CZ20023970A3

CZ20023970A3 - Kombinované přípravky obsahující mořské a rostlinné extrakty

Info

Publication number: CZ20023970A3
Application number: CZ20023970A
Authority: CZ
Inventors: Bengt Krister Olson
Original assignee: Bengt Krister Olson
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-10
Publication date: 2003-06-18
Also published as: MXPA02011133A; NZ523050A; EE200200635A; AU5823701A; BRPI0110940B1; US7435432B2; ATE320262T1; UA74375C2; NO20025381D0; DK1283713T3; PL204004B1; AU2001258237B8; EP1283713B1; PT1283713E; JP2008273963A; WO2001085182A3; KR20080026663A; AU2001258237B2; RU2002133461A; CN1437475A

Description

Kombinované přípravky obsahující extrakty

Oblast techniky

Vynález se týká přípravků určených pro orální podání, které obsahují chrupavku nebo sloučeniny extrahovatelné z chrupavky společně s hydrofilními a lipofilními antíoxídačními činidly.

Dosavadní stav techniky

V důsledku UV záření, znečištění ovzduší, příjmu alkoholu atd., může v těle, například v pokožce, docházet ke tvorbě volných radikálů. Nadbytek volných radikálů může způsobit závažné poškození tkáňové struktury, včetně struktury pokožky, a v souvislosti s tím se mohou začít objevovat známky stárnutí.

Pro redukci oxidačního stresu způsobeného v pokožce volnými radikály se tedy začaly používat antioxidační činidla, a to v kombinaci obsahující jak hydrofilní, tak lipofilní antioxidační činidla (Maffei Facino a kol. „Free Radical Scavenging and Anti-enyzme Activities of Procyanidines from Vitis vinifera Arzneim.-Forsch./Drug Res., 44(1), č. 5 (1994), str. 592 až 601).

US 5 648 277 Popisuje orální přípravky obsahující hydrofilní i lipofilní antioxidační činidla.

01-3367-02-Če • ···· ·· ···· ·· ···· • · ··· ··· · • · ··· · · · • · ··· · · · · · • · ···· · · · · • · · · ·· ·· ·· · ·

JP 09 241637 Popisuje přípravky obsahující účinný zachycovač volných radikálů a uronové kyseliny nebo mukopolysacharidy.

Rovněž se zjistilo, že podávání proteinových komplexů obsahujících mukopolysacharidy odvozené z mořských zdrojů chrupavky má schopnost zlepšovat strukturu dermu pokožky tím, že zvyšuje jeho hustotu a pevnost (Kieffer ME, Efsen J., J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol., září 1998; 11(2): str. 129 až 136).

Podstata vynálezu

Nyní se zjistilo, že unikátní kombinace chrupavkového extraktu se speciální směsí rostlinných extraktů vede k vytvoření překvapivě účinného přípravku pro zvýšení syntézy kolagenu v pokožce a pro snížení vysoké úrovně oxidace mediované radikály uvnitř dermu. Snížení syntézy kolagenu a radikálová oxidace jsou spojovány s procesem stárnutí pokožky.

Vynález se tedy týká přípravku určeného pro orální podání, který obsahuje rostlinný extrakt a chrupavkový extrakt, přičemž rostlinný extrakt obsahuje extrakt ze semínek hroznového vína a extrakt z rajčat.

Vynález lze alternativně definovat jako přípravek určený pro orální podání, který obsahuje rostlinný extrakt a chrupavkový extrakt, přičemž rostlinný extrakt obsahuje extrakt ze semínek hroznového vína lykopen v poměru hmotn./hmotn. přibližně 5:1 až 15:1, výhodně přibližně 10:1.

···· ·· ···· ·· ····

01-3367-02-Če

Vynález se dále týká přípravku určeného pro orální podání, který obsahuje i) chrupavku, jednu nebo několik sloučenin extrahovatelných z chrupavky nebo její deriváty;

ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel; a iii) jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel; a který zvyšuje syntézu kolagenu v buněčném modelu alespoň o 35 %.

Zde definovaný přípravek pro obecné uchování zdraví pokožky, zpomalení nástupu degenerace pokožky v důsledku stárnutí nebo UV expozice a pro léčbu známek stárnutí pokožky je dalším aspektem vynálezu.

Výraz „hydrofilní, jak je použit v kontextu vynálezu v souvislostí s antioxidačním činidlem, obecně znamená, že antioxidační činidlo je dostatečně rozpustné a tedy schopné plnit svou funkci ve vodném prostředí uvnitř těla. Antioxidační činidlo se v tomto kontextu považuje za hydrofilní, pokud má vyšší rozpustnost ve vodě než 0,05 g na 100 g vody. Hydrofilní antioxidační činidlo má výhodně rozpustnost ve vodě vyšší než 0,5 g, výhodněji než 1 g, ještě výhodněji než 5 g, zejména než 100 g a nejvýhodněji než 25 g a zejména než 50 g až 100 g na 100 g vody.

Podobně výraz „lipofilní, jak je použit v kontextu vynálezu v souvislosti s antioxidačním činidlem, obecně znamená, že antioxidační činidlo je dostatečně rozpustné a tedy schopné plnit svou funkci tuků v těle. To rovněž znamená, že má velmi nízkou rozpustnost ve vodě. V tomto kontextu je antioxidační činidlo považováno za lipofilní, pokud má rozpustnost ve vodě nižší než 0,05 g na 100 g vody. Lipofilní antioxidační činidlo má výhodně nižší

01-3367-02-Če • · · · » · · · ·· ·· rozpustnost ve vodě než 0,005 g, a zejména nižší než 0,0005 g na 100 g vody.

Výraz „chrupavka zahrnuje chrupavku, složky, které lze z chrupavky extrahovat, a její deriváty zahrnující syntetické formy sloučenin extrahovatelných z chrupavky a synteticky připravené deriváty. Sloučeniny označené jako „chrupavkový extrakt lze rovněž nalézt v dalších tkáních zahrnujících pojivovou tkáň, například pokožku nebo kůži, a lze je z těchto tkání extrahovat. Chrupavku lze zvolit ze skupiny sestávající z chrupavky mořských živočichů, chrupavky ryb, chrupavky měkkýšů a z chrupavky suchozemských savců. Mořské živočichy lze zvolit ze skupiny sestávající z velryby, delfína, tuleně a lachtana; rybu lze zvolit ze skupiny sestávající ze žraloka, lososa, tuňáka, tresky a dalších známých ryb; měkkýšem může být chobotnice a sépie; a suchozemského savce lze zvolit ze skupiny sestávající ze skotu, prasat, kuřat, kachen, krocanů a krůt. Chrupavka nebo její extrakty se výhodně zvolí z hovězí chrupavky, vepřové chrupavky, žraloci chrupavky, chrupavky sépie nebo chobotnice, kuřecí chrupavky, chrupavky lososa a z jejich extraktů.

Chrupavku lze použít jako takovou, zpravidla se používá ve formě sušené, například lyofilizované, a rozemleté chrupavky. Použitelné extrakty výše zmíněných typů chrupavky nebo dalších tkání obsahujících vhodné složky lze zpravidla připravit parciální enzymatickou proteolytickou hydrolýzou vařené tkáně a následným přefiltrováním a sušením hydrolyzátu, například sušením rozprašováním nebo lyofilizací. Výhodou takových extraktů je částečná nebo úplná rozpustnost ve vodném prostředí (připraveno podle US 3 862 003).

• ···· ·» ···· ·· ···· ·· ··· ··· ·

01-3367-02-Če

Chrupavkový extrakt zpravidla obsahuje jednu nebo více sloučenin extrahovatelných z chrupavky a výhodně obsahuje glykosaminoglykany, případně navázané na peptidy. Chrupavkový extrakt výhodně obsahuje chondroitinsulfát, keratansulfát, kyselinu hyaluronovou nebo dermatansulfát nebo jejich směsi. Výraz „chrupavkový extrakt zahrnuje sloučeniny, které lze získat z chrupavky, nicméně tyto sloučeniny mohou být ve skutečnosti získány z jiných zdrojů. Zvláště výhodným zdrojem chrupavkového extraktu je žraločí chrupavka.

Výraz „chrupavkový extrakt může být spojován se sloučeninami extrahovatelnými z chrupavky nebo s jejich deriváty. Jak již bylo uvedeno, chrupavkový extrakt může pocházet i z dalších přírodních zdrojů, ale může být i syntetického původu, tj . připravený syntetickým nebo polosyntetickým způsobem. Výhodně se chrupavkový extrakt extrahuje z přírodního zdroje a nej výhodněji z chrupavky.

Jak již bylo uvedeno, vynález se týká přípravku určeného pro orální podání, který obsahuje rostlinný extrakt a chrupavkový extrakt, přičemž rostlinný extrakt obsahuje extrakt ze semínek hroznového vína a extrakt z rajčat v poměru hmotn./hmotn. přibližně 2:1 až 1:2, výhodně přibližně 1:1. Nyní se zjistilo, že unikátní kombinace chrupavkového extraktu se speciální směsí rostlinného extraktu vede k získání překvapivě účinného přípravku pro zvýšení syntézy kolagenu v pokožce, a stejně tak pro redukci vysoké úrovně UV radiace a oxidačního stresu, zejména pro redukci radikálové oxidace, které souvisí s degradačními procesy uvnitř dermu.

Příznivé účinky kombinace extraktu semínek hroznového vína a extraktu rajčat, ve smyslu antioxidačních činidel,

01-3367-02-Če

byly zcela neočekávaně a výrazně posíleny přidáním chrupavkového extraktu. Tyto výsledky jsou překvapivé zejména proto, že chrupavkový extrakt jako takový nemá žádné antioxidační účinky.

Chrupavkový extrakt a rostlinný extrakt jsou zpravidla přítomny v poměru hmotn./hmotn. přibližně 1:2 až 2:1, výhodně přibližně 1:1.

Chrupavkový extrakt výhodně obsahuje glykosaminoglykany zvolené ze skupiny sestávající z chondroitinesteru, keratanesteru, kyseliny hyaluronové nebo jejího esteru, dermatanesteru, heparinu a heparanesteru. Tyto mohou být navázány na protein nebo peptid nebo mohou existovat jako epimerní nebo polymerní formy chondroitinesteru, keratanesteru, kyseliny hyaluronové nebo jejího esteru, dermatanesteru, heparinu a heparanesteru, výhodně chondroitinsulfátu, keratansulfátu, kyseliny hyaluronové nebo jejího esteru, dermatansulfátu, heparinu a heparansulfátu.

Glykosaminoglykany lze zvolit ze skupiny sestávající z chondroitin-4-sulfátu, chondroitin-6-sulfátu a keratansulfátu, přičemž každý z nich může být., případně navázán na peptid. Přípravek podle vynálezu nejvýhodněji obsahuje chrupavkový extrakt obsahující chondroitinsulfát, případně navázaný na peptid.

Typickým provedením vynálezu je provedení, kde chrupavkový extrakt obsahuje 5 až 100 % hmotn./hmotn. chondroitinsulfátu.

U výhodného provedení obsahuje přípravek podle vynálezu méně než 1 % hmotn./hmotn. kolagenu, výhodně méně než 0,5 % a zvláště výhodně méně než 0,1 % kolagenového proteinu. Při použití tohoto typického způsobu přípravy • ···· ·· ···· ·· ···· oi-3367-o2-če *:

• · ··· ···· · • · · · · · · · · · • · · · ·· · · ·· · · extrakt neobsahuje kolagen ve významnějším množství. Extrakt se výhodně připraví enzymatickou proteolytickou hydrolýzou, která převede kolagenové proteiny na peptidy. Přípravek obsahující tento extrakt mající takto nízkou hladinu kolagenu vykazuje neočekávaně příznivé účinky. Z tohoto důvodu se kolagen ani jeho zdroj do přípravku podle vynálezu výhodně nepřidávají. U nejvýhodnějšího provedení je přípravek v podstatě prostý kolagenu.

Stejně tak přípravek podle vynálezu zpravidla obsahuje méně než 0,025 % beta-karotenu, výhodně méně než 0,02 % beta-karotenu, a zejména méně než 0,01 % beta-karotenu. Další aspekt vynálezu se tedy týká přípravku, který může dosáhnout výše popsaných příznivých účinků s velmi nízkou neboli v podstatě žádnou koncentrací beta-karotenu.

Na druhé straně se podle současných znalostí zdá, že obsah lykopenu, relativní nebo absolutní, je zvláště důležitý pro neočekávané příznivé účinky přípravku podle vynálezu. Lykopen je obsažen v rostlinném extraktu, zejména v extraktu z rajčat. Extrakt z rajčat výhodně obsahuje přibližně 5 až 12 %, zpravidla přibližně 10 % hmotn./hmotn lykopenu. Extrakt z rajčat může mít formu extraktu z jediného rajčete nebo ze směsi rajčat.

U typického provedení se pro přípravu extraktu z například zejmena

.um, čímž	se
lykopenu.
obsahuj e	0,1
0,2	až
0,3	až
i 0,3	až
0,3	až

az í

^£ ^£

U výhodného provedení vynálezu přípravek obsahuje 0,1 5 % hmotn./hmotn. lykopenu, výhodně hmotn./hmotn. hmotn./hmotn. hmotn./hmotn.

lykopenu, lykopenu a lykopenu,

01-3367-02-Če

0,8 % hmotn./hmotn. lykopenu, například 0,3 až 0,6 % hmotn./hmotn. lykopenu.

U alternativní definice přípravku podle vynálezu tento přípravek obsahuje rostlinný extrakt a chrupavkový extrakt, přičemž rostlinný extrakt obsahuje extrakt ze semínek hroznového vína a lykopen v poměru hmotn./hmotn. přibližně 5:1 až 15:1, výhodně přibližně 10:1. Jak již bylo uvedeno, lykopen je v uvedeném poměru podle současných znalostí velmi důležitý pro dosažení překvapivého přínosného antioxidačniho účinku.

U vhodného provedení je antioxidační aktivita IC₅₀lipofilního antioxidačniho činidla v případě zachycování R'/ROO' radikálů při peroxidaci lipidů nenasyceného fosfolipidu ve vodném prostředí nižší než 1,2-10^-7. Zpravidla je antioxidačním činidlem, které vykazuje v případě zachycování R’/ROO’ radikálů při peroxidaci lipidů nenasyceného fosfolipidu ve vodném prostředí antioxidační aktivitu IC₅o nižší než l,2-10^-7, karotenoidová sloučenina lykopen (rovněž označovaný jako ψ,ψ-karoten). Lykopen lze zpravidla získat extrakcí z určitých čerstvých plodů, jakými jsou například rajčata, vodní meloun, červený grapefruit nebo kvajava o sobě známým způsobem, nebo mohou být připraveny synteticky, rovněž známým způsobem.

Příznivé účinky orálního přípravku podle vynálezu jsou výsledkem nové kombinace tří složek: chrupavkového extraktu, extraktu ze semínek hroznového vína a extraktu z rajčat. Extrakt ze semínek hroznového vína poskytuje hydrofilní antioxidační činidla. Extrakt z rajčat poskytuje lipofilní antioxidační činidla. Vynález se tedy týká nové kombinace antioxidačních činidel a sloučenin extrahovatelných z chrupavky. Další aspekt vynálezu se tedy týká

01-3367-02-Če

přípravku pro orální podání, který obsahuje i) chrupavku, jednu nebo více sloučenin extrahovatelných z chrupavky nebo jejich derivátů; ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel; a iii) jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel; a který zvyšuje syntézu kolagenu alespoň o 35 %, stanoveno testovací metodou A.

U buněk stárnoucí pokožky se syntéza kolagenu výrazně snižuje. Snížení kolagenu v pokožce vede ke změně struktury a rheologických znaků pokožky a ke vzniku typických znaků stárnutí, jakými jsou vrásky, snížená hladkost pokožky a ztráta elasticity a pevnosti.

Jak ukazuje příklad 2, přípravek podle vynálezu vedl k překvapivě výraznému zvýšení syntézy kolagenu v porovnání s dalšími kombinacemi a kolagenu se hodnotila radioaktivního prolinu jednotlivými složkami. Syntéza na základě měření začlenění ( [¹⁴C]-prolin) do proteinů obsahujících prolin, které jsou většinou považovány za kolagen, kde 30 % celkového množství aminokyselin tvoří prolin.

Dermální fibroblasty pěstované v prostředí, které obsahovalo kombinaci GT extraktu semínek hroznového vína (G) a extraktu rajčat (T) (kterou popisuje US 5 648 277) vedla ke snížení stupně zabudování prolinu oproti kontrolnímu vzorku; konkrétně bylo dosaženo 3,6% zabudování, zatímco u kontrolního vzorku bylo dosaženo 4,8% zabudování, což představuje 25% snížení. Buněčné kultury obsahující kombinaci FT extraktu z ryb (F) a extraktu z rajčat (T) neměly významnější vliv na zabudování prolinu, protože zatímco u testované kombinace FT byl 5,0% stupeň zabudování, tak u kontrolního vzorku bylo dosaženo 4,8% stupně zabudování, takže došlo pouze ke 4% zvýšení. Buněčné

01-3367-02-Če ·· • · · · · · · • · © · ···· · • ···· ···· • ·· · · ·© ©· kultury obsahující kombinaci FG extraktu z ryb (F) a extraktu ze semínek hroznového vína (G) způsobily malé zvýšení stupně zabudování prolinu; konkrétně 5,5% zabudování, což představuje 10% zvýšení oproti kontrolnímu vzorku. Buněčné kultury obsahující pouze extrakt z ryb (F) vedly ke zvýšení stupně zabudování prolinu; konkrétně se dosáhlo 6,2% zabudování, což představuje 29% zvýšení.

U buněk kultivovaných společně s přípravkem podle vynálezu, který obsahoval extrakt z ryb (F) , extrakt ze semínek hroznového vína (G) a extrakt z rajčat (T) , tj . extrakty FGT, však překvapivě došlo ke dramatickému 80% zvýšení zabudování prolinu (bylo zabudováno 8,4 % prolinu). Vzhledem k tomu, že GT extrakt vedl ke 25% snížení syntézy kolagenu a F extrakt vedl k 29% zvýšení syntézy kolagenu, je velmi překvapivé, že po kombinaci extraktu F s extraktem GT došlo až k 80% zvýšení syntézy kolagenu.

Jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel přípravku podle vynálezu může být přírodního nebo syntetického původu, přičemž jako výhodné se jeví přírodní zdroje. U typického provedení se přírodní zdroj zvolí ze skupiny sestávající z kůry borovice, Ví tis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Gingo biloba, Cardus mariianum, Vaccinium myrtillus, Silybum marianum.

U vhodného provedení je jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel extrahovatelné ze semene hroznového vína Vitis vinifera.

Přírodní zdroj jednoho nebo více hydrofilních antioxidačních činidel zpravidla obsahuje až 25 % hmotn./hmotn. katechinu, epikatechinu a kyseliny galové; až 90 % hmotn./hmotn. epikatechinového dimeru, trimeru a/nebo

01-3367-02-Če ···· • * • · • · • « · tetrameru a/nebo jejich galátů; a až 10 % hmotn./hmotn. epikatechinového pentameru, hexameru a/nebo heptameru a/nebo jejich galátů.

Jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel lze zvolit z množiny sestávající z polyfenolů a jejich esterů; kyseliny askorbové (vitamin C) a jejich esterů; a jejich farmaceuticky přijatelných solí. Polyfenoly jsou zpravidla katechiny; leukoanthocyanidiny a flavanony; flavaniny, flavony a anthocyaniny; flavonoly; flavonolignany; a jejich oligomery.

U výhodného provedení je hydrofilním antioxidačním činidlem katechin zvolený ze skupiny sestávající z proanthocyaninu A2 a oligomerního procyanidolu (OPC) , nej výhodněji je tímto činidlem oligomerní procyanidol.

Flavonolignany jsou zpravidla silymarin nebo jedna z jeho složek, jakou je například silybin, silydianin, silychristin a isosilybin.

V přípravku podle vynálezu je hydrofilním antioxidačním činidlem zpravidla činidlo, které vykazuje při zachycování R’/ROO' radikálů při lipidové peroxidaci nenasyceného fosfolipidu ve vodném prostředí antioxidační aktivitu IC₅₀ maximálně 5-10⁷.

Jak již bylo uvedeno, zvláště výhodné hydrofilní antioxidační činidlo představuje extrakt ze semínek hroznového vína, tj . ze semínek Vitis vinifera, přičemž tento extrakt se zpravidla získá extrakcí semínek hroznového vína za použití organických rozpouštědel, jakými jsou například aceton a/nebo ethylacetát apod., odpařením rozpouštědel, opětným rozpuštěním zbytku ve vodě, přefiltrováním a vysušením filtrátu, například sušením «9 9999

01-3367-02-Če • 9 · · · 9 9 · 9 · 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 9 9 • 9 9999 9999

9999 99 99 99 99 rozprašováním nebo lyofilizací. U zvláště výhodného provedení takový extrakt zpravidla obsahuje 25 % hmotn./hmotn. katechinu, epikatechinu a kyseliny galové; až 90 % hmotn./hmotn. epikatechinového dimeru, trimeru a/nebo tetrameru a/nebo jejich galátů; a až 10 % hmotn./hmotn. epikatechinového pentameru, hexameru a/nebo heptameru; a/nebo jejich galátů.

Jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel může být rovněž přírodního nebo syntetického původu, přičemž zpravidla se používají přírodní zdroje. Lipofilním antioxidačním činidlem může být směs antioxidačních činidel, například extraktu z přírodního zdroje obsahujícího komplexní směs lipofilních antioxidačních činidel. Vhodným přírodním zdrojem pro lipofilní antioxidační činidlo jsou variety rajčat, zejména varieta Lycopersicum aesculentum.

Jedním nebo více lipofilními antioxidačními činidly jsou zpravidla karotenoidy, prokarotenoidy, tokoferoly, fytosteroly a ubichinony. Karotenoidy jsou zvláště zajímavými lipofilními antioxidačními činidly a lze je zvolit z množiny sestávající z a-karotenu, β-karotenu, y-karotenu, δ-karotenu, lykopenu (ψ, ψ-karotenu), zeaxanthinu, kryptoxanthinu, luteinu a xanthofylu.

Jak již bylo uvedeno, zvláště zajímavým lipofilním antioxidačním činidlem je karotenoid lykopen. Přípravek podle vynálezu tedy nejvýhodněji obsahuje lykopen. Extrakty sloužící jako zdroje lipofilního antioxidačního činidla výhodně obsahují 5 až 12 % hmotn./hmotn. lykopenu, například 7 až 12 % hmotn./hmotn. lykopenu a výhodně přibližně 10 % hmotn./hmotn. lykopenu, což lze zpravidla převést na přípravek podle vynálezu obsahující 0,1 až 5 %

01-3367-02-Če ·« ··«· ·· ·«·· • · · « · · • · · β 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 99 ·· · 9 hmotn./hmotn. lykopenu, výhodně 0,2 až 4 % hmotn./hmotn. lykopenu, například 0,3 až 2 % hmotn./hmotn. lykopenu a nejvýhodněji 0,3 až 1 % hmotn./hmotn. lykopenu, zejména 0,3 až 0,8 % hmotn./hmotn. lykopenu, například 0,3 až 0,6 % hmotn./hmotn. lykopenu.

Přírodní zdroj lipofilních antioxidačních činidel výhodně obsahuje

5 %	až	12 %	lykopenu,
1 %	až	1,5 %	tokoferolů,
0,05 %	až	0,15 %	beta-karotenu
0,5 %	až	0,75 %	fytoenu,
0,5 %	až	0,55 %	fytofluenu,

nejvýhodněji zahrnuje

7 %	až	12 %	lykopenu,
1 %	až	1,5%	tokoferolů,
0,05 %	až	0,15 %	beta-karotenu
0,5%	až	0,75 %	fytoenu,
0,5 %	až	0,55 %	fytofluenu.

Zdroj jednoho nebo více lipofilních antioxidačních činidel výhodně obsahuje méně než 1 % beta-karotenu, například méně než 0,75 %, například méně než 0,5 %, výhodně méně než 0,25 % a nejvýhodněji méně než 0,2 %, zejména méně než 0,15 %. Přípravek podle vynálezu tedy zpravidla obsahuje méně než 0,025 % beta-karotenu, výhodně méně než 0,02 % beta-karotenu a zejména méně než 0,01 % beta-karotenu.

Další aspekt vynálezu se tedy týká přípravku, který může dosáhnout výše popsaných přínosných účinků při velmi

01-3367-02-Če ·«♦« • A Α·

AA AAAA

AA A A A A A · ·

A A · A A AA* • A A A A AAAA A

A A AAAA A···

AAAA AA A A AA AA nízké nebo v podstatě beta-karotenu.

zanedbatelné koncentraci

U typického provedení poskytuje jediný zdroj lipofilního a antioxidačního činidla extrakt z rajčat. Alternativně je lipofilním antioxidačním činidlem extrakt z raj čat.

U typického provedení podle vynálezu přípravek obsahuj e až 40 % hmotn./hmotn. chrupavkového extraktu, například 25 až 35 % hmotn./hmotn., výhodně 27 až 35 % hmotn./hmotn., například 30 až 35 % hmotn./hmotn. chrupavkového extraktu;

až 10 % hmotn./hmotn. extraktu ze semínek hroznového vína, například 2 až 8 % hmotn./hmotn. , výhodně 3 až 7 % hmotn./hmotn. , například 3 až 5 % hmotn./hmotn. extraktu ze semínek hroznového vína; a až 10 % hmotn./hmotn. extraktu z rajčat, například 2 až 8 % hmotn./hmotn. , výhodně 3 až 7 % hmotn./hmotn. , například 3 až 5 % hmotn./hmotn. extraktu z rajčat.

Typický přípravek podle vynálezu obsahuje extrakt z ryb (F), extrakt ze semínek hroznového vína (G) a extrakt z rajčat (T) ve hmotnostním poměru přibližně 5:1:1 až 15:1:1, například přibližně 10:1:1.

Jak již bylo uvedeno, přípravek podle vynálezu je schopen zvyšovat syntézu kolagenu alespoň o 35 %, stanoveno testovací metodou A. Nicméně výhodně vede použití přípravku za podmínek testovací metody A ke zvýšení syntézy kolagenu, které odpovídá alespoň 40 %, například alespoň 45 %, zejména alespoň 50 % nebo alespoň 55 %, výhodně alespoň

9999

9 9

9 9 • · · · >r ··

01-3367-02-Če %, například alespoň ** ··«· » · · • » · * · · · • « · · • 4 ·· % nebo % a nej výhodněji alespoň 75 %.

Další aspekt vynálezu se tedy týká způsobu zvyšování syntézy kolagenu nebo redukce snižování syntézy kolagenu v dermu, který zahrnuje orální podání zde definovaného přípravku.

Zjistilo se, že nejen, že nový přípravek podle vynálezu vede ke zvýšení syntézy kolagenu, ale rovněž to, že uvedený přípravek má další indikátory, které svědčí ve prospěch jeho použitelnosti při léčbě stárnutí pleti vystavené UV záření. U vhodného provedení tedy přípravek podle vynálezu redukuje škodlivé účinky volných radikálů alespoň o 40 %, například alespoň o 45 % nebo 50 %, stanoveno na základě naměřené aktivity MMP-1 porovnané s hodnotou kontrolního vzorku za podmínek testovací metody B. Volné radikály kyslíku a jejich škodlivé účinky jsou zpravidla důsledkem UV expozice, ale mohou být způsobeny i dalšími environmentálními, fyziologickými nebo genetickými faktory.

Za jednu z hlavních příčin fotostárnutí je považována nadprodukce MMP indukovaná UV expozicí (viz Emonard, H. & Grimaud, J.A. Matrix metalloproteinases. A review. Cell Mol. Biol. 36, str. 131 až 153 (1990)). UV Záření aktivuje buňky dermu, což vede k nadprodukci MMP, což jsou enzymy, které rozkládají kolagen a další proteiny, které jsou obsaženy v extracelulární matrici dermu. Po rozkladu dermu následuje oprava, která je nedokonalá. Nedokonalá oprava vede k nedostatku strukturní integrity dermu a opakuje se společně s každou expozicí UV záření, což vede k akumulaci dermálního stresu a v samotném závěru ke vzniku viditelných známek fotostárnutí (viz Fisher, G.J. a kol., Patho···· ···* •r um

01-3367-02-Če * · t · » » · • · · · · · · · » · ♦ · e # · · » 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 »· ·· «r ·« physiology of preraature skin aging induced by ultraviolet light. N. Engl. J. Med. 337, str. 419 až 1428 (1997); Fisher, G.J. & Voorhees, J.J. Molecular mechanisins of photoaging and its prevention by retinoic acid: ultraviolet irradiation induces MAP kinase signál transduction cascades that induce Ap-l-regulated matrix matalloproteinases that degrade human skin in vivo. J. Investig. Dermatol. Symp. Proč. 3, str. 61 až 68 (1998); Fisher, G.J., Ralwar, H.S., Lin, J. & Voorhees, J.J. Molecular mechanisms of photoaging in human skin in vivo and their prevention by allyltrans retinoic acid. Photochem. Photobiol. 69, str. 154 až 157 (1999); Hase T. a kol., Histological increase in inflammatory infiltrate in sun-exposed skin of female subjects: the possible involvement of matrix matallo-

proteinase-1 produced by	inflammatory	infiltrate	on
collagen	degradation. Br. J.	, Dermatol.	142,	str. 267	až	273
(2000)).	Vliv UV světla na	indukci MMP	byl	potvrzen	rovněž
in vitro	ve fibroblastových	kulturách	(viz	Petersen,	M.	. J. ,

Hansen, C. & Craig, S. Ultraviolet A irradiation stimulates collagenase production in cultured human fibroblasts. J. Invest Dermatol. 99, str. 440 až 444 (1992); Scharffetter,

K. a kol., UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblasts in vitro and in vivo. Arch. Dermatol. Res. 283, str. 506 až 511 (1991)). Další studie zaměřující se na mechanismus UV indukce MMP ukazují, že UV indukovaný atom kyslíku (reaktivní kyslíkové druhy) má přímý vliv na buňky vedoucí k produkci MMP (viz Wlaschek, M., Briviba, K. & Stricklin, P. Singlet Oxygen May Mediate Ultraviolet A-Induced Synthesis of Interstitial Collagenase. J. Invest Dermatol. 104, str. 194 až 198 (1995)). Takže antioxidační činidla, a konkrétně ta činidla, která zachycují atom kyslíku, budou působit proti syntéze MMP stimulované UV zářením. Nicméně nelze vyloučit, že se na stimulaci syntézy • · ··· ·

01-3367-02-Če ·· · ·

MMP podílejí rovněž další druhy volných radikálů. Staré buňky v kultuře, a stejně tak buňky pokožky vystavené UV záření, produkují vyšší množství MMP. Redukce MMP-1 aktivity v důsledku použití přípravku podle vynálezu je tedy indikátorem jeho použitelnosti pro udržení zdravé pokožky.

Kromě toho přípravek podle vynálezu snižuje tvorbu finálních produktů pokročilé glykosylace (AGE) alespoň o 10 %, například alespoň o 20 % nebo alespoň o 30 %, 40 %, 50 % nebo 60 %, výhodně alespoň 70 %, zejména alespoň 80 % nebo 90 % a nejvýhodněji alespoň 100 % nebo 110 %, měřeno za podmínek testovací metody C a porovnáno s kontrolním vzorkem.

AGE (finální produkty pokročilé glykace, které jsou rovněž známy jako Amadoriho produkty) Jsou výsledkem glykace (glykoxidace) , což je nespecifická vazebná reakce mezi proteiny a cukry, jednotlivých buněk, tak sestávajících z proteinů

AGE Se akumulují jak uvnitř v mezibuněčné matrici tkání s dlouhou životností, což je například kolagen v pokožce. AGE-Zesíťované proteiny jsou nefunkční proteiny, které mají tendenci usazovat se v mezibuněčné matrici nebo v cytoplasmě buněk a existuje předpoklad, že mají škodlivý vliv na celkovou syntézu proteinů. Nejprve, jakmile glukóza reaguje s proteiny, dojde ke tvorbě produktu raného stádia (Amadoriho produkt). Tento Amadoriho produkt následně podléhá dalšímu přeuspořádání za vzniku hnědých pigmentů pozdního stádia, které mohou zesíťovat proteiny. Po přeuspořádání pokračují pozdní produkty v akumulaci v proteinech s dlouhou životností, například v kolagenu, po dlouhou časovou periodu, během které dochází k vysokému stupni zesíťování proteinů. Ukázalo se, že tvorba AGE in vivo se zvyšuje se • ·

01-3367-02-Če • ·

stupněm stárnutí organismu a buněk, a to jak in vivo, tak in vitro. Existuje předpoklad, že v případě in vivo odráží stupeň akumulace AGE hladinu glukózy v séru. Podstatná úloha při tvorbě pozdních AGE je připisována oxidaci, protože glykace samotná je zvratný proces. Nicméně oxidace je zodpovědná za trvalé chemické poškození a ztrátu funkčnosti proteinů způsobenou trvalým zesíťováním (viz Fu, M.X., Knecht, K.J., Thorpe, S.R. & Bayne, J.W. Role of oxygen in cross-linking and Chemical modification of collagen by glucose. Diabetes 41 dodatek 2, str. 42 až 48 (1992)) . Ukázalo se, že AGE jsou kromě své neúčinnosti a schopnosti snižovat celkovou syntézu proteinu, chromofory, které po vystavení UV světelnému záření generují významné množství účinných kyslíkových radikálů (viz Masaki, H., Okano, Y. & Sakurai, H. Generation of active oxygen species from advanced glycation end- products (AGEs) durring ultraviolet light A (UVA) irradiation and a possible mechanism for cell damaging. Biochim. Biophys. Acta 1428, str. 45 až 569 (1999)). Je tedy zřejmé, že oxidační stres přispívá ke tvorbě AGE.

Po jedné dávce expozice UV záření (5 J/cm²) se hladina AGE v nedoplněných kontrolních buňkách zvýšila přibližně dvacetkrát v porovnání s neozářenými kontrolními buňkami. Za stejných podmínek se hladina AGE v kulturách obohacených extraktem F zvýšila přibližně čtyřicetkrát, což naznačuje, že extrakt F neposkytuje ochranu před tvorbou AGE indikovanou UV zářením. Zvýšení hladin AGE v buňkách ošetřených extraktem F bylo ještě dramatičtější při 7,5 J/cm². Z obr. 3 je zřejmé, že se hladina AGE v buňkách obohacených extraktem FG zvýšila o 72 jednotek, tedy ve stejném rozsahu, v jakém byly hodnoceny neošetřené ozářené

01-3367-02-Če	• · · · · · ♦ • · · · · • · · · • · · · · • · · · • · · · · · 19	·· · · • · • · • · * • · · • ·	•· ···· • · • · • · • · · • · · ·
kontrolní buňky (10%	relativní	snížení oproti	kontrolnímu
vzorku).
Buňky ošetřené	extraktem	FGT	ukázaly	překvapivé
snížení AGE hladiny	přibližně	o 22	j ednotek,	vzhledem k
neozářeným buňkám,	což odpovídá	120% snížení AGE

koncentrace, vztaženo k neošetřeným ozářeným buňkám.

Použití přípravků podle vynálezu tedy vede ke zvýšení zabudování prolinu a k příznivému ovlivnění buněk vystavených UV záření, ve smyslu aktivity MMP-1 a tvorby AGE.

Další aspekt vynálezu se tedy týká přípravku vhodného pro kosmetické ošetření známek stárnutí pleti a pro obecné uchování zdravé pokožky. Známky stárnutí mohou být výsledkem celé řady faktorů, například slunečního světla, věku, stravovacích návyků a dalších vlivů životního prostředí.

Přípravek podle vynálezu zpravidla zahrnuje 1 až 80 % hmotn./hmotn. sloučenin extrahovatelných z chrupavky;

0,1 až 75 % hmotn./hmotn. extraktu ze semínek hroznového vína; a

0,002 až 25 % hmotn./hmotn. lykopenu.

Přípravek podle vynálezu nej výhodněji obsahuje 27 až 35 % hmotn./hmotn., zpravidla 30 až 35 % hmotn./hmotn., chrupavkového extraktu;

až 10 % hmotn./hmotn. , například 3 až 5 % hmotn./hmotn. , extraktu ze semínek hroznového vína; a 0,1 až 5 % hmotn./hmotn., zpravidla 0,2 až 1 % hmotn./hmotn., lykopenu.

• · · · • · · 9

01-3367-02-Če • · • 9 · 9 · • · · · ♦ • 9 9 9 9 9 • 9 9 · · · · · • 9 99 99 99

Byly připraveny vhodné přípravky podle vynálezu, které obsahuj í

100	mg	až	110	mg	extraktu	z	ryby,
95	mg	až	105	mg	extraktů	z	rostlin,
25	mg	až	35	mg	extraktu	z	Acerola,
60	mg	až	90	mg	mikrokrystalické celulózy,

3,5 mg až 4,5 mg oxidu křemičitého, přičemž rostlinné extrakty obsahují oligomerní procyanidol a lykopen a extrakty z ryb obsahují glykosaminoglykan.

Další vhodný přípravek podle vynálezu obsahuje

100 mg až 110 mg extraktu z ryby, mg až 105 mg extraktů z rostlin, mg až 65 mg inulinu, mg až 35 mg kyseliny askorbové, mg až 20 mg glukonátu zinečnatého, mg až 15 mg oxidu křemičitého, přičemž rostlinné extrakty obsahují oligomerní procyanidol a lykopen a extrakty z ryb obsahují glykosaminoglykan.

Přípravek podle vynálezu může tedy dále obsahovat další složky, které představují například další potravinové doplňky, jako jsou vitaminy, minerály, aminokyseliny a cukry. U výhodného provedení přípravek dále obsahuje vitamin C nebo extrakt obsahující vitamin C, například extrakt Acerola.

Jak již bylo uvedeno, relativní a absolutní množství jednotlivých složek jsou podle současného chápání vynálezu velmi důležitá pro dosažení překvapivých přínosných účinků přípravků podle vynálezu. Hydrofilní a lipofilní antioxidační činidla jsou tedy výhodně přítomna v poměru hmotn./hmotn., který se pohybuje v rozmezí přibližně od 1:1 do 200:1, například od 2:1 do 100:1, zejména od 5:1 do • · · ·

01-3367-02-Če

50:1, zejména od 5:1 do 20:1, výhodně od 5:1 do 15:1 a nejvýhodněji přibližně od 7:1 do 12:1, například přibližně 10:1.

Podobně jsou potom chrupavka, jedna nebo více sloučenin extrahovatelných z chrupavky a hydrofilní antioxidační činidla přítomna v poměru hmotn./hmotn., který se pohybuje v rozmezí přibližně od 1:1 do 200:1, například od 2:1 do 100:1, zejména od 5:1 do 50:1, zejména od 5:1 do 20:1, výhodně od 5:1 do 15:1 a nejvýhodněji přibližně od 7:1 do 12:1, například přibližně 10:1.

Důležitý aspekt vynálezu se obecně týká přípravku, ve kterém jsou společně přítomny i) chrupavka, jedna nebo více sloučenin extrahovatelných z chrupavky nebo jejich deriváty; ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel; a iii) jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel v dostatečných množstvích pro potlačení aktivity MMP-1, pro potlačení tvorby AGE nebo pro zvýšení syntézy kolagenu v lidských fibroblastových buňkách pěstovaných in vitro.

Další důležitý aspekt vynálezu se týká přípravku, ve kterém jsou i) chrupavka, jedna nebo více sloučenin extrahovatelných z chrupavky nebo jejich deriváty; ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel; a iii) jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel v poměru vhodném pro potlačení aktivity MMP-1, pro potlačení tvorby AGE nebo pro zvýšení syntézy kolagenu v lidských fibroblastových buňkách pěstovaných in vitro.

U kombinace výhodných provedení může přípravek obsahovat 0,25 mg až 15 mg lykopenu a 2,5 mg až 100 mg extraktu ze semínek hroznového vína, výhodně 0,5 mg až 5 mg • · · · • ·

01-3367-02-Če • « ··· · · · · • · ··· · · · • · · · · · · · · · • · · · · · ···· • · · « ·· ·· ·· ·· lykopenu a 5 mg až 50 mg extraktu ze semínek hroznového vína, zejména 0,75 mg až 2,5 mg lykopenu a 10 mg až 30 mg extraktu ze semínek hroznového vína, a zejména 1 mg až 2,5 mg lykopenu a 10 mg až 25 mg extraktu ze semínek hroznového vína.

U další kombinace provedení může přípravek obsahovat 1 mg až 2,5 mg lykopenu, 5 mg až 50 mg extraktu ze semínek hroznového vína a 50 mg až 200 mg chrupavkového extraktu.

Přípravky podle vynálezu jsou určeny pro orální podání a mohou být podány ve formě pevné dávky, například jako tablety, prášky, granule, kapsle nebo pastilky; nebo ve formě kapalné dávky, například jako roztoky, suspenze, tonik nebo sirupů. Tyto dávkové formy lze připravit způsobem v oblasti farmaceutických technologií známým a mohou obsahovat jeden nebo více v této oblasti běžně používaných excipientů. V případě pevných přípravků lze použít konvenční netoxické pevné excipienty, které zahrnují například farmaceutický mannitol, laktózu, škrob, sójovou vlákninu, stearát hořečnatý, sacharin sodný, mastek, celulózu, například mikrokrystalickou celulózu, glukózu, sacharózu, oxid křemičitý, uhličitan hořečnatý apod. Kapalné dávkové formy lze získat rozpuštěním, dispergací atd. účinných složek a případného farmaceutického adjuvansu v excipientů, jakým je například voda nebo kapalina na bázi vody, například šťávy, olej nebo alkohol, za účelem vytvoření roztoku nebo suspenze. Pokud je to žádoucí, potom může orální přípravek podle vynálezu rovněž obsahovat malá množství aditiv, která jsou v daném oboru známá jako smáčecí činidla nebo emulgační činidla, pufry atd. Tyto dávkové formy lze formulovat podle v daném oboru známých zásad, viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15. vydání, «·«· · · ·«

01-3367-02-Če • ··· · · · · < • ···· · · · I • · ·· ·· · · · ·

1975; nebo Matrindale, The Extra Pharmacopeia, The Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 31. vydání, 1996.

Přípravek může mít takovou formu, že se lipofilní antioxidační činidlo, jakým je například extrakt z rajčat nebo extrakt obsahující lykopen, formulují pro normální uvolňování a hydrofilní antioxidační činidla, jakým je například extrakt ze semínek hroznového vína, se formuluje pro uvolnění s prodlevou nebo pro pozvolné uvolňování.

Jak ukazuje příklad 5, pokud se přípravky užívají orálně, potom mají zjevný viditelný vliv na stav pokožky. Obr. 4 rovněž ukazuje, že dobrovolníci užívající přípravek podle vynálezu zaznamenali zlepšení v celkovém stavu kůže, vláčnosti, kvalitě pokožky okolo očí a okolo úst. Výsledky z příkladů 1 až 4 byly tedy úspěšně transformovány in vivo a zdá se tedy, že přípravek působí po orálním podání systemicky.

Přípravky podle vynálezu lze použít jako orální kosmetický produkt, potravinu nebo potravinový doplněk nebo farmaceutický nebo dietetický produkt.

Další aspekt vynálezu se týká přípravku určeného pro obecné udržení zdravé pokožky, pro zpoždění nástupu degenerace pokožky v důsledku stárnutí nebo UV expozice a pro léčbu příznaků stárnutí pleti. Přípravky podle vynálezu jsou vhodné při léčbě stárnoucí pokožky, pokožky vystavené slunečnímu světlu nebo jiným formám UV záření, suché pokožky, hrubé pokožky, nepřirozeně zabarvené pokožky, pokožky trpící akné, zjizvené pokožky, pokožky se známkami napětí, ekzému a lupénky.

Důležitým aspektem vynálezu je způsob kosmetické nebo profylaktické léčby pokožky před známkami stárnutí pokožky ·· ··· ·

01-3367-02-Če a před poškozením způsobeným expozicí UV záření, který zahrnuje orální podání výše definovaného přípravku podle vynálezu. Dalším aspektem vynálezu je způsob kosmetické nebo profylaktické léčby stárnoucí pokožky, pokožky vystavené slunečnímu světlu nebo jiným formám UV záření, suché pokožky, hrubé pokožky, nepřirozeně zabarvené pokožky, pokožky trpící akné, zjizvené pokožky, pokožky se známkami napětí, ekzému a lupénky, přičemž tento způsob zahrnuje orální podání výše definovaného přípravku podle vynálezu. Použití výše definovaného přípravku pro prevenci nebo pro zpomalení příznaků stárnutí pokožky, pro ochranu před škodlivými vlivy UV záření nebo pro jejich redukci, pro léčbu známek napětí, pro léčbu akné, pro redukci příznaků ekzémů, jako pomoc při léčbě ran, pro redukci jizev, pro redukci příznaků lupénky nebo pro léčbu hrubé, nepřirozeně zabarvené nebo suché pokožky, rovněž spadá do rozsahu vynálezu.

U těchto použití se typická denní dávka pro průměrnou dospělou osobu pohybuje od 55 mg do 3700 mg výše definované směsi chrupavkové složky, hydrofilního antioxidačního činidla a lipofilního antioxidačního činidla, například od 70 mg do 1000 mg. Podání lze realizovat v jedné denní dávce nebo v dělených dávkách podávaných až čtyřikrát denně, například jednou, dvakrát, třikrát nebo čtyřikrát, výhodně jednou nebo dvakrát denně.

Přípravky lze balit podle v daném oboru běžných zásad, například do tabletových zásobníků, blistrů nebo lahviček. V případě, že je jedna složka citlivá na světlo, což je zejména případ, kdy je lipofilním antioxidačním činidlem lykopen, potom by měla být kompozice chráněna před světlem. Například u blistrů lze této ochrany dosáhnout, pokud jsou vyrobeny z dvouvrstvé hliníkové fólie, resp. hliníkem

01-3367-02-Če • ·· ·

9999 • 9 9 9 9

9 9 9 ·

9 9 9 9 9

99 99 potažené plastové fólie, například z vybrání) fólie laminátu tvořeného (například laminát PVC, hliníku polyamidových fólií) a tenké, případně povrchovou úpravou.

tvarované (tvořící plastem a hliníkem a orientovaných hliníkové, fólie s

Vynález bude dále ilustrován pomocí příkladů provedení vynálezu, které mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, jednoznačně vymezený přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Stanovení účinných koncentrací hydrofilních antioxidačních činidel, hydrofobních antioxidačních činidel a chrupavkového extraktu

Na in vitro pěstovaných fibroblastech lidské pokožky se dávkově dependentním způsobem testovaly různé koncentrace extraktu ze semínek hroznového vína (1 až 200 pg/ml), chrupavkového extraktu (0 až 1000 mg/ml) a extraktu z rajčat (0 až 200 pg/ml). Po hodnocení přežívání buněk a rychlosti růstu za všech kultivačních podmínek se zvolila jedna optimální kombinace pro každou složku.

Způsob

Pracovní roztoky chrupavkového extraktu, extraktu ze semínek hroznového vína a rajčatové pasty obsahující lykopen se připravily následujícím způsobem:

• *·· • 4 ··· ·

44· ·

01-3367-02-Če

Chrupavkový roztok (40 mg/ml) ml pufrovaného rozpustilo připravený

200 mg rybí enzymatickou solného roztoku (Hanks) se moučky (chrupavkový extrakt proteolytickou hydrolýzou chrupavky, filtrací a sušením hydrolyzátu rozprašováním) a sterilně přefiltrovalo.

Roztok semínek hroznového vína (40 mg/ml)

V 5 ml pufrovaného solného roztoku (Hanks) se rozpustilo 200 mg extraktu ze semínek hroznového vína (Indena, Milano, Itálie) a sterilně přefiltrovalo.

Rajčatový roztok (zásobní roztok 100 mg/ml)

Ve 4 ml tetrahydrofuranu se rozpustilo 400 mg rajčatové pasty (obsahující 400 mg lykopenu), sterilně přefiltrovalo a až do použití skladovalo při -80 °C.

Rajčatový pracovní roztok (100 Rg/ml)

Bezprostředně před použitím se zásobní roztok naředil v poměru 1:1000 v buněčném médiu DMEM.

Lidské fibroblastové buňky se pěstovaly následujícím způsobem:

Do jamek 24jamkové plotny se umístily buňky v koncentraci 10 000 buněk/jamku. Buňky se nechaly přes noc

AAAA

AA A ·

AA AAAA

01-3367-02-Če

AAAA · AA AA přichytit, načež se použité médium vyměnilo za· médium obsahující různé koncentrace chrupavkového extraktu (F) , extraktu ze semínek hroznového vína (G) a extraktu z rajčat (T) . Buněčné médium DMEM (10% fetální telecí sérum + glutamin, penicilin/streptomycin) se měnilo každý druhý až třetí den, s výjimkou média obsahujícího TE, které se obnovovalo každý den. Buňky se nechaly růst až do konfluence buněk (37 °C, 5% CO₂, 95% vlhkost) a odečítaly každý druhý den za použití 300 μΐ trypsinu/EDTA/buňku pro vyjmutí buněk během lOmin pobytu v inkubátoru při 37 °C, kde se pro odečet buněk/ml použilo množství 200 μΐ.

Hodnocení přežívání buněk a růst buněk se provádělo po 15 dnech. Přežívání buněk se hodnotilo na základě měření MTT absorpce v buňkách. Hladina absorpce odpovídá hladinám mito-chondriální aktivity, kterou lze použít jako známku životnosti buňky. MTT Se redukuje na modře zbarvenou sloučeninu, která se detekuje pomocí UV/VIS absorpce při 595 nm a použití vlnové délky 655 nm jako reference.

Buněčný růst se hodnotil kultivační baňku, který se elektronického čítače Coulter.

jako počet buněk na vypočetl za použití

Výsledky

Buněčné kultury obohacené 70 gg/ml chrupavkového extraktu, 10 pg/ml extraktu ze semínek hroznového vína a .10 μς/ιηΐ rajčatového extraktu (=1,0 μρ/ιηΐ lykopenu) poskytly optimální prostředí pro buněčný růst. Tyto koncentrace neměly žádné toxické účinky ani nezpůsobovaly změnu rychlosti buněčného dělení. Tyto výsledky dále ·« ·

4··· • 4 · ·· ·

01-3367-02-Če

44« 4··· *

44 · · · · · • 4 ·· · · ·· potvrdila dlouhodobá kultivace fibroblastů v kultivačním médiu obohaceném zvolenou kombinací (viz výše) po dobu 50 dnů. Zdvojené hladiny monitorované kumulativní populace (CPDL), které odpovídají počtu buněčných dělení a buněčnému růstu, nejsou testovanými složkami ovlivněny. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1 a znázorněny na obr. 1.

Tabulka 1

Den	0	F	FGT	GT
0	18	18	18	18
3	19, 17	19,34	18,87	18,8
9	21,4	21,52	21,28	21,32
14	23, 08	22,93	23,05	23,02
21	25, 65	25, 87	25,59	25,67
28	27,53	27,57	27,73	27,78
35	28,88	28,88	29,2	29,15
42	31,45	31,54	31,4	32,03
50	32,98	33, 14	33,42	33,39

Příklad 2

Vliv přípravku na syntézu kolagenu

Pro test vlivu F, G a T na syntézu kolagenu byl vytvořen in vitro testovací systém. Syntéza kolagenu se hodnotila jako míra zabudování radioaktivního prolinu ( [¹⁴C]-prolin) do proteinů obsahujících prolin, které jsou většinou považovány za kolagen a ve kterých počet prolinových zbytků tvoří více než 30 % celkového počtu aminokyselin. Do buněčného média se přidaly různé kombinace F, G a T v optimálních koncentracích, které se stanovily způsobem popsaným v příkladu 1, a radioaktivita vyloučených a označených proteinů se měřila po 24 hodinách.

01-3367-02-Če

ΦΦΦΦ φφ φφφφ φφ φφφφ φ φ φ φφφφ φ • ΦΦΦ φφφφ φφ φφ φφ φφ

Způsob

Způsobem popsaným v příkladu 1 se připravily extrakty F, G a T.

Zabudování radiologicky značeného prolinu do lidské fibroblastové buněčné kultury se provádělo následujícím způsobem (testovací metoda A) : den po naočkování buněk se přidaly různé kombinace F, G a T a buňky se nechaly růst až do dosažení konfluence (přibližně 1 týden). Kultivační médium se měnilo denně. Při konfluenci se stávající médium vyměnilo za kombinaci 0,5 ml radioaktivních roztoků (25 μθί) + 2,5 ml média bez F, G nebo T. Po dobu následujících 24 h se buňky ponechaly v inkubátoru, načež se médium jímalo a podrobilo následujícímu měření radioaktivity: 5 μΐ média se smísilo s 20 μΐ BSA (0,5 g/1) a 1 μΐ TCA (10%) a ponechalo 30 min při teplotě -20 °C. Vzorky se nechaly roztát a přefiltrovaly přes nitrocelulózový filtr, ve snaze oddělit volný radioaktivní prolin od označených proteinů. Filtr se přemístil do zkumavky, do které se přidalo 2,5 ml scintilační kapaliny. Zkumavka se ponechala 1 h ve tmě, načež se na scintilačním čítači změřila radioaktivita 5 μΐ vzorku.

Výsledky

Souhrn získaných výsledků ukazuje tabulka 2 a obr. 2A a 2B. U buněčných kultur obsahujících extrakt GT došlo v porovnání s kontrolní kulturou ke snížení stupně zabudování prolinu, tj . došlo k 3,6% zabudování, zatímco u kontrolní kultury došlo ke 4,8% zabudování, což představuje 25% pokles. Buněčné kultury obsahující extrakt FT neměly žádný

01-3367-02-Če »· ♦ ··» • ♦ · * • ♦ · · « · · · · • · · · · · ·· »· ·· významnější vliv na zabudování prolinu, protože stupeň zabudování byl 5,0 %, zatímco u kontrolního vzorku byl 4,8 %, což představuje pouze 4% zvýšení. Buněčné kultury obsahující extrakt FG vedly k malému zvýšení stupně zabudování prolinu, tj . při 5,5% zabudování došlo k 10% zvýšení oproti kontrolnímu vzorku.

U buněčných kultur obsahujících extrakt F došlo ke 29% zvýšení stupně zabudování prolinu, tj . k 6,2% zabudování. Nicméně extrakty FGT překvapivě vedly ke dramatickému 80% zvýšení zabudování prolinu, tj. 8,4% zabudování prolinu.

U tohoto typu experimentů je za významný považován rozdíl vyšší než 30 %.

Tabulka 2

Ošetření	Aktivita v dpm	Aktivita v pCi výstup	% Zabudované ho prolinu	Relativní výsledek vzhledem ke kontrole
GT	4516	0,0015	3, 6	20% snížení
Kontrolní	5787	0,0020	4,8	-
FT	4516	0,0021	5,0	Žádná změna
FG	5137	0,0023	5,5	10% nárůst
F	5787	0,0026	6,2	30% nárůst
FGT	7738	0,0035	8,4	80% nárůst

Příklad 3

Vliv přípravku na lidské fibroblasty po UV expozici

UVA Expozice je zodpovědná za celou řadu degenerativních změn v pokožce, které vedou k viditelným známkám stárnutí (fotostárnutí). Potenciální ochranný vliv *·*·

9999

01-3367-02-Če t 9 ·

I · » · · ·· ··

I • * 3 • * ·· extraktů F, G a T a jejich kombinací proti poškození indukovanému UV zářením se testoval tak, že se monitorovaly biochemické markéry spojené s fotostárnutím (hladina MMP-1 a AGE) v kultuře fibroblastů pokožky po UV záření.

Buněčné kultury lidského fibroblastů se vystavily jedné dávce UVA záření každý den po 4 po sobě jdoucí dny. Použily se dvě různé dávky (5 J/cm² a 7,5 J/cm²) a dávka odpovídající maximální dávce tolerované buňkami předtím, než došlo k buněčné smrti.

Buněčná kultura se obohatila různými kombinacemi F, G a T (F, FG, FT, GT a FGT) za použití optimálních koncentrací F, G a T (jak je určeno a popsáno v příkladu 1) a aktivita MMP-1 a tvorba AGE se měřily po 1 dnu a po 4 dnech.

Způsoby

Extrakty se připravily způsobem popsaným v příkladu 1.

Kultivace buněk se prováděla následujícím způsobem: Buňky s danou pasáží se zavedly do média obsahujícího kombinace léčby F, G a T. Při konfluenci se rozdělily na čtyři díly, čímž se pro každé ošetření získaly 4 baňky. Při konfluenci se jedna (dělení 1:4) nebo dvě (dělení 1:2) sériově zavedly do čtyř nových baněk.

UVA Ozařování buněčné kultury se provádělo následujícím způsobem: UVA Dávka se generovala za použití šesti trubic Philips 40W UVA Cleo Performance. Pro měření dávky v W/m² a pro výpočet potřebné doby expozice pro dosažení dávky 5, 7,5, 10 a 15 J/cm² se použil UVA měřící přístroj Hagner. Předběžné experimenty ukázaly, že

01-3367-02-Če • · 9 9 ·

9 9 9

• 9 9 9 9 9 9 9 9 9999 99 32	9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 « M · 9 9 9
nezpůsobuj e	buněčnou smrt,
optimální dávkou záření, je 7,5 J/cm² .	která
Stanovení aktivity	MMP-1	(endogenní	aktivita plus
latentní hladiny) se	provádělo za použití komerčně

dostupného testovacího systému od společnosti APBiotech, kód RPN 2629 (testovací metoda B).

Stanovení AGE bylo založeno na technice ELISA (testovací metoda C):

Den 1: Mikroplotny se přes noc potahovaly při +4 °C 50 ng AGE/jamku naředěnými v uhličitanovém pufru.

Den 2: Jamky se čtyřikrát propláchly PBST (PBS a 0,05% Tween 20) a následně 2 h blokovaly při pokojové teplotě ve 200 μΐ/jamky PBS-mléko (6%) . Jamky se následně čtyřikrát propláchly PBST, načež se do jamek nejprve přidalo 50 μΐ AGE standardu (20 až 20 000 jednotek/jamku) nebo 50 μΐ vzorku (50 pg proteinu/ml) a potom následovalo přidání 50 μΐ AGE polyklonální protilátky (ředění 1/1000). Plotna se nechala 2 h intenzívně protřepávat za pokojové teploty. Jamky se čtyřikrát propláchly PBST, načež se přidala druhá protilátka (Polyclonal Rabbit, HRP, ředění 1/1000) v koncentraci 50 μΐ/jamku a plotna se nechala 2 h protřepávat za pokojové teploty. Na závěr se jamky čtyřikrát propláchly PBST, načež se přidal substrát (1 OPD tableta/3 ml ddH₂O + 1/1000 (obj./obj.) peroxidu vodíku (35%)) při koncentraci 100 μΐ/jamku. Plotna se nechala na tmavém místě a po vývoji příslušné barvy se reakce zastavila přidáním 50 μΐ H₂SO₄ (1M). Absorpce plotny se odečítala při 490 nm (ref. 655 nm).

• · · · • · · ·

01-3367-02-Če

• · · • · · · • · · ·

Výsledky

Výsledky pro aktivitu MMP-1 a tvorbu AGE jsou znázorněny na obr. 2, resp. na obr. 3.

I. Aktivita MMP-1

Jak se ukázalo, UVA záření indukovalo aktivitu MMP-1 u neošetřených buněk (kontrolní) v případě obou studií, tj . po jednom a po čtyřech dnech, čímž se potvrdila schopnost UVA indukovat MMP-1 v kultivovaných fibroblastech. Aktivita MMP-1 kontrolních buněk se během procesu fotostárnutí přibližně zdvojnásobila.

Buňky ošetřené GT vykazovaly 34% a 58% zvýšení po jednom dni, resp. po čtyřech dnech. Aktivita MMP-1 se rovněž indukovala u buněk obohacených F. Aktivita MMP-1 se po UV expozici po jednom dni přibližně ztrojnásobila a po čtyřech dne přibližně zčtyřnásobila.

Kombinace F s GT za vz zvýšení aktivity MMP-1 u ošetřené FGT mají tedy za poloviční aktivitu MMP-1, buňkami.

niku FGT překvapivě nevedla ke buněk vystavených UV. Buňky dodržení identických podmínek v porovnání s kontrolními

Tabulka 3

Den 1

	0 J/cm²	5 J/cm²	7,5 J/cm²
Kontrolní	1	2,01	1,80
GT	1	1,34	1,34
FGT	1	0, 97	0,99

• ·· · • · · ·

01-3367-02-Če

Tabulka 3a

Den 4

	0 J/cm²	5 J/ cm²	7,5 J / cm²
Kontrolní	1	2,02	2,3
GT	1	1, 37	1,58
FGT	1	1,04	0, 99

II. Tvorba AGE

Výsledky jsou znázorněny na obr. 3 a v tabulce 4. Po jediné dávce expozice UV záření (5 J/cm²) se hladina AGE u ničím neobohacených kontrolních buněk zvýšila přibližně dvacetkrát, v porovnání s neozářenými kontrolními buňkami. Za stejných podmínek se hladina AGE v kulturách obohacených F zvýšila čtyřicetkrát, což ukazuje, že F nezabraňuje vzniku AGE po UV expozici. Z obr. 3 je patrné, že hladiny AGE v buňkách obohacených FG vzrostly o 72 jednotek, což je ve stejném rozsahu, jako neošetřené ozáření kontrolní buňky (10% pokles vzhledem ke kontrole).

Buňky ošetřené extraktem FGT ukázaly překvapivé snížení AGE hladiny přibližně o 22 jednotek, vzhledem k neozářeným buňkám, což odpovídá 120% snížení AGE koncentrace, vztaženo k neošetřeným ozářeným buňkám.

• · · ·

01-3367-02-Če

Tabulka 4

	5 J/co?	7,5 J/cm²
Kontrolní	80,06	67,88
F	152,72	258,21
FG	72,04	118,58
FGT	-21,94	-34,92

Příklad 4

Přípravky podle vynálezu se připravily smísením následujících složek ve vhodných poměrech (udávaná množství jsou vztažena k finální dávkové jednotce):

Vzhledem k tomu, že lykopen je citlivý na oxidaci, provádělo se míšení granulátu a veškerá manipulace, lisování tablet, skladování tablet a balení do alu-alu-blistrových obalů pod ochrannou dusíkovou atmosférou.

Kompozice 1 (kód tablety SF)

105 mg chrupavkového extraktu (připraveného enzymatickou proteolytickou hydrolýzou chrupavky, filtrací a sušením hydrolyzátu rozprašováním);

100 mg rostlinných extraktů (obsahujících přibližně

1,5 mg lykopenu extrahovaného z rajčat a přibližně 14 mg flavonoidů extrahovaných ze semínek hroznového vína, přičemž zbytek tvoří sójová vláknina, olej z rajčat a oxid křemičitý; Alextan od společnosti Indena, Milano, Itálie);

mg extraktu Acerola (obsahujícího 7,5 mg kyseliny askorbové, přičemž zbytek tvoří složky Acerola a maltodextrin);

• ·

01-3367-02-Če • ··· · ·· ···· • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · · • · · · · · · ··· · ·· ·· mg mikrokrystalické celulózy; a mg oxidu křemičitého (velikost částic 2,4 μιη až

3,6 μιη) .

Míšení se provádělo 6 min ve směšovači Lódige. Prášková směs se lisovala do tablet o hmotnosti 305 mg.

Kompozice 2 (kód tablety SF-1)

100 mg rostlinných extraktů (obsahujících přibližně

1.5 mg lykopenu extrahovaného z rajčat a přibližně 14 mg flavonoidů extrahovaných ze semínek hroznového vína, přičemž zbytek tvoří sójová vláknina, olej z rajčat a oxid křemičitý; Alextan od společnosti Indena, Milano, Itálie);

mg mikrokrystalické celulózy; a mg oxidu křemičitého (velikost částic 2,4 μτη až

3.6 μιη) .

Míšení se prováděla 6 min ve směšovači Lódige. Prášková směs se lisovala do tablet o hmotnosti 320 mg.

• · ··· ·

01-3367-02-Če ··· · · · · · • ·

Kompozice 3 (kód tablety SS)

100 mg rostlinných extraktů (obsahujících přibližně

1.5 mg lykopenu extrahovaného z rajčat a přibližně mg flavonoidů extrahovaných ze semínek hroznového vína, přičemž zbytek tvoří sójová vláknina, olej z rajčat a oxid křemičitý; Alextan od společnosti Indena, Milano, Itálie);

mg inulinu;

mg kyseliny askorbové;

mg glukonátu zinečnatého; a mg oxidu zinečnatého (velikost částic 2,4 μιη až

3.6 μτη) .

Míšení se provádělo 6 min ve směšovači Lódige. Prášková směs se lisovala do tablet o hmotnosti 325 mg.

Typická kompozice FE: 105 mg;

GE: 13,7 5 mg; a

TE: 14,38 mg (z toho 10 % tvoří lykopen, tj. 1,44 mg).

Příklad 5

Přípravek z příkladu 1 se testoval ve spotřebitelském testu, který měl určit vnímání změn spotřebitelů na pokožce.

• ·· · ♦ ··· • · ··· ·

01-3367-02-Če

Tříměsíční studie se účastnilo 129 dobrovolníků, kteří brali denně dvě tablety obsahující přípravek z příkladu 1. Před zahájením testu si zaznamenali vzhled a kvalitu pokožky. Po jednom, dvou a třech měsících hodnotili změny vzhledu a kvality pokožky podle následujících kódů:

- stav nezměněn, 1 - mírné zlepšení, 2 - zlepšení a 3 - výrazné zlepšení.

Obr. 4 znázorňuje výsledky hodnocení parametrů: „celkového stavu pleti, „vláčnosti, kvality „pokožky okolo očí a „pokožky kolem úst. Zlepšení představuje procento dobrovolníků pociťujících zlepšení stavu pokožky.

01-3367-02-Če

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje i) chrupavkový extrakt získatelný enzymatickým proteolytickým štěpením nebo syntetické formy sloučenin extrahovatelných z chrupavky enzymatickým proteolytickým štěpením; ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel, která jsou extrahovatelná ze semínek hroznového vína nebo jsou syntetickými formami antioxidačních činidel, která jsou extrahovatelná ze semínek hroznového vína; a iii) jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel, přičemž jedním z uvedených antioxidačních činidel je lykopen, a lipofilní antioxidační činidla jsou extrahovatelná z přírodních zdrojů nebo jsou syntetickými formami lipofilních antioxidačních činidel extrahovatelných z přírodních zdrojů.
2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje i) chrupavkový extrakt získatelný enzymatickým proteolytickým štěpením; ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel, která jsou extrahovatelná ze semínek hroznového vína nebo získaná syntetickým způsobem; a iii) jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel, přičemž jedním z uvedených antioxidačních činidel je lykopen, a lipofilní antioxidační činidla jsou extrahovatelná z přírodních zdrojů nebo ze syntetického zdroje.

• ·< · «« ···· • v · ·· ·

01-3367-02-Če
3. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje i) chrupavkový extrakt získaný enzymatickým proteolytickým štěpením; ii) jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel, která jsou extrahovatelná ze semínek hroznového vína nebo získaná syntetickým způsobem; a iii) jedno nebo více lipofilních. antioxidačních činidel, přičemž jedním z uvedených antioxidačních činidel je lykopen, a lipofilní antioxidační činidla jsou extrahovatelná z přírodních zdrojů nebo ze syntetického zdroj e.
4. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že chrupavkový extrakt a sloučeniny extrahovatelná z chrupavky obsahují glykosaminoglykany zvolené z množiny sestávající z chondroitinesteru, keratanesteru, kyseliny hyaluronové nebo jejího esteru, dermatanesteru, heparinu a heparanesteru; a jejich epimerů a polymerů, přičemž každý z nich může být případně navázán na peptid.
5. Přípravek podle nároku 4, vyznačující se tím, že glykosaminoglykany se zvolí ze skupiny sestávající z chondroitin-4-sulfátu, chondroitin-6-sulfátu a keratansulfátu, přičemž každý z nich může být případně navázán na peptid.
6. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že chrupavkový extrakt obsahuje chondroitinsulfát případně navázaný na peptid.

01-3367-02-Če ···* ► ♦ 1
7. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačujíci se tím,

1% hmotn./hmotn.

0,5 % hmotn./hmotn, 0,1 % hmotn./hmotn.

kolagenu, zvláště že obsahuje méně než výhodně méně než výhodně méně než a nejvýhodněji je prostý kolagenu,
8. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel zvolí ze skupiny sestávající z kůry borovice, Vitis vinifera, Camelia sinensis, Aesculus hippocastanum, Gingo biloba, Cardus mariianum, Vaccinium myrtillus, Silybum marianum.
9. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel obsahuje oligomerní procyanidol.
10. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel je extrahovatelné ze semínek hroznového vína Vitis vinifera.
11. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel je z extraktu semínek hroznového vína.

01-3367-02-Ce *

9 » « · > » « « · · » · » • · 9 · * ·· 99
12. Přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel je extrahováno z Vitis vinifera.
13. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jedno nebo více hydrofilních antioxidačních činidel je ze semínek hroznového vína Vitis vinifera.
14. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel je extrahovatelné z variety rajčat.
15. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že alespoň jedno nebo více lipofilních antioxidačních činidel je extrahováno z variety rajčat.
16. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že lipofilním antioxidačním činidlem je extrakt z rajčat.
17. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 13 a 14, vyznačující se tím, že varietou rajčat je Lycopersicum aesculentum.

01-3367-02-Če «··· ·· ···· ·· ···· • ···· ···· • ·· ·· ·· ··
18. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že lipofilní antioxidační činidlo dále obsahuje karotenoidy zvolené z množiny sestávající z a-karotenu, β-karotenu, γ-karotenu, δ-karotenu, zeaxanthinu, kryptoxanthinu, luteínu a xanthofylu.
19. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje přibližně 0,1 až 5 % hmotn./hmotn.lykopenu, výhodně 0,2 až 4 % hmotn./hmotn. lykopenu, například 0,3 až 2 % hmotn./hmotn. lykopenu a nejvýhodněji 0,3 až 1 % hmotn./hmotn. lykopenu, zejména 0,3 až 0,8 % hmotn./hmotn. lykopenu, například 0,3 až 0,6 % hmotn./hmotn. lykopenu.
20. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje tokoferoly, fytoen a fytofluen.
21. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,025 % beta-karotenu, výhodně méně než 0,02 % beta-karotenu, a zejména méně než 0,01 % beta-karotenu.
22. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že hydrofilní a lipofilní antioxidační činidla jsou přítomna v poměru hmotn./hmotn., který se pohybuje v rozmezí přibližně od 1:1 do 200:1, například od 2:1 do 100:1, zejména od 5:1 do 50:1, zejména ···· ·· ···· ·· ····

01-3367-02-Če od 5:1 do 20:1, výhodně od 5:1 do 15:1 a nej výhodněji přibližně od 7:1 do 12:1, například přibližně 10:1.
23. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se získatelný enzymatickým tím, že chrupavkový extrakt proteolytickým štěpením nebo syntetické formy sloučenin extrahovatelných z chrupavky enzymatickým proteolytickým štěpením a hydrofilní antioxidační činidla jsou přítomna v poměru hmotn./hmotn., který se pohybuje v rozmezí přibližně od 1:1 do 200:1, například od 2:1 do 100:1, zejména od 5:1 do 50:1, zejména od 5:1 do 20:1, výhodně od 5:1 do 15:1 a nejvýhodněji přibližně od 7:1 do 12:1, například přibližně 10:1.
24. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 11 až 23, vyznačující se tím, že obsahuje 0,25 mg až 15 mg lykopenu a 2,5 mg až 100 mg extraktu ze semínek hroznového vína, výhodně 0,5 mg až 5 mg lykopenu a 5 mg až 50 mg extraktu ze semínek hroznového vína, zejména 0,75 mg až 2,5 mg lykopenu a 10 mg až 30 mg extraktu ze semínek hroznového vína, a zejména 1 mg až 2,5 mg lykopenu a 10 mg až 25 mg extraktu ze semínek hroznového vína.
25. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 11 až 24, vyznačující se tím, že obsahuje 1 mg až 2,5 mg lykopenu, 5 mg až 50 mg extraktu ze semínek hroznového vína a 50 mg až 200 mg chrupavkového extraktu.

01-3367-02-Če
26. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 16 až 22, vyznačující se tím, že obsahuje

i) 20 až 40 % hmotn./hmotn. chrupavkového extraktu, například 25 až 35 % hmotn./hmotn., výhodně 27 až 35 % hmotn./hmotn., například 30 až 35 % hmotn./hmotn. chrupavkového extraktu;

li) 1 až 10 % hmotn./hmotn. extraktu ze semínek hroznového vína, například 2 až 8 % hmotn./hmotn. , výhodně 3 až 7 % hmotn./hmotn. , například 3 až 5 % hmotn./hmotn. extraktu ze semínek hroznového vína; a iii) 1 až 10 % hmotn./hmotn. extraktu z rajčat, například 2 až 8 % hmotn./hmotn. , výhodně 3 až 7 % hmotn./hmotn. , například 3 až 5 % hmotn./hmotn. extraktu z rajčat.
27. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 26, vyznačující se tím, že dále obsahuje extrakt Acerola.
28. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 11 až 27, vyznačující se tím, že obsahuje

100 mg až 110 mg extraktu z chrupavky,

95 mg až 105 mg kombinovaného extraktu ze semínek hroznového vína a extraktu z rajčat,

25 mg až 35 mg extraktu z Acerola,

60 mg až 90 mg mikrokrystalické celulózy,

3,5 mg až 4,5 mg oxidu křemičitého, přičemž extrakt ze semínek hroznového vína obsahuje oligomerní procyanidol; extrakt z rajčat obsahuje lykopen a chrupavkový extrakt obsahuje glykosaminoglykan.

···· ·· ···· ·· ····

01-3367-02-Če
29. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 13 až 28, vyznačující se tím, že obsahuje

100 mg až 110 mg extraktu z chrupavky,

95 mg až 105 mg kombinovaného extraktu ze semínek hroznového vína a extraktu z rajčat,

60 mg až 65 mg inulinu,

25 mg až 35 mg kyseliny askorbové,

10 mg až 20 mg glukonátu zinečnatého,

10 mg až 15 mg oxidu křemičitého, přičemž extrakt ze semínek hroznového vína obsahuje oligomerní procyanidol; extrakt z rajčat obsahuje lykopen a chrupavkový extrakt obsahuje glykosaminoglykan.
30. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 11 až 29, vyznačující se tím, že extrakt ze semínek hroznového vína je formulován pro pozvolné uvolňování a lykopen je formulován pro normální uvolňování.
31. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jako orální kosmetický produkt, potravina, potravinový doplněk, farmaceutický prostředek nebo dietetický prostředek.
32. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se přípravek podává ve formě pevné dávkové formy, například jako tablety, prášky, granule, kapsle nebo pastilky; nebo ve formě kapalné dávky, například jako roztoky, suspenze, tonika nebo sirupy.

01-3367-02-Če
33. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vhodný pro obecné udržení zdravé pokožky pro zpoždění nástupu degenerace pokožky v důsledku stárnutí nebo UV expozice a pro léčbu příznaků stárnutí pleti.
34. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vhodný při léčbě stárnoucí pokožky, pokožky vystavené slunečnímu světlu nebo jiným formám UV záření, suché pokožky, hrubé pokožky, nepřirozeně zabarvené pokožky, pokožky trpící akné, zjizvené pokožky, pokožky se známkami napětí, ekzému a lupénky.
35. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zvyšuje syntézu kolagenu alespoň o 35 %, stanoveno testovací metodou A.
36. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že redukuje škodlivé účinky volných radikálů alespoň o 40 %, například alespoň o 45 % nebo 50 %, stanoveno na základě naměřené aktivity MMP-1 porovnané s hodnotou kontrolního vzorku za podmínek testovací metody B.
37. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že snižuje tvorbu finálních produktů pokročilé glykosylace (AGE) alespoň o 10 %, například alespoň o 20 % nebo alespoň o 30 %, 40 %, 50 % nebo 60 %, výhodně alespoň 70 %, zejména alespoň 80 % nebo

01-3367-02-Če

90 % a nejvýhodněji alespoň 100 % nebo 110 %, měřeno za podmínek testovací metody C a porovnáno s kontrolním vzorkem.
38. Přípravek podle nároku 35, vyznačující se tím, že zvýšení syntézy kolagenu je alespoň 40 %, alespoň 45 %, například alespoň 50 %, alespoň 55 %, výhodně alespoň 60 %, například alespoň 65 %, alespoň 70 % a nejvýhodněji alespoň 75 % nebo alespoň 80 %.
39. Přípravek podle nároku 36, vyznačující se tím, že redukuje škodlivé účinky volných radikálů alespoň o 40 %, například alespoň o 45 % nebo 50 %, stanoveno na základě naměřené aktivity MMP-1 porovnané s hodnotou kontrolního vzorku za podmínek testovací metody B.
40. Přípravek podle nároku 39, vyznačující se tím, že škodlivé účinky jsou způsobeny UV expozicí.
41. Použití přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 32 pro přípravu činidla pro prevenci nebo pro zpomalení příznaků stárnutí pokožky, pro ochranu před škodlivými vlivy UV záření nebo pro jejich redukci, pro léčbu známek napětí, pro léčbu akné, pro redukci příznaků ekzémů, jako pomoc při léčbě ran, pro redukci jizev, pro redukci příznaků lupénky nebo pro léčbu hrubé, nepřirozeně zabarvené nebo suché pokožky.

01-3367-02-Če ···· ·· ···· ·· ····
42. Způsob kosmetické nebo profylaktické léčby stárnoucí pokožky, pokožky vystavené působení slunečního záření nebo jiným formám UV záření, suché pokožky, hrubé pokožky, nepřirozeně zabarvené pokožky, pokožky trpící akné, zjizvené pokožky, pokožky se známkami napětí, ekzému a lupénky, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podání výše definovaného přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 32 .
43. Způsob kosmetické nebo profylaktické léčby pokožky před známkami stárnutí pokožky a před poškozením způsobeným expozicí UV záření, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podání výše definovaného přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 32.
44. Způsob zvýšení syntézy kolagenu nebo snížení redukce syntézy kolagenu v dermu, vyznačující se tím, že zahrnuje orální podání výše definovaného přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 32.