CZ2004546A3 - Regulovaný systém exprese nukleových kyselin - Google Patents

Regulovaný systém exprese nukleových kyselin Download PDF

Info

Publication number
CZ2004546A3
CZ2004546A3 CZ2004546A CZ2004546A CZ2004546A3 CZ 2004546 A3 CZ2004546 A3 CZ 2004546A3 CZ 2004546 A CZ2004546 A CZ 2004546A CZ 2004546 A CZ2004546 A CZ 2004546A CZ 2004546 A3 CZ2004546 A3 CZ 2004546A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cell
expression
nucleic acid
protein
viral
Prior art date
Application number
CZ2004546A
Other languages
English (en)
Inventor
Changáyung@Nien
Niáyajin
Dropulicáboro
Original Assignee
Virxsysácorporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Virxsysácorporation filed Critical Virxsysácorporation
Publication of CZ2004546A3 publication Critical patent/CZ2004546A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Regulovaný systém exprese nukleových kyselin
Oblast techniky
Předložený vynález se týká systému pro regulaci exprese genů. Vynález poskytuje zlepšené konstrukty nukleové kyseliny, schopné přesného regulování exprese kódující sekvence, o kterou je zájem. Přesná kontrola regulace je žádoucí tam, kde nukleová kyselina, která má být exprimována, nebo úroveň exprese je toxická pro buněčné nebo hostitelské prostředí, v němž k expresi dochází. Vynález se také týká aplikace expresního systému buněk užívaných k pakážování virových vektorů a poskytuje způsoby přípravy potřebných konstruktů nukleové kyseliny, právě tak jako jejich použití při kontrole exprese rekombinantního virového genu. Z jednoho hlediska se vynález vztahuje k regulaci genové exprese ve stabilně transfektované buňce.
Dosavadní stav techniky
Technologie rekombinantní nukleové kyseliny se ukázala být mocným nástrojem pro expresi produktů kódovaných nukleovými kyselinami, které jsou předmětem zájmu. Výsledkem toho byla způsobilost produkovat polypeptidy a nukleové kyseliny pro výzkum i pro komerční aplikace.
Avšak některé kódované produkty jsou toxické pro buněčné nebo hostitelské prostředí, v němž k expresi dochází, buď proto, že produkt je toxický inherentně nebo proto, že úroveň, při které k expresi dochází, je tak vysoká, že jejím výsledkem je toxicita. Jedním způsobem vypořádání se s touto nesnází bylo využívání dočasných expresních systémů, ve kterých je kódovaný produkt exprimován a odebrán předtím než toxicita působí snižování úrovně produktu. Nebo je kódovaný produkt podroben přesně kontrolovanému regulačnímu systému tak, že produkt může být exprimován a potom se exprese ukončí dříve než toxicita dosáhne letální úrovně. Jeden z příkladů přesně kontrolovaného regulačního systému lze vidět v užití regulace operátor / promotor tetracyklinem v kombinaci s tet represorem (viz například US patent 5 750 396).
Exprese toxického produktu je zvlášť závažná v situacích, když musí být produkt exprimován kontinuálně, protože je složkou rozsáhlejšího produktu, který má ·· ··· · · · · · • · · · · · být buňkou produkován, nebo metabolické aktivity, která má být buňkou vykonávána. Jedním příkladem takové situace je případ buněčné linie pro virové pakážování, která exprimuje produkty potřebné ke shromáždění a pakážování virových částic. Jestliže je nějaký z potřebných produktů virového genu vůči buňce toxický, stává se požadavek kontrolovat jeho expresi rozhodující, má-li být použita stabilní (jako protiklad k dočasné) pakážovací buněčná linie. Jeden z příkladů potřebného toxického virového genu je případ G proteinu z viru vezikulární stomatitidy (VSV), který je žádoucí pro produkci pseudotypických virových částic.
Příklad užívající tet operátor a represor k regulování exprese VSV-G popisuje Henriette a spol. [J. Virol. 73(1), 576-584 (1999)], kde tet represor (jako chimerový produkt fúze s doménou VP-16 a označovaný jako tTA), je pod kontrolou promotoru cytomegaloviru (CMV) a VSV-G je pod kontrolou tet operátoru. Následkem exprese chimerového represoru v nepřítomnosti tetracyklinu je nulová exprese VSV-G. Přítomnost tetracyklinu brání asociování mezi tTA a tet responzivními elementy (TRE) nacházejícími se v operátoru a umožňuje expresi VSV-G. Tento systém se označuje jako tet-on, kde přítomnost tetracyklinu má za následek expresi genu, o který je zájem (tj. VSV-G).
Existuje také alternativní tet-off systém, kde tTA je chimerový transaktivátor. V přítomnosti tetracyklinu se nemůže vázat na TRE tet operátoru. Avšak v nepřítomnosti tetracyklinu tTA se k operátoru váže a silně aktivuje promotor, aby exprimoval kódující sekvenci, o kterou je zájem.
Klages a spol. [Molec. Therap. 2(2), 170 (2000)] používají ke kontrole exprese VSV-G aplikaci dvou podobných systémů nukleových kyselin. První nukleová kyselina exprimuje tTA, který potom kontroluje TRE obsahující tet operátor, který řídí expresi VSV-G. Stejný tTA protein také reguluje expresi rev proteinu, který pak reguluje expresi gag a pol oblastí (nutných k pakážování viru) kontrolováním spojování gag/pol mediátorové RNA cestou rev responzivního elementu (RRE).
Jiný příklad použití rev proteinu ke kontrolování exprese genu byl popsán od Yu a spol. [J. Virol. 70(7), 4530-4537 (1996)]. Použili expresi tTA k regulování HIV-1 rev a obálkových proteinů, které současně podléhaly regulaci jediného tet operátoru obsahujícího TRE. Tento rev protein potom prostřednictvím RRE reguluje expresi virového obálkového proteinu, právě tak jako expresi gag/pol mediátorové RNA přes jiný RRE. Zatímco transkripce gag/pol kódujících sekvencí byla regulována jiným promotorem, jeho exprese byla přímo regulována rev proteinem a tedy nepřímo regulována pomocí tTA.
Podstata vynálezu
Předložený vynález poskytuje (expresní) konstrukty nukleové kyseliny a metody regulace exprese jedné nebo více než jedné kódující sekvence, o kterou je zájem. Konstrukty nukleové kyseliny jsou přednostně rekombinantního charakteru a zahrnují nejméně tři konstrukty, kde poslední obsahuje žádanou kódující sekvenci. Konstrukty mohou být nahlíženy a používány jako expresní systém k expresi kódující sekvence, o níž je zájem, kde každý konstrukt exprimuje produkt, který reguluje expresi dalšího konstruktu tak, že nakonec je kontrolována exprese požadované kódující sekvence prostřednictvím posledního konstruktu. Každý konstrukt přednostně a individuálně obsahuje regulační oblast, jako je promotor (případně s operátorem).
Z jednoho hlediska vynálezu je expresní systém využíván jako součást buňky nebo buněčné linie, užívané pro pakážování virových vektorů, k regulování exprese složek potřebných k pakážování vektoru. Expresní systém může být užit k regulování exprese virových strukturních nebo regulačních genových produktů potřebných pro pakážování požadovaného virového vektoru. Kde má být exprimován více než jeden žádaný produkt virového genu, mohou být umístěny na různých molekulách nukleových kyselin a stále zůstávají součástí expresního systému podle vynálezu.
Expresní systémy podle vynálezu mohou tedy mít společně konstrukty, takže k expresi dvou nebo více těmito systémy regulovaných žádaných kódujících sekvencí mohou být kombinovány dva nebo více systémů. Příklady systémů se společnými konstrukty zahrnují použití stejných prvních a druhých konstruktů nukleové kyseliny, ale s dvěma třetími konstrukty obsahujícími dvě kódující sekvence, které jsou předmětem zájmu, z nichž obě jsou regulovány stejným mechanizmem prostřednictvím prvního a druhého konstruktu nukleové kyseliny.
Z jiného hlediska vynálezu je exprese z prvního konstruktu nukleové kyseliny přednostně přesně regulována nebo dokonce autoregulována. Jeden z neomezujících příkladů se děje prostřednictvím mechanizmu pozitivní zpětné vazby, kde produkt prvního konstruktu nukleové kyseliny může potlačit svoji vlastní expresi. V nepřítomnosti aktivace umožňuje tato autoregulace prvního konstruktu nukleové kyseliny velmi nízkou bazální aktivitu tak, že dochází k malé až nulové expresi žádaných kódujících sekvencí (v dalším konstruktu nukleové kyseliny). Jakmile je aktivována exprese prvního konstruktu nukleové kyseliny, následuje exprese všech dalších konstruktů v systému. Autoregulace prvního konstruktu se využívá v preferovaných provedeních vynálezu k maximalizaci kontroly exprese z dalších konstruktů v systému.
Konstrukty a systémy podle vynálezu mohou být inkorporovány do vektorů nebo zavedeny do buněk. U buněk mohou být konstrukty integrovány do buněčného genomu nebo zůstat jako epizomální konstrukty. Volba buněk není rozhodující, pokud umožňují expresi konstruktů a systémů podle vynálezu. Při provedeních vynálezu, při nichž jsou buňky používány k pakážování virových vektorů, je rezultující virový vektor přednostně rezistentní vůči komplementu.
Každý konstrukt podle vynálezu může být přítomen na individuální molekule nukleové kyseliny nebo na stejné molekule nukleové kyseliny jako jeden nebo více než jeden z ostatních konstruktů (například stejný plazmid, vektor nebo chromozom, ale není to na to omezeno). V preferovaných provedeních vynálezu, kde je expresní systém použit v buňkách k pakážování virových vektorů, jsou jednotlivé konstrukty přednostně rozděleny na různé molekuly nukleových kyselin. Přítomnost konstruktů na jedné nebo více než jedné molekule nukleové kyseliny není obvykle pro provádění vynálezu rozhodující, pokud uspořádání konstruktů nevyústí v interferenci schopnosti každého konstruktu regulovat expresi nějakého dalšího konstruktu.
Alternativně a z dalšího aspektu vynálezu jsou konstrukty umístěny tak, že existuje regulační efekt vznikající z uspořádání. Neomezujícím příkladem je, když jsou dva konstrukty umístěny na jedné molekule tak, že jejich promotory jsou orientovány, aby exprimovaly sekvence divergentně (kde 5‘ části každého promotoru jsou k sobě blíže než 3‘ části každého promotoru) tak, že aktivace jednoho promotoru zvyšuje snadnost aktivace druhého. Když toto uspořádání na plazmidech bylo užito v buňkách k pakážování virových vektorů, zjistilo se, že zvyšuje titr produkce vektoru. Toto uspořádání se může odrážet v buňkách, obsahujících stabilní integraci konstruktů nukleových kyselin, připravením dvou konstruktů, které jsou divergentně orientovány na jedné molekule, a potom integrováním této molekuly do buněčného genomu. Divergentní orientace by takto byla zachována spolu s relativními polohami obou konstruktů.
• · · · • · · ····· • · · · • · · · ·
Z dalšího hlediska vynálezu je jeden nebo více než jeden produkt exprimovaný jedním nebo více než jedním konstruktem podle vynálezu přednostně virového původu a schopný přísného kontrolování exprese z jiného konstruktu. Preferovaný expresní systém podle vynálezu tedy exprimuje jeden nebo více než jeden virový regulační protein, který může regulovat expresi z jiného konstruktu systému.
Konstrukty a systémy podle vynálezu jsou přednostně používány k regulování exprese sekvencí kódujících produkt nebo produkty toxické vůči buňkám nebo hostiteli, jako například virové proteiny, ale neomezuje se to jen na ně. Konstrukty a systémy mohou být ovšem užity rovněž pro regulování exprese netoxických produktů.
Podle jednoho preferovaného hlediska vynálezu jsou konstrukty podle vynálezu inkorporovány do buněk užívaných k pakážování virových vektorů do virových částic. Takové buňky mohou být označovány jako pakážovací buňky protože produkují všechny složky nezbytné pro pakážování nukleových kyselin virových vektorů do virových částic. Takovými buňkami mohou být pakážovány rekombinantní virové nukleové kyseliny, obsahující případně jiné heterologní nebo endogenní sekvence, o něž je zájem. V aspektech vynálezu, kde konstrukty nukleových kyselin rezultují v indukovatelný systém pro regulování exprese potřebných virových složek, mohou být takové buňky považovány a používány jako indukovatelný systém pro pakážování virových částic.
Konstrukty podle vynálezu mohou být zaváděny do buněk, aby jejich výsledkem bylo zachování konstruktů jako extrachromozomálních a/nebo integrovaných kopií. Při preferovaných provedeních vynálezu se používá integrace konstruktů k produkování stabilně transfektované buněčné linie, která může být využita k pakážování virových částic na delší nebo neurčitou dobu.
Vynález také poskytuje způsoby produkce shora popsaných konstruktů a systémů, právě tak jako způsoby využití takových systémů pro regulaci exprese kódujících sekvencí. Tyto způsoby zahrnují využití vynálezu pro produkci jedné nebo více než jedné složky potřebné pro pakážování virového vektoru. ZAhrnuty jsou rovněž sady obsahující konstrukty podle vynálezu nebo pro využití popsaných metod.
• · • · · · · • ·
Definice
Nukleová kyselina nebo konstrukt nukleové kyseliny anebo molekula nukleové kyseliny je polynukleotid nebo polymerní forma nukleotidu jakékoliv délky, buď ribonukleotidu nebo desoxyribonukleotidu. Tento termín se vztahuje pouze na primární strukturu molekuly. Tento termín tedy zahrnuje dvou řetězcovou i jednořetězcovou DNA a RNA. Termín zahrnuje také lineární nebo cirkulární polymery.
Zde uváděná „kódující sekvence, o kterou je zájem“ nebo žádaná kódující sekvence, je polynukleotidová sekvence, která je předmětem zájmu a jejíž exprese je požadována. Kódující sekvence může být, pokud jde o její skutečnou sekvenci, známá nebo neznámá, avšak kóduje RNA nebo polypeptid, o které je zájem.
Zde používané buňka nebo hostitel se vztahuje na odpovídající živý organizmus, do kterého mohou být zavedeny a v něm exprimovány konstrukty nukleové kyseliny nebo expresní systémy podle vynálezu. Buňkou může být jakákoliv buňka a přednostně je to eukaryotická buňka. Buňkami mohou být buňky buněčné linie nebo primární buňky nově izolované a transformované zavedením nebo ve spojení se zavedením konstruktů nukleové kyseliny podle vynálezu. Buněčné linie nebo kultury označují buňky udržované cestou kultivace in vitro, které mohou být neidentické s rodičovskou/rodičovskými buňkou/buňkami, z nichž linie nebo kultury pocházejí. Neomezující příklady buněk zahrnují eukaryotické buněčné linie jako HeLa, 293, HT-1080, CV-1, TE671 nebo jiné lidské buňky, Věro buňky nebo D17 buňky. Jiné buňky zahrnují lymfocyty (jako T nebo B buňky) nebo makrofágy (jako monocytické makrofágy), nebo jsou prekurzory kterékoliv z těchto buněk, jako je hematopoetická kmenová buňka. Další buňky k provádění vynálezu zahrnují astrocyty, kožní fibroblasty, střevní epitelové buňky, endotelové buňky, epitelové buňky, dendritické buňky, Langerhansovy buňky, monocyty, svalové buňky, neuronální buňky (jako buňky mozku a oka, ale neomezuje se na ně), hepatocyty, hematopoetické kmenové buňky, embryonální kmenové buňky, buňky, ze kterých vznikají spermatozoa nebo oocyty, stromální buňky, mukozální buňky a podobně. Hostitelská buňka je přednostně buňkou eukaryotického vícebuněčného druhu (například jako protiklad k jednobuněčné kvasince) a zejména savčí, například lidskou buňkou.
Buňka může být přítomna jako samostatná entita nebo může být součástí většího souboru buněk. Takový větší soubor buněk může představovat například kultura buněk (buď smíšená nebo čistá), tkáň (například endotelová, epitelová, sliznice či jiná tkáň, včetně tkání obsahujících zmíněné CD 4 postrádající buňky), orgán (například srdce, plíce, játra, svalovina, žlučník, močový měchýř, gonády, oko a jiné orgány), orgánový systém (například oběhový systém, dýchací systém, gastrointestinální systém, močový systém, nervový systém, kožní systém nebo jiný orgánový systém) nebo organizmus (například pták, savec nebo podobně). Preferovány jsou orgány/tkáně/buňky oběhového systému (například srdce, krevních cest a krve, včetně bílých krvinek a červených krvinek, ale není to omezeno jen na ně), dýchacího systému (například nosu, hltanu, hrtanu, průdušnice, průdušek, průdušinek, plic a podobně), gastrointestinálního systému (například úst, hltanu, jícnu, žaludku, vnitřností, slinných žláz, slinivky břišní, jater, žlučníku a jiných), močového systému (například ledvin, močovodů, močového měchýře, močové trubice a podobně), nervového systému (například mozku, míchy a speciálních smyslových orgánů jako oka, ale není to na ně omezeno) a kožní systém (například kůže, epidermis a buňky subkutánní nebo dermální tkáně). Ještě přednostněji jsou buňky vybírány ze skupiny, kterou tvoří buňky srdce, krevních cest, plic, jater, žlučníku, močového měchýře a oční buňky. Buňky nemusí být normálními buňkami a mohou být chorobnými buňkami. Takovými chorobnými buňkami, ale omezeno to tím není, mohou být nádorové buňky, infikované buňky, geneticky abnormální buňky nebo buňky v blízkosti nebo v kontaktu s abnormální tkání jako jsou tumorové vaskulární endotelové buňky.
Zde zaměnitelně používané část nebo oblast polynukleotidu nebo oligonukleotidu je souvislá sekvence dvou nebo více baží. U jiných provedení znamená část nebo oblast alespoň asi 3, 5, 10, 15, 20 nebo 25 souvislých nukleotidů.
Virus je infekční činidlo, které tvoří protein a nukleová kyselina, a které používá genetický aparát hostitelské buňky k produkování virových produktů určovaných nukleovou kyselinou viru. Vynález zahrnuje aspekty, jako je exprese virových kódujících sekvencí, které mohou být aplikovány na viry RNA i DNA. RNA viry jsou různorodá skupina, která infikuje prokaryonta (například bakteriofágy), stejně jako mnohá eukaryonta včetně savců a zejména lidí. Většina RNA virů má jako svůj genetický materiál jednořetězcovou RNA, i když nejméně jeden druh má jako genetický materiál dvou řetězcovou RNA. RNA viry se rozdělují na tři hlavní skupiny: viry s pozitivním řetězcem, viry s negativním řetězcem a dvoutřetězcové ···· ··· · · « • · · 9 · · · · · · ··· • · ··· ·· ·· · · · · ···· • · · ···· · · ·
RNA viry. RNA viry, kterých se týká předložený vynález, zahrnují Sindbis virům odpovídající (například Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, llarvirus, Tobravirus a Potexvirus), picornavirům odpovídající (Picornaviridae, Calciviridae, Comovirus, Nepovirus a Potyvirus), viry s negativním řetězcem (například Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae a Arenaviridae), dvouřetězcové viry (například Reoviridae a Birnaviridae), flavivirům odpovídající (například Flaviviridae a Pestivirus), retrovirům odpovídající (například Retroviridae), Coronaviridae a jiné skupiny virů včetně Nodaviridae, ale na ně se to neomezuje. Vynález je preferovaně aplikován na RNA virus čeledi Flaviviridae, přednostněji na virus rodu Filovirus a zejména virus Marburg nebo Ebola. Virus čeledi Flaviviridae je virus rodu Flavivirus, jako je virus žluté zimnice, virus horečky dengue, virus západního Nilu, virus encefalitidy St. Louis, virus japonské encefalitidy, virus encefalitidy Murray Valley, virus Rocio, virus klíšťové encefalitidy apod. Vynález se přednostně aplikuje na virus čeledi Picornaviridae, přednostně virus hepatitidy A (HAV), virus hepatitidy B (HBV), virus hepatitidy C (HCV) nebo virus hepatitidy non-A či non-B.
Jiný preferovaný RNA virus, na který může být vynález aplikován, je virus čeledi Retroviridae (tj. retrovirus) zejména virus rodu nebo podčeledi Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae a Lentivirus. RNA virus podčeledi Oncovirinae je přednostně lidský T-lymfotropní virus typu 1 nebo 2 (tj. HTLV-1 nebo HTLV-2) nebo virus leukemie skotu (BLV), virus sarkomu ptačí leukózy [například virus Rousova sarkomu (RSV)], virus ptačí myeloblastózy (AMV), virus ptačí erytroblastózy (AEV), Rous-asociovaný virus (RAV, RAV-0 až RAV-50), savčí virus C-typu [například Moloneyův virus myší leukemie (MuLV), Harveyův virus myšího sarkomu (HaMSV), Abelsonův virus myší leukemie (A-MuLV), AKR-MuLV, virus kočičí leukemie (FeLV), virus opičího sarkomu, virus retikuloendoteliózy (REV), virus nekrózy sleziny (SNV)], virus B-typu [například virus tumoru myší mléčné žlázy (MMTV)] a virus D-typu [například Mason-Pfizerův opičí virus (MPMV) a SAIDS viry], RNA virus podčeledi Lentivirus je přednostně virus lidské imunodeficience typu 1 nebo 2 [tj. HIV-1 nebo HIV-2, kde HIV-1 byl dříve nazýván lymfadenopatii přidružený virus 3 (HTLV-III) a (ARV) virus příbuzný syndromu získané imunodeficience (AIDS), nebo jiný virus příbuzný s HIV-1 nebo HIV-2, který byl identifikován a asociován s AIDS nebo AIDS podobnou chorobou. Akronym HIV nebo virus lidské imunodeficience jsou zde užívány tak, že se genericky týkají HIV • · ··« • · virů a virů HIV- příbuzných a -přidružených. Kromě toho RNA virus podčeledi Lentivirus je přednostně Visna/maedi virus (například jako ovčí nákaza), (FIV) virus kočičí imunodeficience, lentivirus skotu, (SIV) virus opičí imunodeficience, (EIAV) virus koňské infekční anemie a (CAEV) virus kozí artritidy-encefalitidy. Vynález může být rovněž aplikován na DNA viry. DNA virus je především herpes virus (jako virus Epstein-Barr, herpes simplex viry, cytomegalovirus), adenovirus, AAV, papilomavirus, virus vakcinie a podobně.
Musí se poznamenat, že kde jsou v tomto textu a připojených patentových nárocích používány tvary jednotného čísla, zahrnují odpovídající odkazy i v čísle množném, pokud z kontextu jasně nevyplývá jinak.
Exprese zahrnuje transkripci desoxyribonukleové kyseliny a/nebo translaci ribonukleové kyseliny.
Zde používaný termín zahrnující a jeho obdoby, jsou používány v jejich inkluzivním smyslu, to jest ekvivalentně k termínu obsahující a jeho odpovídajícím obdobám.
Podmínky, které dovolují či „umožňují“, aby jev probíhal, nebo podmínky, které jsou vhodné pro průběh jevu, jako je iniciace transkripce nebo translace, extenze nebo prodloužení a podobně, jsou podmínky, které nebrání nebo neinhibují průběh takového jevu. Tyto podmínky tedy dovolují, zvyšují, usnadňují a/nebo jsou jevu nápomocné. Takové podmínky, v praxi známé a zde popsané závisí například na povaze nukleotidové sekvence, teplotě a podmínkách pufrování. Tyto podmínky jsou závislé na případu, jaký je požadován, jako jsou interakce nukleová kyselina/protein, interakce protein/protein, transkripce nebo translace.
Termín 3‘ (tři s čárkou) se obecně vztahuje na oblast nebo polohu v polynukleotidu nebo oligonukleotidu 3‘ (po směru exprese genu) od jiné oblasti nebo polohy v témž polynukleotidu nebo oligonukleotidu.
Termín 5‘ (pět s čárkou) se obecně vztahuje na oblast nebo polohu v polynukleotidu nebo oligonukleotidu 5‘ (proti směru exprese genu) od jiné oblasti nebo polohy v témž polynukleotidu nebo oligonukleotidu.
Termín 3‘-DNA část, 3‘-DNA oblast, 3‘-RNA část a 3‘-RNA oblast se týká části nebo oblasti polynukleotidu nebo oligonukleotidu umístěné směrem ke 3' konci polynukleotidu nebo oligonukleotidu a může nebo nemusí zahrnovat 3‘-krajní nukleotid(y) nebo jednotky připojené k 3‘-krajnímu nukleotidu téhož polynukleotidu nebo oligonukleotidu.
• ·
Termín 5-DNA část, 5‘-DNA oblast, 5‘-RNA část a 5‘-RNA oblast se týká části nebo oblasti polynukleotidu nebo oligonukleotidu umístěné směrem k 5‘ konci polynukleotidu nebo oligonukleotidu a může nebo nemusí zahrnovat 5‘-krajní nukleotid(y) nebo jednotky připojené k 5‘-krajnímu nukleotidu téhož polynukleotidu nebo oligonukleotidu.
Výraz heterologní se týká vztahu mezi dvěma materiály, když se v přírodě nebo ve svém přírodním stavu normálně společně nevyskytují. Výraz endogenní se týká vztahu mezi dvěma materiály, když se v přírodě nebo ve svém přírodním stavu normálně společně vyskytují. Například kódující sekvence může být operativně spojena s heterologním promotorem, který v přírodě se sekvencí normálně asociován není, a se svým endogenním promotorem, se kterým je v přírodě normálně asociována. Eventuelně může být nukleová kyselina kovalentně spojena s heterologní sekvencí, se kterou se uvedená nukleová kyselina normálně vyskytuje, s tou výjimkou, že heterologní sekvence má antisense orientaci. Kódující sekvence je operativně spojena s promotorem (například když i kódující sekvence i promotor spolu vytváří nativní nebo rekombinantní konstrukt se schopností být exprimován), když je promotor způsobilý k řízení transkripce kódující sekvence.
Pokud není uvedeno jinak, všechny zde používané technické a vědecké termíny mají tentýž význam jak mu obecně rozumí ten, kdo má průměrnou zkušenost v oboru, ke kterému tento vynález patří.
Předložený vynález poskytuje (expresní) konstrukty nukleové kyseliny, které, když jsou použity v kombinaci, regulují expresi jedné nebo více než jedné žádané kódující sekvence. Žádaná kódující sekvence může kódovat RNA nebo polypeptid, na jehož expresi je zájem či požadavek. Konstrukty nukleové kyseliny jsou přednostně rekombinantního charakteru a účinkují postupně tak, že regulují expresi žádané kódující sekvence, která bude tedy umístěna na posledním konstruktu. Výsledkem každého konstruktu je exprese produktu, který pak reguluje expresi z následujícího konstruktu, dokud nakonec prostřednictvím posledního konstruktu není kontrolována exprese požadované sekvence. Každý konstrukt preferenčně a individuálně obsahuje regulační oblast, která je indukovatelná a/nebo regulovaná expresí z jiného konstruktu. Konstrukty obsahují případně také volitelné nebo detegovatelné signální znaky pro usnadnění jejich identifikace a použití. Jako detegovatelný signální znak může sloužit regulační nebo kódující sekvence přítomná na konstruktu, avšak nikoliv endogenní vůči buňkám, do nichž byl konstrukt zaveden.
«· » · > · • · ·
Konstrukty podle vynálezu jsou přednostně přítomny v buňce nebo buněčné linii užívané k pakážování virových vektorů. Konstrukty tedy regulují expresi jedné nebo více než jedné virové komponenty potřebné pro pakážování uvedeného vektoru. Virovou komponentou může být jakýkoliv virový genový produkt, který je nezbytný pro vlastní pakážování, včetně, ale takto to omezeno není, virového obálkového proteinu, kapsidového proteinu, gag nebo pol kódovaných proteinů v případě retrovirů a/nebo virového regulačního proteinu. Nukleové kyseliny kódující tyto virové komponenty mohou být umístěny na jedné nebo více než jedné molekule nukleové kyseliny, pokud mohou být exprimovány, aby výsledkem bylo příslušné pakážování virového vektoru. Aby se snížila pravděpodobnost rekombinace mezi virovým vektorem a konstrukty rezultujícími na vektory obsahující všechny virové komponenty, jsou nukleové kyseliny kódující virové komponenty přednostně rozděleny do různých molekul nukleové kyseliny. Preferované virové komponenty, které mají být exprimovány, jsou komponenty kódované gag/pol sekvencemi HIV-1 nebo HIV-2, retrovirovým (nejlépe z HIV-1 nebo -2) rev proteinem a proteinem virové obálky.
Například a bez omezování vynálezu, může vynález zahrnovat tři konstrukty pro expresi žádané kódující sekvence. První konstrukt nukleové kyseliny je schopen exprimovat první produkt, kde tento první produkt je schopen regulovat expresi druhého produktu z druhého konstruktu nukleové kyseliny a kde tento druhý produkt je schopen regulovat expresi produktu kódovaného uvedenou kódující sekvencí, která je předmětem zájmu a která je přítomna na třetím konstruktu nukleové kyseliny. Přednostně nejméně jeden z těchto tří konstruktů nukleové kyseliny obsahuje heterologní nukleové kyseliny. U jiných preferovaných provedení je exprese z prvního a druhého konstruktu přímou regulací transkripce a/nebo translace, zatímco exprese žádané sekvence z třetího konstruktu se děje regulací sestřihu a/nebo nukleárního exportu.
V jednom provedení vynálezu obsahuje první konstrukt indukovatelný nebo jinak regulovaný promotor, jako je tetracyklinový promotor/operátor nebo steroid anebo promotorovou oblast ekdyzonu. Jiný regulační systém byl vyvinut u ARIAD Pharmaceuticals lne. Promotor je operativně spojen na první kódující sekvenci, jež kóduje produkt, který reguluje expresi z druhého konstruktu. Při jednom preferovaném provedení vynálezu obsahuje první konstrukt tetracyklinový promotor a první kódující sekvenci, která kóduje aktivátor tetracyklinového promotoru (nebo • · · · • · · · • ··· · · fúzní protein obsahující aktivátor, jako je tTA, ale není to takto omezeno) tak, že první konstrukt je autoregulační a v přítomnosti tetracyklinu exprese neprobíhá. Alternativně kóduje první kódující sekvence retrovirový, přednostně HIV-1 nebo HIV2, tat protein.
Indukce transkripce odstraněním tetracyklinu rezultuje v tomto případě do exprese tet aktivátoru či eventuelně tat proteinu. Druhý konstrukt nukleové kyseliny bude tedy obsahovat tet promotor/operátor, nebo případně tat regulovanou oblast promotoru, jako je 5' LTR promotor, regulovaný exprimovaným tat proteinem. Kódující sekvence uvedené druhé sekvence nukleové kyseliny může kódovat jakýkoli konstrukt, který reguluje expresi třetího konstruktu. V provedení vynálezu, které není omezující, může druhá sekvence nukleové kyseliny kódovat retrovirový rev protein pro regulování sestřihu mRNA a/nebo nukleového exportu požadované kódující sekvence přítomné ve třetím konstruktu. V provedeních vynálezu zahrnujících expresi rev proteinu může být promotorem přítomným na třetím konstruktu jakýkoliv vhodný promotor schopný exprimování požadované kódující sekvence, jako je mRNA, v úrovních dostačujících, aby výsledkem byly požadované úrovně produkce proteinu po patřičném sestřihu a/nebo nukleovém exportu v přítomnosti rev proteinu. Promotor je přednostně retrovirový, nejlépe HIV, 5‘ LTR nebo z cytomegaloviru (CMV), nejlépe lidský nebo opičí CMV.
Žádaná kódující sekvence na třetím konstruktu, aplikovaná k pakážování buněk podle předloženého vynálezu, může kódovat virový obálkový protein (například z retroviru), přednostněji HIV-1, HIV-2 nebo MMLV obálkový protein, G protein z viru vezikulární stomatitidy (VSV), viru Mokola nebo viru vztekliny, GaLV, glykoprotein Alfaviru E1/2 nebo RD114, env protein kočičího endogenního viru. Jinak mohou být použity sekvence kódující chimérový obálkový protein. Použity mohou být rovněž obálkový protein kódující sekvence z následujících virových čeledí: Piconaviridae, Tongaviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Paroviridae, Poxviridae, Hepadnaviridae a herpes viry.
Při alternativním provedení vynálezu, kde první konstrukt obsahuje tetracyklinový promotor/operátor, operativně připojený k sekvenci kódující receptor steroidního hormonu, je výsledkem indukce exprese exprimování uvedeného receptoru. Druhý konstrukt bude tedy mít promotor, který je regulován uvedeným receptorem steroidního hormonu (iniciace od uvedeného promotoru je aktivována ···· · · · · · · • · · · · · ··· · 9 9 9 ♦ · ····· · · 9 9 9 9 9 999 *·♦’ *..· *,.* í komplexem zahrnujícím receptor a aktivační ligand). Při nepřítomnosti uvedeného komplexu je promotor inaktivní. Kódující oblast druhého konstruktu může opět kódovat jakýkoliv produkt, který reguluje expresi ze třetího konstruktu. Například kódující sekvence druhého konstruktu může kódovat retrovirový tat nebo rev protein. U kódovaného tat proteinu obsahuje třetí konstrukt oblast, která dovoluje, aby byla exprese regulována tat proteinem, jako je, ale omezující to není, retrovirový 5‘ LTR promotor a sekvence kódující cis-působící RNA element, označované TAR. U kódovaného rev proteinu musí být pouze exprese třetího konstruktu pod regulací rev proteinem (prostřednictvím sestřihu mRNA a/nebo kontroly nukleového exportu), jak je diskutováno výše.
Retrovirový tat protein, aplikovaný na buňky k pakážování virového vektoru, může být z heterologního viru vzhledem k viru z virového vektoru. Virový vektor může být derivován z HIV-1 a, bez omezování vynálezu, může být v jednom nebo více konstruktů nukleové kyseliny podle vynálezu použit chimerový retrovirový promotor. Neomezující příklad chimerového retrovirového promotoru je retrovirový 5‘ LTR promotor obsahující heterologní TAR sekvenci, takže pro expresi kódující sekvence připojené k promotoru je zapotřebí exprese příbuzného heterologního tat proteinu. Preferovaný chimerový promotor zahrnuje HIV-1 5‘ LTR promotor obsahující HIV-2 TAR sekvenci. Když je použit v kombinaci s konstruktem schopným exprimování HIV-2 tat proteinu, je exprimována kódující sekvence operativně připojená k chimerovému promotoru.
V dalších provedeních vynálezu, v nichž je v jednom nebo více než jednom konstruktu podle vynálezu používán prvek TAR, nemusí být tat protein kódující sekvence přítomna v žádném konstruktu zde popisovaného expresního systému. Místo toho může být požadavku TAR na příbuzný tat protein vyhověno dodáním tat proteinu z jiného zdroje. Například tam, kde jsou konstrukty podle vynálezu zaváděny do buňky, může buňka obsahovat další, případně do buněčného genomu integrovaný, konstrukt nukleové kyseliny, který potřebný tat protein exprimuje. Takové jednoduché expresní konstrukty jsou v oboru dobře známy.
Jeden příklad shora uvedeného je, když je tat protein použit v kombinaci se systémem exprese podle vynálezu. Kde mají být exprimovány dvě sekvence nukleové kyseliny, o něž je zájem, může být první pod kontrolou expresního systému podle vynálezu, zatímco druhá je pod kontrolou jak uvedeného systému, tak tat proteinu exprimovaného z jiného zdroje, jak je popsáno shora. Například k regulování exprese první požadované sekvence (z třetího konstruktu) prostřednictvím rev proteinu (z druhého konstruktu) mohou být použity tři konstrukty. Druhá žádaná sekvence je potom exprimována ze čtvrtého konstruktu, který je regulován rev proteinem (z druhého konstruktu) a tat proteinem. První požadovaná sekvence je tedy pouze pod kontrolou systému, zatímco druhá požadovaná sekvence je pod kontrolou, jak systém, tak tat proteinu. V tomto alternativním provedení vynálezu mohou být samozřejmě použity heterologní tat proteiny i TAR elementy. Při další alternativě může být první sekvence, o niž je zájem, rovněž vytvořena tak, že ji reguluje tat.
Jako alternativa k použití tat kódujících sekvencí mohou být použity sekvence kódující chimerový tat protein. Tat byl vytvořen ve fúzovaném proteinu (například Tat-Gal4) a prokázal, že zachovává svoji transaktívační aktivitu HIV-LTR promotoru. Rovněž jiné chimerové tat proteiny mohou být použity, pokud je zachovávána dostatečná transaktívační aktivita.
Vždy, když je k regulování exprese z následujícího konstruktu použit rev protein, kódující sekvence uvedeného následujícího konstruktu obsahuje, nebo je modifikována, aby obsahovala, rev responzivní element (RRE) a vhodné donorové a akceptorové místo sestřihu pro regulaci rev proteinem. Například, a aniž by to vynález omezovalo, kde uvedený třetí konstrukt obsahuje kódující sekvenci, která kóduje virovou obálku nebo G protein, obsahuje kódující sekvence donorové a akceptorové místo sestřihu, která vyžadují příbuzný rev protein pro příslušný sestřih a/nebo nukleový export, aby mohla být exprimována obálka nebo G protein. Místa mohou být případně volena tak, aby zajišťovala zmírněné fungování sestřihu ve spojení s rev proteinem. Zmírnění poskytuje způsob, jak učinit expresi více závislou na rev proteinu a RRE. Například, je-li v povaze míst pro sestřih příliš rychlá funkce, může být vystřižena kódující sekvence, o kterou je zájem, předtím, než rev protein a RRE mají příležitost exportovat mRNA a dovolit expresi sekvence. Místa sestřihu jsou tedy volena tak, aby v nepřítomnosti rev proteinu umožňovala sestřih a potlačovala expresi, zatímco v přítomnosti rev proteinu sestřih potlačují a expresi umožňují.
Na konstrukty podle vynálezu lze nahlížet a používat je v kombinaci jako expresní systém pro kódování sekvence, o kterou je zájem. Mimo to k regulování exprese dvou nebo více požadovaných kódujících sekvencí současně mohou být kombinovány dva nebo více expresních systémů obsahujících identické konstrukty.
• · • · • * • · • · · • · · · ·
Například, a aniž by to vynález omezovalo, první dva konstrukty mohou být identické s druhým konstruktem regulujícím expresi žádaných kódujících sekvencí na dvou nebo více třetích konstruktech, každém schopném exprimování kódující sekvence, o kterou je zájem. Při jednom provedení tohoto příkladu může první konstrukt obsahovat tetracyklinem indukovatelný promotor, operativně připojený ke kódující sekvenci, která kóduje produkt, jenž reguluje expresi rev protein kódující sekvence v druhém konstruktu. Žádané kódující sekvence v každém ze dvou nebo více třetích konstruktů jsou modifikovány, aby obsahovaly donorové a akceptorové místo sestřihu tak, že exprese kódujících proteinů probíhá za přítomnosti rev proteinu exprimovaného druhým konstruktem. V konkrétním příkladu mohou být dvě žádané kódující sekvence přítomny ve dvou třetích konstruktech: první kódující sekvence je retrovirová, přednostně HIV, gag/pol sekvence operativně připojená na RRE a druhá kódující sekvence je VSV-G nebo G protein viru Mokola, operativně spojený s RRE. Jak je poznamenáno shora, promotorem těchto dvou třetích konstruktů může být každý promotor schopný dostatečné exprese za přítomnosti rev proteinu.
Jak se zde uvádí, exprese z prvního konstruktu nukleové kyseliny je přednostně přesně regulována nebo dokonce autoregulována. Jako neomezující příklad je přesná regulace opatřena mechanizmem zpětné vazby, kde produkt z prvního konstruktu nukleové kyseliny může potlačit (přímo nebo nepřímo) svoji vlastní expresi. V nepřítomnosti aktivace je výsledkem této autoregulace prvního konstruktu nukleové kyseliny velice malá bazální aktivita, takže dochází k malé až žádné expresi z jiných konstruktů expresního systému podle vynálezu. Namísto toho a po aktivaci exprese z prvního konstruktu nukleové kyseliny následuje exprese všech dalších konstruktů v systému.
Konstrukty a systémy podle vynálezu mohou být inkorporovány do vektorů nebo zaváděny do buněk jako jsou buňky savčí, buňky hlodavců, buňky primátů nebo buňky lidské, ale neomezuje se to na ně. Konstrukty podle vynálezu mohou být integrovány do buněčného genomu nebo udržovány jako epizomální konstrukty. Preferovanými buňkami podle vynálezu jsou takové, u nichž je vyžadována exprese kódující sekvence, o kterou je zájem, samotné nebo v kombinaci s expresí s jinou nukleovou kyselinou. Konstrukty podle vynálezu mohou být zaváděny do buněk v jakémkoli pořadí. Přítomnost konstruktů v buňkách po zavedení může být potvrzena detegováním uvedených konstruktů pomocí volitelných či detegovatelných signálních znaků umístěných na uvedeném konstruktu.
• ·
Zatímco každý konstrukt podle vynálezu může být přítomen na individuální molekule nukleové kyseliny, některé preferované aplikace zahrnují jednu molekulu nukleové kyseliny obsahující více než jeden konstrukt podle vynálezu. Například a jako neomezující příklad vztahující se k přípravě stabilní buněčné linie, jsou konstrukty podle vynálezu stabilně integrovány do jednoho nebo více než jednoho chromozomu buňky, aby produkovaly stabilně transfektovanou buněčnou linii. Eventuelně mohou být konstrukty před zavedením do uvedené buňky umístěny na jednom nebo více než jednom epizomálním vektoru nebo plazmidu. Individuální konstrukty, aplikované do buněk pro pakážování virových vektorů, se přednostně rozdělují do různých molekul nukleových kyselin, aby se zvýšil počet rekombinací s virovým vektorem potřebných k tomu, aby byl replikačně kompetentní. Konstrukty podle vynálezu, zejména části jejich regulačních a kódujících sekvencí, přednostně obsahují sekvence, které jsou původem z virů. Pro provádění vynálezu jsou tedy preferovány virové regulační oblasti (které působí v poloze cis) a kódující oblasti (které působí v poloze trans), Příklady v poloze cis působících oblasti jsou TAR a RRE, INS elementy retrovirů (inhibiční sekvence nebo sekvence nestability označované také jako CRS), zatímco příklady v poloze trans působících oblastí jsou tat a rev kódující sekvence. Buňky užívané s virovými konstrukty jsou přednostně prosté jiných virových sekvencí než těch, které mají být zavedeny konstrukty podle vynálezu.
V konstruktech podle vynálezu je přednostně používán RRE, heterologní k virové nukleové kyselině, o kterou je zájem. Příklady zahrnují, ale neomezují se na HIV-2 RRE pro HIV-1 derivovanou nukleovou kyselinu, CTE (konstitutivní transportní element, například z Masonova-Pfizerova opičího viru a jiné retroviry) nebo PRE (post-transkripční regulační element, například z viru hepatitidy sviště lesního). Vedle snížení, minimalizování nebo eliminování možnosti homologní rekombinace, založené na různých RRE majících různé sekvence, bylo pozorováno překvapující a neočekávané zvýšení produkce pakážované virové nukleové kyseliny až přibližně pětinásobné.
Mezi různými provedeními vynálezu je exprese žádané kódující sekvence, při které je kódovaný produkt toxický vůči buňkám nebo hostiteli, ve kterém k expresi dochází. Příklady zahrnují virové gag-pol proteiny a obálkové proteiny, například VSV G protein. Úplný rozsah vynálezu nicméně zahrnuje jeho použití pro expresi sekvencí, které jsou buď vůči buňce nebo hostiteli netoxické, nebo toxické pouze za » ·« • · • · · · • · « • · « > »· φ· ·
Λ · · • · · · • · · · · • · · «·* · specifických podmínek, jako je exprese při vysokých úrovních nebo v přítomnosti dalších faktorů, které k toxicitě přispívají.
Jeden preferovaný aspekt vynálezu se týká přípravy buněk a buněčných linií, které obsahují konstrukty podle vynálezu. Metody pro zavádění konstruktů nukleové kyseliny do buněk, včetně využívání podmínek vedoucích k integraci do buněčného genomu (jako je elektroporace, lipofekce a precipitace fosforečnanem vápenatým) jsou v praxi známé. Při preferovaných provedeních jsou konstrukty a buňky konstruovány tak, aby poskytovaly nezbytné faktory pro produkci virových částic obsahujících konkrétní virovou nukleovou kyselinu, která je žádána. Virová nukleová kyselina přednostně postrádá replikaci a je odvozena z přírodně se vyskytujícího viru bez odstranění nebo ztráty endogenního pakážovacího signálu. Při zvláště preferovaných provedeních vynálezu je virová nukleová kyselina odvozena z HIV-1. Virové nukleové kyseliny odvozené z HIV-1 mohou být produkovány pomocí pNL43HIV-1 molekulového klonu, což je standardní kmen, který lze získat z AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog přes National Institutes of Health [viz rovněž Adachi a spol., J. Virol. 59, 284-291 (1986)]. Na tyto buňky lze nahlížet a používat je jako pakážovací buňky pro virovou nukleovou kyselinu, které mohou být odděleně zavedeny do buňky, protože produkují všechny komponenty potřebné pro pakážování virové nukleové kyseliny v infekčních virových částicích.
Preferované pakážující buňky exprimují ze žádané sekvence alespoň virový obálkový protein nebo ekvivalent (například mutant, jeho fúzovanou nebo zkrácenou formu), nebo jeho heterologní formu, když virová nukleová kyselina poskytuje všechny ostatní složky. Preferovanými obálkovými proteiny jsou ty, které jsou kódovány sekvencemi endogenními k virové nukleové kyselině v její přírodní formě (tj. která je normálně užita při pakážování viru, z něhož je virová nukleová kyselina odvozena) nebo heterologními k virové nukleové kyselině. Při praktickém provádění tohoto vynálezu může být exprimována široká paleta obálkových proteinů, počítaje v to proteiny pro měnění specificity cílové buňky pakážované virové částice nebo alternativní obálkové proteiny rezultující na pseudotypické virové částice. Preferované obálkové proteiny pro užití s HIV-1 odvozenými virovými nukleovými kyselinami zahrnují VSV G protein, G protein viru Mokola a HIV-2 obálkový protein.
Eventuelně poskytují buňky alespoň virový obálkový protein a jeden nebo více než jeden protein potřebný pro expresi pakážovacích komponent z virové nukleové kyseliny, u které má k pakážování dojít. Neomezujícím příkladem jsou buňky, které • · • » • · ·
• ·
poskytují jak obálkový protein, tak příbuzný tat protein, nebo jeden či více než jeden další protein požadovaný jako trans, pro pakážování retrovirové nukleové kyseliny (tj. buňky, které poskytují VSV G protein a HlV-tat protein pro pakážování vektoru odvozeného z HIV-1). Příklady dalších proteinů požadovaných jako trans představují proteiny, které jsou kódovány gag, pol a rev sekvencemi.
Virová nukleová kyselina, která je předmětem zájmu a u které má dojít k pakážování, přednostně postrádá schopnost exprimovat nebo kódovat jednu nebo více než jednu ze sekvencí průvodního virového proteinu (jako je, ale bez omezování, Vif, Vpu, Vpr nebo Nef nebo jejich kombinace či fragmenty), které by mohly učinit nukleovou kyselinu patogenní nebo eventuálně patogenní. Toto může být dosaženo odstraněním odpovídajících kódujících sekvencí nebo jejich mutováním, aby se zabránilo jejich expresi na úrovni transkripce nebo translace. Takové proteiny, do té míry, že jsou nezbytné pro pakážování, budou dodávány pakážovacími buňkami buď pomocí konstruktů podle vynálezu nebo dalším konstruktem nukleové kyseliny.
Exprese jednoho nebo více než jednoho virového proteinu pakážovacími buňkami podle vynálezu může být potvrzena rozličnými, v oboru známými metodami, včetně metod ELISA, jako je sendvičová ELISA, užívající jednu nebo více než jednu protilátku pro rozeznání virového/virových proteinu/proteinů. Další neomezující příklady metod představuje imunologický test a westernový přenos.
Virové nukleové kyseliny, o které se jedná, které mají být pakážovány takovými buňkami, mohou případně obsahovat jednu nebo více než jednu heterologní sekvenci, o kterou je zájem, pro pakážování svrchu zmíněnými pakážovacími buňkami. Příklady takových heterologních sekvencí zahrnují genetické antivirové činidlo, jak se popisuje v US patentu 6 168 953. Typické příklady představují ribozymy, antisense sekvence a/nebo klamné nukleové kyseliny.
Při jednom preferovaném provedení vynálezu je virová nukleová kyselina podmíněně replikujícím vektorem, jak se popisuje v US patentu 5 885 806 a v US patentové přihlášce 09/562,894 podané 1. května 2000. V dalším preferovaném provedení je virová nukleová kyselina takovým podmíněně replikujícím vektorem, které zahrnuje rovněž endogenní sekvence kódující gag a pol protein. Buňky mohou být tedy posuzovány a používány jako systém pro pakážování uvedené/uvedených heterologní/heterologních sekvence/sekvencí ve virových částicích. Částice mohou • · · · · · ·· · ♦ * • · · · · · ·
I « · · · · « jako prostředek dodávání být potom nahlíženy a používány pakážovací/pakážovacích sekvence/sekvencí do buněk infekcí.
Při dalším výhodném provedení jsou virová nukleová kyselina a konstrukty podle vynálezu konstruovány tak, že existuje minimální identita mezi jejich sekvencemi, aby se snížila možnost rekombinace mezi nimi pro redukování pravděpodobnosti vzniku replikace schopných virových nukleových kyselin. Přednostně je mezi virovou nukleovou kyselinou a konstrukty podle vynálezu méně než asi 8 identických zbytků nukleových kyselin, avšak výhodnější je méně než asi 6 a asi 4 identické zbytky. Metody zavádění takové neidentičnosti zahrnují odstranění neexprimovaných nebo nekritických sekvencí z virové nukleové kyseliny a/nebo konstruktů nebo degenerování sekvencí, které se nalézají v obou, aby se snížila frekvence sekvenčně identických zbytků.
Metody použití konstruktů podle vynálezu zahrnují jejich zavedení do buněk, které jsou schopny je exprimovat, pro získání buněčného expresního systému pro jednu nebo více kódujících sekvencí, které jsou předmětem zájmu. Aby takové buněčné systémy in vivo exprimovaly požadovanou kódující sekvenci, mohou být případně zavedeny do vícebuněčného hostitele nebo v takovém hostiteli již přítomny. Buněčný expresní systém může být použit k exprimování uvedené požadované kódující sekvence buď pro následující izolaci nebo rafinaci nebo být užit při jiné buněčné metabolické aktivitě, jako je pakážování virových částic.
Pakážované virové částice se mohou nacházet v supernatantu obklopujícím pakážované buňky a z něho případně izolovány. Částice budou mít přednostně vysoký titr i transdukční efektivitu pro zavedení žádané pakážované virové nukleové kyseliny do cílové buňky.
Z jiného hlediska poskytuje vynález metody získávání popsaných konstruktů a systémů způsoby v oboru běžnými. Rekombinantní užití různých konstruktů nukleových kyselin, včetně technik úpravy nukleových kyselin sestřihem a buněčné transformace, je v praxi oboru dobře zavedeno a může být použito bez zbytečného experimentování. Pokud se týká buněk pro pakážování virových vektorů, poskytuje vynález metody kultivace takových buněk po introdukci do uvedeného virového vektoru za podmínek napomáhajících buněčnému růstu a produkci vektoru způsoby v oboru dobře zavedenými.
Podle dalšího hlediska vynálezu mohou být konstrukty a jejich systémy připraveny ve formě soupravy k použití pro expresi jedné nebo více než jedné • · « ♦ · · ···· « · · «» · požadované sekvence. Taková souprava obsahuje případně jiné komponenty potřebné k provádění vynálezu, včetně, avšak bez omezení, vhodných buněčných linií, pufrů, solí, stabilizátorů lyofilizace nebo stabilizačních pomůcek. Soupravy podle vynálezu obsahují konstrukty, jak se zde popisují, a mohou rovněž obsahovat další materiály, které usnadňují provádění vynálezu, jako například, ale není to omezující, zařízení k využívání vynálezu a/nebo použití konstruktů, systémů nebo buněk, které je obsahují. Položky, které souprava obsahuje, mohou být podle přání zkušeného praktika dodávány ve formě individuálních balíčků a/nebo baleny společně.
U jednoho provedení obsahuje souprava nejméně jeden expresní systém ve vhodném obalu. Přednostně souprava obsahuje alespoň označení, například, ale bez omezení, obal nebo nálepku, která soupravu identifikuje, položky vhodné pro použití při aplikacích předloženého vynálezu a/nebo alespoň jeden pokyn týkající se používání soupravy nebo jednotlivých položek při zde popsaných aplikacích předloženého vynálezu. Tento alespoň jeden pokyn může být případně součástí většího souboru pokynů týkajících se použití soupravy nebo položky při zde popisovaných aplikacích předloženého vynálezu, nebo vztahujících se k používání soupravy nebo sloučeniny při provádění předloženého vynálezu. Zvláště jsou preferovány ty soupravy, které jsou pomocí balení, nálepky nebo pokynů označeny jako vhodné k použití při exprimování žádané sekvence.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 je diagram expresního systému podle vynálezu pro regulování exprese jak retrovirové gag/pol kódující oblasti, tak VSV-G proteinu v buňce. Systém používá čtyři konstrukty, přičemž první je autoregulovaný expresní konstrukt pro tTA pod kontrolou TRE regulovaného promotoru. Druhý konstrukt exprimuje retrovirový rev protein pod kontrolou TRE regulovaného promotoru. Třetí konstrukt exprimuje retrovirovou RRE obsahující gag/pol kódující oblast pod kontrolou chimerového retrovirového promotoru. Čtvrtý konstrukt exprimuje VSV-G transkript, regulovaný RRE a pod kontrolou heterologního promotoru, jako je promotor opičího cytomegaloviru.
Obr. 2 ukazuje struktury řady různých konstruktů nukleové kyseliny podle vynálezu. Jsou ukázány konstrukty, které umísťují rev kódující sekvence pod
ΦΦΦ φ φ kontrolou promotoru cytomegaloviru (CMV) nebo tetracyklinu (TRE). Organizace pTRE-tTASvPuroTKTat je zde popsána v příkladu 1. pCGCRSRRE-1M je zčásti v detailu na obr. 5. Plazmidy pVP1.2RznoG a pVP1.2RznoG-U31TAR2 (kde IRES je interní vstupní místo ribozomu) jsou zde podrobně uvedeny v příkladu 7. Plazmidy pN2CGFP a pN1(cpt)CGFP zde jsou diskutovány v příkladech 5 a 7.
Obr. 3 ukazuje transfektovaný HT1080-TR klon po imunotestu s anti-Rev a and Tat protilátkami v přítomnosti nebo v nepřítomnosti tetracyklinu pro regulování res exprese. Zde viz příklad 2.
Obr. 4 ukazuje diagramy chimerového U3/TAR2 promotoru zde diskutovaného v příkladu 7.
Obr. 5 ukazuje diagramy konstruktů majících různé uspořádání donorového a akceptorového místa sestřihu pro poskytnutí genové exprese Rev responzivní (závislé) nebo neresponzivní (nezávislé).
Obr. 6 ukazuje westernový přenos demonstrující rev-dependentní expresi VSV-G proteinu cestou použitím různých donorových míst sestřihu.
Příklady provedení vynálezu
Sloučeniny a metody podle vynálezu jsou dále popisovány v kontextu následujících příkladů. Tyto příklady slouží k další ilustraci předloženého vynálezu a nejsou zamýšleny pro omezování rozsahu vynálezu.
Příklad 1
Regulace systémem genové regulace tetracyklinem
Obrázek 1 ukazuje diagram typického systému regulované exprese genu podle vynálezu, kde dvě žádané kódující sekvence, retrovirová gag/pol sekvence a VSV-G obálkový protein, jsou současně regulovány expresí ze dvou jiných konstruktů nukleové kyseliny. Systém může být tedy nazírán jako kombinace dvou a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a systémů po třech konstruktech nukleové kyseliny, kde první a druhé konstrukty jsou používány společně mezi dvěma systémy.
V preferovaném expresním systému podle vynálezu je tTA exprimován z TRE promotoru (tet operon), což umožňuje jak vysokou úroveň indukovatelné exprese, tak nízkou bazální expresi v nepřítomnosti indukce. To vyplývá z toho, že TRE promotor je velmi slabý a jakákoliv tTA exprese z promotoru bude v přítomnosti tetracyklinu při kontaktu se systémem zcela inaktivována. Po odstranění tetracyklinu je tTA exprese silně indukována pozitivním mechanizmem zpětné vazby a dojde k produkci vysokých úrovní tTA, který indukuje expresi druhého konstruktu nukleové kyseliny.
Schematické diagramy struktur prvních dvou konstruktů, pTREtTASvPuroTKTat a pTRE-Rev (obr. 1) jsou uvedeny na obrázku 2. V pTREtTASvPuroTKTat je tTAT exprimován z TRE promotoru, Tat je exprimován z HSV TK promotoru a selekční signální znak genu rezistentního na puromycin je exprimován z SV40 prvotního promotoru. Tam, kde došlo k integraci obou konstruktů do buněk, bude exprese Rev v buňkách pod kontrolou tetracyklinu, jak je popisováno shora.
Příklad 2
Konstrukce pakážovacích buněčných linií založených na HT1080
HT1080 buňky byly transfektovány spolu s pTRE-Rev a pTREtTATvPuroTKTat plazmidem DNA při molárním poměru 10:1. Transfektované buňky byly kultivovány v prostředí, umožňujícím výběr na rezistenci vůči puromycinu. Po 2 až 3 týdnech se vytvořily jednotlivé kolonie buněk a byly vybrány, expandovány a zkoumány imunologickým testem za použití anti-Rev protilátky.
Regulace exprese Rev tetracyklinem: buňky od jednoho z pozitivních klonů 2A3(1) byly 48 hodin pěstovány ve čtyřjamkové desce v přítomnosti nebo nepřítomnosti tetracyklinu. Potom byly buňky fixovány a testovány s anti-Rev protilátkou nebo anti-Tat protilátkou. Obrázek 3 ukazuje, že z TRE promotoru exprimovaný Rev je přesně kontrolován tetracyklinem. V přítomnosti tetracyklinu nebyla žádná buňka pozitivní, avšak téměř každá jednotlivá buňka byla za použití anti-Rev protilátky v nepřítomnosti tetracyklinu testována pozitivně. Protože Tat gen byl konstitutivně exprimován z HSV TK promotoru, téměř všechny buňky byly pozitivně testovány anti-Tat protilátkou jak v přítomnosti, tak nepřítomnosti tetracyklinu. Tyto výsledky naznačují, že exprese Rev je přesně regulována tetracyklinem a tTA, který je exprimován z TRE promotoru.
Příklad 3
GagPol integrace
Dva HT1080-TR klony (stabilně transfektovány s pTRE.Rev a pTRE.tTASvPuroTKTat, jak popsáno shora) byly pro GagPol integraci transfektovány spolu s p(SCNV.Neo) a p(U3-1TAR2.GagPolRRE) v poměru 1: 10 a selektovány neomycinem 48 h po začátku transfekce. p(SCMV.Neo) obsahuje zvolitený neomycinu rezistentní gen pod kontrolou opičího CMV promotoru. p(U31TAR2.GagPolRRE) má RRE obsahující GagPol kódující sekvenci pod kontrolou modifikovaného U3 promotoru z HIV-1 obsahujícího TAR2 sekvenci z HIV-2.
Rezistentní klony byly tříděny pomocí p24 eseje a bylo vybráno celkem 40 pozitivních klonů s různými p24 hodnotami a označeno jako HT1080-TRGP nebo pre-pakážovací buněčná linie. Nejvyšší klon mohl produkovat přes 5000 ng/ml p24 a byl indukován více než tisíckrát (viz tabulka 1). Většina klonů poskytla v přítomnosti tetracyklinu 100 až 200násobnou indukci a nízkou úroveň pozadí p24 (3 až 9 ng/ml; tabulka 1). To naznačuje, že GagPol exprese je kontrolována tetracyklinem prostřednictvím Rev. Pro VSV G integraci byly vybrány dva pozitivní klony, 11-6 a 12-5 s p24 hodnotou při 1072 ng/ml a 1854 ng/ml.
· * · • ·«· « ·
9 9 9 9
9999
Tabulka 1 p24 ELISA esej klonů pre-pakážovacích buněk
p24 (ng/ml)
Pojmenování klonu Tc+ Tc-/ butyrát sodný+
11-6 9,0 870-1274
12-5 8,3-8,8 1854
6-3 3,0 538-1030
3-6 4,6 5136
15-2 7,3-7,7 658-979
4-1 4,5 464-757
2-1 28 119
HT1080 8,1 ng/ml 8,7pg/ml
Příklad 4
VSV-G integrace
Dva HT1080-TRGP klony (11-6 a 12-5, viz shora) byly transfektovány s 20 pg p(SCMV.VSVGRRE,TK.Hyg) a selektovány hygromycinem 48 hod po začátku transfekce. Rezistentní klony byly vybrány imunologickým testováním s anti-VSVG in šitu a bylo vybráno celkem 8 pozitivních klonů se silným anti-VSVG zabarvením a označeno jako HT1080-TRGPG či pakážovací buněčná linie. Nebylo zjištěno žádné VSVG zabarvení v přítomnosti Tc a v matečných HT1080 buňkách, zatímco v nepřítomnosti Tc a přítomnosti butyrátu sodného bylo VSVG zabarvení pozitivních klonů bylo lokalizováno v cytoplazmě a koncentrováno také na povrchu buněk. Tyto výsledky ukazují, že VSVG exprese je rovněž kontrolována tetracyklinem prostřednictvím Rev.
Příklad 5
Pakážování virovým vektorem
Vybrané HT1080-TR klony z příkladu 2 byly dále čištěny limitovaným ředěním v 96-jamkových deskách. Na základě imunologického testování bylo vybráno pět finálních klonů a kotransfekcí byly analyzovány dále na produkci vektoru. HT1080-TR klony o >90 %-ní čistotě byly naneseny do 6-jamkových desek při hustotě buněk 1 x 106 buněk/miska a po odstranění tetracyklinu (Tc) a přidání 2,5 mM butyrátu sodného byly 24 hodin transfektovány s 5 mg pN2CGFP a 5 mg pCGCRSRRE. pN2CGFP je na HIV-1 založený replikačně deficitní virový vektor, který obsahuje gag-pol gen exprimovaný z 5‘ -LTR, RRE za gag-pol genem a gen zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) exprimovaný z interního CMV promotoru. Generální struktura pCGCRSRRE je uvedena na obr. 2, kde G označuje VSV-G protein.
Po transfekci bylo medium na 48 hodin před shromážděním supernatantu pro použití k transdukování HT1080 buněk zaměněno na 3 ml prostředí prostého Tc a prostého butyrátu sodného. 48 hodin po transdukci byly transdukované buňky pomocí FACS analyzovány na GFP expresi. Titr vektoru byl stanoven % GFP exprimovaných buněk. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 2, kde klony 2A(1)-2E5 a 2A3(2) dávaly mezi pěti finálními klony relativně vysoké titry.
.··.:
• · · ♦ • · · · · * • · · «· ·
Tabulka 2
Vzorek č. Označení klonu Produkce vektoru
Titr (lU/ml)
Tc+ Tc-
1 HT1080 2x10e2
2 11
3 II 6,0x10e2
4 II
5 2A2(1)-2-E5 4,5x10e3
6 II
7 II 4,8x10e4
8 II
9 2A3(1)-2-F7 7,3x10e3
10 II
11 II 1,5x10e4
12 II
13 2A3(2) 5,8x10e3
14 II
15 II 6,3x10e4
16 II
17 7A2(2) 6,3x10e3
18 II
19 II 1,7x10e4
20
21 HT1080P 1,6x10e4
22 II
Všechny vzorky byly zpracovávány dvojmo. HT1080 kontroly byly transfektovány současně spolu s všemi čtyřmi plazmidy, aby poskytly dočasnou transfekci plazmidů v buňce. Konečný výsledek titru čtyř klonů HT1080-TR je v tomto pořadí: 2A3(2) > 2A2(1)-2-E5 > 7A2(2) > 2A3(1)-2-F7. Jak je z tabulky zřejmé, je za použití HT1080 klonů produkce vektoru vyšší než u dočasného transfekčního • · ·· i » · $
I · · · systému, podobně jako u HT1080 kontroly. Klony 2A2(1)-2-E5 a 2A3(2) mají v prostředí neobsahujícím tetracyklin indukci desetinásobnou.
Příklad 6
Produkce virových vektorů se stabilně transfektovanými pakážovacími buňkami
Pozitivní klony pakážovacích buněk z příkladu 4 byly vytříděny na konečný výsledek titru pomocí transdukce pN1(cpt)GFP vektorem při moi 70. Buňky byly transdukovány v přítomnosti tetracyklinu s vymýváním zbylého vektoru a 12 h po transdukci potom kultivovány v čerstvém mediu bez tetracyklinu, ale obsahujícím 7 mM butyrátu sodného. Supernatant byl sbírán 24, 48 a 72 h po ošetření butyrátem sodným a titrován v HeLa-Tat buňkách. Shromážděná směs producentských buněk, obsahující na buňku v průměru 10 kopií vektoru, poskytla konečný výsledek titru 1,4 x 106 TU/ml nebo 4,0 x 106 TU/ml po 48 h sběru ve 12ti jamkových deskách, resp. T75 baňkách (viz tabulka 3). TU znamená transformující jednotky.
Všechny buňky byly rozkládány po třídenní indukci. V přítomnosti tetracyklinu byla pozorována nízká úroveň (< 1 x 102 TU/ml) produkce vektoru (tabulka 3). Produkce vektoru zůstávala na stejné úrovni po nejméně sedmitýdenních pasážích producentských buněk (tabulka 3). To naznačuje, že produkce vektoru/pakážování vektoru je kontrolováno tetracyklinem, který nejprve kontroluje tTA expresi, tTA pak kontroluje Rev expresi, Rev pak (a prostřednictvím sekvencí RRE) kontroluje expresi proteinů GagPol a VSV-G, které jsou nezbytnými komponentami pro pakážování virových vektorů.
* · • ·
·· 3 • · ♦ « · · · • 9 9 9 · ♦ « · · • ♦ *
Tabulka 3
Produkce vektoru pomocí stabilní pakážovací buněčné linie
Deska 12 jamek; 1,2 x105 buněk/ml; sběr 3 dny; pasáže 1 týden
Tc+ Tc-/butyrát sodný+
Dny Titr (TU/ml) p24 (ng/l) Titr (TU/ml) p24 (ng/l)
1 nestanoven nestanoven 9,0 x 105 nestanoven
2 nestanoven nestanoven 1,4 x 106 116
3 nestanoven nestanoven 3,9 x 104 9,1
Baňka T75; 6,8 x106 buněk/ml; sběr 3 dny; pasáže 7 týdnů
Tc+ Tc-/butyrát sodný+
Dny Titr (TU/ml) p24 (ng/l) Titr (TU/ml) p24 (ng/l)
1 < 1 x 102 nestanoven 2,3 x 105 74
2 < 1 x 102 nestanoven 4,3 x 10b 424
3 < 1 x 102 nestanoven 2,5 x 104 205
Příklad 7
Regulace požadovaných genů pomocí Tat a Rev exprese
Ukázali jsme dříve, že gag-pol gen (exprimovaný z CMV promotoru), následovaný po směru exprese HIV-2 RRE (RRE2), může být regulován HIV-1 Rev. Chang a spol. [Nud. Acids Res. 20(20), 5465-5472 (1992)] nalezli, že chimerový HIV-1 LTR s autentickým TAR (TAR1) elementem nahrazeným HIV-2 TAR (TAR2) může být aktivován HIV-1 Tat. Poněvadž byl zaměněn pouze TAR element, zbytek R a U5 v HIV-1 LTR je v tomto chimerovém LTR stále přítomen. Předkládaný vynález zahrnuje chimerový promotor U3/TAR2, jenž obsahuje pouze HIV-1 U3 a TAR2 (obr. 4), který byl použit pro zaměnění CMV promotoru, jenž exprimuje gag-pol v konstruktu pVP1.2RznoG (viz obr. 2), aby vytvořil pVP1.2RznoG-U31TAR2 (viz obr. 2). Plazmid pVP1.2RznoG nebo pVP1.2RznoG-U31TAR2 byl transfektován spolu s pNICGFP a pCGCRSRRE do buněk 293T. 48 hodin po transfekci byl shromážděn supernatant a byl titrován na HT1080. Bylo zjištěno, že oba konstrukty produkují stejná množství pakážovaných vektorů (pNICGFP). Titry byly 9,0 x 106 a 9,2 x 106 TU/ml pro pVP1.2RznoG, resp. pVP1,2RznoG-U31TAR2 (kde TU představuje transformující jednotky). Tyto výsledky ukazují, že chimerový promotor • · • · ·· • · · « · * · * · · •« » * ·* · » ♦♦ * může být transaktivován pomocí Tat, aby exprimoval v úrovni srovnatelné s úrovní CMV promotoru.
Příklad 8
Regulace požadovaných genů pomocí Rev exprese
Hammarskjold a spol. [J. Vir. 68(2), 951-958 (1994)] nalezli, že exprese HIV-1 env genu (obsahujícího RRE element) je regulována pouze, je-li v intronu. Jestliže je env gen exprimován jako neintronová cDNA, exprese env genu již není regulována prostřednictvím Rev. Chang a Sharp [Cell 59, 789-785 (1989)] zjistili, že Rev regulovaná exprese genu je závislá na síle signálu donoru sestřihu. Je-li signál donoru sestřihu velmi silný a RNA je velmi účinně sestřižena, nemůže být exprese genu Rev regulována.
Byla vytvořena řada VSV-G expresních konstruktů, ve kterých byl VSV-G cDNA (gen) vložen do intronu. Za VSV-G kódující oblastí (genem) ve směru exprese se nachází CRS element a RRE. 3‘ konec RRE obsahuje akceptorové místo sestřihu (viz Rev-responzivní na obr. 5). Bylo klonováno pět různých signálů donoru sestřihu (SD) před VSV-G cDNA (viz níže tabulka 4).
Tabulka 4
Konsenzuální SD NAGGTAAGT
Beta-globin SD CAGGTAAGT
HIV-1 hlavní SD CTGGTGAGT
HIV-1 env SD GCAGTAAGT
HIV-2 env SD CAAGTGAGT
Hammarskjoldův SD AGGGTGAGT
Celé oblasti VSV-G, CRS a RRE jsou tedy exprimovány jako intron (viz obr. 5, Rev-responzivní). Těchto pět VSV-G expresních konstruktů bylo testováno v 293T buňkách, aby se zjistilo, zda je exprese VSV-G regulována Rev. Výsledek je uveden na obrázku 6. Těchto pět konstruktů bylo transferováno do 293T buněk spolu buď s pCMVRev (rev expresní konstrukt) nebo s pCI (matečný konstrukt pCMVRev, který neobsahuje Rev gen a je použit jako negativní kontrola). Westernový přenos (obr. 6) • · · «
9 9 *
999 9 9
9 9 9 9
999· · ·· ·
9 9 9 9 9999 ukazuje, že VSV-G exprese je regulována Rev v těch buňkách, které byly transfektovány třemi z pěti konstruktů.
VSV-G protein je detegován v buňkách transfektovaných spolu s pCMVRev a kterýmkoliv z pCGCRSRRE-1M nebo pCGCRSRRE-H či pCGCRSRRE-1E. Avšak VSV-G není detegován v buňkách transferovaných spolu s pCI a kterýmkoliv z pCGCRSRRE-1M nebo pCGCRSRRE-H či pCGCRSRRE-1E. Data ukazují, že exprese VSV-G z těchto tří konstruktů je regulována Rev.
Žádný VSV-G nebyl detegován v těch buňkách, jež byly transfektovány s dalšími dvěma konstrukty (pCGCRSRRE-G a pCGCRSRRE-2E). Signál betaglobinového donoru sestřihu v pCGCRSRRE-G je identický se signálem konsenzuálního donoru sestřihu a signál HlV-env donoru sestřihu v pCGCRSRRE2E je o jeden nukleotid různý od konsenzuální sekvence (viz nahoře). Je pravděpodobné, že tyto signály donoru sestřihu jsou příliš silné (sestřiženo příliš účinně), aby připouštěly regulaci pomocí Rev.
Je třeba poznamenat, že VSV-G je exprimován v buňkách transfektovaných s pCMVG a exprese je na rev expresi nezávislá. V tomto konstruktu nejsou CRS, RRE a signály sestřihu, které pod kontrolou CMV promotoru přímo exprimují VSV-G protein.
Svrchu uvedené demonstruje identifikaci tří VSV-G expresních konstruktů, kde exprese VSV-G z konstruktů může být regulována pomocí Rev.
Všechny zde citované odkazy, včetně patentů, patentových přihlášek a publikací, jsou zde zahrnuty ve své úplnosti, ať byly dříve výslovně zahrnuty či nikoliv.
Nyní, když je vynález zcela popsán, bude si odborník vědom, že totéž může být bez přehnaného experimentování prováděno v širokém rozmezí ekvivalentních parametrů, koncentrací a podmínek. Úmyslem této přihlášky je pokrýt jakékoliv obměny, aplikace nebo úpravy vynálezu, sledující principy vynálezu obecně, což zahrnuje taková odchýlení od předkládaného popisu, jak přicházejí při známé nebo obvyklé praxi v oboru, ke kterému vynález náleží a jak mohou být aplikována na hlavní rysy popisované v předcházejícím.

Claims (20)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Buňka pro pakážování, zahrnující první, druhý a třetí konstrukt nukleové kyseliny, které regulují expresi jednoho nebo více než jednoho produktu virového genu nezbytného pro pakážování virového vektoru, kde uvedený první konstrukt nukleové kyseliny zahrnuje tetracyklinem regulovaný promotor/operátor, který reguluje expresi kódovaného prvního produktu;
    uvedený první produkt je schopen regulovat expresi druhého produktu kódovaného na uvedeném konstruktu druhé nukleové kyseliny a uvedený druhý produkt je schopen regulovat expresi uvedeného produktu virového genu, který je kódován sekvencí přítomnou v uvedeném třetím konstruktu nukleové kyseliny.
  2. 2. Buňka podle nároku 1, kde uvedený první produkt je transaktivátor tetracyklinem regulovaného promotoru / operátoru nebo fúzovaný protein obsahující uvedený transaktivátor.
  3. 3. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený druhý konstrukt nukleové kyseliny zahrnuje tetracyklinem regulovaný promotor/operátor.
  4. 4. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený druhý produkt je rev protein.
  5. 5. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený třetí konstrukt zahrnuje promotor odvozený z retrovirového 5‘ LTR.
  6. 6. Buňka pro pakážování, kde tato buňka zahrnuje první, druhý a třetí konstrukt nukleové kyseliny, které regulují expresi jedné nebo více než jedné virové obálky nebo G proteinu, přičemž uvedený první konstrukt nukleové kyseliny je schopen exprimovat kódovaný první produkt;
    uvedený první produkt je schopen regulovat expresi druhého produktu kódovaného na uvedeném konstruktu druhé nukleové kyseliny a • · • · • · · · • ♦ · · • ··· · · ·· ♦ 9 9 9 9
    9 99·
    9 9 9 9
    99 · uvedený druhý produkt je schopen regulovat expresi uvedené virové obálky nebo G proteinu, který je kódován sekvencí přítomnou v uvedeném třetím konstruktu nukleové kyseliny.
  7. 7. Buňka podle nároku 6, kde buňka dále zahrnuje další konstrukt nukleové kyseliny, který kóduje retrovirové gag a pol proteiny.
  8. 8. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený první produkt je tat protein nebo chimerový protein obsahující tat protein.
  9. 9. Buňka podle nároku 6, kde uvedený produkt virového genu je G protein.
  10. 10. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kde buňka je stabilně transfektována uvedenými konstrukty nukleové kyseliny.
  11. 11. Buňka podle nároku 1 nebo 2, kde buňka dále zahrnuje podmíněně replikující virový vektor a kde uvedená buňka pakážuje uvedený vektor.
  12. 12. Buňka podle nároku 11, kde uvedený vektor je odvozen z HIV-1.
  13. 13. Buňka podle nároku 12, kde uvedený G protein je VSV nebo G protein viru Mokola.
  14. 14. Způsob pakážování virového vektoru, vyznačující se tím, že se kultivuje buňka podle nároku 12 za podmínek, při nichž uvedený první konstrukt nukleové kyseliny exprimuje uvedený první produkt.
  15. 15. Buňka podle nároku 1, kde uvedený virový genový produkt je virová obálka nebo G protein.
  16. 16. Buňka podle nároku 15, kde buňka dále zahrnuje další konstrukt nukleové kyseliny, který kóduje retrovirální proteiny gag a pol.
  17. 17. Buňka podle nároku 15, kde uvedený druhý produkt je rev protein.
    • ··« • · • · ·· · • · · • · · · • · ··· • · · • · ·
  18. 18. Buňka podle nároku 15, kde uvedený virový genový produkt je G protein.
  19. 19. Buňka podle nároku 15, kde buňka dále zahrnuje podmíněně replikující virový vektor a tato buňka pakážuje uvedený vektor.
  20. 20. Způsob pakážování virového vektoru, vyznačující se tím, že se kultivuje buňka podle nároku 19 za podmínek, při nichž uvedený první konstrukt nukleové kyseliny exprimuje uvedený první produkt.
CZ2004546A 2001-10-30 2002-10-30 Regulovaný systém exprese nukleových kyselin CZ2004546A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/020,472 US6835568B2 (en) 2001-10-30 2001-10-30 Regulated nucleic acid expression system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2004546A3 true CZ2004546A3 (cs) 2004-10-13

Family

ID=21798805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2004546A CZ2004546A3 (cs) 2001-10-30 2002-10-30 Regulovaný systém exprese nukleových kyselin

Country Status (15)

Country Link
US (2) US6835568B2 (cs)
EP (1) EP1446488A4 (cs)
JP (1) JP2005512573A (cs)
KR (1) KR100984268B1 (cs)
CN (1) CN100591769C (cs)
AU (1) AU2002365090B2 (cs)
BR (1) BR0213964A (cs)
CA (1) CA2464268C (cs)
CZ (1) CZ2004546A3 (cs)
IL (2) IL161495A0 (cs)
MX (1) MXPA04003969A (cs)
NO (1) NO20041763L (cs)
NZ (1) NZ533132A (cs)
RU (1) RU2004116319A (cs)
WO (1) WO2003054210A2 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297536B2 (en) * 2003-01-23 2007-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Inducible protein expression system
US20090123494A1 (en) * 2007-07-31 2009-05-14 William Staplin Momlv-based pseudovirion packaging cell line
AU2009228183A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Virxsys Corporation Lentivirus-based immunogenic vectors
RU2012123145A (ru) * 2009-11-05 2013-12-10 Проекто Де Биомедисина Сима, С.Л. Генный конструкт (варианты), вектор и рекомбинантный вирусный геном на его основе, вирион, их фармацевтическая композиция, способ in vitro экспрессии полинуклеотида в клетке печеночной природы, лекарственное средство, способ лечения заболевания печени (варианты), индуцируемый двунаправленный оператор-промотор
AU2012216792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-28 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
EP2586461A1 (en) 2011-10-27 2013-05-01 Christopher L. Parks Viral particles derived from an enveloped virus
US9347065B2 (en) 2012-03-29 2016-05-24 International Aids Vaccine Initiative Methods to improve vector expression and genetic stability
DE102016122317A1 (de) 2015-11-24 2017-05-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Transientes transfektionsverfahren für retrovirale produktion
ES2939617T3 (es) 2015-11-24 2023-04-25 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Líneas celulares estables para producción retroviral

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2140380T5 (es) 1990-03-21 2005-03-16 Geneart Gmbh Secuencias de adn que codifican polipeptidos gag retroviricos modificados y vacunas que las contienen o agregados de las mismas.
US6174666B1 (en) * 1992-03-27 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA
US5750396A (en) * 1995-05-08 1998-05-12 St. Judes Children's Research Hospital Stable virus packaging cell lines
US5888767A (en) * 1996-11-27 1999-03-30 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of using a conditionally replicating viral vector to express a gene
US5885806A (en) * 1995-11-28 1999-03-23 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to prepare conditionally replicating viral vectors
US6133027A (en) * 1996-08-07 2000-10-17 City Of Hope Inducible expression system
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
BR0010077A (pt) 1999-04-26 2002-01-15 K U Leuven Res & Dev Universit Gene sintético para expressão de uma proteìna retroviral ativa em eucariotas

Also Published As

Publication number Publication date
EP1446488A4 (en) 2004-12-22
MXPA04003969A (es) 2004-07-08
IL161495A0 (en) 2004-09-27
WO2003054210A2 (en) 2003-07-03
KR20040066799A (ko) 2004-07-27
US6835568B2 (en) 2004-12-28
US8043611B2 (en) 2011-10-25
AU2002365090B2 (en) 2007-12-20
AU2002365090A1 (en) 2003-07-09
BR0213964A (pt) 2006-05-30
WO2003054210A3 (en) 2003-12-24
JP2005512573A (ja) 2005-05-12
KR100984268B1 (ko) 2010-09-30
NO20041763L (no) 2004-04-29
US20060121579A1 (en) 2006-06-08
CN1578837A (zh) 2005-02-09
WO2003054210B1 (en) 2004-02-26
CN100591769C (zh) 2010-02-24
RU2004116319A (ru) 2005-03-27
US20030087419A1 (en) 2003-05-08
EP1446488A2 (en) 2004-08-18
IL161495A (en) 2009-06-15
NZ533132A (en) 2008-04-30
CA2464268C (en) 2012-03-20
CA2464268A1 (en) 2003-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Balvay et al. Translational control of retroviruses
JP4979851B2 (ja) 高いタイターで安全な組換えレンチウイルスベクターの作製方法
Bray et al. A small element from the Mason-Pfizer monkey virus genome makes human immunodeficiency virus type 1 expression and replication Rev-independent.
Aiken et al. Nef stimulates human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis
US6168953B1 (en) Genetic antiviral agents and methods for their use
CA2328404C (en) Novel lentiviral packaging cells
WO1993011230A1 (en) Modified mammalian stem cell blocking viral replication
Sparacio et al. Generation of a flexible cell line with regulatable, high-level expression of HIV Gag/Pol particles capable of packaging HIV-derived vectors
AU2002365090B2 (en) Regulated nucleic acid expression system
CZ2003784A3 (cs) Zlepšené podmíněně se replikující vektory, způsoby jejich produkce a jejich použití
US7803582B2 (en) Recombinant vector and use in gene therapy
US20040091853A1 (en) Viral reporter particles
EP1380650B1 (en) Conditionally replicating viral vectors and their use
AU2005244907B2 (en) Regulation of transcription with a cis-acting ribozyme
AU773015B2 (en) Lentiviral vectors
AU2008201303A1 (en) Regulated nucleic acid expression system
Escors et al. Development of retroviral and lentiviral vectors
US20120034693A1 (en) Recombinant vector and use in gene therapy
EP4132590A1 (en) Modified vectors for production of retrovirus
Kräusslich Genetic analysis and gene expression of human immunodeficiency virus
WO2011062155A1 (ja) 変異型Ｇａｇタンパク質をコードする核酸
Sinapius Characterization and Use of Replication Competent HIV-1 Genomes Carrying Fluorescent Reporter Genes
Sinapius Characterization and Use of Replication Competent HIV-1 Genomes