CZ2008183A3

CZ2008183A3 - 5-Fluor-3 alfa, 17 beta-dihydroxy-5 alfa -androstan-6-on, zpusob jeho výroby a jeho použití pro ovlivnování rustu rostlin

Info

Publication number: CZ2008183A3
Application number: CZ20080183A
Authority: CZ
Inventors: Slavíková@Barbora; Kasal@Alexander; Kohout@Ladislav; Budešínský@Miloš; Swaczynová@Jana
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie, Akademie ved CR
Priority date: 2008-03-20
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2009-09-30
Also published as: CZ301228B6; EP2283025B1; WO2009115060A1; EP2283025A1; ATE536361T1

Abstract

Je popsán 5-fluor-3.alfa.,17.beta.-dihydroxy-5.alfa.-androstan-6-on vzorce IV. Je popsána také syntéza 5-fluor-3.alfa.,17.beta.-dihydroxy-5.alfa.-androstan-6-onu vzorce IV, která spocívá v parciální hydrolýze 5-fluor-6-oxo-5.alfa.-androstan-3.beta.,17.beta.-diyl acetátu mírne alkalickým cinidlem na 5-fluor-3.beta.-hydroxy-6-oxo-5.alfa.-androstan-17.beta.-yl acetát, který solvolytickou zmenou konfigurace v poloze 3 poskytne 5-fluor-3.alfa.-hydroxy-6-oxo-5.alfa.-androstan-17.beta.-yl acetát a ten hydrolytickým odstranením bránící skupiny poskytne žádaný 5-fluor-3.alfa.,17.beta.-dihydroxy-5.alfa.-androstan-6-on vzorce IV. Dále se tento vynález týká použití 5-fluor-3.alfa.,17.beta.-dihydroxy-5.alfa.-androstan-6-onu vzorce IV pro regulaci rustu rostlin a to jak pro zvýšení výnosu rostlin tak i pro odstranování stresu pusobících na rostliny.

Description

ovlivňování růstu rostlin

Oblast techniky

Tento vynález se týká 5-fluor-3a.l7p-dihydroxy-5a-androstan-6-onu, způsobu jeho výroby a jeho použití pro ovlivňování růstu rostlin.

Dosavadní stav techniky

Pro ovlivňování růstu rostlin se používají různé rostlinné hormony a jejich směsi. V poslední době je věnována velká pozornost brassinosteroidům, což jsou analogy přírodního rostlinného hormonu brassinolidu, (22R,23R,24S)-2a,3a,22,23-tctrahydroxy-24-mcthyl-7a-homo-7-oxa-5a-cholestan-6-onu vzorce I

Tato sloučenina se získává isolací z rostlinného materiálu. Pro praktické použití je ale tento postup nepoužitelný, protože brassinolid se v přírodě vyskytuje ve velmi nízkých množstvích. Například v pylu řepky [Groves M.D. a spol.; Nátuře (London) 281, 216 (1979).] je jeho obsah 0,1 ppm, v jiných rostlinných materiálech ještě mnohem nižší, např. v čínském zelí [Morishita T, a spol.: Phytochemistry 22, 1051 (1983).] 0,000 003 ppm. Brassinolid je možno získat i synteticky, což je však pro mnohastupňovou a komplikovanou syntézu a nízké výtěžky syntézy [např. Fung a spol. J. Amer. Chem. Soc. 102, 6580 (1980), Hazra B.G. a spol.: Tetrahedron 50,2523 (1994), Koreeda M. a spol.: Synlett 8,650 (1995) a další] rovněž nereálné. Proto se jak v praxi tak i ve výzkumu brassinosteoridů ujalo používání • · * φ «φ · · φ φ »

Φ·Φ φ φ · ·φφφ φ φφφ · · φ · φφ · • φφ φ · φ · φφφ* ··«· »4 44 φφ φ· φφ

24-epibrassinolidu, (22R,23R,24R)-2a,3a,22,23-tetrahydroxy-24-methyl-7a-homo-7-oxa5a-cholestan-6-onu, vzorce II

který je isomerem brassinolidu, lišícím se od brassinolidu pouze konfigurací methylové skupiny v poloze 24. I tato sloučenina je však synteticky obtížně přístupná, i když se její syntézu podařilo podstatně vylepšit a zkrátit [viz např. Kohout L.: Coll. Czech. Chem. Commun. 59, 457 (1994), Brosa C. a spol.: Tetr. Lett. 32, 7057 (1992) a Khripach V.A. a spol.: Zh. Org. Khim. 30,1650 (1994)].

Existuje snaha připravit a používat další nové brassínosteroidy [např. Khripach V.A. a spol.: Věsti Akad, Nauk. Belarusi, Ser. Khim. Nauk (3), 64 (1995) a Moři K. a spol.: Liebigs Ann. Chem. 815 (1988)], Tyto sloučeniny jsou málo účinné nebo jejich syntéza je příliš komplikovaná a drahá, a tak zůstává nej častěji užívaným brassinosteroidem shora uvedený 24-epibrassinolid vzorce II. Nevýhody tohoto používání zde už byly uvedeny.

Před několika lety byla publikována syntéza syntetického brassínosteroidu, kterým je 2a,3a,17B-trihydroxy-5a-androstan-6-on vzorce III

(ΠΙ), a jeho použití pro ovlivňování růstu rostlin, při čemž tento 2a,3a,17B-trihydroxy-5a-androstan-6-on je značně levnější než výše uvedené přírodní brassínosteroidy (Kohout L., Kasal • φ φ φ ·· * · · · * ··· · · · · φ · · ·· φ · φ · · · · * · · • φφ φ φ φ · · · · ·

ΦΦΦΦ φφ ·· Φ· *· ··

A., Chodounská Η.: Použití 2a,3a,17B-trihydroxy-5a-androstan-6-onu pro ovlivňování stresu rostlin, CZ 294 343 (4,10.2004) a Kohout L., Kasal A., Chodounská H., Slavíková B., Hniličková J.: EU patent 1 401 278 (28. 9. 2005), Běloruský pat. č. 9385 (05.03.2007) a Ukrajinský pat. č. 74670 (16.01.2006).

Nyní jsme překvapivě zjistili, že námi syntetizovaná nová sloučenina, 5-fluor3a,17P-dihydroxy-5a-androstan-6-on vzorce IV

je nejen účinná jako regulátor růstu rostlin, ale její syntéza je ekonomičtější a rychlejší než jakéhokoliv přírodního brassinosteroidů a také než shora uvedeného syntetického brassinosteroidů vzorce III.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-onu vzorce IV

(IV).

Dále se tento vynález týká syntézy 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-onu vzorce IV «··« 4« · · 4 4 ♦

4 4 4 « · · ·♦· * · «4» « 444 444 • *« φ»4»*444 «444 44 4* 44 4«44

(IV), která spočívá v tom, že se známý 5-fluor-6-oxo-5a-androstan-3p,l 7p-diyl diacetát vzorce V

(V) parciálně zhydrolyzuje mírně alkalickým činidlem, s výhodou jedním ekvivalentem uhličitanu draselného, v organickém rozpouštědle, jako je alkohol, vodný alkohol, s výhodou vodný methanol, za vzniku 5-fluor-3p-hydroxy-6-oxo-5a-androstan-17p-yl acetátu vzorce VI

U tohoto monoacetátu vzorce VI je pak nutno změnit konfiguraci hydroxylu v poloze 3. To lze provést například Mitsunobeho reakcí nebo převedením na vhodný solvolyzovatelný derivát, jako tosyloxyderivát nebo mesyloxyderivát a solvolýzou např. dusitanem sodným ve vhodném rozpouštědle, jako je DMAA, HMPA, DMF, DMSO a podobné, s výhodou v HMPA. Získá se tak 3a-alkohol, 5-fluor-3a-hydroxy-6-oxo-5aandrostan-17p-yl acetát vzorce VII • 44« 4 4 · 4 4 44 *4« 44 · 4«44

4« · · · 4 444 «4·

44 444444*4

4*4* 44 44 44 4«··

(VII).

Hydrolýzou chránící acetoxyskupiny v alkalickém prostředí, jako je uhličitan nebo hydroxid alkalického kovu, například uhličitan nebo hydroxid draselný nebo sodný, nebo v kyselém prostředí, jako je kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková a podobné, s výhodou kyselina chlorovodíková ve vhodném rozpouštědle, s výhodou v methanolu, se získá žádaná sloučenina, 5-fluor'3a,17p-dihydroxy-5aandrostan-6-on vzorce IV

Dále se tento vynález týká použití 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-onu vzorce IV pro regulaci růstu rostlin podobným způsobem jako přírodní nebo syntetické brassinosteroidy. Tato sloučenina se rozpustí na koncentrovaný roztok ve vhodném rozpouštědle, jako je alkohol, například ethanol, propanol nebo isopropanol, nebo inertní rozpouštědlo, jako je dimethylsulfoxid, dimethylformamid, Ν,Ν-dimethylacetamid apod. Tento koncentrovaný roztok se zředí vodou na vhodnou koncentraci, například na 10'⁶M roztok, a ten se pak aplikuje na rostliny. Je možné také rozpustit účinnou složku s výhodou přímo v potřebném množství vody a tento roztok přímo aplikovat. Aplikace se může provádět jakýmkoliv vhodným způsobem, například ručním rozprašovačem, rozprašovačem na zádech nebo jakýmkoliv typem průmyslově používaných rozprašovacích zařízeních. Při výběru vhodného rozprašovače neexistuje žádné zvláštní omezení, protože koncentrace účinné složky v roztoku je velmi nízká. Pro dobré smáčení je možné přidat povrchově aktivní činidlo, jako je Tween, např. Tween 20.

Takto připravený roztok je vhodný pro aplikace, při nichž je potřeba dosáhnout zvýšeného růstu rostlin nebo pro odstranění stresových situací působících na rostliny, například nedostatek vlhkosti, nedostatek živin v prostředí, ve kterém se rostliny pěstují, nadměrný chlad, nadměrná teplota, působení látek zvyšujících stres rostlin (nadměrné použití soli, pesticidů, herbicidů) atd.

Tento vynález bude podrobněji ilustrován na následujících příkladech, které není možné brát jako omezení předloženého vynálezu, ale pouze jako jeho ilustraci.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba 5-fluor-3p-hydroxy-6-oxo-5a-androstan-17p-yl acetátu (sloučenina vzorce VI)

Roztok uhličitanu draselného (670 mg, 4,85 mmol) ve vodě (12 ml) a methanolu (24 ml) se přidá k roztoku 5-fluor-6-oxo-5a-androstane-3|3,17P-diyl diacetátu (1,83 g, 4,.48 mmol) v methanolu (180 ml). Po jedné hodině za teploty místnosti se přidá kyselina octová (0,6 ml) a tento roztok se zahustí odpařením in vacuo. Solným roztokem se vysráží bílá pevná látka, která se extrahuje ethylacetátem. Extrakt se promyje roztokem chloridu sodného, vysuší a zahustí se in vacuo. Chromatografie odparku na koloně silikagelu (150 ml) poskytne alkohol vzorce VI (1,25 g, 76 %). T.t. 165-167 °C (1,18 g, aceton/heptan); [cx]d -16,4 (c 0,18). IR spektrum: 3500,3439,3611,1048 (OH), 1725,1257 (COCH₃).

Příklad 2

Výroba 5-fluor-3ct-hydroxy-6-oxo-5a-androstan-17P-yl acetátu (sloučenina vzorce VII)

4-Toluenesulfonyl-chlorid (200 mg, 1,04 mmol) se přidá k roztoku 3p-alkoholu VI (200 mg, 0,55 mmol) v pyridinu (2 ml). Po 48 h se směs zředí solným roztokem, bílá sraženina se extrahuje chloroformem, extrakt se promyje vodou, zředěnou kyselinou chlorovodíkovou,

• *	• ·	« · · · ·	•	«
	• ·			• ·
•	• ·	• · « · · · ·		9
«	• ·	♦ · ♦ · ♦ «	«	«
	♦ ♦	♦ ♦ ·* ♦·		• Φ

vodou, potom roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a vysuší se bezvodým síranem sodným. Odpařením roztoku destilací in vacuo dosucha se získá tosylát, který se pak solvolyzuje dusitanem sodným (480 mg, 0,70 mmol) v HMPA (25 ml) při 90 °C po dobu 2 hodin pod atmosférou dusíku. Tato směs se nalije do vody a produkt se extrahuje chloroformem. Extrakt se pak následně promyje vodou, zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, vodou, potom roztokem hydrogenuhličitanu draselného a vodou. Odpaření rozpouštědla a rozdělení produktu na PLC (5 desek, benzen/ethyl-acetát, 7:3) poskytne 3aalkohol vzorce VII (83 mg, 41 %) jako bílé krystalky. T.t. 139-142 °C (aceton/heptan). [a]o -13.6 (c 0.21). IR spektrum: 3617,1017 (OH), 1725 (AcO). *H NMR: δ 0,78 (s, 3H, H18); 0,80 (s, 3H, H-19); 2,04 (s, 3H, CH₃CO); 4,08 (m, 1H, W~ 16 Hz, H-3); 4,64 (t, 1H, J=8.5 Hz, H-17).

Příklad 3

Výroba 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-onu (sloučenina vzorce IV)

5-Fluor-3a-hydroxy-6-oxo-5a-androstan-17p-yl acetát vzorce VII z příkladu 2 (70 mg, 0,19 mmol) v chloroformu (0,5 ml) se hydrolyzuje přidáním kyseliny chlorovodíkové (0,1 ml) v methanolu (5 ml). Reakční směs se nechá stát 20 hodin za teploty místnosti. Přidá se roztok uhličitanu draselného a produkt se extrahuje chloroformem. Extrakt se promyje solným roztokem, vysuší a zahustí se oddestilováním in vacuo. Chromatografie zbytku PLC na dvou deskách poskytne žádaný 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-on (50 mg, 81 %) jako bílé krystalky. T.t. 260-262 °C (aceton/heptan). [cc]d -12.4 (c 0.31). IR spektrum: 3617,1070 (OH), 1725 (C=O), 1020 (C-F). *H NMR: δ 0,74 (s, 3H, H-l 8); 0,80 (s, 3H, H-l9); 3,70 (t, 1H, J=8.5 Hz, H-17); 4,08 (m, 1H, IF~16Hz, H-3). Pro Ci^FOj (324,4) vypočteno: 70,34 % C, 9,01 % H, nalezeno 70,13 % C, 8,83 % H.

Příklad 4

Příprava roztoku sloučeniny vzorce IV pro aplikace na rostliny • I ♦· •· ·· • · ··« · · · · · ·· « · · · · · · · · ·· *··· β· ·· «· ···*

Κ 5 mg 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-onu se přidá 10 ml isopropanolu. Tento roztok se pak ředí vodou na příslušnou koncentraci.

Příklad 5

Příprava roztoku sloučeniny vzorce IV s povrchově aktivním činidlem pro aplikace na rostliny

K5 mg 5-fluor-3(x,17p-dihydroxy-5ct-androstan-6-onu se přidá 10 ml ethanolu a 1 ml Tweenu 20. Tento roztok se pak ředí vodou na příslušnou koncentraci.

Příklad 6

Příprava roztoku sloučeniny vzorce IV ve vodě pro aplikace na rostliny

0,2 mg 5-fluor-3a,17p-díhydroxy-5ci-androstan’6-onu se rozpustí v 10 1 vody. Tento roztok je připraven pro přímou aplikaci.

Příklad 7

Testování aktivity testem na druhém intemodu fazole

Semena fazole (Phaaeolus vulgaris L., cv. Pinto) vyklíčená dva dny byla vybrána z velké populace tak, aby rostlinky byly jednotné. Potom byly přeneseny do kelímků obsahujících perlit a 1/10 zředěný Hoaglandův roztok (poloviční koncentrace, pH 5,7). Sazeničky byly nechány růst v kultivační místnosti s regulovaným osvětlením (25-27 °C, světlo 48 W.m'², světlo/tmal 6/8 h). Sedm dnů staré rostlinky s druhým intemodem dlouhým 2 mm byly ošetřeny různými množstvími testovaných sloučenin v 5 μΐ frakcionovaného lanolinu. Sloučenina byla aplikována jako mikrokapička na místo po odstraněném listenu na počátku druhého intemodu. Kontrolní rostlinky byly ošetřeny samotným lanolinem. V každém pokusu bylo použito alespoň sedm rostlinek a celý test byl zopakován alespoň třikrát.

• 4	•	«	• 4	*	* 4	4 4
•	4	4	4 *	4	• 4	• 4
•	4	*	*4 4	4	4 * 4	4	•
4	4	*	4 4 4	4	4 4	4	4
*444	*4	44	44	4«	4 4

Délka druhého intemodu byla změřena pátý den. Mírou aktivity sloučeniny je rozdíl mezi délkou intemodu ošetřených rostlinek a délkou internodu kontrolních rostlin, jak ukazuje následující tabulka.

sloučenina	prodloužení (mm) druhého intemodu vzhledem ke kontrole při koncentraci 1O’¹⁰ mol.1“¹	SD
24-epiBR	54	±5,4
IV	43,4	±0,9

Z tabulky je zřejmé, že námi nárokovaná sloučenina vzorce IV, tedy 5-fluor3a,17p-dihydroxy-5o.-androstan-6-on, se svojí aktivitou velice přibližuje aktivitě přírodního brassinosteroidů, 24-epibrassinolidu.

Příklad 8

Zachování zelené a suché hmotnosti fazole

Z 0,01 ml roztoku připraveného podle příkladu 5, se přidáním 500 ml vody připraví aplikační roztok A. Rostlinky fazole pěstované ve skleníku v kelímcích ve stadiu růstu druhého intemodu (intemod má délku 2 mm) se rozdělí na 6 skupin o stejném počtu rostlin. První a druhá skupina se zalévají vodou obsahující 1% (hmotn.) roztok chloridu sodného, třetí a čtvrtá skupina se pěstují ve skleníku za teploty 15 °C, pátá a šestá skupina se pěstují za standardních podmínek. Druhá, čtvrtá a šestá skupina se postříkají aplikačním roztokem A, Po 4 dnech se odváží zelená hmota všech skupin, nechá se uschnout a znovu se odváží.

V _w	T ·	v · · »	v	«
•	*	to	to · * · ·	to»
•	•	•	• t · ·»··	•
•	to	to	to t · · · ·	•	•
• •toto	toto	·· toto	··

Zelené a suché hmotnosti fazole (v % ke kontrole, tj. skupina 5 = 100 %) po 4 dnech růstu

	aplikace	zelená hmota	suchá hmota
skupina 1	NaCl	72	74
skupina 2	NaCl + roztok A	110	113
skupina 3	15 °C	71	76
skupina 4	15 °C +roztok A	112	110
skupina 5	0	100	100
skupina 6	0 + roztok A	127	130

Z tabulky je vidět, že aplikace aplikačním roztokem A ve všech případech vede ke zvýšení zelené i suché hmotnosti rostlin při srovnání s kontrolou a že ve všech případech došlo k výraznému odstranění vlivu stresové situace na rostlinu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 5-Fluor-3cc, 17P-dihydroxy-5a-androstan-6-on vzorce IV (IV).
2. Způsob výroby 5-fluor-3a,17P-dihydroxy-5a-androstan-6-onu vzorce IV (IV), vyznačující se tím, žesc známý 5-fluor-6-oxo-5a-androstan-3p,17p-diyl acetát vzorce V parciálně zhydrolyzuje mírně alkalickým činidlem v organickém rozpouštědle za vzniku 5-fluor-3p-hydroxy-6-oxo-5a-androstan-17P-yl acetátu vzorce VI (VI), ψ » v 9 · · * * » * * • · · 4 4 4 *·»» • · 444 4 4 4 4 »4 4

4 · 4 4444 4444

1*4) φφ ΦΦ 44 ·· ΦΦ u kterého se změní konfigurace hydroxylu v poloze 3 tak, že se převede na solvolyzovatelný derivát a solvolýzou tohoto derivátu se získá 5-fluor-3a-hydroxy-6oxo-5a-androstan-17p-yl acetát vzorce VII (VII), jehož hydrolýzou se získá žádaný 5-fluor-3a,17p-dihydroxy-5a-androstan-6-on vzorce IV (IV).
3. Způsob výroby podle nároku 2, vy zn a č u j í c í se t i m, že se hydrolýza sloučeniny V provádí jedním ekvivalentem uhličitanu draselného v methanolu.
4. Způsob výroby podle nároku 2 nebo 3, vy zn a č uj i c í se t í m, že se změna konfigurace provádí solvolýzou tosyloxyderivátu dusitanem sodným v HMPA.
5, Použití 5-fluor-3a,17P-dihydroxy-5a-androstan-6-onu vzorce IV

4 4 t • 4 * • 4 4 4 t t 4 4 4 • ·♦ • a 4 4» * 4 ♦ 4 • 4 • 4 • 444 4» 44 4* • V 4*

(IV) pro regulaci růstu rostlin.
6. Použití podle nároku 5 pro zvýšení růstu rostlin.
7. Použití podle nároku 5 pro odstranění stresu rostlin.