny rezistentní druhy (K64R u křepelky a bažantů, P77T u křepelky, H66P/Q u perličky a bažantů a G85S u křepelky). Některé aminokyselinové změny jsou přítomny jak u rezistentních druhů, tak u senzitivního krocana a nemohou tak vysvětlit rezistenci k J podskupině ALV bez příspěvku jiných substitucí (D29N, AE72,73SD u bažantů a krocana a P75S/A u orebice, perličky, bažantů a krocana). NHE1 z orebice je přitom nejpodobnější s chNHEl pouze se třemi změnami v jedné aminokyselině, a sice ŮW38, P52H a P75S. Z těchto změn je P52H unikátní pro orebici a nemůže tak vysvětlit rezistenci u jiných druhů a P75S je sdílena s krocanem, který je k infekci senzitivní. Lze tedy shrnout, že pro senzitivitu k ALV-J je rozhodující W38.

W38 v chNHEl je rozhodující aminokyselina pro vstup ALV-J

Důležitost W38 pro vstup ALV podskupiny J do buňky byla testována expresí cDNA tvj divokého typu a mutované cDNA tvj v rezistentních QT6 buňkách a analýzou následné infekce RCAS(J)GFP. Pro tento účel byl připraven expresní vektor kódující úplný chNHEl a série mutantních chNHEl nesoucích jednoduché aminokyselinové změny v ECL1. AW38 mutanta chNHEl simuluje deleci zjištěnou u orebice, mutanty W38E a W38G simulují substituce zjištěné v nekonzervativních klastrech NHE1 křepelky japonské, respektive perličky (obrázek 2). Kromě toho mutanta P52H simuluje unikátní substituci P52 pozorovanou v NHE1 orebice.

Účinnost transfekce s jednotlivými expresními konstrukty byla kontrolována měřením fluorescence z tdTomato koexprimovaného ze stejného konstruktu s mutantou chNHEl « · • ·

• · · · • · · · · • · · · • · · · · · nebo chNHEl divokého typu. Transfekce Q.T6 buněk s konstruktem exprimujícím wt chNHEl navodila senzitivitu k infekci RCAS(J)GFP (obrázek 5). V opakovaných pokusech bylo pozorováno až 12,8 % GFP-pozitivních buněk mezi transfekovanými tdTomato-pozitivními buňkami pátý den po infekci. Výsledky reprezentativního experimentu jsou ukázány na obrázku 5A, kde snížení účinnosti receptoru mutantní NHE1 varianty je srovnáno s wt chNHEl (odpovídá 100 %). P52H mutanta navodila téměř stejnou senzitivitu k RCAS(J)GFP, což ukazuje, že P52H substituce neruší receptorovou aktivitu chNHEl a nelze jí připisovat rezistentní fenotyp křepelky japonské. Naproti tomu bylo zjištěno, že exprese AW38 mutanty chNHEl nenavodila senzitivitu k ALV-J infekci a nevedla k tvorbě žádných GFP-pozitivních buněk, podobně jako kontrolní transfekce QT6 buněk prázdným vektorem. Bylo tím zjištěno, že W38 je rozhodující aminokyselinový zbytek nutný pro receptorovou funkci chNHEl a jeho delece, pozorovaná u orebice, vysvětluje rezistenci k ALV-J u příslušných ptačích druhů. Kromě toho W38G a W38E mutanty chNHEl vykazovaly přechodný fenotyp vykazující 22%, respektive 9% receptorovou aktivitu ve srovnání s wt chNHEl (obr. 5A). Takže W38 substituce neruší úplně receptorovou aktivitu chNHEl a rezistence buněk křepelky japonské a perličky pravděpodobně vyžaduje přítomnost dalších mutací zjištěných v NHE1 u těchto druhů (obr. 3).

DISKUSE

Bylo prokázáno, že delece nebo substituce jediné aminokyseliny, konkrétně W38, v ECL1 z chNHEl ruší nebo alespoň silně zeslabuje funkci chNHEl jakožto receptoru pro ALV-J. Dále byly zjištěny odpovídající delece nebo substituce v panelu ptačích druhů rezistentních k ALV-J, buďto samotné nebo v kombinaci s jinými změnami v ECL1. To jasně ukázalo, že W38 v chNHEl je rozhodující determinantou receptorové funkce TVJ. Navíc model vytvořený pro tuto studii, tj. replikačně-kompetentní RCAS(J)GFP reportérový vektor, může být výhodně používán jako nástroj pro testování senzitivity k ALV-J.

Díky své délce ECL1 pravděpodobně vyčnívá ze struktury NHE1 v membráně a je tak přístupná navázání virového obalu. Mezi analyzovanými druhy hrabavých ptáků se odlišnosti mezi senzitivními a refrakterními druhy koncentrovaly do poměrně úzké oblasti v okolí W38.

Je zajímavé, že tato oblast a rozhodující aromatický zbytek leží v blízkosti předpokládané hranice mezi TMI a ECL1 a nikoliv na vrcholu ECL1. ALV-J se mohl evolučně vyvinout tak, aby se vyhnul receptorovým strukturám, které jsou rozhodující-pro normální buněčné funkce a které interagují s přirozenými vazebnými partnery.

NHE1 je Ca²⁺-řízený Na⁺/H⁺ transportér, který reguluje intracelulární pH a buněčný objem. Je ubikvitně exprimován a vše nasvědčuje tomu, že jde housekeeping gen podstatný pro základní buněčné funkce. Zatímco delece W38 ruší zcela receptorovou aktivitu a vysvětluje rezistenci k J podskupině ALV u orebice, alely s W38 substituovaným G nebo E zachovávají alespoň slabou schopnost zprostředkovat vstup viru. Silná rezistence perličky a jiných druhů hrabavých ptáků tedy pravděpodobně vyžaduje další mutace skutečně pozorované kolem substituovaného W38. To může být testováno ektopickou expresí kombinovaných mutant simulujících alely z rezistentních druhů. Alternativně substituce W38G a W38E mohou být dostatečné pro rezistenci při normální hladině exprese, ale nikoliv při nadměrné expresi z transfekovaného konstruktu. Problém nadměrné exprese by mohl být vyřešen vsazením (knock-in) W38 substituce do endogenního tvj lokusu v DT40 buňkách. W38 může být částí vazebného místa a hrát tak roli spojky mezi virem a receptorem. Na druhé straně by W38 mohl přispívat ke společné konformační změně vedoucí k procesu fúze mezi virem a buňkou. Další deleční/mutační analýzy a srovnání vazebných afinit mezi variantami receptoru a virového obalového glykoproteinu budou nutné k vyřešení tohoto problému.

Průmyslová využitelnost

ALV-J způsobuje značné ekonomické ztráty v drůbežářském průmyslu. Identifikace receptorových determinant chNHEl zodpovědných za senzitivitu k ALV-J může přispět k nalezení přirozených polymorfismů v chNHEl, které pak mohou sloužit jako potenciál zdroj hostitelské rezistence. Jestliže alela chNHEl s W38 delecí nebo substitucí v populaci kúra domácího neexistuje, mohla by být připravena uměle současnými nástroji editace genomu, jako je například sekvenčně specifická TALE nebo ZnF nukleáza, a vnesena do genomu hospodářsky užívaných plemen.

• · · ·

Seznam citované literatury

Bai, J., Howes, K., Payne, L.N., and Skinner, M.A. 1995. Sequence of host-range determinants in the env gene of a full-length infectíous proviral cloně of exogenous avian leukosis virus HPRS-103 confirms that it represents a new subgroup (designated J). J. Gen. Virol. 76:181187.

Barnard, R.J.O., D. Elleder, and J.A.T. Young. 2006. Avian sarcoma and leukosis virus-receptor interactions: from classical genetics to novel insights into virus-cell membrane vision.

Virology 344:25-29.

Benson, S.J., Ruis, B.L., Fadly, A.M, and Conklin, K.F. 1998. The Unique Envelope Gene of the Subgroup J Avian Leukosis Virus Derives from ev/J Proviruses, a Novel Family of Avian Endogenous Viruses. J. Virol. 72: 10157-10164.

Chai, N. and Bates, P. 2006. Na+/H+ exchanger type 1 is a receptor for pathogenic subgroup J avian leukosis virus. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 103: 5531-5536.

Chesters, P.M., Howes, K., Petherbridge, L., Evans, S., Payne, L.N., and Venugopal, K. 2002. The viral envelope is a major determinantfor the induction of lymphoid and myeloid tumours by avian leukosis virus subgroups A and J, respectively. J. Gen. Virol. 83: 2553-2561.

Federspiel, MJ. and Hughes, S.H. 1997. Retroviral gene delivery. Methods Cell Biol. 52:167177.

Hughes, S.H. 2004. The RCAS vector systém. Folia Biol. (Praha) 50:107-119.

Moscovici, C., Moscovici, M.G., Jimenez, H., Lai, M.M., hayman, M.J., and Vogt, P.K. 1977. Continuous tissue culture cell lineš derived from chemically induced tumors of japanese quail. Celili: 95-103.

Murphy, H.M. 1977. A new, replication-defective variant of the Bryan high-titer strain Rous sarcoma virus. Virology 77: 705-721.

Nehyba, J., Svoboda, J., Karakoz, I., Geryk, J., and Hejnar, J. 1990. Ducks, a new experimental host systém for studying persistent infection with avian leukaemia retroviruses. J. Gen. Virol. 71: 1937-1945.

Payne, L.N., Brown, S.R., Bumstead, N., Howes, K., Frazier, J.A., and Thouless, M.E. 1991. A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens. J. Gen. Virol. 72: 801-807.

Payne, L.N., Gillespie, A.M., and Howes, K. 1992a. Myeloid leukaemogenicity and transmission of the HPRS103 strain of avian leukosis virus. Leukemia 6:1167-1176.

• · · ·

Payne, L.N., Howes, K., Gillespie, A.M., and Smith, L.M. 1992b. Host range of Rous sarcoma virus pseudotype RSV(HPRS103) in 12 avian species: support of a new avian retrovirus subgroup, designated J. J. Gen. Virol. 73: 2995-2997.

Payne, L.N. and Nair, V. 2012. The long view: 40 years of avian leukosis research. Avian Pathology 41:11-19.

Plachý, J. 2000. The chicken - a laboratory animalof the class Aves. Folia Biol. (Praha) 46: 17-24.

Plachý, J., Hejnar, J., Trtková, K., Trejbalová, K., Svoboda, J., and Hála, K. 2001. DNA vaccination against v-src oncogene-induced tumours in congenic chickens. Vaccine 19:45264535.

Šenigl, F., Auxt, M., and Hejnar, J. 2012. Transcriptional provirus silencing as a crosstalk of de novo DNA methylation and epigenomic features at the integration site. Nucleic Acids Res. 40: 5298-5312, 2012.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná molekula DNA kódující mutovaný protein chNHEl nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je deletován.
2. 2. Izolovaná molekula DNA kódující mutovaný protein chNHEl nebo jeho fragment, kde tryptofan v poloze 38 je nahrazen glycinem nebo glutamátem.
3. 3. Mutantní protein chNHEl kódovaný molekulou DNA podle nároku 1 nebo 2.
4. 4. Rekombinantní vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 1 nebo 2 a řídicí sekvence pro její expresi v buňce, výhodně ptačí buňce, výhodněji buňce kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagrís gallopavo).
5. 5. Hostitelská buňka obsahující molekulu DNA podle nároku 1 nebo 2, přičemž buňka je výhodně ptačí buňka, výhodněji buňka kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagrís gallopavo).
6. 6. Transfekovaná hostitelská buňka exprimující mutantní protein chNHEl podle nároku 3, výhodně buňka křepelky japonské (Coturnix japonica) nebo kúra domácího (Gallus gallus).
7. 7. Molekula DNA podle nároku 1 nebo 2 nebo vektor podle nároku 3 pro použití při přípravě transgenního jedince kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagrís gallopavo) s rezistencí nebo sníženou senzitivitou vůči ALV-J
8. 8. Použití genetického markéru spočívajícího v deleci tryptofanu v poloze 38 nebo substituci tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem v proteinu chNHEl pro selekci kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagrís gallopavo) s rezistencí nebo sníženou senzitivitou vůči ALV-J, kde delece tryptofanu v poloze 38 je asociována s rezistencí « · a · • · ··· ♦ · · · · ······ · * ! _Λ !

   •Z·· ·*·* **·* ··· ··· ·· vůči ALV-J a substituce tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem je asociována se sníženou senzitivitou vůči ALV-J.
9. 9. Způsob detekce genetického markéru asociovaného s rezistencí nebo sníženou senzitivitou vůči ALV-J u kúra domácího (Gallus gallus) nebo krocana domácího (Meleagris gallopavo), který zahrnuje kroky, kdy se a) izoluje genomová DNA ze vzorku z kúra domácího, a b) případně se z DNA podle bodu a) izolují fragmenty obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že způsob dále zahrnuje kroky, kdy se v DNA pro chNHEl detekuje nepřítomnost kodonu pro tryptofan v poloze 38 nebo přítomnost kodonu zodpovědného za substituci tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem, přičemž delece tryptofanu v poloze 38 je asociována s rezistencí vůči ALV-J a substituce tryptofanu v poloze 38 glycinem nebo glutamátem je asociována se sníženou senzitivitou vůči ALV-J.