CZ2009399A3 - Zpusob prípravy esteru hyaluronanu - Google Patents

Abstract

Rešení se týká zpusobu prípravy esteru hyaluronanu, kde hyaluronan nesoucí skupinu COOH nebo COO.sup.-.n.Na.sup.+.n.se rozpustí ve vode, roztok se ochladí na laboratorní teplotu a pridá se s vodou mísitelné organické rozpouštedlo. Následne se pridá esterifikacní cinidlo R-X nebo X-Z-X, kde R a Z jsou alifatický, cykloalifatický, olefinický, arylalifatický ci heterocyklický zbytek s poctem uhlíku 1 až 18, volitelne s obsahem hydroxy skupiny a/nebo disulfidického mustku, a X je Cl, Br nebo l. Výsledná reakcní smes se míchá po dobu 1 hod až 6 dní, pricemž pH reakcní smesi se udržuje na hodnote 6 až 10, kde pH reakcní smesi muže být udržováno na hodnote 7 postupným pridáváním báze Na.sup.+.n.Y.sup.n-.n.(n=1, 2, 3), kde Y.sup.n-.n.je vybrán ze skupiny zahrnující OH.sup.-.n., HCO.sub.3.n..sup.-.n., CO.sub.3.n..sup.2-.n., PO.sub.4.n..sup.3-.n., HPO.sub.4.n..sup.2-.n., H.sub.2.n.PO.sub.4.n..sup.-.n., F.sup.-.n..

Description

Způsob přípravy esterů hyaluronanu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy derivátů hyaluronanu, s využitím v biomedicíně, založeného na esterifikaci karboxylových skupin COOH nebo COO' Na⁺ hyaluronanu halogensloučeninami s alifatickým nebo arylalifatickým zbytkem ve vodně-organickém prostředí, s možným použitím anorganické báze.

Dosavadní stav techniky

Kyselina hyaluronová je polysacharid, který se skládá z disacharidických jednotek složených z D-glukuronové kyseliny a D-/V-acetylglukosaminu vázaných alternujícími β-1,4 a β-1,3 glykosidickými vazbami. Molekulová hmotnost in vivo bývá v rozsahu 3 kDa až 20 MDa, biopolymer v synoviální tekutině má molekulovou hmotnost 3 až 4 MDa.

Funkčními skupinami pro chemickou modifikaci hyaluronanu jsou karboxylová skupina, hydroxylová skupina (primární nebo sekundární) a W-acetylamidová skupina.

Existuje řada postupů jak chemicky polysacharidy modifikovat, řada z nich modifíkační reakci provádí právě na karboxylové skupině a využívá ktomu halogenované sloučeniny.

Příprava esterů hyaluronové kyseliny, kde všechny, nebo jen část karboxylových skupin kyseliny, jsou esterifikovány a část karboxylů je ve formě soli s kovy nebo farmakologicky akceptovatelnou organickou bází, je popsána v patentu della Valle et al. (EP0216453; 1986), v patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986) a v patentu della Valle et al. (US4965353; 1989). Postup přípravy esterů hyaluronanu je založen na reakci tetrabutylamonné soli hyaluronanu s alkylhalogenidy, a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu.

Della Valle et al. popsal přípravu síťovaných esterů hyaluronanu (US patent 4957744; 1987). Postup je založen na reakci tetrabutylamonné soli hyaluronanu s dihalogenalkany, a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu.

Jiný způsob zesíťováni / auto-zesíťování kyselých polysacharidů je popsán u della Valle et al. (US patent 5676964; 1995) a je založen na tvorbě esteru mezi karboxylovou skupinou polysacharidů a hydroxy- skupinou téže nebo jiné molekuly • · polysacharidů. Karboxylové skupina tetrabutylamonné soli polysacharidů je aktivována 2-chloro-1-methylpyridinium jodidem. Reakce probíhá s přídavkem terciárního aminu (triethylaminu), a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu. Postup je aplikován na kyselinu hyaluronovou, kyselinu alginovou, karboxymethylcelulózu a ka rboxymethylch itin.

Della Valle et al. (US patent 5336767; 1992) popisuje estery hyaluronové kyseliny, částečně nebo plně esterifikované na karboxylové skupině alifatickými nebo jednoduchými cykloalifatickými zbytky bez farmakologické aktivity, dále alkoholy s farmakologickou aktivitou (steroidními alkoholy s protizánětlivým účinkem, na které je patent cílen - např. kortison), a jejich kombinacemi. Použitý způsob esterifikace je aplikovatelný obecně na kyselé polysacharidy s karboxylovou skupinou. Kvarterní amoniová sůl kyselého polysacharidů reaguje s esterifikačním činidlem (alkylhalogenidem) v aprotickém organickém rozpouštědle. Variací je rovněž reakce sodné nebo draselné soli kyseliny hyaluronové, suspendované v aprotickém rozpouštědle, salkylačním činidlem v přítomnosti katalytického množství kvarterní amoniové soli (tetrabutylamonium jodid).

Další patent téhož autora (US patent 5202431; 1991) je cílen na estery hyaluronové kyseliny, částečně esterifikované na karboxylové skupině alifatickým, arylalifatickým, cykloalifatickým nebo heterocyklickým zbytkem, které mají část karboxylů ve formě soli s terapeuticky aktivním aminem (např. antibiotika, peptidy, alkaloidy, vitaminy). Sodná sůl esteru kyseliny hyaluronové je převedena na kyselou formu pomoci katexu v H⁺ cyklu, smíchána s bází terapeuticky aktivního aminu (získá se převedením soli terapeuticky aktivního aminu na bázi pomocí anexu v OH' cyklu), kde vzniklá sůl je zamražena a lyofilizována.

Angele et al. (US patent 6737072; 1999) připravili pórovitou kompozitní matrici pro tkáňové inženýrství složenou z esteru kyseliny hyaluronové (ethyl nebo benzyl ester) a hydrolyzovaného kolagenu (želatiny). Jako rozpouštědlo použili HFP (hexafluorisopropanol).

Bellini et al. (US patent 6632802 / US patent 2002026039; 2001 / 2001) popisuje přípravu biokompatibilních vláken pro chirurgii z esterů kyseliny hyaluronové, kde jedna část karboxylových skupin hyaluronanu je esterifikována arylalifatickým zbytkem (benzyl-; stupeň substituce 75 %) a druhá část karboxylů hyaluronanu je esterifikována dlouhými alkyly C10-C22 (25 %): dokosyl- (C22), eikosyl- (C₂₀), oktadecyl-, hexadecyl-, dodecyl- a decyl-. Nejprve je tetrabutylamonná sůl hyaluronanu esterifikována benzylbromidem a poté probíhá esterifikace příslušným alkylhalogenidem, a to v prostředí čistého dimethylsulfoxidu.

Abatangelo et al. (US patent 6596274; 1996) vyvinuli biologický materiál pro náhrady pojivových tkání, který obsahuje kmenové buňky kostní dřené částečně nebo kompletně diferencované v buňky pojivových tkání ze skupiny: fibroblasty, osteoblasty, myoblasty, adipocyty, chondrocyty a endotheliální buňky; extracelulární matrix spolu s buňkami nebo pouze tuto matrix. Dále tento materiál obsahuje matrici z esteru kyseliny hyaluronové (benzylester se stupněm esterifikace 75 % nebo 100 %), kde příprava esteru vychází z patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986).

Dorigatti et al. (US patent 5879359; 1997) popisuje biodegradabilní „vodící kanálky“ (guide channels) pro regeneraci nervové tkáně, které se skládají z propletených vláken zapuštěných v matrici. Vlákna i matrice se skládá z esteru kyseliny hyaluronové, jehož příprava vychází z patentu della Valle et al. (EP0216453; 1986) a patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986).

Dorigatti et al. (US patent 5658582; 1994) poskytl mnohavrstvý netkaný materiál, jehož svrchní vrstva přichází do kontaktu s kůží a obsahuje ester kyseliny hyaluronové, jehož příprava vychází z patentu della Valle et al. (US patent 4851521; 1986). Tento materiál má využití jako neadhezivní krytí a v chirurgii.

V patentu Mariotti et al. (WO02/098923; 2002) jde o přípravu derivátů hyaluronanu s esterifikovanými nebo karbamoylovanými hydroxy skupinami a esterifikovanými karboxy skupinami, použitelných jako chirální stacionární fáze pro separaci enantiomerů. Esterifikace karboxylové skupiny hyaluronanu probíhá reakcí tetrabutylamonné soli hyaluronanu s alkylhalogenidem, a to v prostředí čistého N,N-dimethylformamidu.

Pomocí halogenovaných sloučenin lze modifikovat i nízkomolekulární látky. Patentově chráněný je postup esterifikace hydroxybenzoových kyselin (salicylové a p-hydroxybenzoové kyseliny), založený na reakci s halogensloučeninou v homogenní kapalné fázi v přítomnosti nekvaternizovatelného (stericky bráněného) terciárního

-4toto to toto ·· ·· *· • · ··« · tov * • toto · to to to to · ·· to • ·*·« to to toto · « to ···· • · to to to to to toto to · · « · · ·· ·· · · aminu (např. Λ/,/V-diisopropylethylamin), který slouží zároveň jako rozpouštědlo (Desmurs et al., 1991, EP0467727).

Esterifikace solí mono- nebo polykarboxylových kyselin reakcí s halogensloučeninami ve vodě s použitím katalyzátoru fázového přenosu (např. tetrabutylamonium bromid nebo tributylbenzylamonium chlorid) je chráněna patentem (Crochemore, 1992, EP0534817).

Všechny dosud patentované postupy esterifikace karboxylu hyaluronanu vyžadují přípravu soli hyaluronanu s organickou bází, což je krok navíc. V námi navrhovaném postupu se vychází z hyaluronanu (sodné soli) a reakce probíhá ve vodně-organickém prostředí na rozdíl od jiných postupů, které jsou prováděny v organickém rozpouštědle bez přídavku vody. Zároveň je v navrhovaném postupu používána anorganická báze. Vedlejšími produkty v našem postupu jsou anorganické soli (NaCI, NaBr), v jiných postupech je to sůl organické báze, tudíž je náš postup mnohem výhodnější, protože čištění produktu od těchto vedlejších látek je snazší. Navíc anorganické soli jsou jako stopové nečistoty v produktu mnohem méně škodlivé než organické soli. Náš předkládaný postup je mnohem výhodnější i proto, že jako reakční prostředí používá vodu (resp. směs vody a organického rozpouštědla mísitelného s vodou), která snižuje nutnost použití organických rozpouštědel až o 50 %, a proto je tedy navrhovaný postup také mnohem ekologičtější.

Rozdíly mezi námi navrhovaným postupem a patentovanými postupy esterifikace karboxylu hyaluronanu shrnuje Tab. 1.

Tab. 1. Srovnání navrhovaného postupu s patentovanými postupy esterifikace karboxylu hyaluronanu.

Vlastnost postupu	Postup podle vynálezu	Patentované postupy
Forma hyaluronanu	Hyaluronan (sodná sůl)	Tetraalkylamonná sůl HA, pyridiniová sůl HA
Rozpouštědlo	Směs vody a organického rozpouštědla	Cistě organické prostředí
Použití anorganické báze	ANO	NE
Reakční systém	Homogenní i heterogenní	Homogenní
Vedlejší produkty	NaCi, NaBr (anorganická sůl)	Sůl organické báze
Ekologie	Vodně-organické prostředí snížení použití organických rozpouštědel až o 50 %	Vysoká zátěž

-5 • · ♦ ·· ·♦ ·· ·· * · · · · φ · · ··

Φ · · Φ Φ ΦΦΦ 9ΦΦ ·

ΦΦ·· · · Φ· « φ · ··«· • Φ ··»·· ···· · ·· ΦΦ ♦···

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je esterifikace karboxylové skupiny COOH nebo COO Na⁺ hyaluronanu, pomocí halogenované sloučeniny, tj. esterifikačního činidla R-X nebo X-Z-X, kde R a Z jsou alifatický, cykloalifatický, olefinický, arylalifatický či heterocyklický zbytek s počtem uhlíků 1 až 18, volitelně s obsahem hydroxy skupiny a/nebo disulfidického můstku, a X je Cl, Br nebo I, v prostředí voda-organické rozpouštědlo, kde výsledná reakční směs se míchá po dobu 1 hod až 6 dní, přičemž pH reakční směsi se udržuje na hodnotě 7.

Hyaluronan sodný je normálně v DMSO (dimethylsulfoxid) nerozpustný a v DMSO obsahujícím 10 % vody tvoří suspenzi. Na základě vlastního výzkumu jsme zjistili, že pokud je hyaluronan nejprve rozpuštěn ve vodě ve vysoké koncentraci (zpravidla 10 %, v závislosti na molekulové hmotnosti polysacharidů a tím i viskozítě vzniklého roztoku), a poté je k vodnému roztoku postupně přidáváno organické rozpouštědlo (DMSO), je takto ihned získán homogenní roztok polymeru (i v 90% DMSO s vodou).

Zjistili jsme, že pomocí halogenalkanů lze hyaluronan, který obsahuje karboxylovou skupinu, resp. její sodnou sůl, vhodně chemicky modifikovat. Základní reakce je znázorněna níže:

hyaluronan—COOH + Na⁺Yⁿ’-----hyaluronan—COO'Na⁺ + H*Yⁿ' hyaluronan—COONa⁺ + R—X -----► hyaluronan—C—OR + Na⁺X

O kde X = Cl, Br, I; Yⁿ' = OH; HCO3; CO3²; PO4³; HPO4²’, H2PO₄; F'; n=1

Esterifikace probíhá reakcí karboxylové funkční skupiny hyaluronanu s halogensloučeninou.

Zbytek R je alifatického, cykloalifatického, olefinického, arylalifatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků C1-C18, který může nést hydroxylovou skupinu nebo obsahovat disulfidický můstek.

Organické rozpouštědlo mísitelné s vodou může být dimethylsulfoxid, /V,A/-dimethylformamid, Λ/,/V-dimethylacetamid nebo A/-methylpyrrolidon.

(I) (II) ,2, 3.

-6• · ··«« ·· • · · · · ·· ·· · · ··

Dále jsme zjistili, že jako esterifikační činidlo lze použít i sloučeninu mající dva reaktivní halogeny, kde reakce je následující:

hyaluronan COONa + X Z X hyaluronan C O Z X 4- NaX* (|||)

O

Zbytek Z je alifatického, cykloalifatického, olefinického, arylalifatického či heterocyklického charakteru s počtem uhlíků C1-C18, který může nést hydroxylovou skupinu nebo obsahovat disulfidický můstek.

Reakce se opět provádí ve směsi vody a vhodného organického rozpouštědla mísitelného s vodou (např. dimethylsulfoxid, A/,/V-dimethylformamid).

Vyznačený postup esterifikace hyaluronanu je následující: připraví se výchozí reakční směs, přičemž hyaluronan nesoucí COOH skupinu nebo její sodnou sůl COO’Na⁺ se nejprve rozpustí při teplotě 5 až 80 °C ve vodě a připraví se roztok o koncentraci 0,01 až 10 %hmotn., s výhodou co nejkoncentrovanější, s výhodou 1 až 10%hmotn., při laboratorní teplotě (tj. 20 až 25 °C). Posléze se k tomuto roztoku přidává s vodou mísitelné organické rozpouštědlo tak, aby vznikla heterogenní nebo s výhodou homogenní směs, kde výsledná koncentrace organického rozpouštědla je v rozmezí 10 až 95 %hmotn., s výhodou 90 %. K tomuto roztoku se přidá 0,2 až 3 molární ekvivalenty esterifikačního činidla R-X nebo X-Z-X, vzhledem k disacharidické jednotce hyaluronanu, a míchá se při teplotě 5 až 80 °C, s výhodou při 45 °C, po dobu 1 h až 6 dní, s výhodou 72 hod. Do reakční směsi lze přidávat i alkálii ΝθΎ' (n=1, 2, 3), kde Yⁿ‘ je vybrán ze skupiny zahrnující OH', HCO3*, CO3²·, PO₄ ³‘, ΗΡΟΛ, H2PO4·, F tak, aby došlo k neutralizaci COOH skupiny, případně kyselin vznikajících hydrolýzou činidla R-X nebo X-Z-X.

Pokud je reakce prováděna v heterogenním systému, je hyaluronan suspendován ve směsi vody s vhodným organickým rozpouštědlem (např. dimethylsulfoxid, A/,/V-dirnethylformamid).

Ve vodě, obzvláště pak za přítomnosti alkálie, může probíhat i vedlejší reakce, hydrolýza esterifikačního činidla R-X, resp. X-Z-X - viz reakce (IVa), (IVb), (IVc). Tato hydrolýza vede jednak ke vzniku kyseliny HX, která následně utváří zpět volnou karboxylovou kyselinu (hyaluronan-COOH, viz reakce (V)), a jednak ke vzniku alkoholu (R-OH, X-Z-OH, HO-Z-OH). Kyselinu HX, pokud je to nutné, lze snadno

			• · * ·
odstranit dalším dialýzou.	přídavkem alkálie (neutralizací) za	vzniku	soli,	která se odstraní
R x +	h2o	- R OH	+	HX	(IVa)
x z x +	h2o	- X Z OH	+	HX	(IVb)
X Z OH +	h2o	HO Z OH	+	HX	(IVc)
hyaluronarr-COO Na	+ HX	*- hyaluronarrCOOH +	NaX	(V)

Alkoholy je rovněž nezbytné oddělit od žádaného produktu, což je možné srážením a dialýzou.

Vzniklý ester hyaluronanu (žádaný produkt) je možné izolovat srážením nebo dialýzou s následnou lyofilizací. V případě srážení je vhodným rozpouštědlem ke srážení například 2-propanol, aceton nebotetrahydrofuran.

Vznik esteru je prokázán v IR spektru vibrací karbonylové skupiny v(C=O) -1740 cm’¹ a obsažený alkylový zbytek vibracemi v(CH2)as 2926 cm'¹ a v(CH2)_s 2853 cm'¹.

V ¹³C NMR spektru se vznik esteru projeví signálem nové karbonylové skupiny, která má chemický posun -171 ppm.

Pokud je karboxylová skupina esterifikována arylalifatickým zbytkem, jsou přítomny v ¹³C NMR spektru signály fenylu -130-140 ppm.

V ¹H NMR spektru se vznik alkyl esteru projeví signálem -4,2 ppm CH₂ skupiny v těsném sousedství esterové skupiny a dále signály dalších methylenových skupin (např. pro hexyl: 1.70, 1.55, 1.38 ppm). Z poměru integrálu signálu methylenových skupin k integrálu signálu methylu z A/-acetylglukosaminu hyaluronanu lze stanovit stupeň substituce (DS) polymeru alkylovým řetězcem.

Pokud je karboxylová skupina esterifikována arylalifatickým zbytkem, jsou přítomny v ¹H NMR spektru signály fenylu -7,3-7,5 ppm. Z poměru integrálu signálu fenylové skupiny k integrálu signálu methylu z N-acetylglukosaminu hyaluronanu lze stanovit stupeň substituce (DS) polymeru arylalkylovým řetězcem.

V» ·Φ ···· * · · ♦ · · ·· · · * · ♦ · ··· ·φ φ * »«· · φ φφ φφφ ····

-8- · *··»···· ···· φ φ· ·· φφ ··

Pokud je karboxylová skupina esterifikována aromatickým zbytkem, který absorbuje v UV-VIS oblasti, je možné prokázání substituce polymeru pomocí GPC analýzy s UV-VIS detekcí a stanovení procentuálního zastoupení jeho substituované a nesubstituované formy (resp. čistoty, zastoupení nízkomolekulárních UVabsorbujících činidel).

Vynález se dále týká esteru hyaluronanu připraveného způsobem podle vynálezu, které odpovídají obecnému vzorci A, B nebo C:

hyaluronan	c -0	R
	0		A
hyaluronan	C 0	Z X
	o		B
hyaluronan	C 0	Z 0 -C-hyaluronan
	ó	I 0	C
Kde R,	Z a X mají význam uvedený výše.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 1 v D₂O, kde 1 = signál fenylu, 2 = signály methylenové skupiny, 3 = signál vody.

Obr. 2 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 1, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.

Obr. 3 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 2 v DzO, kde 1 = signál fenylu, 2 = signály methylenové skupiny, 3 = signál vody.

Obr. 4 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 2, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.

Obr. 5 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 3 v D₂O, kde 1 = signál fenylu, 2 = signál methylenové skupiny, 3 = signál vody).

Obr. 6 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 3, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.

··

Obr. 7 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 4 v D₂O, kde 1 = signál fenylu, 2 = signál methylenové skupiny v sousedství fenylu, 3 = signál vody).

Obr. 8 znázorňuje GPC analýzu derivátu z příkladu 4, kde 1 je detektor rozptylu světla; 2 je refraktometrický detektor; 3 je UV detekce při 257 nm.

Obr. 9 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 5 v D₂O, kde 1 = signál methylu z -CH₂- CH₃, 2 = signál methylenu z -CH2- CH₃, 3 = signál vody, 4 = signál NMR standardu).

Obr. 10 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 6 v D₂O, kde 1a = signál středových methylenových skupin hexylu; 1b, 1c = signály methylenových skupin hexylu, 1d = signál methylenové skupiny vedle esterové vazby, 2 = signál vody, 3 = signál NMR standardu.

Obr. 11 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 7 v D₂O, kde 1 = signál methylenu, 2 = signál DMSO, 3 = signál vody, 4 = signál NMR standardu.

Obr. 12 znázorňuje naměřené DOSY NMR spektrum derivátu z příkladu 8 v D₂O, kde 1 = signál methylenu, 2 = signál DMF, 3 = signál vody, 4 = signál NMR standardu.

Obr. 13 znázorňuje naměřené H-H COSY NMR spektrum derivátu z příkladu 8 v D₂O, kde 1 = interakce methylenů -CH₂-CH₂-Br skupiny, 2 = interakce methylenů -CH₂-CH₂-OH skupiny, 3 = interakce vodíku v poloze 5 glukuronové části polymeru.

Obr. 14 znázorňuje naměřené HSQC NMR spektrum derivátu z příkladu 8 v D₂O, kde 1 = interakce vodíku s uhlíkem nesoucím Br v -CH₂-CH2-Br skupině.

Příklady provedeni vynálezu

Použitá zařízení

IR

FTIR 8400S spektrofotometer Shimadzu s hydraulickým lisem SSP-10A

NMR

300 MHz NMR spektrometr Bruker AVANCE ···

-10500 MHz NMR spektrometr Bruker AVANCE III

600 MHz NMR spektrometr Bruker AVANCE

GPC

HPLC (Agilent), rozptyl světla DAWN EOS (Wyatt), refraktometrický detektor Optilab rEX (Wyatt); separace: 2 za sebou zapojené kolony PL aquagel OH 30 (bez termostatu); mobilní fáze: 0.1 M NaH₂PO₄ . 2H₂O + 0.05 % NaN₃, pH=7,5; průtok mobilní fáze: 0,8 ml / min; dávkovaný objem vzorku: 100 μΙ.

Odstředivka

Centrifuga chlazená Jouan BR4i

Lyofilizátor

Lyofilizátor PowerDry PL3000

Dialýza

Dialyzační střeva Pierce, SnakeSkin Pleated Dialysis Tubing, 3500 MWCO, 22 mm x 35 feet dry diameter

Molekulová hmotnost výchozího hyaluronanu (zdroj: CPN s.r.o., Dolní Dobrouč, ČR) byla stanovena metodou SEC-MALLS.

Příklad 1

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované benzylchloridem

Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C v 10 ml vody a přidá se 40 ml DMSO (směs se zahřívá uvolněným směšovacím teplem). Směs je ochlazena na 23 °C a za míchání se přidá benzylchlorid (0,4315 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 4 dny při 45 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt vysrážen přídavkem 2-propanolu (100 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 50 min při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 10 ml vody, přidá se 10 ml roztoku 0,4 M NaHCO₃ ochlazeného na 4 °C a směs je míchána 5 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (4000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

• φ • · φ · φ φ · · · · · * . _Λ · ···· ·· · φ · ♦ · · ···

-11- · ·····*·· ♦ ··· 4 ·· «φ φφ ΦΦ

FT-IR v (KBr) cm·¹: 3419, 2921, 2896, 1733, 1652, 1616, 1558, 1411, 1377, 1321, 1236, 1207, 1153, 1080, 1045.

¹³C NMR (300 MHz, D₂O) δ: 177.81, 176.60, 171.30 (-C(=O)-O-); 137.84, 131.97 (fenyl); 106.04, 103.44, 85.49, 82.85, 78.25, 76.48, 75.35, 71.34, 63.43, 57.18, 25.37.

¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ: 7.5 (m, 5H, fenyl); 5.40, 5.36, 5.28, 5.24 (d, 2H, CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 1.

GPC-UV detekce: viz Obr. 2.

DS: 10 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace ¹H NMR a GPC-UV analýzy)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 1.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH₂- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.

Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 11,6 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě poměru integrálů signálů methylenové skupiny a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 11,5 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA benzylovým zbytkem od nízkomolekulámího nevázaného benzylového zbytku (Obr. 2., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika benzylu je patrné, že absorbuje i polymerní frakce, kterou je kyselina hylauronová a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.

Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného benzylu (81,9 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z ¹H NMR byl zjištěn DS=10 % benzylovým zbytkem.

* * »* .·· ·· · · « * 4 · * · · φ * * • * · · ♦ ·«* · ♦ · · **·· · · · · · ♦ · · ··· _ 19 _ · *······· ¹ ·«*« · ·« · ·· ·♦

Příklad 2

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované benzylchloridem v přítomnosti báze

Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C v 5 ml vody a přidá se 45 ml DMSO. Směs je ochlazena na 23 °C a za mícháni se přidá benzylchlorid (0,4315 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 4 dny při 45 °C. Během reakce je postupně přidáván 1 M NaHCO₃ tak, aby bylo pH=7 (celkem přidáno 2 ml 1 M NaHCO₃). Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt vysrážen přídavkem 2-propanolu (150 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána, přidá se 2-propanol (40 ml) a sraženina je znovu 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 1,5 h při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 50 ml DMSO, přidá se 40 ml vody ochlazené na 4°C a směs je míchána 10 min. Přidá se 10 ml roztoku 0,4 M NaHCO₃ ochlazeného na 4°C a směs je míchána 15 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

FT-IR v (KBr) cm’¹: 3415, 2921, 2893, 1745, 1646, 1614, 1556, 1498, 1407, 1377, 1315, 1215, 1153, 1080, 1045.

¹³C NMR (500 MHz, D₂O) δ: 177.86, 176.67, 171.34 (-C(=O)-O-); 137.89, 132.00, 131.93 (fenyl); 106.10, 103.38, 85.53, 82.88, 78.29, 76.52, 75.38, 75.00, 71.22, 71.00, 63.44, 57.22, 25.41.

¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ: 7.52, 7.51, 7.49, 7.47, 7.40, 7,38 (m, 5H, fenyl); 5.44, 5.41,5.40, 5.38, 5.31, 5.28, 5.26, 5.24 (m, 2H, CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 3.

GPC-UV detekce: viz Obr. 4.

DS: 24 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace ¹H NMR a GPC-UV analýzy)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 3.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difůzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH₂- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.

-13* ♦ ··

Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 34,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě poměru integrálů signálů methylenové skupiny a methylu z Nacetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 29,5 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA benzylovým zbytkem od nízkomolekulámího nevázaného benzylového zbytku (Obr. 4., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika benzylu je patrné, že absorbuje i polymemí frakce, kterou je kyselina hylauronová a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.

Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného benzylu (70,5 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z ¹H NMR byl zjištěn DS=24 % benzylovým zbytkem.

Příklad 3

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované benzylbromidem

Hyaluronan sodný (Mr - 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozmíchá při teplotě 23 °C ve 2 ml DMSO a do vzniklé suspenze se přidá 0,2 ml vody. Za stálého míchání se přidá benzylbromid (0,2973 ml; 2,50 mmol). Směs se míchá 43 h při 45 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, naředěna 7,5 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (20 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 35 min při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 10 ml DMSO, přidá se 10 ml vody ochlazené na 4°C a 10 ml 0,2 M NaHCO3 ochlazeného na 4°C a směs je míchána 5 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (4000 RPM / 10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

FT-IRv(KBr) cm'¹: 3429, 2894, 1735, 1647, 1612, 1560, 1411,1377, 1319, 1234, 1207,1153,1080,1047.

¹³C NMR (500 MHz, D₂O) δ: 177.85, 177.56, 176.33, 171.32 (-C(=O)-O-); 137.87, 132.15, 131.99, 131.91 (fenyl); 106.06, 103.48, 85.95, 85.45, 82.86, 78.28, 76.56, 75.35, 71.34, 63.45, 57.20, 25.39, 24.90.

• · · ·* φφ ** ·* ν Φ Φ φφφ · · · · • · · « φφφ* · · · · • ···* φ · φ · · · · Φ··

- 14 - · ··»,»·· ¹Η NMR (500 MHz, D₂O) δ: 7.55, 7.53, 7.52 (m, 5Η, fenyl); 5.43, 5.40, 5.31, 5.28 (d, 2Η, CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 5.

GPC-UV detekce: viz Obr. 6.

DS: 12 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace ¹H NMR a GPC-UV analýzy)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázáni aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 5.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difúzniho koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH₂- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.

Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z W-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 15,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě poměru integrálů signálů methylenové skupiny a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) benzylu 11,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA benzylovým zbytkem od nízkomolekulárního nevázaného benzylového zbytku (Obr. 6., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika benzylu je patrné, že absorbuje i polymerní frakce, kterou je kyselina hylauronová a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.

Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného benzylu (76,4 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z ¹H NMR byl zjištěn DS=12 % benzylovým zbytkem.

Příklad 4

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 2-fenylethylbromidem

Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozmíchá při teplotě 23 °C ve 2 ml DMSO a do vzniklé suspenze se přidá 0,2 ml vody. Za stálého míchání se přidá 2-fenylethylbromid (0,3414 ml; 2,50 mmol). Směs se míchá 6 dní při τ w « * vv v v « · · · ♦ ··· ·· · · • «··* «· * · ·«·· ··· _ 4Κ _ · ·······* ¹ *··· · ·* «· ·· ·· °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, naředěna 7,5 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (30 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 40 min při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn v 10 ml DMSO, přidá se 10 ml vody ochlazené na 4 °C a 10 ml 0,4 M NaHCO3 ochlazeného na 4 °C a směs se míchá 5 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (4000 RPM / 10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

FT-IR v (KBr) cm'¹: 3409, 2918, 2894, 1743, 1647, 1620, 1560, 1498, 1409, 1375, 1315, 1228, 1205, 1153, 1076, 1037.

¹³C NMR (500 MHz, D₂O) δ: 177.81, 177.48, 176.42, 171.41 (-C(=O)-O-); 141.12, 132.10, 131.73, 129.86 (fenyl); 106.03, 103.47, 85.95, 85.47, 82.84, 82.44, 78.26, 76.50, 75.34, 74.98, 71.32, 70.00, 63.43, 57.18, 36.83 (CH₂), 25.37, 25.25.

¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ: 7.45, 7.43, 7.40, 7.39, 7.36 (m, 5H, fenyl); 4.53 (t, 2H, CH₂); 3.07 (t, 2H, CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 7.

GPC-UV detekce: viz Obr. 8.

DS: 23 % (stupeň substituce stanovený na základě kombinace ¹H NMR a GPC-UV analýzy)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání aromatického zbytku na hyaluronan (Obr. 7.). Signály aromatiky se nacházejí ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že aromatický zbytek musí být vázán na polymer. Signál -CH₂- skupiny v sousedství fenylu je rovněž součástí polymeru.

Na základě poměru integrálů signálů fenylu a methylu z /V-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) 2-fenylethylu 23,8 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě poměru integrálů signálů CH₂ skupiny v sousedství fenylu a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven celkový obsah (vázaného i nevázaného) 2-fenylethylu 21,0 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě GPC analýzy došlo k rozdělení substituované HA 2-fenylethylovým zbytkem od nízkomolekulárního nevázaného 2-fenylethylového zbytku ♦ · · ·« φ* ♦··♦ • · · φφφ Φ♦ Φ · • · · k φ ··« * · ·♦ • ···♦ « Φ φφ φ φ · ···· ·φφφ_βφ·Φφ * 10- «««* ν ·· «· φ« ·· (Obr. 8., 3. křivka). Z UV detekce při 257 nm, při které absorbuje aromatika 2-fenylethylu je patmé, že absorbuje i polymerní frakce, kterou je kyselina hylauronová, a tudíž musí být substituována aromatickým zbytkem.

Z poměru ploch pod píky UV křivky byl stanoven poměr vázaného a nevázaného 2-fenylethylu (95,9 % navázaného) a v kombinaci se stanovením celkového obsahu aromatiky z ¹H NMR byl zjištěn DS=23 % 2-fenylethylovým zbytkem.

Přiklad 5

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované ethyljodidem

Hyaluronan sodný (Mr = 24,09 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozmíchá při teplotě 23 °C ve 2 ml DMSO a do vzniklé suspenze se přidá 0,2 ml vody. Za stálého míchání se přidá ethyljodid (0,0800 ml; 1,00 mmol). Směs se míchá 7 dni při 45 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, naředěna 8 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (40 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 4 x 20 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 1 h při 40 °C. Po usušeni je derivát rozpuštěn ve 20 ml 0,2 M NaHCO3 během 25 min. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

FT-IR v (KBr) cm'¹·. 3413, 2894, 1735, 1647, 1616, 1560, 1407, 1377, 1315, 1226, 1205, 1151, 1078, 1047.

¹³C NMR (300 MHz, D₂O) δ: 177.87, 176.73, 171.71 (-C(=O)-O-); 106.11, 103.49, 85.55, 82.91, 82.38, 78.31, 76.56, 75.41, 75.05, 71.38, 66.08 (CH₂), 63.48, 57.23, 25.42, 16.17 (CHg).

¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ: 4.30, 4.29 (m, 2H, CH₂); 1.31,1.30, 1.28 (t, 3H, CHg).

DOSY NMR: viz Obr. 9.

DS: 24 % (stupeň substituce stanovený na základě ¹H NMR)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání ethylového zbytku na hyaluronan (Obr. 9.). Signály methylové a methylenové skupiny ethylu se nacházejí ve stejné oblasti difúzniho koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že ethylový zbytek musí být vázán na polymer.

• ·♦ ·· 44·· • 4 4 4 4 4 4 · • · · *4 444 · ♦ 4 4 • ·♦·· 44 ·· 444 ··♦·

-_Ύ 4444.4444

- Ί/ “ ·♦»· 4 4» .4 4444

Na základě poměru integrálů signálů methylu z ethylové skupiny a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah ethylu 22,3 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Na základě poměru integrálů signálů CH₂ skupiny ethylu a methylu z Nacetylglu kosa minu HA byl stanoven obsah ethylu 25,5 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Přiklad 6

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,6-dibromhexanem

Hyaluronan sodný (Mr = 72,81 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C v 5 ml vody a přidá se 45 ml DMSO. Za stálého míchání se přidá 1,6-dibromhexan (0,0769 ml; 0,50 mmol). Směs se míchá 49,5 h při 60 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt je vysrážen přídavkem 2-propanolu (150 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 2 x 20 ml a 2 x 30 ml 2-propanolu. Produkt je sušen 1,5 h při 40 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn ve směsi 40 ml vody a 10 ml roztoku 0,4 M NaHCOa mícháním během 1 h. Následuje dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM /10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

FT-IR v (KBr) cm’¹: 3411, 2925, 1739, 1643, 1614, 1558, 1407, 1377, 1315, 1230, 1205, 1151, 1076, 1045.

¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ: 4.30 (m, 2H, 2x CH₂); 1.72, 1.57 (m, 2H, 2x CH₂); 1.40 (m, 2H, 2x CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 10.

Obsah hexylu: 15 % (stanoveno na základě ¹H NMR).

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání hexylového zbytku na hyaluronan (Obr. 10.). Signály methylenových skupin hexylu se nacházejí ve stejné oblasti difúzniho koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že hexylový zbytek musí být vázán na polymer.

Na základě poměru integrálů signálů středových CH₂ skupin hexylu a methylu z W-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah hexylu 15 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

*«

-18Přiklad 7

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,2-dibromethanem

Hyaluronan sodný (Mr = 18,8 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C ve 2,5 ml vody a přidá se 2,5 ml DMSO. Za stálého míchání se přidá 1,2dibromethan (0,3232 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 68 h při 60 ’C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, přidá se 1 ml DMSO a produkt je vysrážen přídavkem acetonu (24 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 3 x 10 ml acetonu. Produkt je sušen v exsikátoru 24 h při 23 °C.

FT-IR v (KBr) cm’¹: 3402, 3001, 2916, 2538, 1743, 1654, 1556, 1434, 1407, 1375, 1315,1259, 1218, 1153, 1078, 1047.

¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ: 4,3 (m, 2H, 2x CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 11.

DS: 13 % (stupeň substituce stanovený na základě ¹H NMR)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázáni zbytku 1,2dibromethanu na hyaluronan (Obr. 11.). Signál methylenových skupin se nachází ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že zbytek 1,2-dibromethanu musí být vázán na polymer.

Na základě poměru integrálů signálu methylenu a methylu z N-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah zbytku 1,2-dibromethanu 13 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Příklad 8

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,2-dibromethanem ve směsi vodaDMF (A/,A/-dimethylformamid)

Hyaluronan sodný (Mr = 18,8 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C ve 2,5 ml vody a přidá se 2,5 ml DMF. Za stálého míchání se přidá 1,2dibromethan (0,3232 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 72 h při 60 °C. Posléze je směs ochlazena na 23 °C a produkt je vysrážen přídavkem acetonu (20 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 3 x 10 ml acetonu Produkt je sušen v exsikátoru 24 h při 23 °C.

- 19 • · «·«

FT-IR v (KBr) cm'¹: 3411, 2921, 2894, 1747, 1658, 1556, 1377, 1313, 1257, 1217, 1153, 1078, 1045.

¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ: 4,3 (m, 2H, 2x CH₂).

DOSY NMR: viz Obr. 12.

DS: 42 % (stupeň substituce stanovený na základě ¹H NMR)

H-H COSY: viz Obr. 13

HSQC: viz Obr. 14

Obsah -CH₂-CH₂-OH skupin: 26 %

Obsah -ΟΗ₂-ΟΗ₂-Βγ skupin: 16 %

Elementární analýza Br: 11 % (molárně na disacharidickou jednotku HA)

Naměřené DOSY spektrum derivátu prokazuje navázání zbytku 1,2dibromethanu na hyaluronan (Obr. 12.). Signál methylenových skupin se nachází ve stejné oblasti difúzního koeficientu jako signály vodíků polymeru, z toho vyplývá, že zbytek 1,2-dibromethanu musí být vázán na polymer.

Naměřené H-H COSY spektrum derivátu ukázalo interakce dvou nově vzniklých signálů 4,3 a 4,4 ppm se sousedními vodíky (3,87 ppm), které přísluší CH₂-CH₂-OH skupině. Dále pak interakce dvou nové vzniklých signálů 4,55 a 4,65 ppm se sousedními vodíky (3,71 ppm), které přísluší -CH₂-CH₂-Br skupině. Nakonec je to také přítomnost nového signálu v oblasti —4,1 ppm, který přísluší posunutému signálu skeletárního vodíku v poloze 5 glukuronové kyseliny, a k němu příslušnou interakci (3,9 ppm). Signál při 4,1 ppm vyjadřuje celkovou substituci jak -CH₂-CH₂OH skupinou tak i -CH₂-CH₂-Br skupinou, která měla hodnotu 42 %.

Na základě rozdílu integrálů signálu vodíku v poloze 5 glukuronové kyseliny (4,1 ppm) a signálu vodíku -CH₂-CH₂-OH (4,3 ppm) skupiny byl stanoven obsah CH₂-CH₂-Br skupin 16 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Naměřené HSQC spektrum derivátu ukázalo interakci signálu 3,71 ppm s příslušným uhlíkem s posunem 28 ppm. Z hodnoty ulikového posunu se jedná o uhlík nesoucí Br.

Naměřená NMR spektra H-H COSY a HSQC a výsledek elementární analýzy obsahu Br potvrzují strukturu B nároku 14.

!

• · · · *

·· toto • · to · to • ··· to · * to* · · ♦ ·

Příklad 9

Příprava kyseliny hyaluronové esterifikované 1,2-dibromethanem

Hyaluronan sodný (Mr = 18,8 kDa; 0,5 g; 1,25 mmol) se rozpustí při teplotě 23 °C ve 2,5 ml vody a přidá se 2,5 ml DMSO. Za stálého míchání se přidá 1,2dibromethan (0,3232 ml; 3,75 mmol). Směs se míchá 76 h při 60 °C. Během reakce je udržováno pH reakční směsi na hodnotě 7 pomocí 1 M NaHCO₃. Posléze je směs ochlazena na 23 °C, přidá se 1 ml DMSO a 1 ml vody a produkt je vysrážen přídavkem acetonu (28 ml). Vzniklá sraženina je 5 min míchána a po sedimentaci odfiltrována a promyta 3 x 10 ml acetonu. Produkt je sušen v exsikátoru 24 h při 23 °C. Po usušení je derivát rozpuštěn ve směsi 60 ml vody a 40 ml roztoku 0,1 M NaHCO₃ mícháním během 2 h. Následuje dialýza proti 0,1% hm. roztoku NaCi a poté dialýza proti vodě. Roztok po dialýze je odstředěn (3000 RPM / 10 min) a supernatant je zamražen a lyofilizován.

FT-IR v (KBr) cm'¹: 3394, 2921, 2893, 1743, 1653, 1616, 1560, 1407, 1377, 1317, 1234, 1207, 1151, 1078, 1045.

¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ: 4,3 (m, 2H, 2x CH₂).

DS: 17 % (stupeň substituce stanovený na základě ¹H NMR)

Mr: 140,7 kDa

Na základě poměru integrálů signálu methylenu a methylu z W-acetylglukosaminu HA byl stanoven obsah zbytku 1,2-dibromethanu 17 % molárně vůči disacharidické jednotce HA.

Nárůst molekulové hmotnosti derivátu na hodnotu 140,7 kDa z výchozí hodnoty molekulové hmotnosti hyaluronanu 18,8 kDa potvrzuje síťování derivátu a tím strukturu C v nároku 14.

Claims (14)

1. Způsob přípravy esterů hyaluronanu, vyznačující se tím, že hyaluronan nesoucí skupinu COOH nebo COO’Na⁺, se rozpustí ve vodě, roztok se ochladí na laboratorní teplotu, přidá se s vodou mísitelné organické rozpouštědlo, a pak se přidá esterifikační činidlo R-X nebo X-Z-X, kde R a Z jsou alifatický, cykloalifatický, olefinický, arylalifatický či heterocyklický zbytek s počtem uhlíků 1 až 18, volitelně s obsahem hydroxy skupiny a/nebo disulfidického můstku, a X je Cl, Br nebo I, a výsledná reakční směs se míchá po dobu 1 hod až 6 dní, přičemž pH reakční směsi se udržuje na hodnotě 6 až 10.

2. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hyaluronan rozpustí ve vodě při teplotě 5 až 80 °C.

3. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že koncentrace roztoku hyaluronanu je v rozmezí 0,01 až 10 %hmotn.

4. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 3, vyznačující se tím, že koncentrace roztoku hyaluronanu je v rozmezí 1 až 10 %hmotn.

5. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že výsledná koncentrace organického rozpouštědla v roztoku hyaluronanu je v rozmezí 10 až 95 % hmotn.

6. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 5, vyznačující se tím, že koncentrace organického rozpouštědla v roztoku hyaluronanu je 90 % hmotn.

7. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že po přidání esterifikačního činidla se směs míchá při teplotě 5 až 80 °C.

8. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 5, vyznačující se tím, že se směs míchá při teplotě 45 °C.

9. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že po přidání esterifikačního činidla se směs míchá po dobu 72 hodin.

·· 4 «V «· 44*« **· * 4 4 4 · 44 • 44 * 44» 4 4 44 • ·*·· φ 44 ·»· ·444 » V ♦ > φ · · 44 ··» · Φ φΦ φφΦ«

10. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že molární ekvivalent přidaného esterifikačniho činidla je 0,2 až 3 vůči disacharidické jednotce hyaluronanu.

11. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že pH reakční směsi je udržováno na hodnotě 7 postupným přidáváním báze Na⁺Yⁿ' (n=1, 2, 3), kde Yⁿ' je vybrán ze skupiny zahrnující OH‘, HCO3’, CO3²', PO?', HPO?', H2PO₄·, F.

12. Způsob přípravy esterů hyaluronanu podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že kyselina hyaluronové nebo její sodná sůl má hmotnostně střední molekulovou hmotnost v rozsahu 4.10³ až 5.10⁶ g.mol·¹.

13. Způsob podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že s vodou mísitelné organické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, /V.N-dimethylformamid, Λ/,/V-dimethylacetamid a N-methylpyrrolidon.

14. Ester hyaluronanu připravený způsobem podle kteréhokoli z předchozích nároků, odpovídající obecnému vzorci A, B nebo C hyaluronan C O R hyaluronan C O Z X Ó hyaluronan C O Z O C hyaluronan O O přičemž R, Z a X mají význam uvedený výše.