CZ2012664A3

CZ2012664A3 - Enzym hyaluronan-lyáza, zpusob jeho výroby, pouzití a zpusob prípravy nízkomolekulárního hyaluronanu

Info

Publication number: CZ2012664A3
Application number: CZ20120664A
Authority: CZ
Inventors: Knorová@Lenka; Smirnou@Dzianis; Leierová@Veronika; Krcmár@Martin; Franke@Lukás; Velebný@Vladimír
Original assignee: Contipro Biotech S.R.O.
Priority date: 2012-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2013-11-13
Also published as: AR092702A1; CZ304140B6; JP2015530099A; RU2015113473A; KR20150063057A; US20150344926A1; WO2014048406A1; EP2900816A1; BR112015005957A2

Abstract

Resení se týká enzymu schopného stepit kyselinu hyaluronovou, který je produkován houbami rodu Fistulina (zejména Fistulina hepatica). Degradace probíhá lyázovým mechanismem, pri nemz vznikají dvojné vazby mezi C4 a C5 kyseliny glukuronové. Dále je popsán zpusob prípravy a cistení enzymu a jeho mozné praktické vyuzití pro prípravu nízkomolekulárního hyaluronanu nebo kosmetických ci farmaceutických prostredku. Resení se rovnez týká zpusobu prípravy nízkomolekulárního hyaluronanu.

Description

Enzym hyaluronan-lyáza, způsob jeho výroby, použití a způsob přípravy nízkomolekulárního hyaluronanu

Oblast techniky

Vynález se týká enzymu, případně enzymového preparátu schopného degradovat kyselinu hyaluronovou (hyaluronan). Rovněž je popsán způsob výroby enzymu kultivací houby patřící do rodu Fistulina, jeho využití a způsob přípravy nízkomolekulárního hyaluronanu.

Dosavadní stav techniky

Kyselina hyaluronová je lineární polysacharid tvořený disacharidovými jednotkami složenými z kyseliny glukuronové a N-acetylglukosaminu. Touto strukturou se řadí mezi glykosaminoglykany. Vyskytuje se v extracelulární matrix měkkých pojivových tkání, kde vykazuje stabilizační a hydratační funkci. V současnosti se kyselina hyaluronová nejčastěji získává biotechnologickou cestou.

Hyaluronidázy jsou enzymy, které jsou schopné štěpit kyselinu hyaluronovou nebo její soli na nižší fragmenty. Pojem hyaluronidáza je nadřazený pojmům označujícím jednotlivé skupiny enzymů s degradační aktivitou vůči hyaluronanu. Dle mechanismu účinku na polysacharid lze hyaluronidázy rozdělit na několik typů. Do první skupiny řadíme savčí enzymy (EC 3.2.1.35), které štěpí β-1-4 vazbu kyseliny hyaluronové za vzniku tetrasacharidů. Mechanismus štěpení těmito enzymy je hydrolytický. Druhá skupina je tvořena hyaluronát-3-glykanohydrolázami pijavic (EC 3.2.1.36), které tvoří tetra a hexasacharidy. I v tomto případě je kyselina hyaluronová degradována hydrolyticky. Třetí skupinou jsou bakteriální hyaluronidázy (EC 4.2.2.1). Tyto enzymy jsou nazývány hyaluronan-lyázy a degradují kyselinu hyaluronovou mechanismem β-eliminace za vzniku dvojné vazby mezi C4 a C5 kyseliny glukuronové. Tento typ štěpení byl dosud popsán pouze u bakterií. Tato přihláška vynálezu popisuje hyaluronan-lyázu z nového (nebakteriálního) zdroje.

Níže uvedené patentové spisy pojednávají o bakteriálních hyaluronan lyázách. Ve všech případech je chráněna výroba enzymů fermentační cestou. Vždy se jedná o bakterie z rodů Streptococcus nebo Streptomyces. Veškeré hyaluronidázy jsou produkovány extracelulárně. Aplikace jsou vesměs popisovány jako přímé medicínské, kosmetické nebo farmaceutické využití enzymů v určitých kompozicích. Nejčastěji se jedná o pomocnou látku pro průnik léčiva do pokožky při topické * S % $

2. · C ·* í < « · * ·: » ' -í * · < < 4 · aplikaci. Oproti hyaluronidázám s hydrolytickým mechanismem štěpení jsou lyázy často velice specifické vůči kyselině hyaluronové.

CH 628088 se zabývá přípravou několika produktů produkovaných streptokoky. Jedním z těchto produktů je i hyaluronan lyáza.

JP 63044883 pojednává o hyaluronan-lyáze SD-678 produkované druhem Streptococcus dysgalactiae. Enzym má optimum aktivity v rozmezí pH 5,8-6,6 při teplotě 37 °C. lonty, které inhibují hyaluronidázovou aktivitu, jsou např Fe²⁺ nebo Cu²⁺.

JP 62104579 popisuje hyaluronan-lyázu produkovanou skupinou C rodu Streptococcus, mezi něž patří i Streptococcus dysgalactiae. Molekulová hmotnost enzymu je 80 kDa. Tento enzym je vysoce specifický vůči kyselině hyaluronové. Optimum aktivity bylo pozorováno při pH 6-7 a teplotě 35-45 °C. Rovněž je prokázaná stabilita při 40 °C při pH 6,0 po dobu 15 min.

US 3728223 popisuje produkci hyaluronan-lyázy druhem Streptomyces hyalurolyticus. Tento enzym je schopen selektivně štěpit kyselinu hyaluronovou. Optimální pH je 5,0 a optimální teplota 60 °C. Aktivita je však zachována i po záhřevu na 70 °C.

US 6902548 se zabývá využitím hyaluronan-lyázy produkované druhem Streptomyces hyalurolyticus v očním lékařství. Po purifikaci již enzymový preparát neobsahuje proteázy, které byly pro takovou aplikaci dosud překážkou.

US 4258134 se týká hyaluronan-lyázy BMP-8231. Tento enzym je produkován Streptomyces koganiensis. Je specifický vůči kyselině hyaluronové. Optimální pH je 4,0, avšak stabilita byla pozorována v rozmezí pH 4,0-11,3. Optimální teplota pro štěpení je 60 °C. Rovněž je enzym stabilní vůči proteázám.

WO 2010/130810 popisuje hyaluronidázu produkovanou druhem Streptomyces koganiensis ATCC 31394. Molekulová hmotnost je 21,6 kDa. Isoelektrický bod je v rozmezí 4,4-4,8. Aktivita enzymu je 40000 I.U./mg nebo vyšší. Vynález kromě procesu izolace a purifikace popisuje i využití enzymu pro přípravu farmaceutických kompozic nebo analytických činidel.

US 6719986 patentuje přípravek obsahující hyaluronan lyázu napomáhající penetraci léčiv do kůže. Produkce lyázy zde není blíže popsána. Je zmíněn pouze produkční a * 8 » « 9«

Λ . Λ 8 »«-*»·»>

’ Ο ’ 1 * * »>

. i Μ S »druh Streptococcus agalactiae. Molekulová hmotnost enzymu je 116 kDa a isoelektrický bod 8,6.

US 2010/0172892 popisuje hyaluronan-lyázu produkovanou Streptomyces actinocidus77. Je zde detailně popsána struktura enzymu, která je chráněna patentovými nároky. Je patentováno použití enzymu pro přípravu kompozic využitelných v kosmetice, medicíně nebo farmacii, přednostně s topickou aplikací. Optimální podmínky štěpení jsou: pH 6,5 - 7,0 a teplota 50;60 °C. Enzym má isoelektrický bod při pH 4,4 a molekulovou hmotnost 44 kDa. Má nízkou nebo žádnou aktivitu vůči chondroitin sulfátu nebo heparinu. Aktivita enzymu je inhibována ionty železa a mědi. Shodný enzym popisuje i WO 2009/037566.

Příprava nízkomolekulárního hyaluronanu pomocí lyáz bakterií (Streptomyces hyalurolyticus) je zmíněna v patentu US 6613897. Jedná se však pouze o přípravu oligosacharidů před jejich následnou chemickou modifikací.

Žádná odborná literatura ani patent dosud nepopisuje hyaluronidázy s eliminačním (lyázovým) mechanismem štěpení produkované jinými organismy než bakteriemi.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nové hyaluronidázy produkované houbami, která má lyázový (eliminační) mechanismus štěpení. Tento enzym může být produkován houbami rodu Fistulina, obzvláště Fistulina hepatica.

Předložený vynález se dále týká způsobu získávání enzymu a jeho možného využití. Způsob kultivace hub a izolace enzymu není striktně daný, zásadním parametrem je zdroj enzymu, tj. houby rodu Fistulina, který vede k hyaluronan-lyáze. Jedním z možných způsobů produkce enzymu je například submersní kultivace hub. Kultivace optimálně probíhá při 20 až 30 °C podobu 5 až 11 dní. Je možné ji provádět jak v třepaných Erlenmeyerových baňkách, tak i ve fermentoru. Kultivační médium obsahuje zdroj uhlíku, například sacharózu, dále zdroj dusíku, například kvasničný autolyzát, a anorganické soli, například Na₂HPO₄.12 H₂O a MgSO₄.7H₂O. Enzym se může izolovat z kultivačního média po odstranění mycelia a/nebo extrakcí z mycelia po jeho desintegraci. Po centrifugaci je enzym dále čištěn v oboru známými metodami, například promytím pufrem o pH 7,0. Před chromatografickou separací je roztok obsahující enzym zaměněn za vhodný pufr, potřebný pro její optimální průběh. Jako nejvhodnější se jevila separace na anexových sorbentech. Lze však použít i jiné typy chromatografie. V případě vyššího požadavku na čistotu preparátu lze využít gelovou permeační chromatografií.

Lyáza produkovaná houbami se vyznačuje aktivitou v širokém rozmezí pH (3,5-8,0), s optimem při pH 4,0, a v širokém rozmezí teplot (5 až 50 °C), s optimem při teplotě 20 °C. Enzym je za podmínek štěpení stabilní až několik týdnů. Aktivitu enzymu lze zvýšit o 10-30 % přídavkem MgSO₄, MnCI₂, KOI nebo CuSO₄, a to v množství 5 mM až 20 mM vzhledem k roztoku kyseliny. U jiných enzymů (JP 63044883, WO 2009/037566) je Cu²⁺ často inhibitorem.

Produkce hyaluronan-lyázy z Fistulina hepatica je výhodná, protože se jedná o dřevokaznou houbu, tzv. brown rot fungi. Tato houba neprodukuje žádné toxické metabolity ani endotoxiny, jako tomu může být u bakterií.

Enzym lze využít pro přípravu nízkomolekulárního hyaluronanu nebo jeho derivátů. Molekulovou hmotnost výsledných produktů je možné ovlivnit podmínkami degradace jako je čas, teplota, koncentrace kyseliny hyaluronové v roztoku nebo poměr enzymu a kyseliny. Štěpení probíhá ve vodném roztoku v rozmezí pH 3,5 až 8,0 a teplotě 5 až 50 °C po dobu 1 minuty až 30 dní. Optimálně probíhá štěpení ph pH 4,0 a teplotě 20 °C po dobu 24 až 168 h. Použitá kyselina hyaluronová může pocházet z různých zdrojů (kohoutí hřebínky, Streptococcus zooepidermicus, Streptococcus equismilis) a mít libovolnou molekulovou hmotnost, například v rozmezí 1,5 až 2,2 MDa, nicméně pojmem vysokomolekulární HA je míněna HA, která má hmotnostně střední molekulovou hmotnost 0,8 MDa nebo vyšší. Roztok kyseliny může být připraven v koncentraci od 0,1 do 10 %hmotn. Kromě nativní kyseliny hyaluronové lze rovněž použít její soli, např. Na nebo K, nebo deriváty, např. acylderiváty, a připravit tak funkčně specifické oligosacharidy nebo jiné nízkomolekulární produkty.

Dále lze připravený enzym použít i pro přípravu farmaceutických nebo kosmetických kompozic jakožto látku napomáhající penetraci látek do tkání.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje mechanismus štěpení kyseliny hyaluronové hyaluronan-lyázou podle vynálezu.

Obr. 2 znázorňuje chromatogramy oligosacharidů vzniklých štěpením kyseliny hyaluronové. Detekce při 210 a 232 nm.

i * s « « a

Obr. 3 znázorňuje závislost relativní aktivity enzymu na pH, přičemž relativní aktivita enzymu je poměr aktivity enzymu při daném pH k maximální aktivitě enzymu, tj. při optimálním pH 4,0, x 100 %.

Obr. 4 znázorňuje závislost relativní aktivity enzymu na teplotě, přičemž relativní aktivita enzymu je poměr aktivity enzymu při dané teplotě k maximální aktivitě enzymu, tj. při optimální teplotě 20 °C, x 100 %.

Obr. 5 znázorňuje zvýšení aktivity enzymu po přídavku solí, kde je vynesena závislost relativní aktivity enzymu na přídavku konkrétní soli v konkrétním množství, přičemž relativní aktivita je poměr aktivity enzymu s přídavkem soli k aktivitě enzymu bez přídavku soli, x 100 %.

Příklady provedení vynálezu

Vynález objasňují, avšak neomezují, následující příklady praktického provedení.

Je-li v popise uvedena molekulová hmotnost (Mr), například hyaluronanu, je míněna hmotnostně střední molekulová hmotnost. Výraz „vysokomolekulární“ hyaluronan zahrnuje hyaluronan o Mr vyšší než 0,8 MDa. Výraz „nízkomolekulámí“ hyaluronan zahrnuje hyaluronan o Mr v rozsahu přibližně 0,3 až 500 kDa. Výraz „hyaluronan“ zahrnuje jak kyselinu hyaluronovou, tak i její soli (např. Na nebo K).

Příklad 1

Kultivace hub (Fistulina hepatica) za účelem výroby enzymu nebo enzymového preparátu probíhala v tekutém médiu o složení 35 g/l sacharózy, 3 g/l kvasničného autolyzátu, 2,5 g/l Na2HPO₄ · I2H2O a 0,5 g/l MgSO₄ · 7H₂O, přičemž uváděná množství složek se vztahují na 1 I média. Kultivace byla prováděna při 25 °C po dobu 6 dní. Byly použity Erlenmeyerovy baňky o objemu 1 I, které obsahovaly 500 ml kultivačního média. Pro inokulaci baněk byla použita vždy 1 kulturou porostlá Petriho miska o průměru 9 cm na 1 I kultivačního média. Baňky byly buď přímo použity pro izolaci enzymu, nebo pro zaočkování fermentoru.

Po kultivaci bylo z média odstraněno mycelium, např. pomocí centrifugace nebo filtrace přes polyamidovou plachetku. Enzym lze získat i z mycelia, avšak v podstatně menším množství, a proto je dále popisováno získávání enzymu z kultivačního média. V případě získávání enzymu z mycelia se provede desintegrace mycelia, t a 4 * j

-,ι » 9 * -i ř * » * Q » í « » v s · · 4 · a ' s například prudkým zmražením a třením v třecí misce, pomocí ultrazvuku nebo jinými metodami.

Pro účely purifikace bylo kultivační médium vyměněno za pufr o pH 7,0, a to tak, že se médium nejprve odfiltrovalo za pomocí membrány a vzorek se pak alespoň jednou promyl pufrem (2 I), například fosfátovým. Enzym lze dále ihned použít pro další purifikaci chromatografickou separací. Není-li enzym dále purifikován, je zde nazýván „enzymový preparát“. Pro štěpení kyseliny hyaluronové lze využít i takto připravený hrubý enzymový preparát.

Příklad 2

Pro dosažení vyšší čistoty byl enzymový preparát připravený způsobem podle Příkladu 1 dále separován pomocí chromatografických technik. S výhodou byla využita anion výměnná chromatografie. Eluce byla provedena lineárním gradientem NaCI v rozmezí Ofl mol/L Pro nejlepší čistotu byly frakce dále separovány pomocí gelové permeační chromatografie.

Množství vyprodukovaného enzymu po chromatografii se pohybovalo v rozmezí 600 ± 200 pg/ml, což činí přibližně 1 mg čistého enzymu na 1 I kultivačního média.

Příklad 3

Štěpení kyseliny hyaluronové bylo provedeno v 0,1M acetátovém pufru o pH 4,0. Pro tyto účely byl připraven 1% roztok vysokomolekulární kyseliny hyaluronové (2 MDa). Substrát byl připraven biotechnologicky. 4 ml roztoku vysokomolekulární kyseliny hyaluronové byly smíseny s 200 pl roztoku enzymu v 0,02 M fosfátovém pufru o pH 7,0 po chromatografii o koncentraci enzymu 600 pg/ml. Štěpení probíhalo při 20 °C 3 dny. Vzniklými produkty byly oligosacharidy hyaluronanu, převážně směs disacharidů až dodeka-sacharidů s dvojnou vazbou mezi C4 a C5 koncové kyseliny glukuronové. Střední molekulová hmotnost oligosacharidů stanovená gelovou permeační chromatografii se pohybovala v rozmezí 0,3 až 300 kDa a koncové kyseliny glukuronové měly dvojnou vazbu mezi C4 a C5.

Příklad 4

Vzniklé nízkomolekulární fragmenty kyseliny hyaluronové byly kvantifikovány pomocí RP-HPLC. Detekce byla provedena UV detektorem při 210 a 232 nm. Analýzou vzniklých produktů byl prokázán lyázový mechanismus štěpení. Je známo, že

I 4 ’ * » ,ϊ •r 4 - 4.i

7» f * · i ·ί« « · < * 3«

- ί ί · - * i Λ« « ( vznikající nenasycené vazby vykazují zvýšenou absorbanci při 232 nm. Dále bylo potvrzeno, že veškerá kyselina, která byla do reakční směsi dodána, byla rozštěpena na oligosacharidy.

Příklad 5

Štěpení derivátu kyseliny hyaluronové bylo provedeno v 0,1M acetátovém pufru o pH 4,0. Pro tyto účely byl připraven 1% roztok palmitoylhyaluronanu (2 MDa). 4 ml tohoto roztoku byly smíseny s 200 pl roztoku enzymu v 0,02 M fosfátovém pufru o pH 7,0 po chromatografii o koncentraci enzymu 600 pg/ml. Substrát byl připraven chemickou syntézou z biotechnologicky vyrobené kyseliny hyaluronové. Štěpení probíhalo při 20 °C 3 dny. Vzniklými produkty byly acylované oligosacharidy hyaluronanu, konkrétně směs disacharidů až dodeka-sacharidů s dvojnou vazbou mezi C4 a C5 koncové kyseliny glukuronové. Střední molekulová hmotnost oligosacharidů stanovená gelovou permeační chromatografii se opět pohybovala v rozmezí 0,3 až 300 kDa a koncové kyseliny glukuronové měly dvojnou vazbu mezi C4 a C5.

Příklad 6

Aktivita enzymu v závislosti na teplotě, na pH a přidaných solích byla sledována pomocí reometru. Byl sledován pokles viskozity reakční směsi v čase. Pro veškeré pokusy byl připraven 1% roztok HA v příslušném pufru (pH), k němuž byl pipetován roztok enzymu po chromatografické separaci (0,02M fosfátový pufr, 600 μg/ml enzymu). Objem roztoku kyseliny hyaluronové byl 460 μΙ a objem enzymu 40 μΙ. V případě testování závislosti aktivity enzymu na teplotě a stanovení optimální teploty štěpení byl použit pufr o pH 4,0. Závislost aktivity enzymu na pH byla testována při teplotě 37 °C. Testování vlivu solí bylo provedeno přídavkem příslušné soli do roztoku kyseliny hyaluronové. Zjištěné výsledky byly vyneseny do grafů - viz Obr. 3, Obr. 4. a Obr. 5. Z grafů je zřejmé, že optimální teplota pro štěpení je přibližně 20 °C, optimální pH je přibližně 4,0.

Příklad 7

Štěpení kyseliny hyaluronové bylo provedeno v 0,1M acetátovém pufru o pH 4,0, do kterého byla přidána jedna ze solí do koncentrace až 20 mM. Solemi byly MgSO4, MnCh, KOI, CuSO₄. Pro štěpení byl připraven 1% roztok vysokomolekulární kyseliny hyaluronové v takto modifikovaném pufru. Substrát byl připraven biotechnologicky.

ml roztoku vysokomolekulární kyseliny hyaluronové byly smíseny s 200 μΙ roztoku enzymu v 0,02 M fosfátovém pufru o pH 7,0 po chromatografii o koncentraci enzymu 600 pg/ml. Štěpení probíhalo při 20 °C 3 dny. Vzniklými produkty byly oligosacharidy hyaluronanu, převážně směs disacharidů až dodekasacharidů s dvojnou vazbou mezi C4 a C5 koncové kyseliny glukuronové. Střední molekulová hmotnost oligosacharidů stanovená gelovou permeační chromatografii se pohybovala v rozmezí 0,3 až 300 kDa a koncové kyseliny glukuronové měly dvojnou vazbu mezi C4 a C5.

Claims

Patentové nároky

1. Způsob přípravy hyaluronan-lyázy, vyznačující se tím, že se získá submersní kultivací houby patřící do rodu Fistulina při teplotě 20 až 30 °C po dobu 5 až 11 dní.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že houba patřící do rodu Fistulina je druhu Fistulina hepatica.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahuje zdroj uhlíku, zdroj dusíku a anorganické soli.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že zdrojem uhlíku je sacharóza, zdrojem dusíku je kvasničný autolyzát a anorganické soli jsou Na₂HPO₄.12 H₂O a MgSO₄.7H₂O.
5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se enzym izoluje z kultivačního média po odstranění mycelia a/nebo extrakcí z mycelia po desintegraci mycelia.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se enzym dále alespoň jednou promyje pufrem o pH 7,0.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se enzym dále purifikuje pomocí chromatografické separace.
8. Hyaluronan-lyáza připravitelná způsobem podle nároku 1 submerzní kultivací houby patřící do rodu Fistulina v kultivačním roztoku.
9. Hyaluronan-lyáza podle nároku 8, vyznačující se- tím, že houbou rodu Fistulina je Fistulina hepatica.
10. Hyaluronan-lyáza podle nároku 8 nebo 9, vyznačující setím, že má optimální aktivitu při pH 4,0 a teplotě 20 °C.
11. Použití enzymu hyaluronan-lyázy připravené způsobem podle nároku 1 kultivací houby patřící do rodu Fistulina pro štěpení hyaluronanu nebo jeho derivátu.

-10 ·
12. Použití enzymu hyaluronan-lyázy připravené způsobem podle nároku 1 kultivací houby patřící do rodu Fistulina pro přípravu farmaceutických nebo kosmetických kompozic jako látka napomáhající penetraci látek do tkání.
13. Způsob přípravy nízkomolekulárního hyaluronanu, vyznačující se tím, že se připraví 0,1 až 10%hmotn. vodný roztok vysokomolekulární kyseliny hyaluronové, její soli nebo jejího derivátu o pH v rozmezí 3,5 až 8,0, přidá se vodný roztok enzymu hyaluronan-lyázy připravené způsobem podle nároku 1 kultivací houby patřící do rodu Fistulina, a nechá se probíhat reakce při teplotě 5 až 50 °C po dobu 1 minuty až 30 dní.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se reakce nechá probíhat při pH 4,0 a teplotě 20 °C po dobu 24 až 168 h.
15. Způsob podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se tím, že vysokomolekulární kyselina hyaluronová, její sůl nebo její derivát má molekulovou hmotnost v rozmezí 1,5 až 2,2 MDa.
16. Způsob podle kteréhokoli z nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že solí kyseliny hyaluronové je sodná nebo draselná sůl a derivátem hyaluronanu je acylovaný hyaluronan.
17. Způsob podle kteréhokoli z nároků 13 až 16, vyznačující se tím, že se do 0,1 až 10%hmotn. roztoku vysokomolekulární kyseliny hyaluronové, její soli nebo derivátu, a enzymu hyaluronan-lyázy přidá 5 až 20 mM soli vybrané ze skupiny zahrnující MgSO₄, MnCI₂, KCI, CuSO₄.