CZ20014466A3

CZ20014466A3 - Kosmetický prostředek pro péči a pokoľku

Info

Publication number: CZ20014466A3
Application number: CZ20014466A
Authority: CZ
Inventors: Robert George Carson; Krupa Patel; Sreekumar Pillai; Stewart Paton Granger; Beth Anne Lange
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1999-06-30
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2002-03-13
Also published as: KR100666512B1; CN1359287A; RU2244537C2; CZ293932B6; MXPA01013218A; DE60002863D1; JP2003503439A; ES2199166T3; CN1241534C; AR024497A1; WO2001001947A1; CA2373844A1; DE60002863T2; KR20020011999A; EP1189585A1; ZA200109738B; PL352360A1; ATE240715T1; EP1189585B1; TWI226244B

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká kosmetických prostředků obsahujících kumylalkohol a způsobů zlepšení kosmetického vzhledu pokožky nanášením takových prostředků na pokožku.

Dosavadní stav techniky

Lidská kůže sestává ze dvou hlavních vrstev, přičemž spodní silnější vrstva je známa jako dermis a horní tenší vrstva je známa jako epidermis.

Dermis je vrstvou, která poskytuje kůži pevnost, pružnost a tloušťku. S postupem stárnutí se tloušťka dermální vrstvy snižuje a předpokládá se, že tento jev je částečně zodpovědný za vytváření vrásek ve stárnoucí pokožce.

Horní vrstva lidské kůže, neboli epidermis, se skládá z mnoha různých typů buněk a poskytuje kůži vlastnosti jako pružnost a tvoří překážku vnějšímu prostředí. Hlavním buněčným typem v epidermis jsou keratinocyty (představují 75 až 80 % z celkového počtu buněk v lidské epidermis). Keratinocyty jsou v epidermis ve čtyřech odlišných stádiích diferenciace. Diferenciace (rozlišení) epidermu je důležitá pro zajišťování hlavní funkce kůže, zejména pro poskytnutí ochranné překážky, bariéry, vůči vnějšímu prostředí a k předcházení tělesného úbytku vody. Vytvoření zrohovatělého obalu je konečným stádiem diferenciace keratynocytu. Enzym zodpovědný za vytváření zrohovatělých obalů, transglutamináza, je indikátorem diferenciace epidermis.

• ·

» »9	9 99	9«
9 ·	« ·	• 9 » 9	• 9
•	9	9 9	9	9
•	• ·	9 «	9 9	9
9	•	9 9	• 9
		9*9 9···	9 9

Kromě tloušťky kůže umožňují kůži bariérové působení i jiné faktory. Vrstvy tuků tvoří v kůži vodní bariéru, která zabraňuje ztrátě vody z kůže a v důsledku toho i výskytu zestárlé, suché nebo vrásčité pokožky. Tyto lipidy sestávají především z ceramidů, cholesterolu a z mastných kyselin. V normální pokožce, pokud je bariérová funkce rozrušená, epidermis resyntetizuje chybějící tuky. Za určitých podmínek však může dojít ke snížení kapacity této opětné syntézy, zvláště u zestárlé nebo suché pokožky, u níž jsou úrovně kožních tuků v každém případě podnormální. Navíc je u zestárlé a/nebo suché pokožky poškozen i buněčný metabolismus. Snížený obrat a snížené využívání glukózy může vést ke sníženému metabolismu a ke zvratu kožních buněk, což vede k výskytu zestárlé, suché a šupinkovité kůže.

Vystavení ultrafialovému záření a jiným škodlivým substancím z okolního prostředí může způsobit poškození kožních buněk volnými radikály. Antioxidanty, jako askorbáty (sole kyseliny askorbové), pomáhají snížit toto poškození snížením koncentrace volných radikálů. V důsledku toho lze u materiálů, které stimulují transport antioxidantů do buněk, předpokládat, že budou ochranu vůči poškození volnými radikály zvyšovat.

Předkládaný vynález se zakládá alespoň částečně na zjištění, že vystavení kultivovaných keratinocytů kumylalkoholu má za důsledek několik žádoucích účinků; posílení diferenciace, expresi tuků, které jsou zásadní pro funkci bariéry a zvýšení příjmu glukózy a askorbátu.

Kumylalkohol (známý také jako p-isopropylbenzylalkohol) je esenciálním (nezbytným) olejem, který se nachází ve stopových množstvích v lékořicovém kořeni (4 ppm, díly z milionu; US Služba zemědělského výzkumu, fytochemické a etnobotanické databáze; US Agricultural Research Service, Phytochemical and Ethnobotanical

t

-3Databases). Merckův rejstřík (Merck Index) rovněž uvádí jako zdroj kumylalkoholu kmínová semena. Ovšem databáze Služby zemědělského výzkumu (Agricultural Research Service database) kumylalkohol ve svém výčtu nevšedních chemických látek přítomných v kmínu nezmiňuje vůbec.

Lékořice a lékořicový extrakt byly popsány jako látky, mající použití v prostředcích pro péči o pokožku. US patent č. 5 716 800 (Meybeck se spoluautory) zmiňuje lékořicový extrakt jako regulátor kožního tuku. US patent č. 5 565 199 (Page se spoluautory) zmiňuje použití materiálu lékořicového extraktu jako zevně nanášené substance s estrogenní aktivitou. US patent č. 5 080 901 (Hangay se spoluautory) uvádí použití lékořice v kosmetickém a zdravotnickém protizánětlivém výrobku.

Jiné publikace zmiňují použití lékořice nebo materiálů lékořicového extraktu vzhledem k různým příznivým účinkům na pokožku, jako je: ochrana před slunečním zářením (J010182416), působení jako antioxidační činidlo (J02204495), jako působení bělící činidlo (J06256150), zmírnění kontaktní dermatitidy (J04356423, J04356424), působení jako protimikrobiální kosmetická konzervační látka J62181202, J09202712), působení jako koupelový prostředek pro suchou pokožku (J09002939), působení jako krém proti akné (CN1136431) a růst vlasů (WO 9522957).

Žádný z dokumentů dosavadního stavu techniky, které byly uvedeny výše, neuvádí jako aktivní látku kumylalkohol. Patent Hangaye se spoluautory udává, že 50% alkoholový extrakt z lékořicového kořene (Glycyrrhiza glabra, radix) má obsah sušiny od 3,5 do 4,5 %. I když proces extrakce odděluje materiál od předmětu extrakce, nezvyšuje celkovou koncentraci extrahovaného materiálu; naopak ji snižuje.

-4Jelikož typická koncentrace kumylalkoholu v lékořicovém kořeni je 4 díly z milionu, je tato koncentrace v extrakčním rozpouštědle snížena a v jakémkoli postupu formulování, při němž se extrakt používá, se dále snižuje až na stopovou úroveň.

US patent 5 871 718 (Lucas se spoluautory) a US patent 5 874 070 (Trinh se spoluautory) předkládá prostředky absorbující zápach, které lze používat na kůži. Prostředky obsahují cyklodextrin, který je molekulou, schopnou komplexace molekul zápachu. Prostředek zahrnuje také parfém, kterým může být kumylalkohol. Oba patenty udávají, že parfémy mají v prostředku sklon ke komplexaci s cyklodextriny.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje kosmetický prostředek pro péči o pokožku, který obsahuje:

a) 0,001 až 50 % hmotnostních solubilizovaného kumylalkoholu o vzorci I:

b) kosmeticky přijatelné vehikulum (nosič).

Prostředky podle předkládaného vynálezu poskytují zvýšenou diferenciaci keratinocytů a zvýšenou tvorbu tuků a zlepšený příjem glukózy a askorbátu, výsledkem čehož je zlepšená bariérová funkce vůči

vnějšímu prostředí. To poté přináší snížený dojem zbrázdění, vrásek a zestárlé pokožky, zlepšení barvy pokožky, kosmetické ovlivnění suché nebo působením světla zestárlé pokožky, zlepšení zářivosti pokožky a jasu a konečného vzhledu a celkový zdravý a mladistvý vzhled pokožky.

Pokud není uvedeno jinak, veškerá množství jsou vztažena ke hmotnosti konečného prostředku.

Výraz kůže nebo pokožka, jak je zde používán, zahrnuje pokožku obličeje, krku, hrudi, paží, nohou, rukou a pokožku hlavy.

Výraz solubilizovaný jak je zde používán znamená, že alespoň 90 % kumylalkoholu, přítomného v konečném prostředku, je solubilizováno.

Kumylalkohol má následující strukturní vzorec:

Kumylalkohol lze získat od firmy Sigma.

Kumylalkohol se do prostředků podle předkládaného vynálezu začleňuje v množství od 0,001 do 50 %. K maximalizování přínosů prostředku při nejmenších nákladech se kumylalkohol s výhodou začleňuje v množství od 0,001 do 10 % a nejlépe od 0,001 do 5 %.

Kosmeticky přijatelné vehikulum

-6Prostředek podle vynálezu rovněž obsahuje kosmeticky přijatelné vehikulum, které působí jako ředidlo, disperzní činidlo nebo nosič kumylalkoholu v prostředku, k tomu, aby usnadnilo jeho rozílení (distribuci) při nanesení prostředku na pokožku. Kumylalkohol musí být, k tomu, aby poskytoval pokožce přínos, solubilizován a nesmí být komplexován. Pronikání do vrstvy startům corneum je pro aktivitu zásadní. Kumylalkohol může být v ionizačním prostředku rozpuštěn v alkoholu. Prostředky jsou s výhodou ve formě emulzí oleje ve vodě, v nichž je kumylalkohol rozpuštěn v olejové fázi. Emulze s výhodou obsahují alespoň 80 % hmotnostních vody vzhledem ke hmotnosti vehikula. Množství vody s výhodou představuje alespoň 50 % hmotnostních prostředku podle vynálezu a lépe 60 až 80 % hmotnostních prostředku.

Volitelné materiály, přínosné pro pokožku a kosmetické doplňky

Podle předkládaného vynálezu patří mezi přínosné účinky kumylalkoholu jeho schopnost zvyšovat příjem glukózy a kyseliny askorbové buňkami pokožky. I když kumylalkohol zvyšuje příjem endogenní glukózy a kyseliny askorbové, tento příjem může být dále zvýšen tím, že se do prostředku přidá glukóza, kyseliny askorbová nebo sloučenina, o níž je známo, že se v pokožce rozkládá na glukózu či kyselinu askorbovou.

Sloučeniny, rozkládající se v pokožce a poskytující glukózu zahrnují, ne však výlučně, glukosamin, glutamát glukózy, galaktózu, laktózu, sacharózu a glukozofosfátové estery.

Sloučeniny, rozkládající se v pokožce a poskytující kyselinu askorbovou zahrnují, ne však výlučně, askorbylpalmitát, askorbylstearát,

-Ί askorbyltetraisopalmitát, askorbylfosfát horečnatý, askorbylmonofosfát sodný a polypeptid askorbové kyseliny.

Tento upřednostňovaný volitelný doplněk se do prostředků začleňuje v množství od 0,001 do 10 %, lépe od 0,01 do 10 % a nejlépe od 0,1 do 5 %.

Zvláště upřednostňovaný prostředek podle vynálezu obsahuje glukózu nebo kyselinu askorbovou, neboť ty jsou dostupné pro příjem bez dalšího metabolizování v pokožce.

Prostředky podle vynálezu s výhodou zahrnují ochranné látky proti slunečnímu záření, sloužící ke menšímu vystavení pokožky škodlivým ultrafialovým paprskům.

Ochranné látky proti slunečnímu záření zahrnují takové materiály, které se běžně používají k blokování ultrafialového světla. Dokreslujícími sloučeninami jsou deriváty PABA (kyseliny paraaminobenzoové), skořičnan a deriváty salicylátu (odlišné od ferulylsalicylátu). Použity mohou být například oktylmethoxyskořičnan a 2-hydroxy- -4-methoxybenzofenon (známý jako oxybenzon). Oktylmethoxyskořičnan a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon jsou obchodně dostupné pod svými obchodními názvy Parsol MCX, respektive Benzophenone 3. Přesné množství ochranné látky proti slunečnímu záření použité v emulzích se může měnit v závislosti na stupni požadované ochrany vůči slunečnímu ultrafialovému záření.

K poskytnutí buď emulze vody v oleji nebo emulze oleje ve vodě může být přítomný olejový nebo olejovitý materiál, spolu se zvláčňovadlem, což šířeji závisí na na průměrné hydrofilně-lipofilní rovnováze (hydrophilic-lipophilic balance, HLB) použitého zvláčňovadla.

-8Množství takových zvláčňovadel mohou být v rozmezí přibližně od 0,5 % do 50 % a lépe přibližně od 5 % do 30 % hmotnosti celkového prostředku. Zvláčňovadla mohou být tříděna do takových obecných chemických kategorií, jako jsou estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být mono- nebo diestery. Přijatelné příklady diesterů mastné kyseliny zahrnují d ibutylad i pát, diethylsebakát, diisopropyldimerát a dioktylsukcinát. Přijatelné estery mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem zahrnují 2-ethyihexylmyristát, isopropylstearát a isostearylpalmitát. Přijatelné estery trojsytných kyselin zahrnují triisopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelné estery mastné kyseliny s rovným řetězcem zahrnují laurylpalmitát, myristyllaktát, oleylerukát a stearyloleát. Upřednostňované estery zahrnují kokosový kaprylát/kaprát (směs kokosového kaprylátu a kokosového kaprátu), myristyletheracetát propylenglykolu, diisopropyladipát a cetyloktanoát.

Vhodné alkoholy s dlouhým alifatickým řetězcem a mastné kyseliny zahrnují tyto sloučeniny, které mají 10 až 20 atomů uhlíku. Zvláštní přednost se dává takovým sloučeninám, jako jsou cetylové, myristylové, palmitové a stearové alkoholy a kyseliny.

Mezi polyoly, které mohou sloužit jako zvláčňovadla, patří alkylpolyhydroxylové sloučeniny s rovnými i rozvětvenými řetězci. Upřednostňují se například propylenglykol, sorbitol a glycerin. Vhodnými látkami mohou být i polymerní polyoly jako polypropylenglykol a polyethylenglykol. Zvláštní přednost se dává rovněž butylenu a propylenglykolu jako látkám zvyšujícím pronikání (penetraci).

Příkladem uhlovodíků, které mohou sloužit jako zvláčňovadla, jsou ty, které mají uhlovodíkový řetězec kdekoli v rozmezí od 12 do 30 atomů

-9uhlíku. Specifické příklady zahrnují minerální olej, žlutou vazelínu, skvalen a isoparafíny.

Jinou kategorií funkčních přísad kosmetických prostředků podle předkládaného vynálezu jsou plniva. Plnivo bude obvykle přítomno v množstvích od 0,1 do 20 % hmotnosti a s výhodou přibližně od 0,5 % do 10 % hmotnosti prostředku. Příkladnými plnivy jsou zesítěné polyakrylátové materiály, dostupné pod obchodním názvem Carbopol od firmy B. F. Goodrich Company. Použity mohou být i gumy, jako xanthanová guma, karagen, želatina, karaya, pektin a karubová guma. Za určitých podmínek může funkci plniva splňovat také materiál, který rovněž slouží jako silikon nebo zvláčňovadlo. Například silikonové gumy v nadbytku 1 . 10'⁵ m²s'¹ (10 cSt) a estery jako stearát glycerolu mají duální funkčnost.

Do kosmetického prostředku podle předkládaného vynálezu mohou být začleněny i prášky. Tyto prášky zahrnují křídu, talek, kaolin, škrob, smektítové jíly, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnato-hlínitý, organicky modifikovaný montmorillonitový jíl, hydratovaný křemičitan hlinitý, kouřovou siliku (oxid křemičitý), hlinitý škrobový oktenylsukcinát a směsi takových látek.

Do kosmetických prostředků mohou být začleněny i další přídavné menší složky. Tyto přísady mohou zahrnovat barvící činidla, zneprůhledňující činidla a parfémy. Množstí dalších přídavných menších složek tohoto typu se může pohybovat kdekoli v rozmezí od 0,001 % až do 2 % hmotnosti prostředku.

Použití výrobku, jeho formy a balení

-10Při použití se malá množství prostředku, například množství od 1 do 100 ml, nanášejí na vystavené plochy pokožky z vhodného zásobníku nebo aplikátoru a, pokud je to nezbytné, následně se roztírají a/nebo vmasírují do pokožky pomocí ruky či prstů nebo vhodného nástroje.

Kosmetický prostředek k úpravě pokožky, podle tohoto vynálezu, může být formulován jako pleťová voda (lotion), krém nebo gel. Prostředek může být balen ve vhodném zásobníku, vyhovujícím jeho viskozitě a předpokládanému použití spotřebitelem. Například pleťová voda nebo krém mohou být baleny v lahvičce nebo v aplikátoru s nanášecí kuličkou, anebo v aerosolovém zařízení s hnacím plynem či v zásobníku, vybaveném pumpičkou, vhodnou pro prstové ovládání. Pokud je prostředek ve formě krému, může být jednoduše skladován v nedeformovatelné lahvičce nebo ve smačknutelném zásobníku, jako je tuba nebo nádobka s víčkem. Vynález tedy rovněž poskytuje uzavřený zásobník, obsahující kosmeticky přijatelný prostředek, jak je zde definován.

Následující specifické příklady dále dokreslují vynález, který se však na ně neomezuje.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Kultura keratinocytů

Normální lidské keratinocyty, isolované z novorozenecké předkožky působením trypsinu, byly pěstovány v Eaglově médiu, modifikovaném podle Dulbecca (Dulbecco's Modified Eagle's Medium,

DMEM, Life Technologies, Grand Island, New York) s 10% fetálním

• 9 9 • · • 9 ·

9

9 hovězím sérem v přítomnosti ozářených myších fibroblastů pro zajištění (nastolení) dělení keratinocytových kolonií. Buňky byly inkubovány až do jejich druhého pasážování a poté byly při teplotě -70°C skladovány až do příštího použití. Veškeré inkubace byly prováděny při teplotě 37°C a za přítomnosti 5% CO₂. Zmrazené keratinocyty z druhého pasážování byly rozmraženy a umístěny do lahví T-175 (Corning, Corning, New York) s DMEM a v nich byly pěstovány po dobu 5 dní. Po získání 80% konfluence (spojitého nárůstu) byly trypsinovány a vysety na destičky s 6 jamkami, obsahujícími růstové médium pro keratinocyty (KGM, keratinocyte growth medium, Clonetics, San Diego, CA) s 0,15 mmol.l'¹vápníkem.

Stanovení transglutaminázy (TG-1)

Keratinocyty byly vloženy v počtu 0,2 milionu buněk/destičku do KGM (2 ml na jamku) v 6-jamkových kultivačních destičkách a pěstovány 4 nebo 5 dnů, dokud buňky nedosáhly přibližně 20% konfluence (spojitého nárůstu). Po odstranění starého média byly do každé jamky přidány 2 ml čerstvého KGM a každý den po dobu 3 dnů bylo 10 μΙ kukuřičného oleje, obsahujícího 0%; 2,5% nebo 5% kumylalkohol, převrstveno na povrch média. Jedna sada tří jamek byla ponechána bez ovlivnění jako kontrolní. Po třech dnech inkubace byly buňky důkladně promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS, 10 mmol.l'¹fosfát sodný, 138 mmol.l'¹ chlorid sodný, 2,7 mmol.l'¹ chlorid draselný, pH 7,4) a byly na 2 hodin vystaveny teplotě -70°C. Poté byly po dobu 2 hodin rozmražovány.

Obsah DNA v buňkách byl kvantifikován za použití fluoroforu, vázajícího se na DNA, bis-benzimidazolu (Hoechst 33258) a měřením specifické fluorescence fluoroforu vázaného na DNA (excitace při 360 nm, emise při 450 nm). Buněčné hladiny TG-1 byly stanoveny za použití • ·· · ·· ·· • · · · · · · ♦ · · · • · · · · 9 specifické monoklonální protilátky vůči transglutamináze-1 (TG-1) jako primární protilátky (BC1, Amersham, Velká Británie) a peroxidázou značeného králičího protimyšího IgG (imunoglobulinu typu G) jako sekundární protilátky (Amersham, Velká Británie). Destičky byly při teplotě místnosti blokovány 5% netučným mlékem v Trisem pufrovaném fyziologickém roztoku (Tris-buffered šalině, TBS; 10 mmol.l'¹ Tris, 150 mmol.l'¹ NaCl, pH 8,0) po dobu 1 hodiny a a následně byly po dobu 2 hodin inkubovány s primární protilátkou (naředění 1:4000) v soustavě 1% mléko/TBS při teplotě místnosti. Po trojnásobném promytí soustavou 1% mléko/TBS, obsahující 0,05% Tween 20 (od firmy Bio-Rad, Hercules, CA) byly destičky inkubovány se sekundární protilátkou v naředění 1:4000 po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Poté byly trojnásobně promyty soustavou 1% mléko/0,05% Tween 20/TBS a trojnásobně pomocí PBS.

Zbarvení bylo vyvíjeno inkubací s o-fenylediaminem (Sigma, St. Louis, MO) a peroxidem vodíku (Sigma), rozpuštěnými ve směsi, obsahující v poměru 1:1 0,2 mol.l'¹ Na₂HPO₄ (Sigma) a 0,1 mol.I’¹kyselinu citrónovou při pH 5,0 (Sigma). Roztoky byly přeneseny do plastových kyvet o objemu 4 ml (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a absorbance byla odečítána při 492 nm na spektrofotometru Ultraspec 3000 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Hladiny TG-1 byly vyjádřeny jako poměr absorbance a fluorescence DNA.

Stanovení tuků

Keratinocyty byly vloženy v počtu 0,2 milionu buněk/destičku do

KGM (2 ml na jamku) v 6-jamkových kultivačních destičkách a pěstovány po dobu 5 dnů, dokud buňky nedosáhly přibližně 20% spojitého růstu.

Buňky byly zásobovány a ovlivňovány kumylalkoholem, jak bylo popsáno dříve. Po třech dnech takového působení byly buňky dvakrát promyty

-13 •S pomocí PBS a shromážděny přídavkem 3 ml 0,1 N roztoku NaCI (Fisher) do každé jamky a seškrabáním pomocí gumové stěrky. Supernatanty byly převedeny do skleněných testovacích zkumavěk o rozměru 16 x 100 ml s teflonem pokrytými uzávěry a poté byly inkubovány 1 hodinu při 70°C. Po ochlazení na teplotu místnosti byla alikvotní část (50 μΙ) odebrána pro stanovení bílkoviny (stanovení Pierce BCA, Rockford, IL). Do každé zkumavky bylo přidáno 320 μΙ 1N roztoku NaCI a 2,5 ml chloroformu a obsah zkumavky byly důkladně promíchán. Poté byly zkumavky vloženy do třepačky a protřepávány po dobu 30 minut. Následně byly směsi odstřeďovány 10 minut při 2000 g.

Z organické fáze byly odebrány 2 ml chloroformu a umístěny do lahvičky automatického dávkovače. Vzorky pak byly vysušeny pod dusíkem, resuspendovány v 60 μΙ soustavy chloroforrmmethanol (2:1) a převedeny do vnitřní mikrozkumavky pro automatický dávkovač. Tato zkumavka byla zasunuta do lahvičky pro automatický dávkovač, která byla následně utěsněna. 40 μΙ vzorku bylo naneseno (pomocí zařízení Camag Automatic TLC Sampler III, Wilmington, NC) na silikové desky pro chromatografii v tenké vrstvě, TLC (Whatman 4807-700). Desky byly vyvíjeny ve vodorovných komorách (Camag) za použití následujících systémů rozpouštědel: 1) chloroform, methanol, kyselina octová v poměrech 95:4,5:0,5 a 2) hexan, ethylether a kyselina octová v poměrech 60:40:2. Po ponoření desek do 10% síranu měďnatého v 8% kyselině fosforečné byly při teplotě 165°C po dobu 20 minut zuhelněny a poté odečteny na densitometru (Camag TLC Scanner II).

Stanovení příjmu glukózy

Keratinocyty byly vloženy v počtu buď 0,5 nebo 1 milionu buněk/destičku do média KGM v 6-jamkových kultivačních destičkách a pěstovány 4 dny. Poté bylo médium odsáto, jamky byly dvakrát promyty ··

-14• · pomocí PBS (fysiologickým roztokem pufrovaným fosfátem) a destičky byly inkubovány (1ml/jamku) po dobu 24 hodin. Médium bylo nahraženo čerstvým KBM, poté bylo přidáno 10 μΙ kukuřičného oleje s obsahem kumylalkoholu v různých koncentracích a buňky byly ponechány inkubovat (4 hodiny při 37°C). Následně bylo do každé jamky přidáno množství 2pCi ³H 2-deoxyglukózy (Amersham, Velká Británie) a vzorky byly inkubovány 1 hodinu. Pak bylo médium odsáto a jamky byly třikrát promyty PBS před přidáním 500 μΙ 0,1 N roztoku NaOH na jamku. Po 10 minutách protřepávání v třepačce byla alikvotní část 25 μΙ odebrána pro stanovení bílkoviny a 200 μΙ bylo přeneseno do scintilační lahvičky, obsahující 5 ml scintilačního roztoku (Scintiverse) a odečet byl proveden ve scintilačním počítači Beckman. Výsledky příjmu glukózy byly vyjádřeny jako CPM/pg bílkoviny (počet impulsů za minutu na pg bílkoviny).

Stanovení příjmu askorbátu

Pro tento pokus byly keratinocyty ze třetího pasážování vloženy do média KGM (Clonetics, CA), obsahujícího 0,15 mmol.I'¹ vápníku. Do každé jamky šestijamkových destiček pro kultivaci buněk bylo umístěno přibližně 80 000 buněk a pěstováno po dobu 5 dnů, dokud buňky nedosáhly přibližně 60-70% spojitého růstu.

Poté byly buňky převedeny do čerstvého KBM a byly ovlivňovány 5% kumylalkoholem, podávaným v kukuřičném oleji ( dávkování 10 μΙ kukuřičného oleje + aktivní látka v uvedené koncentraci/2 ml média). Po 4 hodinách inkubace bylo do každé jamky přidáno množství 0,1 pCi/ml L-¹⁴C-1-askorbové kyseliny (Amersham, Velká Británie) a 50 jednotek oxidázy askorbové kyseliny (Sigma) a destičky byly inkubovány další hodinu. Pak bylo médium odsáto a jamky byly třikrát promyty PBS před přidáním 500 μΙ 0,1 N roztoku NaCl na jamku. Po 10 minutách

- 15protřepávání v třepačce byla odebrána alikvotní část 25 μΙ pro stanovení bílkoviny a 200 μΙ bylo přeneseno do scintilačních lahviček, obsahujících 5 ml scintilačního roztoku (Scintiverse). Odečet byl proveden ve scintilačním počítači Beckman (model LS 5801). Výsledky příjmu kyseliny askorbové byly vyjádřeny jako CPM/pg bílkoviny (počet impulsů za minutu na μg bílkoviny).

Koncentrace, použité v níže uvedených příkladech, se týkají kumylalkoholu v kapénkách kukuřičného oleje. Koncentrace in vitro nemusí být odpovídající koncentraci in vivo, neboť mezi olejem a kultivačním médiem dochází k rozdílení a koncentrace aktivní látky v médiu není totožná s koncentrací aktivní látky v olejových kapénkách. Pro dosažení účinků kumylalkoholu na kultivované buňky musí tato látka difundovat ven z kukuřičného oleje do kultivačního média a v něm je pak dostupná pro buňky. Koncentrace kumylalkoholu v kultivačním médiu je tedy významně nižší než jeho koncentrace v kapénkách kukuřičného oleje.

Příklad 1

Tento příklad zkoumal účinek kumylalkoholu na příjem glukózy lidskými keratinocyty. Získané výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1.

Tabulka 1

vzorek	cpm/pg bíkoviny	% kontroly	hodnota p	statistická významnost
kontrolní	19,77 ± 1,01	100	-	-
1% kumylalkohol	21,18 ± 0,84	107	>0,05	ne
2,5% kumylalkohol	36,67 ± 1,04	185	< 0,05	ano
5 % kumylalkohol	40,67	206	< 0,05	ano

-16• ·

Z výsledků uvedených v Tabulce 1 je zřejmé, že lidské keratinocyty, ovlivněné kumylalkoholem, vykázaly podstatně zvýšený příjem glukózy (zvýšení na 185, respektive 206 %) ve srovnání s neovlivněnými kontrolními buňkami.

Příklad 2

Tento příklad zkoumal účinek kumylalkoholu na expresi transglutaminázy a produkci ceramidů. Získané výsledky jsou shrnuty v Tabulkách 2 a 2A.

Tabulka 2

vzorek	TG-1 (absorbance/ DNA)	% kontroly	hodnota P	statistická významnost
Pokus č. 1
kontrolní	5,53 ± 0,67	100	-	-
2,5% kumylalkohol	6,48 ± 0,58	117	>0,05	ne
5% kumylalkohol	9,94 ±1,15	180	< 0,05	ano
Pokus č. 2
kontrolní	6,41 ± 0,67	100	-	-
2,5% kumylalkohol	9,27 ± 0,40	145	< 0,05	ano

♦ ·

- 17• Φ* 9 Φ· 99

Φ Φ « « ΦΦ»Φ ·

Φ · · Φ Φ Φ

Φ * · · Φ ♦ · φ • Φ Φ Φ · ·

Tabulka 2Α

vzorek	ceramidy (ng/Mg bílkoviny)	% kontroly	hodnota p	statistická významnost
Pokus č. 1
kontrolní	6,10 ± 2,01	100	-	-
2,5% kumylalkohol	4,03 ± 1,02	67	> 0,05	ne
5% kumylalkohol	9,37 ± 0,51	156	< 0,05	ano
Pokus č. 2
kontrolní	1,76 ± 0,20	100	-	-
2,5% kumylalkohol	2,93 ± 0,12	166	< 0,05	ano
5% kumylalkohol	3,26 ± 0,41	185	< 0,05	ano

Z výsledků uvedených v Tabulce 2 a 2A je zřejmé, že lidské keratinocyty, ovlivněné 2,5 a 5% kumylalkoholem, vykázaly zvýšenou expresi transglutaminázy 1, indikátoru diferenciace a zvýšené exprese ceramidů ve srovnání s neovlivněnými kontrolami.

Příklad 3

Tento příklad zkoumal účinek kumylalkoholu na příjem askorbátu v lidských keratinocytech. Získané výsledky jsou shrnuty v Tabulce 3.

Tabulka 3

vzorek	cpm/jamku	% kontroly	hodnota p	statistická významnost
kontrolní	13 355 ± 938	100	-	-
5% kumylalkohol	17 235 ± 398	129	< 0,05	ano

-18 • · · ·» · · · • · · · · ··· ··· ···· «· «

Z výsledků, uvedených v Tabulce 3, je zřejmé, že lidské keratinocyty, ovlivněné 5% kumylalkoholem v kukuřičném oleji, významně zvýšily příjem askorbátu ve srovnání s neovlivněnými kontrolními buňkami.

Příklad 4

Tento příklad zkoumal účinek kumylalkoholu na expresi transglutaminázy a produkci ceramidů. Získané výsledky jsou shrnuty v Tabulkách 4A a 4B.

Tabulka 4A

vzorek	TG-1 (absorb./DNA)	% kontroly	hodnota p	statistická významnost
kontrolní	12,73 ± 1,41	100	-	-
1 % kumylalkohol	16,17 ± 5,37	127	>0,05	ne
2,5% kumylalkohol	22,10 ±1,74	174	< 0,05	ano
5% kumylalkohol	26,05 ± 2,73	205	< 0,05	ano

Tabulka 4B

vzorek	ceramidy (ng^g bílkoviny)	% kontroly	hodnota p	statistická významnost
kontrolní	13,9 ± 3,6	100	-	-
1% kumylalkohol	12,5 ± 2,2	90	> 0,05	ne
2,5% kumylalkohol	19,4 ± 1,1	140	> 0,05	ne
5% kumylalkohol	41,5 ± 10,1	299	< 0,05	ano

• · • · ·

Z výsledků, uvedených v Tabulce 4A a 4B je zřejmé, že lidské keratinocyty ovlivněné kumylalkoholem, vykázaly významné zvýšení exprese transglutaminázy 1 a produkce ceramidů. Neaktivnost nižších koncentrací může být vysvětlena tak, jak je uvedeno v odstavci, který bezprostředně předchází uváděným Příkladům.

Příklad 5

Příklad 5 dokresluje místně podávané prostředky podle předkládaného vynálezu. Tyto prostředky mohou být zpracovávané běžným způsobem a jsou vhodné pro kosmetické použití. Zvláště jsou takové prostředky vhodné pro nanášení na vrásčitou, drsnou, šupinkovatou, zastárlou a/nebo ultrafialovým zářením poškozenou pokožku, a/nebo na suchou pokožku a na pokožku po menopauze pro zlepšení jejího vzhledu a pocitu z ní, stejně jako pro nanášení na zdravou pokožku k prevenci či pozdržení jejího poškození.

Emulze oleje ve vodě

přísada	% hmotnost/hmotnost
deionizovaná voda	do 100
karbomer	0,30
dvojsodná sůl EDTA	0,10
glycerin	3,00
Polysorbate 20	2,50
butylenglykol	2,00
methylparaben	0,30
triethanolamin 99%	0,30
kumylalkohol	2,00

isopropylmyristát	5,00
oktylpalmitát	3,00
cetylalkohol	1,00
Dimethicone, 100 cSt	0,50
včelí vosk	0,30
propylparaben	0,10
Germall II	0,10
0 v vune	0,10

EDTA = kyselina ethylendiamintetraoctové

Dimethicone = směs individuálních sloučenin na bázi dimethylpolysiloxanu, 100 cSt =1x10 ⁴m²s'¹

Polysorbate 20 = monostearát polyoxyethylensorbitanu Germal II = diazolidinylmočovina

Emulze oleje ve vodě

přísada	% hmotnost/hmotnost
deionizovaná voda	do 100
xanthanová guma	0,20
dvojsodná sůl EDTA	0,10
glycerin	5,00
butylenglykol	2,00
methylparaben	0,30
kumylalkohol	2,00
isopropylmyristát	5,00
oktylpalmitát	3,00

cetylalkohol	1,00
Dimethicone,100 cSt	0,50
steareth-2	0,40
steareth-21	3,00
včelí vosk	0,30
propylparaben	0,10
Germall II	0,10
vůně	0,10

steareth-2 = polyoxyethylen(2)stearylether steareth 21 = polyoxyethylen(21)stearylether

Emulze vody v oleji

přísada	% hmotnost/hmotnost
deionizovaná voda	do 100
dvojsodná sůl EDTA	0,10
glycerin	3 ,00
prop ylenglykol	2,0 0
chlorid sodný	0,70
methylparaben	0,30
Cyclomethicone	14,00
kumylalkohol	2,00
isopropylmyristát	5 ,00
oktylpalmitát	3,00
Dimethicone Copolyol, 100 cSt	2 ,50
Dimethicone, 100 cSt	0,50

včelí vosk	0,30
propylparaben	0,10
Germall II	0,10
vůně	0,10
celkem	100,00

Cyclomethicone = tetra- nebo pentamerní těkavý silikon, působící jako perspirant

Hydrogel

přísada	% hmotnost/hmotnost
deionizovaná voda	do 100
butyl englykol	5 ,00
PPG-5-c eteth 20	5,00
glycerin	3 ,00
karbomer	1,2 0
triethanolamin 99%	1,20
kumylalkohol	2,00
methylparaben	0,30
Polysorbate 20	0,25
dvojsodná sůl EDTA	0,10
Germall II	0,10

PPG-5-ceteth 20 = polypropylenglykol-5-polyethylenglykolový derivát cetylalkoholu

-23 Bezvodé sérum

přísada	% hmotnost/hmotnost
Cycomethicone	do 100
kumylalkohol	1,00
isopropylmyristát	5,00
oktylpalmitát	3,00
polyglycerol-6-dioleát	5,00
butylenglykol	4,00
Dimethicone, 100 cSt	0,50
včelí vosk	0,30
propylparaben	0,20
vůně	0,10
celkem	100,00

Hydroalkoholový gel

přísada	% hmotnost/hmotnost
deionizované voda	do 100
alkohol SDA40B	30,00
butylenglykol	5,00
PPG-5-ceteth 20	5,00
glycerin	3,00
karbomer	1,20
triethanolamin 99%	1,20
kumylalkohol	1,00

methylparaben	0,30
Polysorbate 20	0,25
dvojsodná sůl EDTA	0,10
Germall II	0,10

Bude zřejmé, že specifické formy vynálezu zde ozřejměné a popsané jsou zamýšleny pouze jako příkladné ukázky. V dokreslujících ztělesněních mohou být bez toho, že by vybočily z jasných obrysů objevu, provedeny změny, včetně těch, které jsou v tomto popisu popsány, aniž by se však na ně omezovaly. Pro stanovení plného rozsahu vynálezu je tedy třeba zmínit následující připojené patentové nároky .

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kosmetický prostředek pro péči o pokožku, vyznačující se t í m , že obsahuje:

(a) od 0,001 do 50 % hmotnostních solubilizovaného kumylalkoholu o vzorci I (b) glukózu, kyselinu askorbovou, nebo sloučeninu, o níž je známo, že se v pokožce štěpí na glukózu nebo kyselinu asdkorbovou; a (c) kosmeticky přijatelné vehikulum.
2. Kosmetický prostředek pro péči o pokožku podle nároku 1, v y značující se tím, že dále obsahuje sloučeninu askorbátu, zvolenou z kyseliny askorbové, askorbylpalmitátu, askorbylstearátu, askorbyltetraisopalmitátu, askorbylfosforečnanu hořečnatého, askorbylmonofosforečnanu sodného a polýpeptidů kyseliny askorbové.
3. Kosmetický prostředek pro péči o pokožku podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje sloučeninu glukózy, zvolenou z glukózy, glukosaminu, glutamátu glukózy, galaktózy, laktózy, sacharózy a glukózofosfátových esterů.
4. Kosmetický prostředek pro péči o pokožku podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že prostředek je emulzí typu oleje ve vodě a kumylalkohol je solubilizován v olejové fázi.

-265. Kosmetický způsob ovlivnění zestárlé, působením světla zestárlé, suché, zbrázděné nebo vrásčité pokožky, vyznačující se t í m, že zahrnuje nanášení prostředku podle kteréhokoli z předcházejících nároků na pokožku.
6. Kosmetický způsob zlepšení bariérového působení pokožky, vyznačující se tím, že zahrnuje nanášení prostředku podle kteréhokoli z předcházejících nároků na pokožku.
7. Kosmetický způsob zlepšení diferenciace keratinocytů, v y značující se tím, že zahrnuje nanášení prostředku podle kteréhokoli z předcházejících nároků na pokožku.
8. Kosmetický způsob zlepšení produkce tuků keratinocyty, v y značující se tím, že zahrnuje nanášení prostředku podle kteréhokoli z předcházejících nároků na pokožku.
9. Kosmetický způsob zlepšení příjmu glukózy keratinocyty, v y značující se tím, že zahrnuje nanášení prostředku podle kteréhokoli z předcházejících nároků na pokožku.
10. Kosmetický způsob zlepšení příjmu askorbátu keratinocyty, vyznačující se tím, že zahrnuje nanášení prostředku podle kteréhokoli z předcházejících nároků na pokožku.