CN100591769C - 受调控的核酸表达系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供关于调控基因表达的核酸构建物、表达系统和方法。本发明可用于调控任何感兴趣的编码序列，包括包装病毒粒子所必须的病毒组分的编码序列的表达。

Description

受调控的核酸表达系统
发明的技术领域
本发明涉及一种调节基因表达的系统。本发明提供改进的能紧密调节感兴趣的编码序列表达的核酸构建物。当要被表达的核酸或表达水平对发生表达的细胞或宿主环境有毒时就需要这种紧密调控。本发明还涉及这种表达系统在用于包装病毒载体的细胞中的应用，并提供了制备该必须的核酸构建物的方法及它们在调控重组病毒表达中的应用。一方面，本发明涉及稳定转染的细胞中基因表达的调控。
发明背景
已证明重组核酸技术是表达感兴趣的核酸所编码产物的一种强有力的工具。这导致能够生产用于研究和商品化应用的多肽和核酸。
然而某些编码产物对表达它们的细胞或宿主环境有毒，系由于此产物先天有毒性或由于其表达水平高而导致毒性。处置此难题的一种方法是采用短时表达系统，该系统可表达此编码产物并在其毒性导致产物水平降低前复原。或者可将此编码产物置于一紧密调控系统之下，可使该产物表达并在毒性升高到致死水平之前仃止其表达。紧密调控系统的一个例子见于与tet阻抑子组合中的四环素调控的操纵子/启动子(例如参见美国专利5,750,396)。
在毒产物必须连续表达的情况下其表达特别重要，因为它是细胞所产生的或者进行代谢活动的较大产物的一个成分。这种情况的一个例子是病毒包装细胞系中所表达的装配和包装病毒所必须的产物。如果任何一种必须的病毒基因产物对该细胞有毒，采用稳定(与短暂相反)包装细胞系时，关键是需要控制其表达。必须的毒性病毒基因的一个例子是水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白，它是产生假型病毒颗粒所必须的。
采用tet操纵子和阻抑子来调控VSV-G表达的一个例子见Henriette等(J.virol.73(1)：576-584，1999)所述，其中tet阻抑子(作为含VP-16功能域的嵌合融合蛋白，称为tTA)在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下，VSV-G在tet操纵子的控制下。在缺少四环素时，该嵌合阻抑物的表达导致不表达VSV-G。存在四环素时防止了该操纵子中tTA和tet应答元件之间(TRE)的结合，使VSV-G得以表达。此系统称为″tet-on″，当存在四环素时导致该感兴趣的基因(即VSV-G)的表达。
还有另一种″tet-on″系统，其中tTA是一种反式激活蛋白，它在存在四环素时不能结合tet操纵子的TSE，但在缺乏四环素时tTA能结合该操纵子并强烈激活此启动子，表达感兴趣的编码序列。
Klages等(Molec.Therap.2(2)：170，2000)描述了采用类似的两种核酸系统来控制VSV-G的表达。第一种核酸表达tTA，其能控制含tet操纵子的TRE，从而控制VSV-G的表达。同一tTA蛋白也调控rev蛋白的表达，rev蛋白进而通过rev应答元件(RRE)调控gag/pol信使RNA的剪接，来调节gag和pol区(病毒包装所必须)的表达。
利用rev蛋白来控制基因表达的另一个例子见Yu等(J.Virol.70(7)：4530-37，1996)所述。他们利用tTA表达来调节同处于一个含tet操纵子的TRE调节下，HIV-1rev和包膜蛋白的表达。此rev蛋白进而通过RRE调节病毒包膜蛋白的表达，以及通过另一RRE调节gag/pol信使RNA的表达。虽然另一启动子调控gag/pol编码序列的转录，但其表达直接受rev蛋白的调控因而间接受tTA的调控。
发明概述
本发明提供调控一种或多种感兴趣的编码序列表达的核酸(表达)构建物和方法。该核酸构建物性质上优选重组物并至少包含三种构建物，其中至少一个含有感兴趣的编码序列。可将此构建物视为和用作一种表达系统来表达感兴趣的编码序列，其中各种构建物表达一种能调节下一种构建物表达的产物，从而通过最后的构建物控制感兴趣的编码序列的表达。各个构建物优选分别含有一调控区如启动子(任选与操纵子一起)。
本发明一方面，利用此表达系统作为用于包装病毒载体的细胞或细胞系的一部分，来调控包装此载体所需成分的表达。此表达系统可用于调节包装感兴趣的病毒载体所必需的病毒结构性和调节性基因产物的表达。要表达一种以上感兴趣的病毒基因产物时，可将这些基因安置在分开的核酸分子上并且仍保留本发明表达系统部分。
本发明的表达系统可具有共同的结构，从而可组合二个或多个系统以表达所述系统调节的一个或多个感兴趣的编码序列。具有共同结构的这些系统的例子包括：采用相同的第一和第二种核酸构建物，与两个第三种构建物(其含有两个感兴趣的编码序列，二者均通过第一和第二种核酸构建物，受相同的机制调控。
本发明的另一方面，第一种核酸构建物的表达优选受到紧密调控或甚至自身调控。一非限制性例子是通过正反馈机制，其中此第一种核酸构建物可抑制其身表达。在未激活时第一核酸构建物的自身调控产生了非常低的基础活性，以致几孚不能表达该感兴趣的(在另一核酸构建物中)编码序列。一但激活了第一核酸构建的表达，此系统中其它所有的构建物随之表达。在本发明的优选实施例中，采用第一构建物的自身调控来最大程度控制此系统中其它构建物的表达。
可将本发明的构建物和系统加入载体中或导入细胞中。细胞中，此构建物可整合入细胞基因组中或保持为游离型构建物。细胞的选择不是关键，只要该细胞允许本发明的构建物和系统表达。本发明的实施例中，用细胞来包装病毒载体，所得病毒载体优选具有互补抗性。
本发明的各构建物可在不同的核酸分子上提供，或作为一个或多个其它构建物(例如但不限于同一质粒、载体或染色体)在同一核酸分子上提供。本发明的优选实施例中，用此表达系统在细胞中包装病毒载体，各构建物优选分散在核酸分子中。在一种或多种核酸分子上提供这些构建物对实施本发明通常不是关键性的，只要这些构建物的分布不干扰各构建物调节任一亚序列构建物表达的能力。
或者，在本发明的另一方面，安置诸构建物以从排列中获得调控作用。一非限制性实施例是将两个构建物安置在一分子上，使它们的启动子取向可趋异性表达诸序列(各启动子的5’部分比3’部分更靠近在一起)，这样一启动子的激活提高了激活其它启动子的容易程度。已发现质粒上的这种排列当用于细胞中包装病毒载体时，提高了载体产生的效价。通过在一个分子上制备趋异性取向的两种构建物然后将该分子整合入细胞基因组中，可在细胞中映衬出含有核酸构建物稳定整合的此种排列。因此应沿着两构建物的相对位置保持此趋异性取向。
本发明的另一方面，本发明的一种或多种构建物表达的一种或多种产物优选来源于病毒，并能严密调控其它构建物的表达。本发明的一优选表达系统因而可表达能调控该系统其它构建物表达的一种或多种病毒调节性蛋白质。
本发明的构建物和系统优选用于调控对细胞或宿主有毒性的产物(例如但不限于病毒蛋白质)编码序列的表达。当然此构建物和系统也可用于调控无毒产物的表达。
本发明的一优选实施例中，将本发明构建物掺入细胞中用于将病毒载体包装入病毒粒子中。这种细胞可称为″包装细胞″，因为它们可产生将病毒载体核酸包装入病毒粒子中所必须的所有成分。这种细胞可包装任选含有感兴趣的其它异源或内源序列的重组病毒核酸。本发明的诸方面中，此核酸构建物导致一可诱导系统，此系统可调节必须的病毒组分的表达，可将这种细胞视为和用作包装病毒粒子的一种可诱导系统。
可将本发明的构建物导入细胞，以将这些构建物维持为染色体外物质和/或整合性拷贝。本发明的优选实施例中，这些构建物的整合用于产生稳定的转染细胞，再用转染细胞长期限或无限包装病毒粒子。
本发明还提供产生上述构建物和系统的方法，以及采用此系统调控编码序列表达的方法。这些方法包括利用本发明产生包装病毒载体所必须的一种或多种成分。还提供含有本发明构建物或用于所公开方法的试剂盒。
附图的简要说明
图1是本发明调控细胞内逆转录病毒gag/pol编码区和VSV-G蛋白表达的表达系统的示意图。该系统采用四种构建物，其中第一构建物是tTA在TRE调控启动子控制下可自身调控的表达构建物。第二构建物可在TRE调控启动子控制下表达逆转录病毒rev蛋白。第三构建物可在嵌合性逆转录病毒启动子调控下表达含有gag/pol编码区的逆转录病毒RRE。第四构建物可在异源性启动子如猿巨细胞病毒启动子的调控下，表达RRE调控的VSV-G转录物。
图2显示本发明的一些不同的核酸构建物。显示诸构建物中rev编码序列置于巨细胞病毒(CMV)或四环素(TRE)启动子控制下。这里的实施例1描述了pTRE-tTASvPuroTKT的组成。pCGCRSRRE-1M在图5中部分详述。质粒pVP1.2RznoG和pVPznoG-U31TAR2(IRES是内部核糖体进入位点)在本文实施例7中详述。质粒pN2CGFP和pN1(cpt)CGFP在本文实施例5和7中叙述。
图3显示在有或没有四环素调节rev表达时，用抗Rev和抗Tat抗体免疫染色的转染的HT1080-TR克隆。见本文实施例2。
图4显示本文实施例7中所述嵌合性U3/TAR2启动子的示意图。
图5显示含剪接供体和受体位点不同排列的构建物赋于基因表达Rev应答(依赖性)或非应答(非依赖性)的示意图。
图6显示了western印迹，它证实了通过采用不同剪接供体位点的rev-依赖性VSV-G蛋白的表达。
优选实施例的描述
定义
″核酸″或″核酸构建物″或″核酸分子″是多核苷酸或任何长度的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合形式。此术语仅指该分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA和RNA。此术语还包括线性或环形聚合物。
本文所用″感兴趣的编码序列″是需要表达的感兴趣的多核苷酸序列。就其确切序列而言，此编码序列可知或不知，但可编码感兴趣的RNA或多肽。
本文所用″细胞″或″宿主″指其中可导入和表达本发明核酸构建物或表达系统的相应的活生物。″细胞″可以是任何细胞，优选真核细胞。此细胞可以是一种细胞系或新分离和转化的原代细胞，或结合导入了本发明核酸构建物的细胞。细胞系或培养物指通过体外培养而维持的细胞，可以与衍生此细胞系或培养物的亲代细胞不同。细胞的非限制性例子包括真核细胞如Hela、293、HT-1080、CV-1、TE671或其它人类细胞、Vero细胞或D17细胞。其它细胞包括淋巴细胞(如T或B细胞)或巨噬细胞(如单核巨噬细胞)，或是这些细胞的前体细胞如造血干细胞。实施本发明的其它细胞包括星形细胞、皮肤成纤维细胞、大肠表皮细胞、内皮细胞、表皮细胞、树突状细胞、朗格汉姆细胞、单核细胞、肌肉细胞、神经原细胞(例如但不限于脑和眼)、肝细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、产生精子的细胞或卵母细胞、基质细胞、粘膜细胞等。优选宿主细胞是真核多细胞性细胞(与单细胞性酵母细胞相反)，更优选哺乳动物如人的细胞。
细胞可以单个实体存在，或是较大细胞集合体的一部分。例如，这种″较大细胞集合体″可包括细胞培养物(混合性或纯的)，组织(如内皮、表皮、粘膜或其它组织，包括含上述CD4缺乏细胞的组织)，器官(如心、肺、肝、肌肉、胆囊、膀胱、性腺、眼和其它器官)，器官系统(如循环系统、呼吸系统、胃肠道系统、泌尿系统、神经系统、皮肤系统和其它器官系统)或生物(如禽类、哺乳类等)。优选的器官/组织/细胞是循环系统(例如包括但不限于心、血管和血液，包括血液白细胞和红细胞)，呼吸系统(如鼻、咽、喉、气管、支气管、肺泡支气管、肺等)胃肠道系统(如口、咽、食道、胃、小肠、唾液腺、胰腺、肝、胆囊和其它)，泌尿系统(如肾、尿道、膀胱、输尿管等)，神经系统(包括但不限于脑和脊髓，以及特殊感觉器官如眼)和皮肤系统(如表皮、皮下和真皮组织细胞)。甚对更优选细胞选自心、血管、肺、胆囊、膀胱和眼细胞。这些细胞不需要是正常细胞，可以是患病细胞。这些患病细胞可以是但不限于肿瘤细胞、受感染细胞、遗传异常细胞或靠近或密切接触异常组织如肿瘤血管内皮细胞的细胞。
本文中可互换使用的多核苷酸或寡核苷酸的″部分″或″区域″中2个或多个碱基的连续序列。其它实施例中一区域或一部分是至少约3、5、10、15、20、25个连续核苷酸之一。
″病毒″是由蛋白和核酸组成的传染性因子，其能利用宿主的遗传机制产生由病毒核酸所确定的病毒产物。本发明包括许多方面，例如表达病毒所编码的序列可应用于RNA和DNA病毒。RNA病毒是能感染原核细胞(如噬菌体)以及许多真核细胞，包括哺乳动物特别是人细胞的多样性群体。大多数RNA病毒具有单链RNA作为其遗传物质，虽然至少有一个家族具有双链RNA作为其遗传物质。可将RNA病毒主要分成三组：正链病毒、负链病毒和双链RNA病毒。与本发明相关的RNA病毒包括：新培斯样病毒(如披膜病毒、雀麦草花叶病毒组、南瓜花叶病毒组、烟草花叶病毒组、烟草脆裂病毒组和马铃薯X病毒组)，小RNA样病毒(如小RNA病毒科、杯状病毒科、豇豆花叶病毒、线虫传多面体病毒和马铃薯X样病毒组)；负链病毒(如副粘病科、弹状病毒科、正粘病毒科和沙粒病毒科)；双链病毒(如呼肠孤病毒科和双RNA病毒科)；黄病毒样病毒(如黄病毒科和瘟病毒属)；逆转录病毒样病毒(如逆转录病毒科)；冠状病毒科和其它病毒族，其中包括但不限于野田村病毒科。优选将本发明应用于黄病毒科的RNA病毒，更优选黄病毒属的病毒，特别是马堡病毒和埃博拉病毒。黄病毒科的病毒是黄病毒属的病毒，如黄热病毒、登革热病毒、西尼洛河病毒、圣露易斯脑炎病毒、、日本脑炎病毒、Murray谷(Murray Valley)脑炎病毒、Rocio病毒、蜱传脑炎病毒等。本发明优选应用于小RNA病毒科的病毒，优选甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)或非甲非乙肝炎病毒。
可应用于本发明的另一优选RNA病毒是逆转录病毒科的病毒(即逆转录病毒)，特别是致癌病毒科、泡沫病毒科、泡沫病毒、慢病毒科、慢病毒属或亚科的病毒。理想的致癌病毒亚科的RNA病毒是1型或2型嗜人T淋巴细胞病毒(即HTLV-1或HTLV-2)，牛白血病病毒(BLV)、禽造白细胞组织增生-肉瘤病毒(如罗斯肉瘤病毒(RSV)、禽髓母细胞增生病毒(AMV)、禽成红细胞增多症病毒(AEV)和罗斯相关病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)、哺乳动物C-型病毒(如莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒HaMSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)、AKR-MuLV、猪白血病病毒(FeLV)、猿肉瘤病毒、网状内皮增生症病毒(REV)、脾脏坏死病毒(SNV))；B-型病毒(如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV))；和D-型病毒(如Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和″SAIDS″病毒)。理想的慢病毒来家族的RNA病毒是1型或2型人免疫缺陷病毒(即HIV-1或HIV-2；其中HIV-1先前称为淋巴腺病相关病毒3(HTLV-III)和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)相关病毒(ARV))；或其它已得到鉴定并与AIDS或AIDS样疾病相关连的HIV-1或HIV-2相关病毒。缩写″HIV″或″人免疫缺陷病毒″在这里一般是指这些HIV病毒和HIV相关病毒。而且，慢病毒亚家族的RNA病毒优选羊髓鞘脱落/呼吸急促病毒(如感染羊)、猪免疫缺陷病毒(FIV)和山羊关节炎脑水病毒(CAEV)。本发明也可用于DNA病毒。优选的DNA病毒是疱疹病毒(如EB-病毒、单纯疱疹病、巨细胞病毒)；腺病毒、AAV、乳头瘤病毒、痘苗病毒等。
必须注意，此说明书和附属权利要求书中所用的单数形式的单词包括相应的复数，除非文中另有清楚说明。
″表达″包括脱氧核糖核酸的转录和/或核糖核酸的翻译。
如本文所用术语″包括″和其同源词，以其广义应用，等于术语″包含″及其相应的同源词。
″使得″事件发生的条件，或″适合″于事件发生的条件，如启动转录或翻译、链扩展或延伸等的条件，是不防止或抑制此活动发生的条件。因此，这些条件允许、提高、促进和/或有助于此活动。本领域已知的和本文所述的这种条件取决于，例如，核苷酸序列的性质、温度和缓冲液条件。这些条件也取决于所需的活动，如核酸/蛋白质相互反应、蛋白质/蛋白质相互反应、转录或翻译。
术语″3’″(3引物)一般指多核苷酸或寡核苷酸3’(下游)中距离同一多核苷酸或寡核苷酸中另一区域或部位的一区域或部位。
术语″5’″(5引物)一般指多核苷酸或寡核苷酸5’(上游)中距离同一多核苷酸或寡核苷酸中另一区域或部位的一区域或部位。
术语″3’-DNA部分″、″3’-DNA区域″、″3’-RNA部分″和″3’-RNA区域″指位于朝向某多核苷酸或寡核苷酸的3’端的该多核苷酸或寡核苷酸的部分或区域，并可包括或不包括结合于同一多核苷酸或寡核苷酸3’大多数核苷酸的3’大多数核苷酸或部分。
术语″5’-DNA部分″、″5’-DNA区域″、″5’-RNA部分″和″5’-RNA区域″指位于朝向某多核苷酸或寡核苷酸的5’端的该多核苷酸或寡核苷酸的部分或区域，并可包括或不包括结合于同一多核苷酸或寡核苷酸5’大多数核苷酸的5’大多数核苷酸或部分。
术语″异源性″指天然或其天然状态时通常发现不在一起的两种物质之间的关系。术语″内源性″指天然或其天然状态时发现通常在一起的两种物质之间的关系。例如，一编码序列可操作性连接于天然时通常不与该序列相连的一异源性启动子，或连接于其天然时通常与该序列相连的内源性启动子。或者，一核酸可共价连接于一异源性启动子，所述核酸通常可见与其在一起，除非该异源性序列是反义取向。一编码序列″可操作性连接于″一启动子时(如当该编码序列和该启动子一起构成能被表达的天然或重组的构建物时)，此启动子能直接指导该编码序列的转录。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员共同所理解的含义相同。
本发明提供的核酸(表达)构建物当组合应用时，能调节一种或多种感兴趣的编码序列的表达。此感兴趣的编码序列可编码感兴趣的或需要表达的RNA或多肽。此核酸构建物优选性质是重组的，随后的作用是调节位于″最后″构建物上的感兴趣的编码序列的表达。每种构建物导致表达一产物，该产物能调节下一种构建物的表达，直至通过调控最后的构建物而表达该感兴趣的编码序列。各构建物优选含有一调节区，该区是可诱导性的和/或受另一构建物表达的调控。这些构建物也任选地含有可选择性或可检测性标记以有利于鉴定和应用。可作为可检测标记的是某构建物所导入的细胞中该构建物上的非内源性调节或编码序列。
本发明的构建物优选存在于用来包装病毒载体的细胞或细胞系中。此构建物从而可调节包装所述载体必须的一种或多种病毒组分的表达。这些病毒组分可以是适当包装所必须的任何病毒基因产物，包括但不限于病毒包膜蛋白、衣壳蛋白、逆转录病毒的gag或pol蛋白和/或病毒调节蛋白。可将编码这些病毒组分的核酸置于一个或多个核酸分子上，只要它们可被表达产生病毒载体的适当包装。为了减少病毒载体和这些构建物之间重组导致产生含所有病毒组分的载体的可能性，优选将编码病毒组分的核酸分散在不同的核酸分子中。优选的待表达病毒组分是HIV-1或HIV-2的gag/pol序列所编码的那些蛋白、逆转录病毒(优选HIV-1或-2的)rev蛋白和病毒包膜蛋白。
例如但不限制本发明，本发明可包括表达感兴趣的编码序列的三种构建物。第一种核酸构建物能表达第一产物，所述第一产物能调节第二种核酸构建物所编码的第二产物的表达；所述第二产物能调节所述感兴趣的编码序列(存在于第三种核酸构建物上)编码产物的表达。优选所述三种核酸构建物中至少一种含有异源性核酸。其它优选实施例中，第一和第二构建物的表达受转录和/或翻译的直接调控，而第三构建物中的感兴趣的编码序列的表达受剪接和/或核输出的调节。
本发明一实施例中，第一构建物含有可诱导性或受调节的启动子，如四环素启动子/操纵子，或类固醇或蜕皮激素区。另一调控系统是ARIAD制药公司开发的。此启动子操作性连接于第一编码序，该第一编码序列编码的产物能调节第二构建物的表达。本发明一优选实施例中，此第一构建物含有四环素启动子和编码此四环素启动子激活剂(或含此激活剂的融合蛋白，例如但不限于tTA)的第一编码序列，这样该第一构建物在存在四环素时能自身调控而不表达。或者，此第一编码序列编码逆转录病毒，优选HIV-1或HIV-2的tat蛋白。
通过去除此实施例中的四环素来诱导转录，导致tet激活剂或者tat蛋的表达。因此第二核酸构建物可含有tet启动子/操纵子，或tat调节的启动子区，如受表达的tat蛋白调节的5’LTR启动子。所述第二核酸序列的编码序列可编码能调节第三构建物表达的任何产物。本发明一非限制性实施例中，该第二核酸序列可编码逆转录病毒的rev蛋白，来调节存在于第三构建物上的感兴趣的编码序列的mRNA的剪接和/或核输出。本发明含有rev蛋白表达的实施例中，存在于第三构建物上的启动子可以是任何能表达感兴趣的编码序列的适当启动子，其表达的mRNA水平足以在rev蛋白存在时产生所需水平的蛋白质，而作用于剪接和/或核输出。优选此启动子是逆转录病毒HIV的5’LTR，或巨细胞病毒(CMV)，宜为人或猿CMV的5’LTR。
应用于本发明包装细胞时，第三构建物上的感兴趣的编码序列可编码病毒包膜蛋白(如逆转录病毒的)，更优选HIV-1、HIV-2或MMLV的包膜蛋白；水泡性口炎病毒(VSV)、Mokola病毒或狂犬病毒的G蛋白；GaLV、甲病毒属E1/2糖蛋白或RD114、猪内源性病毒的env蛋白。或者，也可采用编码嵌合性包膜蛋白的序列。还可采用以下病毒科：小RNA病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、弹状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、Paro病毒科(Paroviridae)、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科和疱疹病毒的包膜蛋白编码序列。
本发明另一实施例中，第一构建物含有操作性连接于类因醇激素受体编码序列的四环素启动子/操纵子，诱导其表达会导致所述受体的表达。第二构建物含有的启动子受所述类因醇受体的调节(含此受体和活化配体的复合物可激活所述启动子的启动)。在缺乏所述复合物时此启动子无活性。第二构建物的编码区还可编码能调控第三构建物表达的产物。例如，第二构建物的编码序列可编码逆转录病毒的tat或rev蛋白。就编码的tat蛋白而言，第三构建物含有其表达受tat蛋白调节的一个区域，例如但不限于逆转录病毒的5’LTR启动子和编码顺式作用RNA元件的称为TAR的序列。就编码的rev蛋白而言，只需要使第三构建物的表达如上所述处于rev蛋白的调控下(通过mRNA剪接和/或核输出控制)。
应用于细胞包装病毒载体时，可从与该病毒载体相关的异源病毒得到逆转录病毒的tat蛋白。此病毒载体可以是HIV-1衍生的，但不限制本发明，可在本发明的一个或多个核酸构建物中采用嵌合性逆转录病毒启动子。嵌合性逆转录病毒启动子的一非限制性例子是含异源性TAR序列的逆转录病毒5’LTR启动子，这样要表达连接于该启动子的编码序列，就必须表达相关的异源性tat蛋白。优选的嵌合启动子包括含HIV-2TAR序列的HIV-1 5’LTR启动子。当与能表达HIV-2 tat蛋白的构建物联用时，可表达操作性连接于嵌合启动子的该编码序列。
本发明另一实施例中，在本发明的一个或多个构建物中采用了TAR元件，上述表达系统的任何构建物中不需要存在tat蛋白编码序列。而是，相关tat蛋白所需的TAR可通过提供另外来源的tat蛋白来满足。例如，将本发明构建物导入细胞时，该细胞可含任选整合入细胞基因组的其它核酸构建物，来表达所需的tat蛋白。这种单一表达构建物是本领域熟知的。
上述一个例子是tat蛋白与本发明表达系统的组合。当要表达二个感兴趣的核酸序列时，可将第一个置于本发明表达系统控制下，而将第二个置于所述系统和上述其它来源表达的tat蛋白二者的控制下。例如，可采用三种构建物通过rev蛋白(来自第二构建物)来调节感兴趣的第一序列(来自第三构建物)的表达。第四构建物表达的感兴趣的第二序列受rev蛋白(来自第二构建物)和tat蛋白的调控。这样，感兴趣的第一序列只处于该系统的控制下，而感兴趣的第二序列处于该系统和tat蛋白的共同控制下。当然异源性tat蛋白和TAR元件也可用于本发明其它实施例中。或者，也可使感兴趣的第一序列受tat调节。
如要取代采用上述tat编码序列，可采用编码嵌合tat蛋白的序列。需将Tat掺入一融合蛋白(如Tat-Ga14)中，并保留其HIV-LTR启动子的反式激活活性。也可采用其它嵌合Tat蛋白，只要其保留了充分的反式激活活性。
采用rev蛋白来调控后续构建物的表达时，所述后续构建物的编码序列应含有，或经修饰后含有受rev蛋白调节的rev应答元件(RRE)和相应的剪接供体和受体位点。例如，但不限制本发明，当第三构建物含有的编码序列编码病毒包膜或G蛋白时，该编码序列应含有相关rev蛋白适当剪切和/或核输出所需的剪接供体和受体位点，从而可表达包膜或G蛋白。可任选地选出这些位点以提供与rev蛋白相关的弱化剪切功能。这种弱化提供了使表达更依赖rev蛋白和RRE的一种方法。例如，如果这些剪接位点内在功能太快，可在rev蛋白和RRE有机会输出mRNA和允许该序列表达前，切下感兴趣的编码序列。因此选择能在缺乏rev蛋白时足以行施剪切和抑制表达，同时在存在rev蛋白时能抑制剪切和允许表达的剪切位点。
可考虑和组合应用本发明的构建物，用作感兴趣的编码序列的表达系统。而且，可组合含有相同构建物的二个或多个表达系统来同时调节二个或多个感兴趣的编码序列。例如但不限制本发明，前二个构建物可相同，其中第二构建物调节二个或多个第三构建物上感兴趣的编码序列的表达，各能表达一感兴趣的编码序列。此例的一实施例中，第一构建物含有四环素可诱导启动子，其操作性连接于编码能调节第二构建物中rev蛋白编码序列表达产物的编码序列。二个或多个第三构建物每一个中的感兴趣的编码序列，可经修饰而含有剪切供体和受体位点，这样在存在第二构建物表达的rev蛋白时可表达该编码蛋白质。一具体实施例中，在二个第三构建物中可存在二个感兴趣的编码序列：第一编码序列是操作性连接于RRE的逆转录病毒的(优选HIV的)gag/pol序列；第二编码序列是操作性连接于RRE的VSV-G或Mokola病毒的G蛋白。如上述，这两个第三构建物的启动子可以是任何在rev蛋白存在时能充分表达的启动子。
如本文所述，第一核酸构建物的表达优选受紧密调控或甚至自身调控。作为非限制性实施例，紧密调控采取正反馈机制，其中第一核酸构建物可抑制(直接或间接)其自身表达。缺乏激活剂时第一核酸构建物的这种自身调控导致极低的基础活性，低至不能表达本发明表达系统的其它构建物。而是，第一核酸构物表达激活时，随之表达该系统中所有其它构建物。
可将本发明的构建物和系统掺入载体或导入细胞，例如但不限于哺乳动物、啮齿动物、灵长动物或人的细胞。可将本发明的构建物整合入细胞基因组中或维持为游离型构建物。本发明优选的细胞是能表达单独的或与其它核酸组合的感兴趣的编码序列的细胞。可以任何顺序将本发明的构建物导入细胞。导入后通过所述构建物上的选择性或可检测性标志来检测所述构建物，证实所述细胞中存在这些构建物。
虽然本发明的各构建物可存在于各核酸分子中，但本发明的一些优选应用包括含多个本发明构建物的一个核酸分子。例如作为非限制性例子，涉及到制备稳定的细胞系，可将本发明的构建物稳定整合入细胞的一个或多个染色体中，以产生稳定转染的细胞系。或者，在导入所述细胞之前，可将这些构建物置于一个或多个游离型载体或质粒上。为了应用于细胞来包装病毒载体，优选将各构建物分置入不同的核酸分子中，以增加与病毒载体重组的数量，从而赋予其复制能力。优选本发明的构建物，具体说是其调节和编码序列部分包含病毒来源的序列。实施本发明优选这种病毒性调节部分(顺式作用)和编码部分(反式作用)。顺式作用区的例子是TAR和RRE、逆转录病毒的INS(抑制序列或不稳定序列，也称为CRS)元件，而反式作用编码区的例子是tat和rev编码序列。含病毒构建物的细胞优选没有导入本发明构建物以外的病毒序列。
优选在本发明的构建物中采用感兴趣的病毒核酸的异源RRE。例子包括但不限于HIV-1衍生核酸的HIV-2RRE，一种CTE(组成性转运元件，如来自Mason-Pfizer猴病毒或其它逆转录病毒)或PRE(转录后调节元件，如美洲旱獭肝炎病毒的这种元件)。除了减少、尽可能减少或消除以具有不同序列的不同RRE为基础同源重组的可能性外，已观察到产生的包装核酸令人惊奇和出孚意料地增加了约5倍。
本发明的各种表达感兴趣的编码序列的实施例中，表达的编码产物可能对细胞或宿主有毒。其例子包括病毒的gag-pol蛋白和包膜蛋白，如VSV G蛋白。然而本发明的整个范围包括用于表达对细胞或宿主无毒，或只在特定情况时(如高水平表达时或存在其它因素时产生毒性)有毒的序列。
本发明一优选方面涉及制备含有本发明构建物的细胞和细胞系。将核酸构建物导入细胞的方法，包括本领域所知的利用条件整合入细胞基因组的方法(如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀)。优选实施例中，设计构建物与细胞以提供产生含感兴趣的具体核酸的病毒颗粒。优选复制缺陷型病毒核酸和衍生自天然病毒但没有去除或丢失掉内源″包装信号″。本发明特别优选和实施例中，此病毒核酸衍生自HIV-1。可通过国立卫生研究院的《AIDS研究和参考试剂计划目录》(AIDS Research andReference Reagent Program Catalog)(见Adachi等，J.Virol；59，284-91，1986)获得野生型菌株的pNL4-3 HIV-1产生HIV-1衍生的病毒核酸。可考虑和利用这些细胞作为病毒核酸的″包装细胞″，将其分别导入细胞中，因为它们可产生将病毒核酸包装入感染性病毒颗粒中所必须的所有成分。
优选的包装细胞当病毒核酸提供了所有其它成分时，可表达感兴趣的编码序列的至少一种病毒包膜蛋白，或等价物(如突变体、融合体或其截短形式)。优选的包膜蛋白是病毒核酸天然形式内源序列(即正常用于包装该病毒核酸所衍生的病毒)或该病毒核酸的异源序列所编码的包膜蛋白。为实施本发明可表达的各种包膜蛋白包括能改变包装病毒颗粒靶细胞特异性的蛋白，或其它可导致假型病毒颗粒的包膜蛋白。采用HIV-1衍生病毒核酸的优选异源性包膜蛋白包括VSV G蛋白、Mokola病毒的G蛋白和HIV-2包膜蛋白。
或者，这些细胞可提供至少一种病毒包膜蛋白，和表达待包装病毒核酸包装成分所必须的一种或多种蛋白。一个非限制性例子是能提供包膜蛋白及相关tat蛋白，或反式激活所需的一个或多个其它蛋白的细胞，来包装逆转录病毒核酸(如能提供VSV G蛋白和HIV-1 tat蛋白来包装HIV-1衍生载体的细胞)。反式激活所需其它蛋白的例子包括gag，pol和rev序列编码的细胞.
优选待包装的感兴趣的病毒核酸缺乏表达或编码一个或多个能使该核酸成为致病性或可能致病性的病毒附属蛋白序列(例如但不限于Vif，Vpu，Vpr或Nef或其组合或片段)。这可通过去除相应的编码序列或使其突变而防止它们在转录或翻译水平上的表达来实现。到需要这些蛋白包装时，可通过本发明的构建物或其它核酸构建物包装细胞来提供这些蛋白。
本发明的包装细胞表达的一种或多种病毒蛋白可通过本领域已知的多种方法来证实，包括ELISA法，如利用一种以上识别病毒蛋白抗体的夹心ELLSA法。其它非限制性方法的例子包括免疫染色和Western印迹。
这类细胞包装的病毒核酸可任选项地含有被上述包装细胞包装的一种或多种感兴趣的异源性蛋白。这类异源性蛋白的例子包括美国专利6,168,953中所述的通用抗病毒制剂。例子有核酶、反义序列和/或核酸诱饵。
本发明一优选实施例中，此病毒核酸是美国专利5,885,806和2000年5月1日提交的待批美国专利申请09/562,894所述的一种条件性复制载体。另一优选实施例中，此病毒核酸是还包含编码gag和pol蛋白的内源序列的条件性复制载体。可考虑和利用这些细胞作为将所述异源序列包装入病毒粒子中的一种系统。然后考虑和利用病毒草粒子作为运输工具使包装序列感染进入细胞。
另一优选实施例中，设计本发明的病毒核酸和构建物使它们序列之间的相同性最少，以减少它们之间重组的可能性，从而减少产生复制能力强的病毒核酸的可能性。优选本发明的病毒核酸和构建物之间相同的核酸残基少于约8个虽然更优选少于约6个，少于约4个相同残基。导入不相同性的方法包括从病毒核酸和/或构建物中去除不表达的或非关键性的序列，或二者中所见的简并性序列，以减少序列相同性残基的频率。
采用本发明构建物的方法包括将其导入能表达它们的细胞，以产生一个或多个感兴趣的编码序列的细胞表达系统。可将这种细胞系统导入多细胞宿主或已存在于这种宿主中，来体内表达感兴趣的编码序列。可利用此细胞系统来表达所述感兴趣的序列，然后分离或纯化，或用于其它细胞代谢活动中如包装病毒粒子。
可在围绕包装细胞的上清液中找到包装的病毒粒子并任选项地分离它们。粒子优选具有高效价和高转导效率，以将包装的感兴趣的病毒核酸导入靶细胞。
本发明另一方面，提供用本领域已知的方法产生所述构建物和系统的方法。各种核酸构建物的重组应用包括本领域已很好建立的核酸剪接和细胞转化技术，可采用而无须不需要的实验。关于包装病毒载体的细胞，本发明通过本领域已很好建立的方法，提供在有助于细胞生长和载体产生的条件下，导入所述病毒载体后培养细胞的方法。
本发明另一方面，可制备试剂盒形式的构建物和系统，用于表达一个或多个感兴趣的序列。此试剂盒任选地包含实施本发明所需的其它成分，包括但不限于适当的细胞系、缓冲液、盐、冻乾稳定剂或稳定助剂。本发明的试剂盒包含本文所述的构建物，也可包括有利于实施本发明的其它材料，例如但不限于本发明所用的，和/或构建物、系统和含有它们的细胞所用的装置。如熟练医师所希望的那样，可以单个包装和/或包装在一起的形式提供含有此试剂盒的商品。
一实施例中，此试剂盒在适当容器中包含至少一种表达系统。优选此试剂盒含有至少一指示物，例如但不限于可确定此试剂盒的包装盒或标签、适用于本发明所述应用的条款和/或至少一份关于此试剂盒使用的说明书，或本发明所述应用的条款。任选项地，至少一份说明书可以是一套关于此试剂盒使用的或本发明所述应用条款的说明，或关于此试剂盒使用或关于实施本发明的化合物的更大说明书的一部分。更优选地通过包装标签或说明书，此试剂盒标明适合用于表达感兴趣的序列。
实施例
在以下实施例中将进一步描述本发明的化合物和方法。这些实施例作用是进一步阐明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例1
四环素基因调控系统的调节
图1显示本发明的示范性受调控的基因表达系统，其中二个感兴趣的编码序列：逆转录病毒的gag/pol序列和VSV-G包膜蛋白同时受二个其它核酸构建物表达的调控。可将该系统视为三个核酸构建功立业物的二个系统的组合，两系统之间共同采用了第一和第二构建物。
本发明的优选表达系统中，缺乏诱导时TRE启动子(tet操纵子)表达的tTA允许高的可诱导表达水平和低基础性表达。这是由于TRE启动子很弱，该启动子的任何tTA表达因四环素与此系统的接触而完全失活。去除四环素后正反馈机制强烈诱导了tTA表达，产生高水平的Tta，其诱导了第二核酸构建物的表达。
图2显示前二个构建物：pTRE-tTASvPuroTKTat和pTRE-Rev(图1)的结构示意图。pTRE-tTASvPuroTKTat中，TRE启动子表达tTA，HSV TK启动子表达Tat，SV40早期启动子表达选择性标志嘌呤酶素抗性基因。发生两个构建物整合入细胞时，如上所述，细胞中的Rev表达处在四环素控制下。
实施例2
构建基于HT1080的包装细胞系
用摩尔比为10∶1的pTRE-tTASvPuroTKTat和pTRE-Rev质粒DNA共转染HT1080细胞。选出培养中嘌呤酶素抗性的转化细胞。2-3周后选出单细胞集落并扩增，用抗Rev抗体作免疫染色筛选。
用四环素调控Rev的表达：在存在或缺少四环素时将阳性克隆之一2A3(1)-2-F7的细胞培养在4孔小室玻片中48小时。然后因定细胞并用Rev抗体或抗Tat抗体染色。图3显示TRE启动子的Rev表达受到四环素的紧密调控。存在四环素时无阳性细胞，然而在缺少四环素时用抗Rev抗体几孚每一个细胞都染成阳性。因为HSVTK启动子组成性表达Tat基因，在存在或缺少四环素时，几孚所有的细胞都被抗Tat抗体染成阳性。这些结果表明，Rev表达受四环素和TRE启动子表达的tTA紧密调控。
实施例3
Gag/Pol整合
用比例为1∶10的p(SCMV.Neo)和p(U3-1TAR2.GagPolRRE)共转染二个HT1080-TR克隆(被上述pTRE.Rev和pTRE.tTASvPuroTKTat稳定转染)，并在开始GagPol整合转染后48小时用新霉素选择。p(SCNV.Neo)具有在猿CMV启动子控制下的可选择性新霉素抗性基因。p(U3-1TAR2.GagPolRRE)具有在HIV-1的修饰U3启动子(含HIV-2的TAR2序列)控制下的含GagPol编码序列的RRE。
用p24试验筛选抗性克隆，选出共40个具有不同p24值的阳性克隆，称为HT1080-TRGP或预包装细胞系。最好的克隆能产生5000ng/ml以上的p24并且经诱导高1000倍以上(见表1)。大部分克隆诱导后产生100-200倍，存在四环素时p24本底水平低(3-9ng/ml)(表1)。这表明GagPol表达通过Rev受到四环素控制。两个阳性克隆，11-6和12-5的p24值为1072和1854ng/ml，选出用于VSV-G整合。
表1预包装细胞系的p24ELISA试验
Figure C0282144200201
实施例4
VSV-G整合
用20μg p(SCMV.VSVGRRE，TK.Hyg)转染二个HT1080-TRGP克隆(上述11-6和12-5)，并在转染开始后48小时用潮霉素选择。用抗VSVG筛选抗性克隆。原位免疫染色。总共有7个克隆为抗VSVG强染色，纯度50-90％，命名为HT1080-TRGPG或包装细胞系。存在Tc时和亲代HT1080细胞中未见VSVG染色，而阳性克隆的VSVG染色位于胞浆中，无Tc和存在丁酸钠时也浓集在细胞表面。此结果表明VSVG表达也通过Rev受四环素控制。
实施例5
病毒载体包装
在96孔板中作有限稀释进一步纯化实施例2选出的HT1080-TR克隆。根据免疫染色选出最终5个克隆，进一步分析共转染的载体产量。将纯度90％以上的HT1080-TR克隆接种在6孔板中，细胞密度为每平皿1×106细胞，去除四环素(Tc)和加入2.5mM丁酸钠24小时后，用pN2CGFP和pCGCRSRRE各5mg转染。pN2CGFP是HIV-1的复制缺陷型病毒载体，含有5’-LTR表达的gag-pol基因，RRE后接gag-pol基因和内部CMV启动子表达的绿色荧光蛋白(GFP)基因。pCGCRSRRE的总体结构见图2所示，其中″G″指VSV-G蛋白。
转染后，将培养液换成3ml无Tc的无丁酸钠的培养液48小时后收集上清液用于转导HT11080细胞。转导后48小时，用FACS分析转导细胞的GFP表达。通过GFP表达细胞的％确定载体效价。结果见表2，其中5个最终克隆中克隆2A(1)-2-E5和2A3(2)产生了较高的效价。
表2
Figure C0282144200211
所有样品进行一式二份测定。用所有四种质粒同时共转染HT1080对照在细胞中产生短暂质粒转染。四个HT1080-TR克隆的终点效价顺序如下：2A3(2)＞2A2(1)-2-E5＞7A2(2))＞2A3(1)-2-F7。如表所示，用HT1080-TR克隆的载体产量比象HT1080对照短暂转染系统为高。在无四环素的培养液中克隆2A(1)-2-E5和2A3(2)具有10倍诱导能力。
实施例6
采用稳定转染的包装细胞的病毒载体产量
筛选实施例4包装细胞阳性克隆的pN1(cpt)GFP载体moi 70转导的终点效价。存在四环素时转导细胞。洗去残留的载体，转导后用无四环素但含7mM丁酸钠的新鲜培养液培养。丁酸钠处理后24、48和72小时收集上清液在HeLa-Tat细胞中滴定。合并的混合物细胞平均每个细胞含10拷贝载体，在12孔板中或T75瓶中48小时收集时产生的终点效价分别为1.4×106TU/ml或4.0×106TU/ml。TU为转化单位。
3天诱导后裂解所有细胞。存在四环素时见到低水平(＜1×102TU/ml的载体产量(表3)。至少7周传代非生产者细胞维持相同水平的载体产量(表3)。这表明载体产生/载体包装受到四环素控制，四环素先控制tTA表达，tTA进而控制Rev表达，Rev进而(并通过RRE序列)控制GagPol和VSV-G蛋白的表达，后二者是载体包装所必须的成分。
表3.通过稳定包装细胞系制造载体
Figure C0282144200221
实施例7
通过Tat和Rev表达调控感兴趣的基因
我们已证明HIV-1 Rev可调控下游HIV-2 RRE(RRE2)之后的HIV-1 gag-pol基因(由CMV启动子表达)。Chang等(Nucl.Acids Res.20(20)：5465-5472，1992)发现HIV-2 TAR(TAR2)置换的含真正TAR(TAR1)元件的嵌合HIV-1LTR可被HIV-1Tat激活。因为只有TAR元件被置换，HIV-1LTR中余下的R和U5仍存在于此嵌合LTR中。本发明包括只含HIV-1 U3和TAR2的嵌合启动子U3/TAR2(图4)，它被用来置换在构建物pVP1.2RznoG(见图2)中表达gag-pol的CMV启动子，以产生pVP1.2RznoG-U31TAR2(见图2)。用pN1CGFP和pCGCRSRRE将质粒pVP1.2RznoG或pVP1.2RznoG-U31TAR2共转染入293T细胞。转染后48小时收集上清液在HT1080上滴定。发现二构建物产生等量的包装载体(pN1CGFP)。pVP1.2RznoG或pVP1.2RznoG-U31TAR2的效价分别是9.0×106和9.2×106TU/ml(其中TU代表转化单位)。此结果表明该嵌合启动子可被Tat反式激活而表达，其水平比得上CMV启动子。
实施例8
Rev表达调控了感兴趣的基因
Hammarskjold等发现(J，Vir.68(2)：951-958，1994)，只有当HIV-1 env基因(含RRE元件)在一内含子中时，其表达受Rev调节。如果env基因表达为非内含子cDNA，env基因表达不再受Rev调节。Chang和Sharp(Cell 59：789-95，1989)发现受Rev调控的基因表达依赖于剪接供体信号的强度。如果剪接供体的信号非常强并且RNA非常有效地被剪切，基因表达可能不受Rev调控。
制备了一系列VSV-G表达构建物，其中VSV-G cDNA(″基因″)被插入一内含子。VSV-G编码区(″基因″)的下游是CRE元件和RRE。RRE的3’端含一剪接受体位点(见″Rev-应答″，图5)。将5个不同的剪接供体(SD)信号克隆到VSV-G cDNA之前(见下表4)
表4
  共有序列SD   NAGGTAAGT
  β-球蛋白SD   CAGGTAAGT
  HIV-1主要SD   CTGGTGAGT
  HIV-1 env SD   GCAGTAAGT
  HIV-2 env SD   CAAGTGAGT
  Hammarskjold的SD   AGGGTGAGT
这样整个VSV-G，CRS，和RRE区被表达为一内含子(见图5，″Rev-应答″)。在293T细胞中测试这5个VSV-G表达构建物以观察VSV-G表达是否受Rev调控。结果见图6。用pCMVRev(rev表达构建物)或pCI(不含Rev基因的pCMVRev亲代构建物，用作阴性对照)将这5个构建物共转染入293T细胞中。Western印迹(Fog/6)显示5个构建物的3个转染的那些细胞中VSV-G表达受Rev调节。
在用pCMVRev和pCGCRSRRE-1M或pCGCRSRRE-H或pCGCRSRRE-1E之一共转染的细胞中检测到VSV-G蛋白。然而，在用pCI和pCGCRSRRE-1M或pCGCRSRRE-H或pCGCRSRRE-1E之一共转染的细胞中未检测到VSV-G。资料显示这三个构建物的VSV-G表达受Rev调控。
用其它两种构建物(pCGCRSRRE-G和pCGCRSRRE-2E)转染的那些细胞中未检出VSV-G。pCGCRSRRE-G中的β-球蛋白剪接供体信号与共有序列剪接供体信号相同，pCGCRSRRE-2E中HIV-2 env剪接供体信号与共有序列(见上)有一个核苷酸的差异。有可能这些剪接供体信号太强(剪切太有效)而不受Rev调控。
应注意，用pCMVG转染的细胞中表勃VSV-G，这种表达不依赖于rev表达。在CMV启动子控制下直接表达VSV-G蛋白的此构建物中无CRE，RRE和剪接信号。
以上证明了三种VSV-G表达构建物的相同性，即它们的VSV-G表达可能受Rev调控。
本文所引用的所有参考文献包括专利、专利申请和出版物其内容纳入本文参考文献中，不论先前是否已纳入。
现已充分描述了本发明，本领域技术人员将会明白，在宽广范围的等价参数、浓度和条件下无须过多实验即可进行同样的工作。本申请包括按照本发明的基本原理的任何变化、用途或改变，包括不背离本文公开内容的那些变化，伴随本发明属领域中的已知或惯用性实例，以及可应用于本文以上陈述的基本持征。

Claims (32)

1.一种病毒载体包装细胞，其特征在于，该包装细胞含有：
第一核酸构建物，它包含编码第一可诱导启动子和第一产物的核苷酸序列，其中所述第一可诱导启动子调节第一产物的表达，第一可诱导启动子选自四环素启动子/操纵子、或类固醇启动子区域；
第二核酸构建物，它包含编码第二可诱导启动子和第二产物的核苷酸序列，其中第二可诱导启动子由第一产物诱导，第二产物编码逆转录病毒rev蛋白或逆转录病毒tat蛋白或嵌合tat蛋白；和
第三核酸构建物，它包含编码第三可诱导启动子和病毒基因产物的核苷酸序列，其中第三可诱导启动子由第二产物诱导。
2.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中，所述第一产物是四环素调节的启动子/操纵子的反式激活蛋白，或含有所述反式激活蛋白的融合蛋白。
3.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中，所述第一产物是tat蛋白或包含tat蛋白的嵌合蛋白。
4.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中，所述第二产物是rev蛋白。
5.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中，所述第二核酸构建物包含四环素调节的启动子/操纵子。
6.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中第三构建物含有逆转录病毒5’LTR的启动子。
7.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中，所述第三可诱导启动子是逆转录病毒5’LTR。
8.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中所述包装细胞被所述第一、第二和第三核酸构建物稳定转染。
9.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，还包含条件复制型病毒载体，且其中所述细胞包装了所述条件复制型病毒载体。
10.如权利要求9所述的病毒载体包装细胞，其中，所述条件复制型病毒载体来自HIV-1。
11.如权利要求10所述的病毒载体包装细胞，其中，所述病毒基因产物是VSV或Mokola病毒的G蛋白。
12.如权利要求1所述的病毒载体包装细胞，其中病毒基因产物是病毒包膜蛋白或G蛋白。
13.如权利要求12所述的病毒载体包装细胞，其中所述病毒基因产物是G蛋白。
14.如权利要求12所述的病毒载体包装细胞，它还包含编码逆转录病毒gag和pol蛋白的另一核酸构建物。
15.一种制备权利要求1所述的病毒载体包装细胞的方法，该方法包括：
将第一核酸构建物、第二核酸构建物和第三核酸构建物加入病毒载体包装细胞内，其中：
a)第一核酸构建物包含编码第一可诱导启动子和第一产物的第一核苷酸序列，其中所述第一可诱导启动子调节第一产物的表达，第一可诱导启动子选自四环素启动子/操纵子、和类固醇启动子区域；
b)第二核酸构建物包含编码第二可诱导启动子和第二产物的第二核苷酸序列，其中第二可诱导启动子由第一产物诱导，第二产物编码逆转录病毒rev蛋白或逆转录病毒tat蛋白或嵌合tat蛋白；和
c)第三核酸构建物包含编码第三可诱导启动子和病毒基因产物的核苷酸序列，其中第三可诱导启动子由第二产物诱导。
16.如权利要求15所述的方法，它还包括在病毒载体包装细胞内加入条件复制型病毒载体，其中病毒载体包装细胞包装了条件复制型病毒载体。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述第一核酸构建物、第二核酸构建物、第三核酸构建物在一种或多种核酸分子上。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述第一核酸构建物、第二核酸构建物、第三核酸构建物位于三个分开的核酸分子上。
19.如权利要求16所述的方法，其中病毒载体包装细胞还包含编码逆转录病毒gag和pol蛋白的另一核酸构建物。
20.如权利要求15所述的方法，其中构建物整合入细胞基因组中或保持为游离型构建物。
21.如权利要求15所述的方法，其中核酸构建物在三个分开的核酸分子上。
22.如权利要求15所述的方法，其中病毒载体包装细胞是HT1080细胞。
23.如权利要求15所述的方法，其中病毒基因产物是病毒包膜蛋白。
24.如权利要求23所述的方法，其中病毒包膜蛋白是嵌合包膜蛋白。
25.如权利要求23所述的方法，其中病毒包膜蛋白选自下列病毒家族：小RNA病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、弹状病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、布尼亚病毒科、沙粒病毒科、Paro病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科和疱疹病毒科。
26.如权利要求23所述的方法，其中病毒包膜蛋白是突变的或截短的。
27.如权利要求23所述的方法，其中病毒包膜蛋白选自HIV-1包膜蛋白、HIV-2包膜蛋白、MMLV包膜蛋白、水泡性口炎病毒G蛋白、Mokola病毒G蛋白、狂犬病毒G蛋白、GaLV糖蛋白、甲病毒属E1/2糖蛋白、RD114糖蛋白、猫内源性病毒的env蛋白，上述任何蛋白的嵌合体、上述任何蛋白的突变型以及上述任何蛋白的截短型。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述病毒基因产物是水泡性口炎病毒G蛋白、Mokola病毒G蛋白、或HIV-2包膜蛋白。
29.如权利要求15所述的方法，其中第一产物是四环素启动子/操纵子的反式激活蛋白或包含该反式激活蛋白的融合蛋白。
30.如权利要求15所述的方法，其中第一和第二可诱导启动子是四环素启动子/操纵子。
31.如权利要求15所述的方法，其中第三可诱导启动子是逆转录病毒5’LTR。
32.一种包装病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括在第一核酸构建物表达所述第一产物的条件下培养权利要求9或10所述的病毒载体包装细胞。
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