KR100984268B1 - 조절된 핵산 발현 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 작제물, 발현 시스템, 및 유전자 발현 조절과 관련된 방법을 제공한다. 본 발명은 바이러스 입자의 패키지에 필수적인 바이러스 성분을 암호화하는 것을 포함하여, 목적하는 임의의 암호화 서열의 발현을 조절하는 데 적용할 수 있다.
Figure R1020047006464
테트라사이클린, 패키지, 핵산 발현 시스템, 바이러스 벡터, 발현 조절

Description

조절된 핵산 발현 시스템{Regulated nucleic acid expression system}
본 발명은 유전자 발현 조절을 위한 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 목적하는 암호화 서열의 발현을 엄격하게 조절할 수 있는 개선된 핵산 작제물을 제공한다. 엄격한 조절 제어는, 발현될 핵산 또는 발현 수준이 발현이 발생하는 세포 또는 숙주 환경에서 독성인 경우 바람직하다. 또한, 본 발명은 바이러스 벡터를 패키지하는 데 사용된 세포에서의 발현 시스템의 적용에 관한 것으로, 필요한 핵산 작제물을 제조하는 방법 뿐만 아니라 재조합 바이러스 유전자 발현의 제어에서 이들 용도를 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 안정하게 형질감염된 세포에서 유전자 발현의 조절에 관한 것이다.
재조합 핵산 기술이 목적하는 핵산에 의해 암호화된 생성물의 발현을 위한 효과적인 수단임이 입증되었다. 이로써 연구 및 상업적 적용 모두를 위한 폴리펩타이드 및 핵산을 제조할 수 있게 되었다.
그러나, 몇몇 암호화된 생성물은, 그 생성물이 본래 독성이거나, 발생한 발현 수준이 독성을 야기할 정도로 높기 때문에 이들 발현이 발생한 세포 또는 숙주 환경에서 독성이다. 이러한 난점을 해결하는 하나의 수단은 생성물의 감소된 수준으로 독성이 야기되기 전 암호화된 생성물이 발현되고 회수되는 일과성 발현 시스템을 사용하였다. 대안으로, 암호화된 생성물을 생성물이 발현된 후, 독성이 치사 수준으로 높아지기 전에 발현이 종결될 수 있도록 하는, 엄격하게 제어된 조절 시스템하에 놓는다. 엄격하게 제어된 조절 시스템의 하나의 예로는 tet 레프레서와 조합된 테트라사이클린 조절된 오퍼레이터/프로모터를 사용하는 것이다[참고문헌: 미국 특허 제5,750,396호].
독성 생성물의 발현은, 그 생성물이 세포에 의해 생성될 보다 큰 생성물의 하나의 성분 또는 수행될 대사 활성때문에 연속적으로 발현되어야만 하는 경우 특히 중요하다. 이러한 경우의 하나의 예로는 바이러스 입자의 어셈블리 및 패키지에 필요한 생성물을 발현시키는, 바이러스 패키지 세포주의 경우에서이다. 필수적인 바이러스 유전자 생성물중 임의의 하나가 세포에 대하여 독성인 경우, 안정한(일과성과는 대조적) 패키지 세포주가 사용되는지 여부가 이의 발현 조절 필요성에 결정적이다. 필수적인 독성 바이러스 유전자의 하나의 예로는 가형(pseudotype) 바이러스 입자 생성에 바람직한, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 유래의 G-단백질의 경우에서이다.
tet 오퍼레이터 및 레프레서를 사용하여 VSV-G의 발현을 조절하는 예는 문헌[참고문헌: Henriette et al., J. Virol. 73(1):576-584, 1999]에 기재되어 있고, 여기서, tet 레프레서(VP-16 도메인과의 키메라성 융합 생성물로서, 및 tTA로서 언급됨)는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어하에 있고, VSG-G는 tet 오퍼레이터의 제어하에 있다. 테트라사이클린 부재하의 키메라성 레프레서의 발현은 VSG-G의 어떠한 발현도 야기하지 않는다. 테트라사이클린의 존재는 tTA와 오퍼레이터에서 발견된 tet 반응성 요소(TRE)와의 결합을 방해하여 VSV-G를 발현시킬 수 있다. 이 시스템을 "tet-온(on)"이라 나타내고, 여기서, 테트라사이클린의 존재는 목적하는 유전자(즉, VSV-G)의 발현을 야기한다.
또한, tTA가 키메라성 트랜스활성화인자인 대안적 "tet-오프(off)" 시스템이 있다. tTA는 테트라사이클린의 존재하에 tet 오퍼레이터의 TRE와 결합할 수 없다. 그러나, 테트라사이클린의 부재하에, tTA는 오퍼레이터와 결합하여 프로모터를 강하게 활성화시켜 목적하는 암호화 서열을 발현시킨다.
문헌[참고문헌: Klages et al., Molec. Therap. 2(2):170, 2000]은 VSV-G 발현을 제어하는 유사한 2개의 핵산 시스템의 용도를 교시하고 있다. 제1 핵산은 tTA를 발현시키고, 이는 이어서 VSV-G 발현을 제어하는 TRE 함유 tet 오퍼레이터 를 제어한다. 또한, 동일한 tTA 단백질은 rev 단백질의 발현을 조절하고, 이는 이어서 rev 반응성 요소(RRE)를 통해 gag/pol mRNA의 스플라이싱을 제어함으로써 gag 및 pol 영역(바이러스 패키지에 필수적임)의 발현을 조절한다.
유전자 발현을 조절하는 rev 단백질 용도의 또다른 예는 문헌[참고문헌: Yu et al., J. Virol. 70(7):4530-4537, 1996]에 기재되어 있다. 동시에 단일 TRE 함유 tet 오퍼레이터의 조절하에 있는, HIV-1 rev 및 외피 단백질 모두의 발현을 조절하는 tTA의 발현을 사용하였다. 이어서, rev 단백질은 RRE를 통한 바이러스 외피 단백질의 발현 뿐만 아니라 또다른 RRE를 통한 gag/pol mRNA의 발현을 차례로 조절한다. gag/pol 암호화 서열의 전사는 또다른 프로모터에 의해 조절되는 반면, 이의 발현은 rev 단백질에 의해 직접 조절되고, 따라서 tTA에 의해서는 간접 조절되었다.
발명의 요약
본 발명은 핵산(발현) 작제물 및 목적하는 하나 이상의 암호화 서열의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 핵산 작제물들은 바람직하게는 천연 재조합체이고 하나 이상의 목적하는 암호화 서열을 함유하는 3개 이상의 작제물을 포함한다. 작제물은 목적하는 암호화 서열을 발현시키는 발현 시스템으로서 고려되고 사용될 수 있고, 여기서 각각의 작제물은 다음 작제물의 발현을 차례로 조절하는 생성물을 발현시키고, 결국 마지막 작제물을 통하여 목적하는 암호화 서열의 발현이 제어된다. 각각의 작제물은 바람직하게 및 개별적으로 (임의로 오퍼레이터를 갖는) 프로모터와 같은 조절 영역을 함유한다.
본 발명의 하나의 양태에서, 발현 시스템은 바이러스 벡터를 패키지하는 데 사용된 세포 또는 세포주의 일부로서 사용되어 벡터를 패키지하는 데 필요한 성분의 발현을 조절한다. 발현 시스템을 사용하여 목적하는 바이러스 벡터를 패키지하는 데 필수적인 바이러스 구조 유전자 생성물 또는 조절 유전자 생성물의 발현을 조절할 수 있다. 목적하는 하나 이상의 유전자 생성물이 발현되는 경우, 이들은 별개의 핵산 분자상에 위치되어 본 발명의 발현 시스템의 일부로 잔류할 수 있다.
따라서, 본 발명의 발현 시스템은 공통의 작제물을 가질 수 있고, 이는 2개 이상의 시스템을 합하여 상기 시스템에 의해 조절된 2개 이상의 목적하는 암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 공통의 작제물을 갖는 시스템의 예로는, 제1 및 제2 핵산 작제물을 통한 동일한 기작에 의해 조절되는, 2개의 모든 목적하는 암호화 서열을 함유하는 2개의 제3 작제물은 제외한, 동일한 제1 및 제2 핵산 작제물의 사용을 포함한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 제1 핵산 작제물로부터의 발현은 바람직하게는 엄격하게 조절되거나, 자가조절된다. 하나의 비-제한적인 예로는 제1 핵산 작제물의 생성물이 그 자신의 발현을 억제할 수 있는 포지티브 피드백 기작을 통해서이다. 활성화의 부재하에, 제1 핵산 작제물의 이의 자가조절로 매우 낮은 기본 활성이 야기되고, 목적하는 암호화 서열(부가의 핵산 작제물)의 어떠한 발현도 거의 발생하지 않는다. 제1 핵산 작제물의 발현이 일단 활성화된 경우, 시스템에서 모든 추가의 작제물 발현이 이어진다. 본 발명의 바람직한 양태에서 제1 작제물의 자가조절이 사용되어 시스템에서 추가의 작제물로부터의 발현 조절을 최대로 한다.
본 발명의 작제물 및 시스템은 벡터내로 혼입되거나, 세포내로 도입될 수 있다. 세포와 함께, 당해 작제물은 세포 게놈내로 통합되거나, 에피솜 작제물로서 유지될 수 있다. 세포의 선택은 본 발명의 작제물 및 시스템의 발현이 허용되는 한, 중요하지 않다. 세포가 바이러스 벡터를 패키지하는데 사용되는 본 발명의 양태에서, 수득한 바이러스 벡터는 바람직하게는 보체 내성이다.
본 발명의 각각의 작제물은 개별적 핵산 분자상에 존재하거나, 하나 이상의 다른 작제물(예, 비-제한적으로 동일한 플라스미드, 벡터 또는 염색체)로서 동일한 핵산 분자상에 존재할 수 있다. 발현 시스템이 바이러스 벡터를 패키지하는 세포에서 사용되는 본 발명의 바람직한 양태에서, 개별적 작제물은 바람직하게는 별개의 핵산 분자내로 분할된다. 작제물의 배열이 임의의 후속적 작제물의 발현을 조절하는 각각의 작제물의 능력을 간섭하지 않는 한, 하나 이상의 핵산 분자상의 작제물의 존재는 일반적으로 본 발명을 수행하는 데 결정적이지 않다.
본 발명의 대안적 양태 및 부가의 양태에서, 당해 작제물을 배열에서 조절 효과가 발생하도록 위치시킨다. 비-제한적 예로는 2개의 작제물이 하나의 분자상에 위치되어, 이들의 프로모터가 서로 다르게 서열을 발현하도록 배위되고(여기서, 각각의 프로모터의 5' 영역은 각각의 프로모터의 3' 영역 보다 서로 더 근접해 있다), 하나의 프로모터의 활성화가 용이하게 다른 프로모터의 활성화를 증가시키는 경우이다. 바이러스 벡터를 패키지하는 세포에서 사용되는 경우, 혈장상의 이 배열은 벡터 생성의 역가를 증가시키는 것으로 발견되었다. 당해 배열은 2개의 작제물을 단일 분자상에 서로 다르게 배위되도록 제조한 후 세포 게놈내로 그 분자를 통합함으로써 핵산 작제물의 안정한 통합을 함유하는 세포에서 반영될 수 있다. 따라서, 서로 다른 배위는 2개의 작제물의 위치가 상대적으로 유지될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 작제물에 의해 발현된 하나 이상의 생성물은 바람직하게는 바이러스 기원이고, 또다른 작제물로부터의 발현을 엄격하게 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 발현 시스템은 시스템의 또다른 작제물로부터의 발현을 조절할 수 있는 하나 이상의 바이러스 조절 단백질을 발현시킨다.
바람직하게는 본 발명의 작제물 및 시스템을 사용하여, 예를 들어 바이러스 단백질을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌, 세포 또는 숙주에 독성인 생성물(들)을 암호화하는 서열의 발현을 조절한다. 또한, 당해 작제물 및 시스템은 비-독성 생성물의 발현을 물론 조절하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 작제물은 바이러스 입자내 바이러스 벡터를 패키지하는 데 사용된 세포내로 혼입된다. 이러한 세포는, 바이러스 입자내 바이러스 벡터 핵산을 패키지하는 데 필수적인 성분 모두를 제조하기 때문에, 바람직하게는 "패키지 세포"로서 나타낼 수 있다. 목적하는 다른 이종 또는 내인성 서열을 임의로 함유하는 재조합 바이러스 핵산은 이러한 세포에 의해 패키지될 수 있다. 핵산 작제물이 필수적인 바이러스 성분의 발현을 조절하는 유도성 시스템을 야기하는 본 발명의 양태에서, 이러한 세포는 또한 바이러스 입자를 패키지하기 위한 유도성 시스템으로서 고려되고 사용될 수 있다.
본 발명의 작제물은 세포내로 도입되어 염색체외 및/또는 통합된 복제물로서 작제물을 유지시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 작제물의 통합은 연장되거나 일정하지 않은 시간 기간 동안 바이러스 입자를 패키지할 수 있는 안정하게 형질감염된 세포주를 생산하는 데 사용된다.
또한, 본 발명은 상기 기재된 작제물 및 시스템의 제조 방법 뿐만 아니라 암호화 서열의 발현을 조절하는 이러한 시스템의 사용 방법을 제공한다. 이들 방법은 바이러스 벡터 패키지에 필수적인 하나 이상의 성분을 생산하기 위한 본 발명의 용도를 포함한다. 본 발명의 작제물을 함유하는 키트 또는 기재된 방법의 용도가 또한 제공된다
도 1은 레트로바이러스 gag/pol 암호화 영역과 세포내 VSV-G 단백질 둘다의 발현을 조절하는 본 발명의 발현 시스템의 도면이다. 당해 시스템은 TRE 조절된 프로모터의 제어하에, tTA에 있어서 자가조절된 발현 작제물인 제1 작제물을 함유하는 4개의 작제물을 사용한다. 제2 작제물은 TRE 조절된 프로모터의 제어하에, 레트로바이러스 rev 단백질을 발현시킨다. 제3 작제물은 키메라성 레트로바이러스 프로모터의 제어하에, RRE를 함유하는 레트로바이러스의 gag/pol 암호화 영역을 발현시킨다. 제4 작제물은 원숭이 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 이종 프로모터의 제어하에, RRE 조절된 VSV-G 전사물을 발현시킨다.
도 2는 본 발명의 다수의 상이한 핵산 작제물의 구조를 나타낸다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 테트라사이클린(TRE) 프로모터의 제어하에 rev 암호화 서열이 배열된 작제물이 제시되어 있다. pTRE-tTASvPuroTKTat의 구성은 본원 실시예 1에 기재되어 있다. pCGCRSRRE-1M은 도 5에 일부로서 상술되어 있다. 플라스미드 pVP1.2RznoG 및 pVP1.2RznoG-U31TAR2(여기서, IRES는 내부 리보솜 진입 부위이다)는 본원 실시예 7에 상술되어 있다. 플라스미드 pN2CGFP 및 pN1(cpt)CGFP는 본원 실시에 5 및 7에서 논의된다.
도 3은 rev 발현을 조절하는 테트라사이클린의 존재 또는 부재하에 항-Rev 및 항-Tat 항체로 면역염색된 형질감염된 HT1080-TR 클론을 나타내고 있다. 본원 실시예 2를 참조한다.
도 4는 본원 실시예 7에서 논의된 키메라성 U3/TAR2 프로모터의 도면을 나타낸다.
도 5는 유전자 발현 Rev 반응성(의존적) 또는 비-반응성(독립적)을 부여하는 스플라이싱 공여체 및 수용체 부위의 상이한 배열을 함유하는 작제물의 도면을 나타낸다.
도 6은 상이한 스플라이싱 공여체 부위의 사용하여 rev-의존적 VSV-G 단백질 발현을 증명하는 웨스턴 블롯을 나타낸다.
정의
"핵산" 또는 "핵산 작제물" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드인 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드이다. 이 용어는 분자의 1차 구조만을 나타낸다. 따라서, 당해 용어는 이본쇄 및 일본쇄 DNA 및 RNA를 포함한다. 또한, 당해 용어는 선형 또는 환형 중합체를 포함한다.
본원에 사용된 "목적하는 암호화 서열"은 발현을 목적으로 하는, 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 당해 암호화 서열은 실질적인 서열로 공지되거나 공지되지 않을 수 있고, 목적하는 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화한다.
본원에 사용된 "세포" 또는 "숙주"는 본 발명의 핵산 작제물 또는 발현 시스템이 도입되고 발현될 수 있는 상응하는 살아있는 생물을 나타낸다. "세포"는 임의의 세포일 수 있고, 바람직하게는 진핵 세포이다. 당해 세포는 본 발명의 핵산 작제물의 도입에 의하거나, 도입과 함께 신규하게 분리되고 형질전환된 세포주 또는 1차 세포들일 수 있다. 세포주 또는 배양물은 시험관내 배양을 통해 유지된 세포를 나타내고, 이는 세포주 또는 배양물을 유도하는 모세포(들)과 동일하지 않을 수 있다. 세포의 비-제한적인 예로는 진핵 세포주, 예를 들어 HeLa, 293, HT-1080, CV-1, TE671 또는 기타 사람 세포; 베로(Vero) 세포; 또는 D17 세포를 포함한다. 기타 세포는 림프구(예, T 또는 B 세포) 또는 대식세포(예, 단핵구 대식세포)를 포함하거나, 이들 세포중 하나에 대한 전구체, 예를 들어 조혈 줄기 세포이다. 본 발명을 수행하기 위한 부가의 세포로는 성상세포, 피부 섬유모세포, 창자 상피세포, 내피세포, 상피세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 단핵구, 근세포, 신경 세포(예, 비-제한적으로 뇌 및 시신경 세포), 간세포, 조혈 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 정자 또는 난모세포를 발생시키는 세포, 기질 세포, 점막 세포 등을 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 진핵, 다세포 종(예, 단세포 효보 세포와는 대조적)이고, 보다 바람직하게는 포유동물, 예를 들어 사람 세포이다.
세포는 단일 단위로서 존재하거나, 세포의 보다 큰 집단의 일부일 수 있다. 이러한 "보다 큰 세포 집단"은 예를 들어 세포 배양물(혼합 또는 순수형), 조직(예, 내피, 상피, 점막 또는 상기 언급된 CD 4 결핍 세포를 함유하는 조직을 포함한 기타 조직), 기관(예, 심장, 폐, 간, 근육, 쓸개, 방광, 생식선, 안구, 및 기타 기관), 기관계(예, 순환계, 호흡계, 소화계, 비뇨계, 신경계, 피부계 또는 기타 기관계), 생물(예, 조류, 포유류 등)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기관/조직/세포는 순환계(예, 심장, 혈관 및 백혈구 및 적혈구를 포함한 혈액을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님), 호흡계(예, 코, 인두, 후두, 기관, 기관지, 세기관지, 폐 등), 소화계(예, 입, 인두, 식도, 위, 장, 침샘, 췌장, 간, 쓸개 및 기타), 비뇨계(예, 신장, 요관, 방광, 요도 등), 신경계(예, 뇌 및 척수, 및 안구와 같은 특수 감각 기관을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님) 및 피부계(예, 피부, 표피 및 피하 또는 진피 조직 세포)이다. 보다 바람직하게는, 세포는 심장, 혈관, 폐, 간, 쓸개, 방광, 및 안구 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 당해 세포들은 정상 세포일 필요는 없고, 질환 세포일 수 있다. 이러한 질환 세포는 종양 세포, 감염 세포, 유전자 비정상 세포, 또는 종양 혈관 내피 세포와 같은 비정상 세포에 근접하거나 접촉한 세포일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 교대로 사용된, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 "부분" 또는 "영역"은 2개 이상의 염기의 연속적인 서열이다. 다른 양태에서, 부분 또는 영역은 임의의 약 3, 5, 10, 15, 20, 25개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드이다.
"바이러스"는 단백질 및 핵산으로 이루어져 있고, 숙주 세포의 유전자 기구를 사용하여 바이러스 핵산에 의해 지정된 바이러스 생성물을 생산하는 감염원이다. 본 발명은, RNA 및 DNA 바이러스 둘다에 적용할 수 있는, 예를 들어 바이러스 암호화 서열의 발현과 같은 양태를 포함한다. RNA 바이러스는 원핵세포(예, 박테리오파지) 뿐만 아니라 포유동물 및 특히 사람을 포함하는 다수의 진핵세포를 감염시키는 각종 그룹이다. 하나 이상의 군은 유전자 물질로서 이본쇄 RNA를 갖지만, 대부분의 RNA 바이러스는 이들의 유전자 물질로서 일본쇄 RNA를 갖는다. RNA 바이러스는 3개의 주요 그룹으로 나뉜다: 포지티브-쇄 바이러스, 네가티브-쇄 바이러스 및 이본쇄 RNA 바이러스. 본 발명과 관련된 RNA 바이러스는 신드비스-유사 바이러스(예, 토가바이러스과, 브로모바이러스, 쿠쿠모바이러스, 토바모바이러스, 일라르바이러스, 토브라바이러스 및 포텍스바이러스), 피코나바이러스-유사 바이러스(예, 피코나바이러스과, 칼리시바이러스과, 코모바이러스, 네포바이러스 및 포티바이러스), 마이너스-쇄 바이러스(예, 파라믹소바이러스과, 라브도바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 버니아바이러스과 및 아레나바이러스과), 이본쇄 바이러스(예, 레오바이러스과 및 버나바이러스과), 플라비바이러스-유사 바이러스(예, 플라비바이러스과 및 페스티바이러스), 레트로바이러스-유사 바이러스(예, 레트로바이러스과), 코로나바이러스과, 및 노다바이러스과를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 기타 바이러스 그룹을 포함한다. 본 발명은 바람직하게는 플라비바이러스과 군의 RNA 바이러스, 보다 바람직하게는 필로바이러스 속의 바이러스, 및 특히 마르부르크 또는 에볼라 바이러스에 적용된다. 플라비바이러스과 군의 바이러스는 플라비바이러스 속의 바이러스, 예를 들어 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 세이트 루이스 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 로키오 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 등이다. 본 발명은 바람직하게는 피코나바이러스과 군의 바이러스, 바람직하게는 A형 간염 바이러스(HAV), B형 바이러스(HBV), C형 바이러스(HBC) 또는 A형도 아니고 B형도 아닌 간염 바이러스에 적용된다.
본 발명에 적용될 수 있는 또다른 바람직한 RNA 바이러스는 레트로바이러스과 군의 바이러스(즉, 레트로바이러스), 특히 온코바이러스과의 속 또는 아군의 바이러스, 스푸마바이러스과, 스푸마바이러스, 렌티바이러스과 및 렌티바이러스이다. 온코바이러스과 아군의 RNA 바이러스는 바람직하게는 1형 또는 2형 사람 T-림프친화성 바이러스(즉, HTLV-1 또는 HTLV-2) 또는 소 백혈병 바이러스(BLV), 조류 백혈병-육종 바이러스(예, 로우스 육종 바이러스(RSV), 조류 골수아세포종 바이러스(AMV), 조류 적아구증 바이러스(AEV), 및 로우스-관련 바이러스(RAV; RAV-0 내지 RAV-50), C형 포유동물 바이러스(예, 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 하비 생쥐 육종 바이러스(HaMSV), 아벨슨 생쥐 백혈병 바이러스(A-MuLV), AKR-MuLV, 고양이과 백혈병 바이러스(FeLV), 원숭이(simian) 육종 바이러스, 세망내피증 바이러스(REV), 비장 괴사 바이러스(SNV), B형 바이러스(예, 마우스 포유류 종양 바이러스(MMTV)) 및 D형 바이러스(예, 메이슨-화이자 원숭이(monkey) 바이러스(MPMV) 및 "SAIDS" 바이러스)이다. 렌티바이러스 아군의 RNA 바이러스는 바람직하게는 1형 또는 2형 사람 면역결핍 바이러스(즉, HIV-1 또는 HIV-2, 여기서, HIV-1은 통상적으로 3형 바이러스(HTLV-III)와 결합된 림프절병증 및 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)-관련 바이러스(ARV)라 한다), 또는 AIDS 또는 AIDS-유사 질환과 연관있는, HIV-1 또는 HIV-2와 관련된 또다른 바이러스이다. 본원에 사용된, 약어 "HIV" 또는 "사람 면역결핍 바이러스"는 이들 HIV 바이러스, 및 유전자적으로 HIV-관련 및 HIV-연관된 바이러스를 나타낸다. 또한, 렌티바이러스 아군의 RNA 바이러스는 바람직하게는 비스나/메디 바이러스(예, 감염 양), 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV), 소 렌티바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 및 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV)이다. 본 발명은 또한 DNA 바이러스에 적용될 수 있다. 바람직하게는, DNA 바이러스는 헤르페스 바이러스(예, 엡스타인-바르 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스), 아데노바이러스, AAV, 유두종 바이러스, 우두 바이러스 등이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 기술되지 않는 한, 상응하는 복수형 참조를 포함한다는 것을 주지하여야 한다.
"발현"은 데옥시리보핵산의 전사 및/또는 리보핵산의 해독을 포함한다.
본원에 사용된, 용어 "포함하는(comprising)" 및 이의 유사어는 포괄적인 의미; 즉, 용어 "포함하는(including)" 및 이의 상응하는 유사어와 동일하게 사용된다.
전사 또는 해독의 개시, 쇄 연장 또는 쇄 신장 등과 같은 반응이 발생하는 데 "적합한" 조건 또는 반응이 발생 "가능한" 조건은 반응의 발생을 방지하거나, 억제하지 않는 조건이다. 따라서, 이들 조건은, 반응을 허용하고, 증강시키며, 용이하게 하고/거나 도움이 된다. 당해 기술분야에 공지되고 본원에 기술된 이러한 조건은, 예를 들어 뉴클레오타이드 서열의 특징, 온도 및 완충액 조건에 따라 달라진다. 이들 조건은 또한 목적하는 반응, 예를 들어 핵산/단백질 상호작용, 단백질/단백질 상호작용, 전사 또는 해독에 따라 달라진다.
용어 "3'"(3 프라임)은 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드내 또다른 영역 또는 위치로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 3'(하류)에서의 영역 또는 위치를 나타낸다.
용어 "5'"(5 프라임)은 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드내 또다른 영역 또는 위치로부터의 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드 5'(상류)에서의 영역 또는 위치를 나타낸다.
용어 "3'-DNA 부분", "3'-DNA 영역", "3'-RNA 부분" 및 "3'-RNA 영역"은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단쪽에 위치한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 부분 또는 영역을 나타내고, 3' 최말단의 뉴클레오타이드(들) 또는 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 3' 최말단 뉴클레오타이드에 부착된 잔기들을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
용어 "5'-DNA 부분", "5'-DNA 영역", "5'-RNA 부분" 및 "5'-RNA 영역"은 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단쪽에 위치한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 부분 또는 영역을 나타내고, 5' 최말단의 뉴클레오타이드(들) 또는 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 최말단의 뉴클레오타이드에 부착된 잔기들을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
용어 "이종"은 2개의 물질이 통상적으로 천연에서 또는 천연 상태에서 함께 발견되지 않는 경우의 두 물질 사이의 관계를 나타낸다. 용어 "내인성"은 2개의 물질이 통상적으로 천연에서 또는 천연 상태에서 발견되는 경우의 이 두 물질 사이의 관계를 나타낸다. 예를 들면, 암호화 서열은 통상적으로 천연 서열과 회합되지 않는 이종 프로모터와 작동적으로 결합될 수 있고, 통상적으로 천연 서열과 회합되는 내인성 프로모터와 작동적으로 결합될 수 있다. 대안으로, 핵산은 이종 서열과 공유적으로 결합될 수 있고, 이를 함유하는 이종 서열은 안티센스 배위인 경우를 제외하고는 통상적으로 발견된다. 암호화 서열은 프로모터가 암호화 서열의 전사를 지시할 수 있는 경우, (예를 들어, 암호화 서열과 프로모터 모두가 발현될 수 있는 천연 또는 재조합 작제물을 구성하는 경우), 프로모터에 "작동적으로 결합"된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명에 속하는 당해 기술분야 숙련가에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명은 재조합에서 사용되는 경우 목적하는 하나 이상의 암호화 서열의 발현을 조절하는, 핵산(발현) 작제물을 제공한다. 목적하는 암호화 서열은 RNA 또는 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고, 이의 발현이 중요하거나 목적으로 한다. 핵산 작제물은 바람직하게는 천연 재조합물이고, 순차적으로 작용하여 목적하는 암호화 서열의 발현을 조절하므로, 목적하는 암호화 서열은 "마지막" 작제물 상에 위치할 것이다. 각각의 작제물은 다음 작제물로부터의 발현을 마지막까지 차례로 조절하는 생성물을 발현시키고, 마지막 작제물을 통해 목적하는 암호화 서열의 발현이 조절된다. 각각의 작제물은 바람직하게 및 개별적으로 또다른 작제물로부터의 발현에 의해 유도되고/거나 조절되는 조절 영역을 함유한다. 또한, 작제물은 임의적으로 이들의 동정 및 사용을 용이하게 하는 선택성 또는 검출성 마커를 함유한다. 작제물상에는 존재하지만 작제물이 도입된 세포에 대해 내인성이 아닌 조절 또는 암호화 서열이 검출성 마커로서 작용할 수 있다.
본 발명의 작제물은 바람직하게는 바이러스 벡터를 패키지하는 데 사용된 세포 또는 세포주내 존재한다. 따라서, 작제물은 상기 벡터를 패키지하는 데 필수적인 하나 이상의 바이러스 성분의 발현을 조절한다. 바이러스 성분은 바이러스 외피 단백질, 캡시드 단백질, 레트로바이러스의 경우 gag 또는 pol 암호화된 단백질 및/또는 바이러스 조절 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 적절한 패키지에 필수적인 임의의 바이러스 유전자 생성물일 수 있다. 이들 바이러스 성분을 암호화하는 핵산은, 이들이 바이러스 벡터의 적합한 패키지를 야기하도록 발현될 수 있는 한, 하나 이상의 핵산 분자상에 위치될 수 있다. 바이러스 벡터와 모든 바이러스 성분을 함유하는 벡터를 야기하는 작제물 사이의 재조합 가능성을 감소시키기 위해, 바이러스 성분을 암호화하는 핵산을 바람직하게는 별개의 핵산 분자내로 분할시킨다. 발현될 바람직한 바이러스 성분은 HIV-1 또는 HIV-2의 gag/pol 서열에 의해 암호화된 것, 레트로바이러스(바람직하게는 HIV-1 또는 -2 유래) rev 단백질, 및 바이러스 외피 단백질이다.
예를 들면 본 발명을 제한함이 없이, 본 발명은 목적하는 암호화 서열의 발현을 위한 3개의 작제물을 포함할 수 있다. 제1 핵산 작제물은 제1 생성물을 발현시킬 수 있고, 여기서, 제1 생성물은 제2 핵산 작제물로부터의 제2 생성물의 발현을 조절할 수 있으며, 제2 생성물은 제3 핵산 작제물 상에 존재하는 목적하는 상기 암호화 서열에 의해 암호화된 생성물의 발현을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 상기 3개의 핵산 작제물은 이종 핵산을 포함한다. 다른 바람직한 양태에서, 제1 및 제2 작제물로부터의 발현은 전사 및/또는 해독의 직접 조절에 의한 것인 반면, 제3 작제물로부터의 목적하는 암호화 서열은 스플라이싱 및/또는 핵 방출의 조절에 의한 것이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 제1 작제물은 유도성 프로모터, 그렇지 않으면 조절된 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터 또는 스테로이드 또는 엑디손 프로모터 영역을 포함한다. 또다른 조절 시스템은 ARIAD 파마슈티칼스 인크사에 의해 개발된 것이다. 프로모터는 제2 작제물로부터의 발현을 조절하는 생성물을 암호화하는 제1 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 제1 작제물은 테트라사이클린 프로모터 및 테트라사이클린의 활성화인자를 암호화하는 제1 암호화 서열(또는 tTA를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 활성화인자를 포함하는 융합 단백질)을 포함하고, 여기서, 제1 작제물은 자가조절되고, 테트라사이클린의 존재하에 어떠한 발현도 발생하지 않는다. 대안으로, 제1 암호화 서열은 레트로바이러스, 바람직하게는 HIV-1 또는 HIV-2, tat 단백질을 암호화한다.
당해 실시예에서, 테트라사이클린의 제거에 의한 전사 유도로 tet 활성화인자 또는 대안으로 tat 단백질을 발현시킨다. 따라서, 제2 핵산 작제물은 tet 프로모터/오퍼레이터 또는 대안으로 tat 조절된 프로모터 영역, 예를 들어 발현된 tat 단백질에 의해 조절된 5' LTR 프로모터를 포함할 것이다. 상기 제2 핵산 서열의 암호화 서열은 제3 작제물의 발현을 조절하는 임의의 생성물을 암호화할 수 있다. 본 발명의 비-제한적 양태에서, 제2 핵산 서열은 레트로바이러스 rev 단백질을 암호화하여 제3 작제물상에 존재하는 목적하는 암호화 서열의 mRNA 스플라이싱 및/또는 핵 방출을 조절할 수 있다. rev 단백질의 발현을 포함하는 본 발명의 양태에서, 제3 작제물상에 존재하는 프로모터는 rev 단백질의 존재하에 적합한 스플라이싱 및/또는 핵 방출시 목적하는 수준의 단백질을 생성시키기에 충분한 수준으로 mRNA로서 목적하는 암호화 서열을 발현시킬 수 있는 임의의 적합한 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 레트로바이러스, 바람직하게는 HIV, 5'LTR의 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV), 바람직하게는 사람 또는 원숭이 CMV의 프로모터이다.
제3 작제물 상의 목적하는 암호화 서열이 본 발명의 세포 패키지에 적용되는 경우, 이는 바이러스 외피 단백질(예, 레트로바이러스의 단백질), 보다 바람직하게는 HIV-1, HIV-2 또는 MMLV 외피 단백질; 수포성 구내염 바이러스(VSV), 모콜라 바이러스 또는 광견병 바이러스 유래의 G 단백질; GaLV, 알파바이러스 E1/2 글리코단백질 또는 RD114, 고양이과 내인성 바이러스 유래의 외피 단백질을 암호화할 수 있다. 대안으로, 키메라성 외피 단백질을 암호화하는 서열이 또한 사용될 수 있다. 하기 바이러스 군 유래의 외피 단백질을 암호화하는 서열이 또한 사용될 수 있다: 피코나바이러스과, 통가바이러스과, 코로나바이러스과, 라브도바이러스과, 파라믹소바이러스과, 오르토믹소바이러스과, 버니아바이러스과, 아레나바이러스과, 파로바이러스과, 폭스바이러스과, 헤파드나바이러스과, 및 헤르페스 바이러스.
본 발명의 대안적 양태에서 및 제1 작제물이 스테로이드 호르몬 수용체에 있어서 암호화 서열에 작동적으로 결합된 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터를 포함하는 경우, 발현 유도는 상기 수용체의 발현을 야기한다. 따라서, 제2 작제물은 상기 스테로이드 호르몬 수용체에 의해 조절되는 프로모터를 갖는다(상기 프로모터부터의 개시는 수용체 및 활성화 리간드를 포함하는 복합체에 의해 활성화된다). 상기 복합체의 부재하에, 프로모터는 불활성이다. 제2 작제물의 암호화 영역은 제3 작제물로부터의 발현을 조절하는 임의의 생성물을 다시 암호화할 수 있다. 예를 들면, 제2 작제물의 암호화 서열은 레트로바이러스의 tat 또는 rev 단백질을 암호화할 수 있다. 암호화된 tat 단백질에 있어서, 제3 작제물은 tat 단백질에 의해 발현이 조절되는 영역, 예를 들어 비-제한적으로 레트로바이러스의 5' LTR 프로모터 및 TAR로 고안된 시스-작용하는 RNA 요소를 암호화하는 서열을 포함한다. 암호화된 rev 단백질에 있어서, 제3 작제물의 발현은 오직 상기 논의된 바와 같은 (mRNA 스플라이싱 및/또는 핵 방출 제어를 통한) rev 단백질의 조절을 필요로 한다.
레트로바이러스 tat 단백질이 바이러스 벡터를 패키지하기 위한 세포에게 적용되는 경우, 이는 바이러스 벡터의 단백질과 비교하여 이종 바이러스 유래일 수 있다. 바이러스 벡터는 HIV-1 유래일 수 있고, 본 발명을 제한함이 없이 키메라성 프로모터는 본 발명의 하나 이상의 핵산 작제물에서 사용될 수 있다. 키메라성 레트로바이러스 프로모터의 비-제한적 예로는 이종 TAR 서열을 함유하는 레트로바이러스 5' LTR 프로모터가 있고, 여기서, 동족 이종 tat 단백질의 발현이 프로모터에 결합된 암호화 서열의 발현에 필수적이다. 바람직한 키메라성 프로모터는 HIV-2 TAR 서열을 함유하는 HIV-1 5' LTR 프로모터를 포함한다. HIV-2 tat 단백질을 발현시킬 수 있는 작제물과 배합하여 사용되는 경우, 키메라성 프로모터에 작동적으로 결합된 암호화 서열이 발현된다.
TAR 요소가 본 발명의 하나 이상의 작제물에서 사용된 본 발명의 추가의 양태에서, tat 단백질 암호화 서열이 본원에 기재된 발현 시스템의 임의의 작제물내에 존재할 필요는 없다. 대신에, 동족 tat 단백질에 있어서의 TAR의 요구성은, 또다른 공급원으로부터 tat 단백질을 공급함으로써 이루어졌다. 예를 들면, 본 발명의 작제물이 세포내로 도입되는 경우, 세포는 세포 게놈내로 임의로 통합된 부가의 핵산 작제물을 함유할 수 있고, 이는 필수적인 tat 단백질을 발현시킨다. 이러한 단순 발현 작제물은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있다.
상기 하나의 예로는 tat 단백질이 본 발명의 발현 시스템과 배합하여 사용되는 경우가 있다. 목적하는 2개의 핵산 서열이 발현될 경우, 제1 핵산은 본 발명의 발현 시스템의 제어하에 있을 수 있는 반면, 제2 핵산은 상기 시스템과 상기 기재된 또다른 공급원을 통해 발현된 tat 단백질 모두의 제어하에 있다. 예를 들면, 3개의 작제물이 사용되어 rev 단백질(제2 작제물 유래)을 통해 목적하는 제1 서열(제3 작제물 유래)의 발현을 조절할 수 있다. 이어서, 목적하는 제2 서열은 rev 단백질(제2 작제물 유래) 및 tat 단백질에 의해 조절되는 제4 작제물로부터 발현된다. 따라서, 목적하는 제1 서열은 시스템 제어하에만 있는 반면, 목적하는 제2 서열은 상기 시스템과 tat 단백질 모두의 제어하에 있다. 이종 tat 단백질 및 TAR 요소는 물론 본 발명의 대안적 양태에서 사용될 수 있다. 추가의 대안으로, 목적하는 제1 서열은 또한 tat가 조절되도록 제조될 수 있다.
상기 기재된 tat 암호화 서열 사용의 대안으로서, 키메라성 tat 단백질을 암호화하는 서열을 사용할 수 있다. Tat는 융합 단백질(예, Tat-Gal4)내에서 제조될 수 있고, HIV-LTR 프로모터의 트랜스활성화 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 기타 키메라성 Tat 단백질은 또한 충분한 트랜스활성화 활성이 보유되는 한 사용될 수 있다.
rev 단백질이 후속적 작제물로부터의 발현을 조절하는 데 사용될 때마다, 상기 후속적 작제물의 암호화 서열은 rev 단백질에 의한 조절을 위해 rev 반응성 요소(RRE) 및 적합한 스플라이싱 공여체 및 수용체 부위를 함유하거나 함유하도록 변형된다. 예를 들면, 본 발명을 제한함이 없이, 제3 작제물이 바이러스 외피 또는 G 단백질을 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 경우, 암호화 서열은 스플라이싱 공여체 및 수용체 부위를 포함하고, 이들 부위는 외피 또는 G 단백질이 발현될 수 있도록 적합한 스플라이싱 및/또는 핵 방출을 위한 동족 rev 단백질을 필요로 한다. 상기 부위는 임의로 선택되어 rev 단백질과 함께 약독화된 스플라이싱 기능을 제공할 수 있다. 약독화는 rev 단백질 및 RRE상에 보다 독립적으로 발현시키는 수단을 제공한다. 예를 들면, 스플라이싱 부위가 본질적으로 상당히 빠르게 작용하는 경우, 목적하는 암호화 서열은 rev 단백질 및 RRE가 mRNA를 방출하거나, 서열의 발현시킬 기회를 갖기 전, 밖으로 스플라이싱될 수 있다. 따라서, 스플라이싱 부위는 rev 단백질의 부재하에는 스플라이싱이 이루어지고 발현을 억제하기에 충분하게 선택되는 반면, rev 단백질의 존재하에는 스플라이싱을 억제하고 발현이 이루어지도록 선택된다.
본 발명의 작제물은 목적하는 암호화 서열을 위한 발현 시스템으로서 배합하여 고려되고 사용될 수 있다. 또한, 동일한 작제물을 포함하는 2개 이상의 발현 시스템을 합하여 목적하는 2개 이상의 암호화 서열의 발현을 동시에 조절할 수 있다. 예를 들면, 본 발명을 제한함이 없이, 2개의 제1 작제물은 2개 이상의 제3 작제물 상의 목적하는 암호화 서열의 발현을 조절하는 제2 작제물과 동일할 수 있고, 각각은 목적하는 암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 이러한 예의 하나의 양태에서, 제1 작제물은 제2 작제물에서 rev 단백질 암호화 서열의 발현을 조절하는 생성물을 암호화하는 암호화 서열에 작동적으로 결합된 테트라사이클린 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 2개 이상의 제3 작제물 각각에서 목적하는 암호화 서열은 변형되어 스플라이싱 공여체 및 수용체를 함유하고, 제2 작제물에 의해 발현된 rev 단백질의 존재시 암호화 단백질의 발현이 발생한다. 특이적 예에서, 목적하는 2개의 암호화 서열은 2개의 제3 작제물내 존재할 수 있다: 제1 암호화 서열은 레트로바이러스, 바람직하게는 HIV, RRE에 작동적으로 결합된 gag/pol 서열이고, 제2 암호화 서열은 VSV-G 또는 RRE에 작동적으로 결합된 모콜라 바이러스 G 단백질이다. 상기 주지된 바와 같이, 이들 2개의 제3 작제물을 위한 프로모터는 rev 단백질의 존재시 충분히 발현될 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다.
본원에 주지된 바와 같이, 제1 핵산 작제물로부터의 발현은 바람직하게는 엄격하게 조절되거나 자가조절된다. 비-제한적 예로서, 엄격한 조절은 제1 핵산 작제물이 이의 자신의 발현을 (직접 또는 간접적으로) 억제할 수 있는 포지티브 피드백 기작으로 제공된다. 활성화의 부재시, 제1 핵산 작제물의 자가조절은 매우 낮은 기본 활성을 야기하고, 본 발명의 발현 시스템의 모든 작제물로부터의 어떠한 발현도 발생하지 않는다. 대신에, 제1 핵산 작제물로부터의 발현의 활성화시, 시스템내 모든 부가의 작제물 발현이 이어진다.
본 발명의 작제물 및 시스템은 벡터내로 혼입되거나, 비-제한적으로 포유동물, 설치류, 영장류 또는 사람 세포와 같은 세포내로 도입될 수 있다. 본 발명의 작제물은 세포 게놈내로 통합되거나 에피솜 작제물로서 유지될 수 있다. 본 발명의 바람직한 세포는 목적하는 암호화 서열의 단독 발현 또는 다른 핵산 발현과의 배합이 바람직한 세포이다. 본 발명의 작제물은 임의의 순서로 세포내로 도입될 수 있다. 도입후, 상기 세포내 작제물의 존재를 상기 작제물상에 위치한 선택성 또는 검출성 마커를 통해 상기 작제물을 검출함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 각각의 작제물이 개별적인 핵산 분자상에 존재할 수 있는 반면, 본 발명의 몇몇 바람직한 적용은 본 발명의 하나 이상의 작제물을 함유하는 단일 핵산 분자를 포함한다. 예를 들면, 안정한 세포주의 작제와 관련한 비-제한적 예로서, 본 발명의 작제물을 하나의 세포의 하나 이상의 염색체내로 안정하게 통합하여 안정하게 형질감염된 세포주를 작제한다. 대안으로, 그 작제물을 상기 세포내 도입전 하나 이상의 에피솜 벡터 또는 플라스미드상에 놓을 수 있다. 개별적 작제물들을 바이러스 벡터의 패키지를 위한 세포에 적용하는 경우, 이들을 바람직하게는 별개의 핵산 분자내로 분할시켜 필요한 바이러스 벡터와의 재조합 수를 증가시켜 복제 수용적격성을 부여한다. 바람직하게는, 본 발명의 작제물, 특히 조절 영역 및 이의 암호화 서열 부분은 바이러스 기원인 서열을 포함한다. 따라서, 바이러스 조절 영역(시스로 작용) 및 암호화 영역(트랜스로 작용)이 본 발명의 수행함에 있어 바람직하다. 시스 작용 영역의 예로는 TAR 및 RRE, 레트로바이러스의 INS(억제 서열 또는 불안정 서열, 또는 CRS로서 언급됨) 요소인 반면, 트랜스 작용 암호화 영역의 예는 tat 및 rev 암호화 서열이다. 바이러스 작제물을 사용한 세포는 바람직하게는 본 발명의 작제물에 의해 도입된 것 이외의 바이러스 서열을 함유하지 않는다.
바람직하게는, 목적하는 바이러스 핵산과 이종인 RRE를 본 발명의 작제물에서 사용한다. 예로는 HIV-1 유도된 핵산에 있어서 HIV-2 RRE, CTE(항상성 수송 요소, 예, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스 및 기타 레트로바이러스 유래) 또는 PRE(전사-후 조절 요소, 예, 마못류 간염 바이러스 유래)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상이한 서열을 갖는 상이한 RRE를 기초로 한 동종 재조합의 가능성을 감소, 최소화 또는 제거하는 것 이외에, 대략 5배의 패키지된 바이러스 핵산 생성의 놀랍고 기대이상의 증가가 관찰되었다.
본 발명의 각종 양태는 목적하는 암호화 서열의 발현에 관한 것으로, 여기서, 암호화된 생성물은 발현이 발생하는 세포 또는 숙주에 독성이다. 이의 예로는 바이러스 gag-pol 단백질 및 외피 단백질, 예를 들어 VSV G 단백질을 포함한다. 그러나, 본 발명의 전체 범주는 세포 또는 숙주에는 독성이 아니고, 특이적 조건, 예를 들어 높은 수준의 발현 또는 독성의 원인이 되는 부가 인자의 존재하에서만 독성인 서열을 발현시키는 이의 용도를 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태는 본 발명의 작제물을 함유하는 세포 및 세포주의 제조에 관한 것이다. 핵산 작제물의 세포내 도입 방법은 세포 게놈내 통합을 돕는 조건의 사용을 포함하여(예, 전기천공법, 리포펙션(lipofection), 및 인산칼슘 침전법) 당해 기술분야에 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 작제물 및 세포는 목적하는 특정 바이러스 핵산을 함유하는 바이러스 입자를 생성하는 필수적인 인자를 제공하도록 고안된다. 바람직하게는, 바이러스 핵산은 복제 결핍이고, 내인성 "패키지 시그날"의 제거 또는 손실없이 천연 발생의 바이러스로부터 유도된다. 특히 바람직한 본 발명의 양태에서, 바이러스 핵산은 HIV-1로부터 유도된다. HIV-1 유도된 바이러스 핵산은 AIDS 리서치(Research) 및 미국 보건국립 연구원을 통한 참조 시약 프로그램 카다로그로부터 입수할 수 있는 야생형 균주인 pNL4-3 HIV-1 분자 클론에 의해 생성될 수 있다[참고문헌: Adachi et al., J. Virol., 59, 284-291(1986)]. 이들 세포는 바이러스 핵산을 위한 "패키지 세포"로서 고려되고 사용될 수 있으며, 이들은 감염성 바이러스 입자내로 바이러스 핵산을 패키지하는 데 필요한 모든 성분을 생성시키므로, 개별적으로 세포내로 도입될 수 있다.
바이러스 핵산이 모든 다른 성분을 제공하는 경우, 바람직한 패키지 세포는 목적하는 암호화 서열로부터 하나 이상의 바이러스 외피 단백질 또는 동족제(예, 변이체, 융합체, 또는 이의 절단형) 또는 이의 이종형을 발현시킨다. 바람직한 외피 단백질은 천연형의 바이러스 핵산의 내인성 서열(즉, 바이러스의 패키지에 통상적으로 사용되고, 이로부터 바이러스 핵산이 유도됨) 또는 바이러스 핵산의 이종 서열에 의해 암호화된 것이다. 가형 바이러스 입자를 야기하는 외피 단백질을 교체하거나 패키지된 바이러스 입자의 표적 세포 특이성을 변형시키는 단백질을 포함하는 각종 외피 단백질은 본 발명의 이의 양태의 수행에서 발현될 수 있다. HIV-1 유도된 바이러스 핵산을 사용하기 위한 바람직한 이종 외피 단백질은 VSV G 단백질, 모콜라 바이러스 G 단백질 및 HIV-2 외피 단백질을 포함한다.
대안으로, 당해 세포는 하나 이상의 바이러스 외피 단백질 및 패키지될 바이러스 핵산 유래의 패키지 성분의 발현에 필수적인 하나 이상의 단백질을 제공한다. 비-제한적 예로는 외피 단백질 뿐만 아니라 동족 tat 단백질 둘다를 제공하는 세포, 또는 레트로바이러스 핵산을 패키지하는 데 트랜스로 요구되는 하나 이상의 기타 단백질(예, HIV-1 유도된 벡터를 패키지하는 VSV G 단백질 및 HIV-1 tat 단백질을 제공하는 세포)을 제공하는 세포이다. 트랜스로 요구되는 부가의 단백질의 예로는 gag, pol 및 rev 서열에 의해 암호화된 단백질을 포함한다.
바람직하게는, 패키지될 목적하는 바이러스 핵산은 핵산 병원성 또는 가능한 병원성을 생성시키는 하나 이상의 바이러스 부속 단백질 서열(예, 비-제한적으로 Vif, Vpu, Vpr 또는 Nef 또는 이의 조합체 또는 이의 단편)을 발현하거나 암호화하는 능력이 결핍되어 있다. 이는 상응하는 암호화 서열을 제거하거나, 이들을 돌연변이시켜 전사 또는 해독 수준으로 이들의 발현을 방지시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 단백질은 본 발명의 작제물을 통하거나 부가의 핵산 작제물에 의해 세포를 패키지함으로써 패키지에 필요한 수준으로 제공된다.
본 발명의 패키지 세포에 의한 하나 이상의 바이러스 단백질의 발현은 하나 이상의 항체를 사용하여 바이러스 단백질(들)을 인지하는 샌드위치 ELISA와 같은 ELISA 방법을 포함하여, 당해 기술분야 공지된 각종 방법에 의해 확인될 수 있다. 기타 비-제한적 방법의 예로는 면역염색법 및 웨스턴 블롯을 포함한다.
이러한 세포에 의해 패키지될 목적하는 바이러스 핵산은 임의로 상기 언급된 패키지 세포에 의한 패키지에 있어서 목적하는 하나 이상의 이종 서열을 함유할 수 있다. 이러한 이종 서열의 예로는 미국 특허 제6,168,953호에 기재된 유전자 항바이러스제를 포함한다. 예로는 리보자임, 안티센스 서열, 및/또는 핵산 데코이를 포함한다.
본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 바이러스 핵산은 미국 특허 제5,885,806호 및 2000년 5월 1일 출원된 공계류중인 미국 특허원 제09/562,894호에 기재된 조건적으로 복제하는 벡터이다. 또다른 바람직한 양태에서, 바이러스 핵산은 조건적 복제 벡터로, gag 및 pol 단백질을 암호화하는 내인성 서열을 또한 포함한다. 따라서, 세포는 바이러스 입자내로 상기 이종 서열(들)을 패키지하기 위한 시스템으로서 고려되고 사용될 수 있다. 이어서, 당해 입자들은 패키지된 서열(들)을 감여된 세포로의 전달 비히클로서 고려되고 사용될 수 있다.
또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 비히클 핵산 및 작제물은 이들 서열 사이에 최소 동일성을 가져서 이들 사이의 재조합 가능성이 감소되고, 복제 가능한 바이러스 핵산을 생성시킬 가능성을 감소시키도록 고안된다. 바람직하게는, 바이러스 핵산과 본 발명의 작제물 사이에는 약 8개 이하의 동일한 핵산 잔기, 보다 바람직하게는 약 6개 이하 및 약 4개 이하의 동일한 잔기를 갖는다. 이러한 동일하지 않은 서열을 도입하는 방법은, 바이러스 핵산 및/또는 작제물로부터 비-발현되거나 비-결정적 서열을 제거하거나, 둘 모두에서 발견되는 서열을 축퇴시켜 연속적으로 동일한 잔기의 빈도를 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명의 작제물의 사용 방법은 이들을 발현시켜 목적하는 하나 이상의 암호화 서열을 위한 세포 발현 시스템을 생성할 수 있는 세포내로의 도입을 포함한다. 이러한 세포 시스템은 다중세포 숙주내로 임의로 도입되거나, 이미 이러한 세포내에 존재하여 생체내 목적하는 암호화 서열을 발현시킬 수 있다. 세포 발현 시스템을 사용하여 순차적 분리 또는 정제를 위해 목적하는 상기 암호화 서열을 발현시키거나, 바이러스 입자의 패키지와 같은 다른 세포 대사 활성에서 사용할 수 있다.
패키지된 바이러스 입자는 패키지 세포 주위의 상등액에서 발견되고, 이로부터 임의로 분리될 수 있다. 바람직하게는, 입자는 목적하는 패키지된 바이러스 핵산을 표적 세포내에 도입하는 보다 큰 역가 및 형질도입 효율을 가질 것이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 본 발명은 기재된 작제물 및 당해 기술분야 공지된 시스템의 제조를 위한 방법을 제공한다. 핵산 스플라이싱 및 세포 형질전환 기술을 포함하여, 각종 핵산 작제물의 재조합 방법은 당해 기술분야에 익히 공지되어 있고, 불필요한 실험없이 사용될 수 있다. 바이러스 벡터의 패키지를 위한 세포에 있어서, 본 발명은 세포 성장에 도움이 되는 조건하에서 상기 바이러스 세포의 도입후 이러한 세포를 배양하는 방법 및 당해 기술분야 공지된 방법에 의해 벡터를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 이의 작제물 및 시스템은 목적하는 하나 이상의 서열의 발현에서 사용하기 위한 키트 형태로 제조될 수 있다. 이러한 키트는, 예를 들어 적합한 세포주, 완충액, 염, 동결건조 안정화제 또는 안정화 보조제를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌, 본 발명을 수행하는 데 필수적인 기타 성분을 임의로 포함한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 작제물을 포함하고, 또한 본 발명의 수행을 용이하게 하는 기타 물질, 비-제한적 예로 본 발명의 사용 장치 및/또는 이들을 포함하는 작제물, 시스템 또는 세포의 사용 장치를 포함할 수 있다. 키트를 포함하는 이들 품목은 당해 숙련가에 의해 바람직한 개별 패키지 및/또는 함께 패키지된 형태로 공급될 수 있다.
하나의 양태에서, 키트는 적합한 용기에 하나 이상의 발현 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서 본원에 기재된 적용에 적합한 키트, 품목을 식별하는, 하나 이상의 지시사항, 비-제한적 예로 패키지 또는 표지를 함유하고/거나, 본 발명에 있어서 본원에 기재된 적용에서 키트 또는 품목의 사용과 관련한 하나 이상의 사용설명서를 함유한다. 임의로, 하나 이상의 사용설명서는 본 발명에 있어서 본원에 기재된 적용에서 키트 또는 품목의 사용과 관련하거나, 본 발명의 수행에서 키트 또는 화합물의 사용과 관련한 사용설명서의 보다 큰 셋트의 일부일 수 있다. 보다 바람직하게는, 목적하는 서열을 발현시키는 데 사용하기에 적합하게 지시된 키트 및 패키지 방법, 표지 방법 또는 지시사항이다.
본 발명의 화합물 및 방법은 하기 실시예에서 추가로 기재된다. 이들 실시예는 본 발명을 추가로 예시하며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
테트라사이클린 유전자 조절 시스템에 의한 조절
도 1은 본 발명의 예시적으로 조절된 발현 시스템의 도면을 나타내는 것으로, 여기서 목적하는 2개의 암호화 서열인 레트로바이러스 gag/pol 서열 및 VSV-G 외피 단백질은 2개의 다른 핵산 작제물로부터의 발현에 의해 동시에 조절된다. 따라서, 당해 시스템은 제1 및 제2 작제물이 2개의 시스템 사이에서 공통으로 사용되는, 각각 3개의 핵산 작제물에 대한 2개의 시스템의 조합으로서 고려될 수 있다.
본 발명의 바람직한 발현 시스템에서, tTA는 TRE 프로모터(tet 오페론)로부터 발현되어 높은 유도성 발현 수준 및 유도 부재시 낮은 기본 발현 수준 모두를 가능하게 한다. 이는 TRE 프로모터가 상당히 빈약하고 프로모터로부터의 임의의 tTA의 발현이 시스템과 접촉시 테트라사이클린의 존재로 인해 완전하게 불활성화되기 때문이다. 테트라사이클린 제거시, tTA 발현은, 제2 핵산 작제물의 발현을 유도하는 tTA를 높은 수준으로 생성시키는 포지티브 피드백 기작에 의해 강하게 유도된다.
2개의 제1 작제물인 pTRE-tTASvPuroTKTat 및 pTRE-Rev(도 1)의 구조 도면은 도 2에 제시되어 있다. pTRE-tTASvPuroTKTat에서, tTA는 TRE 프로모터로부터 발현되고, Tat는 HSV TK 프로모터로부터 발현되며, 선택 마커 퓨로마이신 내성 유전자는 SV40 초기 프로모터로부터 발현된다. 2개의 모든 작제물을 세포내로 통합시키는 경우, 세포내 Rev 발현은 상기 기재된 바와 같이 테트라사이클린의 제어하에 있다.
실시예 2
HT1080-계 패키지 세포주의 작제
HT1080 세포들을 10:1의 몰비의 pTRE.Rev 및 pTRE.tTASvPuroTKTat 플라스미드 DNA로 동시-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를, 퓨로마이신 내성을 선택하는 배지에서 배양하였다. 단일 세포 콜로니 형성 2 내지 3주후, 항-Rev 항체를 사용하여 면역염색함으로써 선택하고 증식시켜 스크리닝하였다.
테트라사이클린에 의한 Rev 발현 조절: 포지티브 클론중 하나로부터의 세포인 2A3(1)-2-F7를 테트라사이클린의 존재 또는 부재하에 4-웰 챔버 슬라이드에서 48시간 동안 성장시켰다. 이어서, 세포를 고정시키고 항-Rev 항체 또는 항-Tat 항체를 사용하여 염색하였다. 도 3은 TRE 프로모터로부터 발현된 Rev가 테트라사이클린에 의해 엄격하게 조절됨을 나타낸다. 테트라사이클린의 존재하에는 어떠한 포지티브 세포도 없었지만, 테트라사이클린의 부재하에는 거의 모든 단일 세포가 항-Rev 항체를 사용하여 포지티브로 염색되었다. Tat 유전자는 HSV TK 프로모터로부터 항상성으로 발현되기 때문에, 거의 모든 세포는 테트라사이클린의 존재 및 부재하 모두에서 항-Tat 항체에 의해 포지티브로 염색되었다. 이들 결과는 Rev 발현이 테트라사이클린 및 TRE 프로모터로부터 발현되는 tTA에 의해 엄격하게 조절된다는 것을 나타낸다.
실시예 3
GagPol 통합
2개의 HT1080-TR 클론(상기 기재된 pTRE.Rev 및 pTRE.tTASvPuroTKTat로 안정하게 형질감염됨)을 1:10의 비의 p(SCMV.Neo)와 p(U3-1TAR2.GagPolRRE)로 동시-형질감염시키고, GagPol 통합을 위해 형질감염 개시 48시간 후 네오마이신으로 선택하였다. p(SCMV.Neo)는 원숭이 CMV 프로모터의 제어하에 선택성 네오마이신 내성 유전자를 갖는다. p(U3-1TAR2.GagPolRRE)는 HIV-2로부터의 TAR2 서열을 함유하는 HIV-1로부터 변형된 U3 프로모터의 제어하에 GagPol 암호화 서열을 함유하는 RRE를 갖는다.
내성 클론을 p24 분석에 의해 스크리닝하고, 상이한 p24 값을 갖는 총 40개의 포지티브 클론을 선택하여 HT1080-TRGP 또는 패키지 세포주로 명명하였다. 가장 큰 클론은 5000ng/ml 이상의 p24를 생성할 수 있었고, 1000배 이상 유도하였다(표 1 참조). 대부분의 클론은 테트라사이클린의 존재하에 100 내지 200배 유도하였고, 낮은 수준의 p24(3 내지 9ng/ml)를 제공하였다(표 1). 이는 Gagpol 발현이 Rev를 통해 테트라사이클린에 의해 조절됨을 나타낸다. 1072 및 1854ng/ml의 p24값을 갖는 11-6 및 12-5의 2개의 포지티브 클론을 VSV G 통합을 위해 선택하였다.
Figure 112007077548675-pct00001
실시예 4
VSV-G 통합
2개의 HT1080-TRGP 클론(상기 11-6 및 12-5)을 20㎍의 p(SCMV.VSVGRRE,TK.Hyg)로 형질감염시키고, 형질감염 개시 48시간 후 하이그로마이신으로 선택하였다. 내성 클론을 동일계에서 항-VSVG 면역염색시킴으로써 스크리닝하고, 강하게 항-VSVG 염색되고, 50 내지 90% 순도를 갖는 총 7개의 포지티브 클론을 선택하여 HT1080-TRGPG 또는 패키지 세포주라 명명하였다. Tc 및 모 HT1080 세포의 존재하에서는 어떠한 VSVG 염색도 발견되지 않은 반면, Tc의 부재 및 나트륨 부티레이트의 존재하에는 포지티브 클론의 VSVG 염색은 세포질에 위치하였고 또한 세포 표면에 농축되었다. 이 결과는 VSVG 발현이 또한 Rev를 통하여 테트라사이클린에 의해 제어됨을 나타낸다.
실시예 5
바이러스 벡터 패키지
실시예 2에서 선택된 HT1080-TR 클론을 96-웰 플레이트에서 제한된 희석으로 추가로 정제하였다. 5개의 최종 클론을 면역염색을 근거로 하여 선택하고, 동시-형질감염에 의해 벡터 생성에 있어서 추가로 분석하였다. 90% 순도 초과의 HT1080-TR 클론을 1 ×106세포/디쉬의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 분주하고 테트라사이클린(Tc)의 제거 및 2.5mM 나트륨 부티레이트의 부가 24시간 후, 각각 5mg의 pN2CGFP 및 pCGCRSRRE로 형질감염시켰다. pN2CGFP는 5'-LTR로부터 발현된 gag-pol 유전자, gag-pol 유전자 다음 RRE 및 내부 CMV 프로모터로부터 발현된 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 함유하는 HIV-1계 복제 결핍 바이러스 벡터이다. pCGCRSRRE의 일반 구조를 도 2에 나타내고, 여기서 "G"는 VSV-G 단백질을 나타낸다.
형질감염후, HT1080 세포를 형질도입하는 데 사용하기 위해 상등액을 수거하기 전, Tc를 함유하지 않고 나트륨 부티레이트도 함유하지 않는 배지 3ml로 48시간 동안 교체하였다. 형질도입 48시간 후, 형질도입된 세포를 FACS에 의해 GFP 발현을 분석하였다. 벡터 역가를 GFP 발현 세포의 %로 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내고, 여기서, 클론 2A(1)-2-E5 및 2A3(2)는 5개의 최종 클론중에서 상대적으로 높은 역가를 생산하였다.
Figure 112007077548675-pct00002
모든 샘플을 2회 수행하였다. HT1080 대조군을 4개의 모든 플라스미드로 동시-형질감염시켜 세포에서 일시 형질감염된 플라스미드를 수득하였다. 4개의 HT1080-TR 클론의 종말점 역가는 하기 순서이다: 2A3(2)〉2A2(1)-2-E5〉7A2(2)〉2A3(1)2-F7. 상기 표에서 증명된 바와 같이, HT1080-TR 클론을 사용한 벡터 생성은 HT1080 대조군의 사용과 같은 일시 형질감염 시스템보다 컸다. 클론 2A2(1)-2-E5 및 2A3(2)는 어떠한 테트라사이클린도 함유하지 않는 배지에서 10배 유도되었다.
실시예 6
안정하게 형질감염된 패키지 세포를 사용한 바이러스 벡터 생성
실시예 4로부터의 패키지 세포의 포지티브 클론을 moi 70에서 pN1(cpt)GFP 벡터 형질도입에 의한 종말점 역가에 있어서 스크리닝하였다. 세포를 테트라사이클린의 존재하에 형질도입하고, 잔존하는 벡터를 세척 배출한 후, 테트라사이클린은 함유하지 않고 7mM의 나트륨 부티레이트를 함유하는 신선 배지에서 형질도입 12시간 후 배양하였다. 상등액을 나트륨 부티레이트 처리 24, 48 및 72시간 후 수거하여 HeLa-Tat 세포에서 역가를 측정하였다. 평균 세포당 10복제수의 벡터를 함유하는 풀(pool)된 혼합 생성 세포는 각각 12웰 플레이트 또는 T75 플라스크에서 48시간 수거시 1.4 ×106TU/ml 또는 4.0 ×106TU/ml를 제공하였다(표 3 참조). TU는 형질전환 단위를 나타낸다.
모든 세포를 유도 3일 후 용해하였다. 테트라사이클린의 존재하에 관찰된 벡터 생성물은 낮은 수준(〈1 ×102TU/ml)이었다(표 3). 벡터 생성은, 생성 세포가 7주 이상 계대되는 동안 동일한 수준을 유지하였다(표 3). 이는 벡터 생성/벡터 패키지가 테트라사이클린에 의해 제어됨을 나타내고, 이는 먼저 tTA 발현을 제어하고, tTA가 차례로 Rev 발현을 제어하며, Rev는 차례로(및 RRE 서열을 통하여) 바이러스 벡터 패키지에 필수적인 성분인 GagPol 및 VSV-G 단백질의 발현을 제어한다.
Figure 112007077548675-pct00003
실시예 7
Tat 및 Rev 발현에 의한 목적하는 유전자의 조절
HIV-1 gag-pol 유전자(CMV 프로모터로부터 발현됨) 다음 하류의 HIV-2 RRE(RRE2)가 HIV-1 Rev에 의해 조절될 수 있음은 이미 증명하였다. Chang 등은 표준 TAR(TAR1) 요소가 HIV-2 TAR(TAR2)로 치환된 키메라성 HIV-1 LTR이 HIV-1 Tat에 의해 활성화될 수 있음을 발견하였다[참고문헌: Chang et al., Nucl. Acids Res. 20(20):5465-5472, 1992]. TAR 요소만이 치환되었기 때문에, HIV-1 LTR에서 나머지 R 및 U5는 여전히 키메라성 LTR에 존재한다. 본 발명은 HIV-1 U3과 TAR2만을 함유하는 키메라성 프로모터 U3/TAR2를 포함하고(도 4), 이를 사용하여 작제물 pVP1.2RznoG(도 2 참조)에서 gag-pol을 발현시키는 CMV 프로모터를 치환시켜 pVP1.2RzonG-U31TAR2를 작제한다(도 2 참조). 플라스미드 pVP1.2RznoG 또는 pVP1.2RznoG-U31TAR2를 pN1CGFP 및 pCGCRSRRE를 사용하여 293T 세포내로 동시-형질감염시켰다. 상등액을 형질감염 48시간 후 수거하고, HT1080에 대한 역가를 측정하였다. 2개의 모든 작제물은 동량의 패키지된 벡터(pN1CGFP)를 생성하는 것으로 발견되었다. 역가는 각각 pVP1.2RznoG 및 pVP1.2RznoG-U31TAR2에 있어서 9.0 ×106 및 9.2 ×106TU/ml였다(여기서, TU는 형질전환 단위를 나타낸다). 이 결과는 키메라성 프로모터가 Tat에 의해 트랜스활성화되어 CMV 프로모터의 수준과 필적할 만한 수준으로 발현될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8
Rev 발현에 의한 목적하는 유전자의 조절
Hammarskjold 등은 HIV-1 env 유전자(RRE 요소 함유)의 발현이, 당해 유전자가 인트론에 존재하는 경우, Rev에 의해서만 조절된다는 것을 발견하였다[참고문헌: Hammarskjold et al., J. Vir. 68(2):951-958, 1994]. env 유전자가 비-인트론 cDNA로서 발현되는 경우, env 유전자 발현은 더이상 Rev에 의해서 조절되지 않는다. Chang과 Sharp는 Rev에 의해 조절된 유전자 발현이 스플라이싱 공여체 시그날의 강도에 따라 달라진다는 것을 발견하였다[참고문헌: Chang and Sharp, Cell 59:789-795, 1989]. 스플라이싱 공여체 시그날이 상당히 강하고 RNA가 매우 효과적으로 스플라이싱되는 경우, 유전자 발현은 Rev에 의해 조절될 수 없다.
일련의 VSV-G 발현 작제물을 제조하였고, 여기서, VSV-G cDNA("유전자")를 인트론내로 삽입하였다. VSV-G 암호화 영역("유전자")의 하류는 CRS 요소 및 RRE이다. RRE의 3' 말단은 스플라이싱 수용체 부위를 함유한다(도 5의 "Rev-반응성" 참조). 5개의 상이한 스플라이싱 공여체(SD) 시그날을 VSV-G cDNA 앞에 클로닝하였다(하기 표 4 참조).
Figure 112007077548675-pct00004
따라서, 전체 VSV-G, CRS 및 RRE 영역은 인트론으로서 발현된다(도 5 "Rev-반응성" 참조). 이들 5개의 VSV-G 발현 작제물을 293T 세포에서 시험하여 VSV-G 발현이 Rev에 의해 조절되는지 여부를 관찰하였다. 결과를 도 6에 제시한다. 이들 5개의 작제물을 pCMVRev(rev 발현 작제물) 또는 pCI(Rev 유전자를 함유하지 않는 pCMVRev의 모 작제물로, 네가티브 대조군으로서 사용됨)를 293T 세포내로 동시-형질감염시켰다. 웨스턴 블롯은 VSV-G 발현이 5개의 작제물중 3개에 의해 형질감염된 세포에서 Rev에 의해 조절됨을 나타낸다(도 6).
VSV-G 단백질을 pCMVRev 및 pCGCRSRRE-1M 또는 pCGCRSRRE-H 또는 pCGCRSRRE-1E중 임의의 하나로 동시-형질감염된 세포에서 검출한다. 그러나, VSV-G는 pCI 및 pCGCRSRRE-1M 또는 pCGCRSRRE-H 또는 pCGCRSRRE-1E중 임의의 하나로 동시-형질감염된 세포에서 검출되지 않는다. 데이타는 이들 3개의 작제물로부터의 VSV-G 발현이 Rev에 의해 조절됨을 나타낸다.
다른 2개의 작제물(pCGCRSRRE-G 및 pCGCRSRRE-2E)로 형질감염된 세포에서는 어떠한 VSV-G도 검출되지 않았다. pCGCRSRRE-G에서 베카-글로빈 스플라이싱 공여체 시그날은 콘센서스 스플라이싱 공여체 시그날과 동일하고, pCGCRSRRE-2E에서 HIV-2 env 스플라이싱 공여체 시그날은 콘센서스 서열과는 하나의 뉴클레오타이드가 상이하다(상기 참조). 이들 스플라이싱 공여체 시그날은 상당히 강하여(상당히 효율적으로 스플라이싱함) Rev에 의한 조절을 허용하지 않는다.
VSV-G가 pCMVG로 형질감염된 세포에서 발현되고, 그 발현이 rev 발현과는 무관함을 주지하여야 한다. 이 작제물에서는 어떠한 CRS, RRE, 및 스플라이싱 시그날도 없고, 이는 CMV 프로모터의 제어하에 VSV-G 단백질을 직접적으로 발현시킨다.
상기 사실은 작제물로부터의 VSV-G의 발현이 Rev에 의해 조절될 수 있는 3개의 VSV-G 발현 작제물이 확인됨을 증명한다.
특허, 특허원 및 명세서를 포함하여 본원에 인용된 모든 참조는 상기 구체적으로 인용되거나 인용되지 않으면서, 전문 참조로서 인용된다.
지금까지 본 발명을 완전하게 기재하였고, 광범위한 동일한 매개변수, 농도 및 과도한 실험이 없는 조건내에서 수행될 수 있음을 당해 기술분야 숙련가에 의해 이해될 것이다. 이의 적용은 본 발명의 일반적 이론을 따르는, 임의의 본 발명의 변형, 용도, 또는 적용을 포함하고자 의도된 것이고, 이는 본 발명이 포함하는 기술분야 내에서 공지되거나 통상적인 수행내에 있으며, 상기 제시된 본질적 특징을 적용할 수 있는 본 발명의 기재로부터의 출발을 포함한다.

Claims (34)

  1. (a) 제1 생성물의 발현을 조절하고 테트라사이클린 프로모터 및 오퍼레이터, 레트로바이러스 장말단 반복체(retroviral long terminal repeat(LTR)) 및 스테로이드 프로모터 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제1 유도성 프로모터 및 제1 생성물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 핵산 작제물;
    (b) 제1 생성물에 의해 유도되는 제2 유도성 프로모터 및 바이러스 RNA 결합 단백질을 암호화하는 제2 생성물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 핵산 작제물; 및
    (c) 제2 생성물에 의해 유도되는 제3 유도성 프로모터 및 바이러스 유전자 생성물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3 핵산 작제물
    을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 패키지하기 위한 패키지 세포.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 제1 생성물이 테트라사이클린 프로모터 및 오퍼레이터의 트랜스활성화인자(tTA)이거나 상기 트랜스활성화인자를 포함하는 융합 단백질인 세포.
  4. 제1항에 있어서, 제2 유도성 프로모터가 테트라사이클린 프로모터 및 오퍼레이터인 세포.
  5. 제1항에 있어서, 바이러스 RNA 결합 단백질이 rev 단백질인 세포.
  6. 제1항에 있어서, 제3 유도성 프로모터가 레트로바이러스 5'LTR로부터 유도된 세포.
  7. (a) 제1 생성물의 발현을 조절하는 제1 tet 반응성 요소(TRE) 유도성 프로모터 및 제2 및 제3 생성물의 발현을 조절하는 제2 TRE-유도성 프로모터를 포함하는 제1 핵산 작제물;
    (b) 제4 생성물의 발현을 조절하는 키메라 레트로바이러스 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산 작제물; 및
    (c) rev 반응성 요소(RRE)-조절된 바이러스 외피 유전자 생성물의 발현을 조절하는 항상성 활성 프로모터를 포함하는 제3 핵산 작제물을 포함하는 세포로서,
    이때, 제1 생성물이 제1 및 제2 TRE 유도성 프로모터를 유도하고;
    제2 생성물이 RRE-조절된 바이러스 외피 유전자 생성물의 핵으로부터의 수송을 조절하는 RNA 결합 단백질을 포함하고;
    제3 생성물이 키메라 레트로바이러스 유도성 프로모터를 유도하는, 렌티바이러스 벡터를 패키지하기 위한 패키지 세포.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 제1 생성물이 tat 단백질이거나 tat 단백질을 포함하는 키메라성 단백질인 세포.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 핵산 작제물로 안정하게 형질감염된 세포.
  12. 제1항에 있어서, 조건적으로 복제하는 바이러스 벡터를 추가로 포함하고, 상기 벡터를 패키지하는 세포.
  13. 제12항에 있어서, 벡터가 HIV-1로부터 유도된 세포.
  14. 제13항에 있어서, 바이러스 유전자 생성물이 VSV 또는 모콜라(Mokola) 바이러스 G 단백질인 패키지 세포.
  15. 제1 핵산 작제물이 제1 생성물을 발현시키는 조건하에서 제13항에 따르는 세포를 배양하는 것을 포함하는, 바이러스 벡터를 패키지하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 바이러스 유전자 생성물이 바이러스 외피 단백질 또는 G 단백질인 세포.
  17. 제16항에 있어서, 레트로바이러스 gag 및 pol 단백질을 암호화하는 부가의 핵산 작제물을 추가로 포함하는 세포.
  18. 제16항에 있어서, 바이러스 RNA 결합 단백질이 rev 단백질인 세포.
  19. 제16항에 있어서, 바이러스 유전자 생성물이 G 단백질인 세포.
  20. 제16항에 있어서, 조건적으로 복제하는 바이러스 벡터를 추가로 포함하고, 상기 벡터를 패키지하는 세포.
  21. 제1 핵산 작제물이 제1 생성물을 발현시키는 조건하에서 제20항에 따르는 세포를 배양하는 것을 포함하는, 바이러스 벡터를 패키지하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 벡터가 HIV-1로부터 유도된 세포.
  23. 제1항에 있어서, 제2 생성물이 rev를 암호화하고 제3 작제물이 rev 반응성 요소(RRE)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 세포.
  24. (a) 제1 생성물의 발현을 조절하는 제1 tet 반응성 요소(TRE) 유도성 프로모터 및 제2 및 제3 생성물의 발현을 조절하는 제2 TRE-유도성 프로모터를 포함하는 제1 핵산 작제물;
    (b) 제4 생성물의 발현을 조절하는 키메라 레트로바이러스 유도성 프로모터를 포함하는 제2 핵산 작제물;
    (c) rev 반응성 요소(RRE)-조절된 바이러스 외피 유전자 생성물의 발현을 조절하는 항상성 활성 프로모터를 포함하는 제3 핵산 작제물; 및
    (d) 하나 이상의 이종성 서열을 함유하는 조건적으로 복제하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 제4 핵산 작제물을 포함하는 세포로서,
    이때, 제1 생성물이 제1 및 제2 TRE 유도성 프로모터를 유도하고;
    제2 생성물이 RRE-조절된 바이러스 외피 유전자 생성물의 핵으로부터의 수송을 조절하는 RNA 결합 단백질을 포함하고;
    제3 생성물이 키메라 레트로바이러스 유도성 프로모터를 유도하는, 렌티바이러스 입자를 생산하기 위한 생산자 세포.
  25. 제7항 또는 제24항에 있어서,
    (a) 제1 생성물이 테트라사이클린 조절된 프로모터 및 오퍼레이터의 트랜스활성화인자(tTA) 또는 상기 트랜스활성화인자를 포함하는 융합 단백질을 포함하거나;
    (b) 제2 생성물이 rev 단백질을 포함하거나;
    (c) 제3 생성물이 tat 단백질, 또는 tat 단백질을 포함하는 키메라 단백질을 포함하거나;
    (d) 키메라 레트로바이러스 유도성 프로모터가 U3 및 TAR2 유도성 프로모터를 포함하거나;
    (e) 제4 생성물이 gag 및 pol 단백질을 포함하거나;
    (f) 항상성 활성 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함하거나;
    (g) RRE 조절된 바이러스 외피 유전자 생성물이 레트로바이러스 외피 단백질 또는 G 단백질을 포함하거나;
    (h) 세포가 포유동물 세포인 세포.
  26. 제25항에 있어서, 키메라 레트로바이러스 유도성 프로모터가 HIV-1 기원 U3 영역 및 HIV-2 기원 TAR2 영역을 포함하는 U3 및 TAR2 유도성 프로모터를 포함하는 세포.
  27. 제25항에 있어서, RRE-조절된 바이러스 외피 유전자 생성물이 사람 면역결핍 바이러스 1(HIV-1) 외피 단백질, 사람 면역결핍 바이러스 2(HIV-2) 외피 단백질 및 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스(MMLV) 외피 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 레트로바이러스 외피 단백질을 포함하는 세포.
  28. 제25항에 있어서, RRE-조절된 바이러스 외피 유전자 생성물이 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV-G), 모콜라 바이러스 G 단백질 및 광견병 바이러스 G 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 G 단백질을 포함하는 세포.
  29. 제7항 또는 제24항에 있어서, 세포가 제1, 제2 및 제3 핵산 작제물로 안정하게 형질감염된 포유동물 세포인 세포.
  30. 제29항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 핵산 작제물이 rev, tat, gag, pol 및 VSV-G 외피 단백질을 발현하는 세포.
  31. 제24항에 있어서, 조건적으로 복제하는 렌티바이러스 벡터가 HIV-1으로부터 유도되거나 하나 이상의 이종성 서열이 항바이러스제 또는 항바이러스 서열을 포함하거나 항바이러스제인 단백질을 암호화하는 세포.
  32. 제31항에 있어서, 항바이러스 서열이 안티센스 서열을 포함하는 세포.
  33. 제7항에 기재된 제1, 제2 및 제3 작제물을 패키지 세포에 도입하거나 혼입시킴을 포함하는, 렌티바이러스 벡터를 패키지하기 위한 패키지 세포를 제조하는 방법.
  34. 제24항에 기재된 제1, 제2, 제3 및 제4 작제물을 생산자 세포에 도입하거나 혼입시킴을 포함하는, 렌티바이러스 입자를 제조하기 위한 생산자 세포를 제조하는 방법.
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