CZ20003192A3 - Sekvenční třída homeoboxních genů PALE, izolovaná sekvence DNA, homeodoménový protein, použití homeoboxního genu, použití sekvence DNA, použití homeodoménového proteinu, transgenní vláknitá rostlina a způsob její přípravy - Google Patents

Abstract

Vlastnosti vláknitého materiálu mohou být modifikovány již v průběhu růstu rostliny prostřednictvím začlenění nového homeoboxního genu. Pozornost je zaměřena na expresi homeoboxních genů v kambiální vrstvě vláknitých rostlin, konkrétně ve vrstvě vláknitých rostlin, konkrétně ve vrstvě zrání xylému, během sekundárních fází vývoje cév u vláknitých rostlin. Spolu s novou třídou homeoboxních genů je poskytována nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence pro pět genů ze tři různých rostlinných druhů, náležejících do této sekvenční třídy.

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se vztahuje k modifikaci vláknitého surového materiálu, např. vláknitého surového materiálu ve formě vláknitých rostlin, ještě před jeho sklizením. Specifičtěji se předmětný vynález zabývá expresí homeoboxních genů ve vrstvě kambia vláknitých rostlin. Konkrétně se předmětný vynález zabývá expresí homeoboxních genů ve vrstvě, kde dochází ke zrání xylému, během sekundárních fází vývoje cév vláknitých rostlin. Je odhalena nová třída homeoboxních genů, nukleotidová sekvence a odvozená aminokyselinová sekvence a to pro pět genů ze tří různých rostlinných druhů, patřících do zmíněné sekvenční třídy.

Dosavadní stav techniky

V různých druzích dřeva následuje po primárním růstu, spojeném s prodlužováním výhonku a kořene, sekundární růst, kdy dochází následkem aktivity cévního kambia k nárůstu radiální šířky xylému a floému. Tento meristem je podobný apikálním meristemům výhonku a kořene v tom, že rovněž vykazuje vysoce regulované průběhy buněčného dělení, přičemž jednotlivé odvozené buňky mají specifické vývojové osudy. Liší se však od terminálních meristemů co se týče původu, pozice, histologie a cytologie.

Cévní kambium se diferencuje z prokambia, ačkoliv může také vzniknout v kalusu. Prokambium je částečně diferencovaná tkáň, která se vyvíjí v embryu a je zvěčněna ve vrcholu výhonku, kde je spojena s počátkem listu. Označení této meristemové vrstvy se v konkrétní části stonku, poté co se zastaví prodlužování, mění z prokambia na vaskulámí kambium. V každém cévním svazku tedy dochází k postupné basipetální přeměně prokambia na cévní kambium, přičemž prokambium a cévní kambium jsou považovány za stejné meristemy ve dvou fázích vývoje. Vztah prokambium-cévní kambium je spojen s postupnou změnou charakteristik jak buněčných složek tak i odvozených prvků xylému a floému. V příčném řezu jsou prvními deriváty prokambia protofloém a protoxylém, které se diferencují v prodlužujících se částech výhonku. Dále jsou produkovány metaxylém a metafloém, které se diferencují v části výhonku zejména poté, co je ukončeno prodlužování. Následně jsou produkovány deriváty cévního kambia a tyto buňky se diferencují na sekundární floém nebo xylém. Cévní kambium, které se vyvíjí v cévních svazcích, je označováno svazkové kambium. Po jeho vzniku dochází k periklinálnímu dělení v parenchymatických buňkách, sousedících s každým cévním svazkem, které je jasně indukováno podnětem, pocházejícím ze svazkového kambia. Vznikající mezisvazkové kambium se příčně spojuje se svazkovými a mezi svazkovými kambii sousedních svazků za vzniku spojitého kruhu cévního kambia. Cévní kambium je vysoce regulovaná dynamická populace částečně diferencovaných buněk, které se mohou rozdělit ve třech rovinách a jejichž deriváty se diferencují do řady genotypově specifických buněčných typů, obsahujících dvě velmi odlišné tkáně floém a xylém.

Testování různých buněčných linií v příčných řezech sekundárního xylému a floému stonku prozrazuje, že jednotlivé radiální nitky vykazují změny, jako je zdvojení nebo zmizení, které se vyskytují současně na obou stranách cévního kambia. Tato shoda může vyplývat pouze z aktivity dělení v běžné kambiální buňce, označené jako iniciála. Po periklinálním rozdělení iniciály si jedna z dceřiných buněk ponechává charakteristiky iniciály, zatímco jiná se stává mateřskou floémovou buňkou nebo mateřskou xylémovou buňkou a to v závislosti na straně kambia. Mateřská buňka se buď diferencuje přímo nebo se dělí periklinálně jednou nebo vícekrát a všechny vznikající dceřinné buňky se poté diferencují.

Na xylémové straně kambia probíhá v několika fázích celý proces od prvního rozdělení kambiální iniciály až po konečný vývoj mnoha možných zralých typů xylémových buněk. Na základě anatomických pozorování je možno tyto fáze rozdělit na dělící vrstvu, kde pokračuje dělení xylémových mateřských buněk, na expanzní vrstvu, kde se odvozené buňky zvětšují na svou konečnou velikost, na vrstvu zrání, kde dochází k lignifikaci a sekundárnímu tloustnutí buněčné stěny a nakonec na vrstvu programované buněčné smrti, kde jsou ukončeny všechny buněčné procesy. U stromů je o molekulární regulaci procesu xylogeneze, který je základem pro tvorbu dřeva, známo poměrně málo.

Dřeviny zajišťují materiály, které mají velký ekonomický význam např. dříví a papír a pokud jde o současný problém, související s rostoucí hladinou oxidu uhličitého, reprezentují významný zásobník uhlíku. Pochopení regulace dělení kambiální buňky a diferenciace odvozených buněk otevře možnosti pomocí genové technologie pozměňovat vývojový osud derivátů již během jejich vzniku. S tímto přístupem bude možno například modifikovat ve vláknech a cévách tvrdého dřeva a v tracheidách měkkého dřeva vlastnosti jako pevnost, tloušťku buněčné stěny, flexibilitu, homogenitu a povrchové vlastnosti.

Na základě mnoha vývojových studií, které byly provedeny u zvířat, hmyzu, červů a také u rostlin, je známo, že během vývoje vzájemně působí v komplexní cestě několik různých regulačních cyklů. Molekulární signály různých typů jsou různě zapínány a vypínány, jsou indukovány vzájemným kontaktem buňky s buňkou, vzájemnou pozicí buněk, vlivem prostředí, nutričním stavem a/nebo jinými dalšími podněty. Avšak všechny regulační kroky v zásadě pracují prostřednictvím změny celkového průběhu exprese genu vjednotlivé buňce. Tohoto je dosaženo střídavě změnou aktivity klíčových genů, kódujících transkripční faktory, které zapínají nebo vypínají vývojové cesty, čímž dochází ke spuštění kaskády sekundárních jevů a alternativních cest.

Je tedy naléhavě třeba nalézt praktické způsoby jak regulovat růstovou rychlost a fyzikální a chemické vlastnosti vláknitého surového materiálu stejně tak jako jsou potřeba nové rostliny, které mají v tomto ohledu zlepšené vlastnosti.

WO 92/17597 odhaluje rekombinantní promotory, uplatňující se při ovlivnění exprese, specifické pro xylém, u rostlin. Zmíněné promotory jsou výhodněji odvozené od fenylalaninamoniumlyázového promotoru nebo jsou homologní kRCRl nebo PCR2. Avšak odhalený rekombinantní promotor nepřenáší sám o sobě žádnou genetickou informaci, související s procesem diferenciace buňky.

V „Xylogenesis, genetic and environmental regulation - a review“ (IAWA Journal, Sv. 17, č. 3, 1996, str. 269 až 310) se autor dotýká homeoboxních genů a dochází k závěru, že „regulace transkripce/translace homeoboxního genu a následná produkce homeodoménových proteinů je jedním mechanismem morfogenetické kontroly.“ Autor dále konstatuje, že „výzkum domnělých homeodoménových proteinů a homeotických genů udržuje další naději na vyřešení problému kambiálních iniciál.“

Kromě těchto obecných tvrzení si autoři vynálezu nejsou vědomi jakéhokoliv jiného stavu techniky, který by zaváděl odborníky vdané oblasti techniky do směru předmětného vynálezu, který je představován specifickým a praktickým přípustným přístupem k modifikaci vláknitého surového materiálu před jeho sklizením. Problém, který je podkladem pro vynález a který je prezentován v části „Dosavadní stav techniky“ zůstává nevyřešený.

Podstata vynálezu

Výše uvedený problém je řešen prostřednictvím vynálezu, který je odhalen v připojených nárocích. Autoři předmětného vynálezu identifikovali klíčové geny nebo de facto zcela novou třídu těchto genů a uvedli je do praktického použití. Předmětný vynález odhaluje novou třídu homeoboxních genů, vybraných z předcházejících známých tříd, které ovlivňují buněčnou

·· · ·· diferenciaci a růst vláknitých rostlin. Předmětný vynález dále činí dostupnými nové transgenní rostliny a technické způsoby jejich produkce.

Řada studií ukázala rozhodující roli homeoboxních (HB) genů v regulaci obrovské rozmanitosti buněčných a vývojových procesů, jako jsou např. prostorové uspořádání, lokalizace, stanovení buněčné smrti a buněčná diferenciace, v eukaryotických organismech od kvasinek po člověka. Od prvního objevu HB genů se počet identifikovaných genů, které nesou HD motiv, neustále zvyšovál, čímž je zdůrazněn velký význam této třídy genů ve všech studovaných biologických systémech.

HB je semikonzervativní sekvence DNA o přibližně 180 párech bází (bp), nalezená v kódující oblasti HB genů, kódujících 60 aminokyselinový (aa) homeodoménový (HD) motiv. Byla provedena NMR a rentgenová krystalografie několika HD domén. Z těchto studií lze učinit závěr, že ačkoliv primární aa sekvence HD může být v případě různých genů poměrně odlišná, sekundární struktury jsou pozoruhodně podobné a skládají se z pohyblivého N-koncového raménka po němž následuje struktura helix-smyčka-helix-ohyb-helix. Různé HD domény mají tedy s nejvyšší pravděpodobností velmi podobnou trojrozměrnou strukturu.

Jestliže je jako kritérium použita 55 až 60% podobnost, pak lze sekvence HD rozdělit do alespoň 30 různých tříd. Některé z těchto tříd byly zahrnuty do společných supertrid jako jsou HEX, PRX a TALE. Některé třídy HB jsou dále rozděleny do rodin. Nejpodstatnějším kritériem pro zařazení nového genu do supertridy HB genů, do třídy nebo rodiny, je samotná struktura HD, vzhledem k jejím důležitým funkčním aspektům zejména v interakci protein/DNA. V mnoha případech jsou však domény vně HD konzervativní a jsou také používány pri určování jednotlivých HB genů. Rovněž i u rostlin se seznam popsaných HB genů velmi rychle zvětšuje. Tyto geny se spíše odlišují a v současné době spadají do čtyř odlišných tříd HB jmenovitě HDZIP, HD-KN (KNOX), HD-BELL a PHD-finger (Obr.2C). Třída HD-ZIP byla dále rozdělena do čtyř rodin, jmenovitě HD-ZIP I, Π, ΙΠ a IV.

Dva HB geny, identifikované autory vynálezu, byly označeny jako PttHBl a PttHB2. Pri srovnání se členy všech známých tříd HB genů vykazovaly PttHB pouze 47% aa identitu s nejbližší HD, DANF genem ze zebrovité ryby („Zebra fish“). Odvozené proteiny, kódované geny PttHB, dále neobsahují vně HD žádné jiné charakteristické motivy, které by připomínaly jakýkoliv jiný HB gen a mezi helixem jedna a dvě vykazují zvláštní 5 aa prodloužení smyčky. 5 aa inzert řadí sekvenci PttHB do konkrétní podskupiny HB genů, které mají v HD více nebo méně než 60 aa. Několik dřívějších studií ukázalo, že tyto aa jsou umístěny buď mezi helix 1 a 2 nebo mezi helix 2 a 3. Z této podskupiny se nedávno vyvinula nová supertrida HB genů, • «· · · · · · · · • · · ···· ··· označená z důvodu tří aminokyselinového prodloužení smyčky jako TALE. Jak jméno naznačuje, geny této supertřídy mají vHD tři extra aa, začleněné mezi helix 1 a 2. Do této supertřídy spadají také například rostlinné HB třídy KNOX a BELL. Avšak 5 aa prodloužení nebylo dosud pozorováno v žádném HB genu. Autoři předmětného vynálezu tudíž předpokládali, že PttHB geny jsou prvními členy nové třídy, která byla předběžně pojmenována PALE a to z důvodu 5 aa prodloužení smyčky. Protože bylo objeveno více genů, patřících do této skupiny, je možné, že také PALE se ukáže jako supertřída.

Když byly aa sekvence PttHB porovnány s HD doménou 34 HB genů z rostlin, včetně členů všech čtyř HB tříd, bylo zřejmé, že nejbližší rostlinný gen, HAT2, patřící do třídy HD-ZIPII, má ještě nižší identitu s aa sekvencemi PttHB než PRX2 nebo 35% (obr. 2B a 2C). Dále, když byly ve vývojové analýze porovnány HD v PttHB genech se stejnými rostlinnými geny, bylo očividné, že PttHB geny hybridní osiky tvoří rostlinnou HB třídu sebe samých (obr. 2D). Tato třída je tedy vývojově odlišná od čtyř dříve popsaných rostlinných HB tříd, které je také možno nalézt na obr. 2D. Jestliže byly zahrnuty v analýzách proteinové sekvence vně HD (obr. 2E) (data nejsou uvedena), byly mezi sekvencemi PttHB a dříve popsanými rostlinnými HB třídami potvrzeny rovněž příbuzné vývojové rozdíly. Dále autoři předmětného vynálezu dospěli k závěru, že PttHB geny hybridní osiky jsou prvními popsanými příklady nové třídy HB genů. Tato třída má 5 aa prodloužení smyčky, které většinou obsahuje aa QKIK motiv mezi helixem 1 a helixem 2, ITXE motiv v helixu 2, poněkud a někdy přerušující tuto strukturu a WTP motiv v N-koncovém raménku HD.

Výběry HB genů s 5 aa prodloužením smyčky mezi helixem 1 a helixem 2 v genomických databázích a PCR s použitím primerů z PttHB2 sekvence odhalily, že členové třídy PALE, kteří splňují výše uvedená kriteria, jsou skutečně přítomny v Arabidopsis a Pinus radiata (obr. 2E).

Studie exprese odhalily, že dva PttHB geny hybridní osiky jsou rozdílně regulovány (obr. 4 a 5). Gen PttHB 1 zobrazoval tkáňově specifickou expresi, aktivní ve vrstvě zrání xylému kambiální oblasti. Gen PttHB2 byl naopak aktivní v dřívějších vývojových fázích na obou stranách kambia stejně tak jako v kambiu samotném (obr. 4 a 5).

Autoři předmětného vynálezu překvapivě identifikovali, izolovali a charakterizovali cDNA sekvence podobné HB, izolované z knihovny kambiální cDNA z tvrdého dřeva Populus tremula x tremuloides. Dále také izolovali podobné DNA sekvence podobné HB z měkkého dřeva Pinus radiata a z jednoleté modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Tyto cDNA a sekvence nespadaly do žádné drive popsané třídy HB sekvencí z jakéhokoliv systému, čímž vznikla nová třída HB sekvencí, která byla tvořena jimi samotnými. Dále je tato sekvenční třída • ··· · · · · • · · · · · · vývojově vzdálenější rostlinným HB genům než zvířecím HB genům. Jedna z cDNA je specificky exprimována ve fázi xylogeneze, kdy je zahájena tvorba sekundárního vlákna. Uvedená data naznačují, že tato cDNA je zahrnuta do regulace tohoto sekundárního vývoje. Důsledky těchto objevů v souvislosti s molekulární regulací tvorby dřeva jsou rozsáhlé.

Přehled obrázků ve výkresech

Předmětný vynález je detailněji popsán níže s odkazy na připojené příklady a obrázky, ve kterých:

Obr. 1 ukazuje sekvenci DNA a odvozenou aminokyselinou sekvenci PttHBl. Aminokyseliny jsou uváděny pomocí jednopísmenného kódu pod nukleotidovou sekvencí. Číslo naznačuje počátek a konec translace. Zbytky, reprezentující homeodoménu (HD), jsou ohraničeny rámečkem. Možné otevřené čtecí rámce na 5'vedoucí sekvenci, předcházející iniciačnímu kodónu, jsou naznačeny kurzívou a domnělé signály o jaderné lokalizaci jsou podtrženy.

Obr. 2 ukazuje vzájemné porovnání aminokyselinové sekvence HD PttHBl a PttHB2 sHD sekvencemi z odlišných organismů. Horizontální silné čáry nad sekvencemi naznačují pozice tří helixů vHD. Identické aminokyseliny jsou vystínovány černě, podobné zbytky jsou vystínovány šedivou barvou a nekonzervativní aminokyseliny nejsou vystínovány. Mezery v sekvenci jsou naznačeny tečkami.

A. HD PttHBl a PttHB2. Velmi konzervativní aa jsou označeny plnými trojúhelníky a jaderné hydrofobní aa písmenem H (vysvětlení viz text)

B. Nejbližší HD z jakéhokoliv organismu

C. 34 vybraných rostlinných HD, reprezentujících všechny 4 rostlinné HB třídy

D. Fylogenetický strom HD ze stejných 34 rostlinných HB genů plus HB geny hybridní osiky.

E. Porovnání celé aa sekvence PttHBl s odpovídající sekvencí z PttHB2, AtPALEl, ATPALE2 a PrPALE 2 HD.

(Přístupová čísla: DANF, sptrembl | P79738 |; PRX2_chicken, sptrembl 1090963 |; hatarath, swiss P46603; ht22_arath, swissP46604; htl4_arath, swissP46665; hatlarath, swiss P46600; hat2_arath, swiss P46601; hat4_arath, swissQ05466; hat3_arath, swiss P46602; chb3_carrot, pironly | s519271; hat5_arath, swissQ02283; ath5_arath, swiss P46667; athó arath, hať7_arath, swiss Q00466; ath7_arath, swiss P46897; atmll, EMBL AT37589; o39, EMBL U34743; hgl2_arath, swiss P46607; athb-8GN, EMBL Z50851; bělil, EMBL U39944; athlarath, swiss ·04·

0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 0 4 999 000·

0 00 000 00 0 0 990 0000

004 ·0 00 00

Ρ48731; kna3_arath, swiss P48000; kna4_arath, swiss P48001; kna5_arath, swiss P48002; hdlbrana, swiss P46606, atkl, EMBL X81353; kna2_arath, swiss P46640; stm, EMBL AT32344; hmblsoybn, swiss P46608; hknlmaize, swiss P24345; oshlorysa, swiss P46609; knalarath, swiss P46639; ht31_arath, swiss Q04996; prh_petcr, swiss P48786; hxlamaize, swiss P46605; prharath, swiss P48785.)

Obr. 3 ukazuje hybridizaci pomocí Southern blotu s cílem demonstrovat přítomnost sekvencí podobných PttHB v rostlinné říši.

(A) Chromozomální DNA, izolovaná z hybridní osiky, byla naštěpena restrikčními enzymy jako je to naznačeno a stejný filtr byl označen buď próbou, odpovídající 3'části PttHB 1 nebo próbou, odpovídající celé sekvenci PttHB2. Filtry byly hybridizovány a promyty za stringentních podmínek.

(B) Vlevo je stejný filtr jako na obr. 4A. Vpravo je filtr, obsahující chromozomální DNA z kukuřice, Arabidopsis, tabáku, kávy a Norského smrku, naštěpenou EcóPA. Oba filtry byly hybridizovány použitím próby, odpovídající celé sekvenci PttHB 1 a byly promyty v porovnání s (A) za méně stringentních podmínek.

Zkratky:E; EcoRI, B; TtowHl, H; HindlAl a Ev; EcoRV.

Zm; Zea maize, At; Arabidopsis thaliana, Nt; Nicotiana tabaccum, Ca; Coffea arabicum, Pa; Picea abies.

Obr. 4 ukazuje hybridizaci pomocí Nothem blotu s cílem demonstrovat expresi PttHB 1 a PttHB2 v rostlinách hybridní osiky. Celková RNA hybridní osiky, izolovaná z různých rostlinných tkání, což je naznačeno, byla za stringentních podmínek hybridizována buď s próbou, odpovídající celé sekvenci PttHBl, s próbou, odpovídající celé sekvenci PttHB2 nebo s aktinovou próbou z P. trichocarpa. Odhadnuté velikosti (v bázích) detekovaných přepisů, vypočítané ze standardů velikosti, které byly použity spolu se vzorky RNA, jsou naznačeny vpravo.

R; kořen, X; diferencující se xylém, P; diferencující se floém, B; kůra a L; list.

Obr. 5 ukazuje expresi PttHBl a PttHB2 v kmeni hybridní osiky.

(A) Obrázek, získaný pod mikroskopem s optikou Nomarski, ukazuje různé vývojové vrstvy kambiální oblasti kmene (stonku) hybridní osiky. Tkáňové vzorky, izolované sekcionováním a použité pro izolaci mRNA, jsou naznačeny dole jako Cl; C2; C3 a C4. Tyto vrstvy vzorku odpovídají diferencujícímu se floému (Ph), kambiální vrstvě (Cz), zvětšujícímu se xylému (EZ) a zrajícímu xylému (MZ). Horizontální silné čáry naznačují délku vývojových a sekcionovaných vrstev.

• 4· · • · · · · · •4 4 ·· · · * · « · • · 4 4 · 4 4 · ♦ • 4 4 ····#·♦· ··· ······· • · · · · ··· · 4 4 · 4 · (Β) Exprese PttHBl a PttHB2 v kambiální vrstvě hybridní osiky, jak byla zjištěna po amplifíkaci mRNA PCR, izolaci postupem, uvedeným na obr. 5 a analýze hybridizace Southern blotem. Použité próby PttHBl &PttHB2 byly stejné jako v případě obr. 4.

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Rostlinný materiál

Materiál byl získán z rostlin hybridní osiky (Populus tremula x tremuloides), které byly

1,5 až 3 m vysoké. Byly pěstovány ve skleníku pod přirozeným světlem, doplněným kovovými halogenovými lampami, které poskytovaly hustotu proudu fotonů 150 pmol/m²/s, s fotoperiodou 18 h a při teplotě asi 22/15 °C (den/noc). Rostliny byly zalévány denně a jednou týdně byly hnojeny kompletním vyživujícím roztokem, obsahujícím 100 mg dusíku na 1 litr. Materiál, používaný pro tvorby knihovny, byl však izolován z rostlin, které byly pěstovány za více standardizovaných podmínek a to v místnosti s kontrolovaným prostředím, s hustotou proudu fotonů 240 pmol/m²/s (kovové halogenové lampy Osram HQI-TS 400 W/DH), s fotoperiodou 18 h, teplotou 20/10 °C (den/noc) a relativní vlhkostí přibližně 70 %. Tyto rostliny byly rovněž zalévány kompletním vyživujícím roztokem, obsahujícím 100 mg na 1 litr.

Rostlinná tkáňová kultura a genetická transformace

Aby byla získána výchozí sterilní tkáňová kultura pro genetickou transformaci, byly kousky kořenů hybridní Populus tremula x tremuloides zasazeny do vlhké rašeliny a tvorba výhonku byla indukována podmínkami ve skleníku (přirozená fotoperioda byla prodloužena na požadovaných 18 h pomocí kovových halogenových lamp, které poskytují hustotu proudu fotonů 150 pmol/m²/s, teplota den/noc byla 23/16 °C a relativní vlhkost alespoň 50 %). Výhonky 100 až 200 mm velké byly povrchově sterilizovány po dobu 10 min. v 0,1% HgCh a třikrát propláchnuty ve sterilní vodě. Části 15 mm dlouhé byly odstřiženy od stonku, pokud možno bez uzlů a s cílem zahájit tvorbu výhonků byly umístěny na pevné médium, zde označované jako MSI, které obsahovalo 0,1 pg/ml kyseliny indol-3-máselné (Π3Α), 0,2 pg/ml 6benzylaminopurinu (BAP) a 0,001 pg/ml thidiazuronu (TDZ; N-fenyl-N-1,2,3thidiazolmočovina). Kultury byly kultivovány v místnosti s kontrolovaným prostředím pri ♦ ·< ·

♦ » 2 v r teplotě 25 °C, fotoperiodě 16 h a intenzitě světla 40 μΕ/m /s, dosažené pomocí fluorescenčních lamp, poskytujících studené bílé světlo. Když byly výhonky asi 5 mm dlouhé, byly kultury převedeny na MS2 médium (MS 1 médium bez TDZ), aby bylo podpořeno prodloužení výhonků. Poté co délka výhonků dosáhla 6 cm, byly buď použity pro transformaci (viz níže) nebo u nich byla indukována tvorba kořenů a to tím, že byly převedeny na MS3 médium (MS médium o poloviční síle a bez hormonů). Zakořeněné výhonky byly umístěny do květináče s rašelinou, byly zakryty plastikovým sáčkem a umístěny do skleníku. Sáček byl po týdnu provětrán a po dalším týdnu byl zcela odstraněn.

DNA byla do rostlin začleněna transformací pomocí Agrobacterium. Čerstvé kultury buněk A. tumefaciens byly učiněny elektrokompetentními pomocí růstu v YEB médiu (0,1% kvasničný extrakt, 0,5% hovězí extrakt, 0,1% pepton, 0,5% sacharóza a 2 mM MgSO₄). Poté, co absorbance při vlnové délce 595 nm dosáhla hodnoty 0,5, byly buňky třikrát promyty v destilované vodě a resuspendovány v 10% glycerolu na koncentraci asi 10⁹ buněk/ml. Kompetentní buňky byly skladovány při -70 °C.

Buňky byly poté rozmraženy v ledu a alikvotní podíly o objemu 50 μΐ byly smíchány s 50 ng vektorové DNA. Do směsi byl přiveden impuls (Gene Pulser, BioRad) při 2 kV, 25 μΡ a 200 ohm. Buňky po elektroporaci byly bezprostředně převedeny do regeneračního média (YEB obohacené 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl₂ a 10 mM MgSO₄). Po inkubaci při 28 °C po dobu 2 h byly transformované buňky umístěny na pevné YEB médium, obsahující 100 pg/ml rifampicinu, 100 μβ/ml karbenicilinu a 25 μg/ml kanamycinu a byly inkubovány 24 až 48 h při 28 °C. Jednotlivé kolonie byly rozčárkovány na čerstvé selektivní médium.

Aby byla zjištěna integrita přeneseného binárního vektoru, bylo provedeno zpětné křížení s E. coli. Jednotlivé kolonie Agrobacterium byly kultivovány do absorbance při 595 nm 0,5. Kultura E. coli kmen DH5a, kultivovaná přes noc, byla rozetřena na misky sLA médiem, obsahujícím 100 pg/ml karbenicilinu. Misky byly ponechány 5 min, aby se usušily a poté byly na vrstvu buněk E. coli naneseny čerstvé buňky Agrobacterium. Misky byly inkubovány 6 h při 28 °C, poté byly přemístěny do 37 °C, kde byly ponechány přes noc. Malé kolonie buněk A. coli se poté objevily uvnitř skvrn Agrobacterium. Tyto kolonie E. coli byly rozčárkovány zpět na LA misky, obsahující karbenicilin. Z těchto buněk byly izolovány plasmidy, které byly fyzikálně zmapovány pomocí restrikčních enzymů.

Buňky Agrobacterium, nesoucí binární plasmidy, obsahující PALE HB geny v sense a anti-sense orientaci, byly kultivovány v YEB médiu, doplněném karbenicilinem o koncentraci 50 μg/ml a kanamycinem o koncentraci 25 μg/ml, při teplotě 25 °C a po dobu asi 24 h. V okamžiku, kdy absorbance při 595 nm dosáhla hodnoty 0,2 až 0,6, byly kultury odstředěny 10 ♦ ··· • φ · · · · • · · · · ···· • ·«· *»·« • « · · ··· · · * • · ··· · · · » • ·· ··· ·· ·· ·♦ min. při 3000 rpm, resuspendovány v MS médiu, obsahujícím 20 μΜ acetosyringon a byly kultivovány při 28 °C 1 h za mírného třepání. Acetosyringon byl aplikován pro zvýšení účinnosti přenosu genu mezi Agrobacterium a rostlinnou buňkou.

Části stonku hybridní osiky byly 0,5 až 2 h kultivovány současně sA. tumefaciens v kapalném MS médiu a poté byly převedeny do MSI média. Po inkubaci 48 h ve tmě, byly segmenty dvakrát promyty ve sterilním cefotaximu o koncentraci 500 pg/ml a umístěny na světle na MS médium, obohacené cefotaximem o koncentraci 250 pg/ml a buď kanamycinem o koncentraci 60 pg/ml nebo hygromycinem o koncentraci 15 μg/ml a to v závislosti na vektoru, který byl použit pro přenos genu. Po zahájení tvorby výhonku byly segmenty převedeny do MS2 média, obsahujícího stejná antibiotika, s cílem podpořit prodlužování. Tvorba kořenů byla iniciována převedením kultur do MS3 média. Zakořeněné výhonky byly umístěny do skleníku v květináči o objemu 1,5 1, které byly naplněny přihnojenou rašelinou. Poté co byla rašelina důkladně zalita, byly rostliny zakryty plastikovým sáčkem. Během aklimatizace bylo vyloučeno přímé vystavení umělému nebo slunečnímu světlu. Po asi 1 týdnu byl sáček provětrán a poté byl asi po 2 týdnech zcela odstraněn. Časování aklimatizačního procesu bylo v jednotlivých případech upravováno podle síly rostlinky.

Příprava a testování cDNA knihovny

Materiál z kambiální vrstvy, obsahující buňky floému, kambiální vrstvu a diferencující se xylém, byl získán tak, že byla odloupnuta kůra a vnitřní vrstvy odloupnuté kůry a vnější vrstva odhaleného xylému byly skalpelem seškrábány. Oba seškrábané podíly obsahovaly vlákna. Z odřezků kambia byla podle návodu od výrobce pomocí magnetických oligo (dT) kuliček (Dynabeads®Oligo(dT) 25 Dynal A.S., Oslo, Norway) izolována póly (A) RNA. Byla vytvořena Lgt22a cDNA knihovna (Superscript™ Lambda System for cDNA Synthesis and Cloning, Gibco BRL, Gaithersburg, USA) a byla zabudována do λ-ěástic opět podle návodu od výrobce (Gigapack II Gold, Stratagen, La Jolla, USA). Jako bakteriální hostitel byla použita E. coli Y1090r. Komplexnost získané knihovny byla 900 000 pfu. Knihovna byla jednou amplifíkována na miskách a 200 000 pfu amplifikované knihovny bylo testováno plakovou hybridizací s degenerovaným oligonukleotidem, označeným HB2, (5'-TGG TTY CAR AAY MGN MG-3'), který rozpoznává konzervativní helix 3 homeoboxních genů. Oligonukleotid byl označen na 5' konci T4 polynukleotidkinázou pomocí [γ-³²Ρ] ATP, 5000 Ci/mmol (Amersham) (Gibco BRL) a byl přečištěn na koloně Sephadex G-50 (Pharmacia, Sollentuna, Švédsko). Poté byl proveden otisk plaku, postup je popsán výrobcem (Hybond-N, Amersham). Filtry z prvního výběru byly

0

0

000 0

0 0 *

0 0 0

0 0 0

00

0 00 promyty 5 x 20 min. při laboratorní teplotě v 6 x SSC + 0,05% pyrofosfát sodný, zatímco filtry z druhého a třetího výběru byly promyty ve stejném pufru jako je popsáno v Burlin a kol., ale při 50 °C. DNA z přečištěných fágů byla amplifikována PCR s použitím universálních primerů (Lambda gtl 1 Forward and Reverse, Promega, Madison, USA), přesahujících cDNA inzert. Produkty PCR byly přečištěny na gelu a sekvenovány pomocí primeru Lambda gtl 1 Forward.

Sekvenování a subklonování DNA

Dvě vybrané cDNA byly subklonovány do klonovacího vektoru pOK12 do míst, vzniklých štěpením NofíJEcóBA &Noi\JSaR. Všechny přítomné cDNA byly sekvenovány na obou řetězcích metodou dideoxynukleotidové řetězové terminace s použitím systému ABI PRISM (Perkin Elmer, Warrington, Velká Británie).

Hybridizace Southern blotem

Chromozomální DNA ze všech sledovaných rostlinných druhů byla izolována z mladých listů. 10 pg genomické DNA bylo naštěpeno EcdBI, BcmňS., HindlU a EcoKV, byla provedena separace na 1% agarozovém gelu a blotování na nylonové filtry (Hybond-N) pomocí vakuového blotovacího zařízení (VacuGene XL, Pharmacia LKB, Švédsko). Ve druhém experimentu, zahrnujícím Southern blot, bylo naštěpeno 15 pg DNA z Norského smrku, 5 pg z kávy, 5 pg z kukuřice a 2 pg z Arabidopsis thaliana restrikčním enzymem EcoBA a byly zpracovány stejně jako je uvedeno výše. Próby byly izolovány jako 3' fragment PítHBl po naštěpení SacUNotl o velikosti 620 bp, fragment, odpovídající celé sekvenci PítHBl po naštěpení NotUEcoRA o velikosti 1100 bp a fragment, odpovídající celé sekvenci PttHB2 po naštěpení NoťUSaR o velikosti 1200 bp. Ty byly označeny y³²P-dATP pomocí reakce, běžně používané pro značení. Hybridizace Southern blotem byly provedeny v Churchově pufru při teplotě 65 °C nebo příležitostně při 50 °C z důvodu nízké stringentnosti. Závěrečná promytí byla prováděna v 0,1 x SSC při 65 °C nebo v 2 x SSC při 50 °C z důvodu nízké stringentnosti. Radiokativita na filtrech byla analyzována na speciálním systému (GS-525 Molecular Imager®, Storage Phosphor Imaging Systems, BioRad, Solná, Švédsko).

• 99 9 ·· 99 «9

9 9 9 9 9 9 > 9 9

9 999 99»·

99 99 999 99 ♦

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 99 99 99

Izolace RNA a hybridizace Nothern blotem

Vzorky pro izolaci RNA byly získány z mladých rostlin asi 3 m vysokých a to tak, že byla odloupnuta kůra a oškrábána vnitřní vrstva odloupnuté kůry s cílem získat buňky z kambiální vrstvy + diferencující se floém (označeno jako floémová frakce) a vnější vrstva odhaleného xylému s cílem získat diferencující se xylém (označeno jako xylémová frakce). Tkáň, která zůstala po oškrábání floému byla považována za kůru. Dále byl po odstranění střední žíly z mladých, ale zcela rozvinutých listů, odebrán vzorek listu. Nakonec byl také shromážděn vzorek mladých kořenů. Na glyoxalovém gelu bylo separováno 25 pg celkové RNA z každého vzorku a byl proveden blot na nylonový filtr (Hybond-N). Všechny následující hybridizace byly prováděny stejným postupem, jako je popsán výše v části „Hybridizace Southern blotem“.

Studium exprese s vysokým rozlišením

Vzorky z různých vývojových vrstev xylému byly získány ze segmentu kmene hybridní osiky pomocí podélných tečných řezů skrz kambiální vrstvu, které byly provedeny kryomikrotomem (HM 505 E microtome, Microme Laborgeráte, Walldorg, Německo). Současně byl proveden příčný ruční řez s cílem osvětlit lokalizaci každého řezu. Jeden z těchto příčných řezů je ukázán na obr. 5A. Různé vývojové vrstvy jsou označeny jako Ph (floém), CZ (kambiální vrstva), EZ (zvětšující se xylémová vrstva) a MZ (vrstva zrajícího xylému). Vzdálenost různých vrstev byla zjištěna na základě radiálního průměru buněk a na základě přítomnosti dvojlomu, který je patrný pod světelným mikroskopem s použitím optiky Nomarski. Jednotlivé řezy o tloušťce 50 pm a rozměrech 2,5 x 15 mm byly spojeny do vývojových skupin, které jsou na obr. 5A naznačeny jako Cl (diferencující se floém), C2, C3 a C4. Z každé tkáně byly pomocí magnetických oligo (dT) kuliček izolovány póly (A) RNA. První řetězec cDNA byl syntetizován na kuličkách pomocí soupravy (First Strand cDNA Synthesis Kit, Pharmacia Biotech), volný póly (dT) byl z kuliček odstraněn T4 DNA polymerázou (BRL) a k odstranění RNA v hybridu cDNA/RNA byla použita RnázaH (MBI Fermenta Švédsko). Homopolymerní (dA) konec byl připojen k ss cDNA pomocí terminální deoxytransferázy TdT. Nakonec byly syntetizované cDNA amplifikovány PCR. To bylo provedeno tak, že 50 pl reakčních směsí pro PCR bylo přidáno k cDNA (200 pM dNTP, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris pufr pH 9,0, 1 U Taq DNA polymerázy a 0,5 pM T7v/I-(dT)l 7 primer (5-GCGCCATCTAGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'). Na počátku byl lOkrát opakován cyklus 1 min. při 94 °C, 2 min. při 40 °C a 3 min. při 72 °C. Poté byly kuličky z reakční směsi odstraněny a bylo provedeno dalších 40 cyklů (1 min.

• ·· ·

99

9 9 9 9 9 9-9 · « · · · · · · * • · ·· 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 999 99 99 99 při 94 °C, 2 min. při 58 °C a 3 min. při 72 °C). Amplifíkované cDNA byly separovány na agarózovém gelu a relativní množství každého produktu bylo stanoveno po obarvení ethidium bromidem. Přibližně stejná množství každého amplifikačního produktu byla nanesena na 1% agarózový gel, proběhla separace a poté byly provedeny přenos na nylonový filtr a hybridizace sPttHBl &PttHB2 próbami, jak je to popsáno v části „Hybridizace Southern blotem“.

Mikroskopie

Příčné ruční řezy byly mikroskopovány pod mikroskopem Axioplan (Carl Zeiss) s použitím optiky Nomarski. Preparáty byly připraveny ve 100% glycerolu.

Analýza sekvence DNA

Pro vizualizaci konstruktů a sekvencí, pro analýzu sekvenčních dat a pro lokální srovnání různých sekvencí DNA byla použita souprava Gene Construction Kit (Textco Inc.,West Lebanon, New Hampshire, USA) a software MacVector 4,5 (Scientific Imaging Systém, New Haven, CT, USA). Výběr podobných sekvencí DNA byl uskutečněn v databázi Basic Local Alignment Search Tool 2 (BLAST2) přímo on line spojenou s EMBL, Heidelberg, Německo. Produkty translace zde popsaných homeoboxních genů byly porovnány s ostatními translačními produkty homeoboxů pomocí programu Pileup v GCG systému (Genetics Computer Group, Wisconsin, USA). Fylogenetické analýzy pro vytvoření stromu byly provedeny pomocí ručně modifikovaných porovnání Pileup pomocí GCG programů DISTANCES a GROWTREE, matrice Kimura Protein a spojovací metody. Fylogenetický strom byl nakreslen pomocí TREEVIEW PPC.

Měření buňky vlákna

Tracheidy a cévy byly izolovány z hmotnosti a transgenních rostlin hybridní osiky a to namáčením v H2O2 a v kyselině octové při 100 °C po dobu 4 h. Délka buňky vlákna a tloušťka buněčné stěny (CWT) byly měřeny v zařízení Kajaani FiberLab a vyjádřeny jako relativní jednotky podle Kajaaniho.

• •fcfc • fc 99 99

9 99 9 9 9 9 9 9

9 fc · fcfcfcfc · fc fcfc fcfc fcfcfc fcfcfc li fc·· ······· fcfcfc fcfc ··· fcfc ·· fcfc

Příklad 1 Nukleotidové sekvence cDNAPíZ/ZS7 &PttHB2

Aby byla objasněna role HB genů ve vývoji rostlinných cév, syntetizovali autoři vynálezu směs primerů, odpovídajících velmi konzervativním 8 aa zbytkům z oblasti třetího helixu homeodomény (HD). Tato směs byla následně použita jako próba při hybridizacích. Autoři předmětného vynálezu otestovali 200 000 plaků knihovny kambiální vrstvy a nalezli 26 cDNA klonů, naznačujících poměrně nízkou expresi HB genů v cévní tkáni hybridní osiky. Informace o DNA sekvenci z těchto 12 klonů ukázaly, že pocházejí ze dvou odlišných genů, které byly označeny PttHBl a PttHB2 (pro homeobox z Populus tremula x tremuloides). Celá nukleotidová sekvence cDNA PttHBl je ukázána na obr. 1. Tato cDNA sekvence je 1094 bp dlouhá, nepřipouštějící póly (A) sekvenci. Obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF) 651 nukleotidů, začínající kodónem ATG v pozici 136 a končící kodónem TGA v pozici 787. PttHBl kódující sekvenci předchází nepřeložený 5'úsek bohatý na AT o velikosti 135 bp, následuje nepřeložená 3 'sekvence o velikosti 304 bp a končí póly (A) koncem.

Nejbližší okolí předpokládaného translačního startovního kodónu je GCTCATGGA který, jestliže je porovnán s odvozenou translační iniciační shodnou sekvencí, caAA/CaATGGCg, je pro rostliny suboptimální. Avšak za nej důležitější pozici je považován G v pozici +4 (kde A v ATG je definováno jako +1), kteiý je přítomen v iniciačním místě PttHBl. Relativně bezvýznamný AUG kontext vtranskriptu PttHBl může svědčit o tom, že tento gen kóduje transkripční faktor a tím fakticky méně účinnou translaci při optimálních buněčných hladinách konkrétního proteinu. Ve všech dalších aspektech se však transkript PttHBl jeví jako typický rostlinný genový transkript. Má poměrně krátkou a na AU bohatou vedoucí sekvenci, která snižuje potenciál pro tvorbu sekundární struktury a v sekvenci, která je v upstream pozici k předpokládanému startovnímu ATG, nemohou být uvnitř rámce nalezeny žádné přídavné ATG kodóny. V sekvenci o 135 bp, která předchází kódující sekvenci PttHBl, je přítomen jeden 2 aa dlouhý ORF. Význam tohoto ORF, jestliže nějaký existuje, není v současné době znám, ale mohl by být možná zahrnut v regulaci translace PttHBl genu. Bezprostředně v upstream pozici vzhledem kpoly (A) inserčnímu místu nejsou přítomny žádné zřetelně shodné sekvence polyadenylačních signálů (AATAAA/T), ačkoliv póly (A) konec je v cDNA očividně přítomen. U mnoha rostlinných genů však tyto signály vykazují difúzi a nebylo možné definovat jediný, universální póly (A) signál. Domnělé jaderné lokalizační signály jsou přítomny v aa pozicích 130 až 137 a 158 až 163 a naznačují, že PttHB proteiny zprostředkovávají jejich biologickou aktivitu v jádře.

44

4 4 4

4 4 4 • 4

4 • 4

4 · 4 • 44 44

4 »·

Příklad 2 Předpovězená aminokyselinová sekvence, odpovídající genu PttHB 1

Předpovídaný protein PttHBl je 217 aa dlouhý a poskytuje molekulovou hmotnost asi 24 kDa. V sekvenci DNA byl mezi pozicemi 352 a 550 nalezen peptidový motiv, odpovídající shodné HD. V Antp HD je terciární struktura udržována hydrofobním jádrem, tvořeným 12 mírně shluknutými aa. Všechny aa vyjma jedné jsou hydrofobní a šest z nich jsou vysoce konzervativní nebo neměnné. VHD PttHBl je přítomno osm z jedenácti konzervativních hydrofobních aa. Na dalších třech pozicích byly nahrazeny dvě hydrofobní aa dvěmi jinými a jediná nehydrofobní aa v jádru je zásaditá. H na obr. 2A označuje těchto 11 strukturně významných aa. Chybějící jaderná aa by měla být umístěna mezi helixem 1 a 2, ale protože aa sekvence PttHBl má v této oblasti 5 zbytkovou inzerci, není možné jednoznačně definovat pozici této poslední hydrofobní aa.

HD PttHBl obsahuje všech sedm nejvíce konzervativních aa v pozicích, ve kterých byla ve všech různých dosud analyzovaných druzích nalezena pouze jedna nebo dvě aa a která slouží jako znamení pro HD domény. Tyto aa jsou na obr. 2A označeny černými trojúhelníky.

V N-koncovém raménku HD domén přímo kontaktují dva argininové zbytky v pozicích 3 a 5 DNA v menším žlábku. Tyto dva zbytky jsou také přítomny v HD PttHBl (obr. 1, 2A). Další kontakty mezi HD proteiny a cílovou DNA jsou realizovány rozpoznávacími aa zbytky helixu III

I.QNRRM/A, dotýkající se hlavního žlábku DNA okolo TAAT motivu. V HD PttHBl doméně jsou aa zbytky QNRRA samozřejmě přítomny (obr. 2A). Navzdory sekvenční odlišnosti mezi HD PttHBl a jinými známými HD třídami (obr. 2B, 2C) se jeví celková trojrozměrná struktura HD jako konzervativní. Nejsou přítomny žádné jiné konzervativní sekvenční motivy, nalezené na jiných homeoboxních genech vně HD.

HB sekvence PttHBl vykazuje vyšší podobnost se sekvencí HAT2 než sjinými rostlinnými HB. Gen HAT2 patří do rodiny HD-ZIP II. Avšak v sekvenci PttHBl není přítomen žádný leucinový zipový motiv, vylučující tento gen z rostlinné třídy HB genů HD-Zip. Dále nebyly nalezeny žádné znaky, které by byly předmětem zájmu, jako jsou kyselé oblasti se svazky asparágové a/nebo glutamové kyseliny, běžné pro mnoho transkripčních faktorů. Mezi aa 152 až 203 však byla nalezena určitá homologie s výraznou transaktivační doménou VP16 herplex simplex viru, která hraje roli v řadě biologických systémů včetně rostlin.

*·» ·

94 94

4 94 4 4 4 9 9 4

9 4 9 9 9 4 4 4 φ 4 9 49 949 4··

4 4 9 9 9 9 4 9 4 9

4 49 94 9 49 4 4 9 9

Příklad 3 Geny PttHB reprezentují novou třídu homeoboxů

Dvě aa sekvence PttHB byly porovnány jedna s druhou a s HD oblastmi reprezentantů různých tříd, pocházejících z mnoha druhů zvířat a rostlin. Tato srovnání ukázala, že geny PttHBl a PttHB2 kódují HD o délce 65 aa, vzhledem k 5 extra aa, inzertovaným mezi helixem 1 a 2. Autoři předmětného vynálezu použili těchto 5 aa jako rozpoznávací značku této nové třídy HD, označené PALE jako Penta AA Loop Extension. Jak je zobrazeno na obr. 2A a E jsou aa sekvence PttHB i 1 a 2 aa sekvence AtPALE A.thaliana a aa sekvence P.rPALE 1 Pinus radiata velmi podobné jedna druhé, vykazují asi 75% identitu pro HD a celkovou identitu pro celé přeložené proteiny asi 60 %. Na druhé straně nebyly zjištěny žádné sekvence PALE, které by byly velmi blízké jakýmkoliv jiným HB sekvencím.

Příklad 4 Geny PttHB jsou součástí malé rodiny genů

Southern blot genomické DNA z hybridní osiky za vysoce stringentních podmínek ukázaly, že kratší 3' próba PttHBl o velikosti 620 bp hybridizovala s jediným proužkem v genomických štěpech, získaných po štěpení HindHA a EcoRV a se dvěma nebo třemi proužky ve štěpech, vzniklých po štěpení EcoRI a Eo/wHI (obr. 3 A). Když byla použita próba, odpovídající celé sekvenci PttHB2, byl ve štěpech s EcoRV získán jediný proužek a ve štěpech pomocí EcoRI, Etz/wHI a HindHA dva až tři proužky (obr. 3 A). Toto naznačuje, že PttHBl i PttHB2 jsou nej pravděpodobněji geny, poskytující jediné kopie a že více vazeb, získaných v případě některých štěpů je důsledkem intronů, přerušujících sekvenci, odpovídající příslušné próbě. Při použití próby, odpovídající celé sekvenci PttHBl bylo pri hybridizaci za málo stringentních podmínek sgenomickou DNA z kukuřice, Arabidopsis, tabáku, kávy a smrku získáno více proužků (obr. 3B). To ukazuje, že sekvence podobné PttHBl jsou v kukuřici, tabáku a Norském smrku přítomny, což naznačuje, že tato nová třída HB je v přírodě velmi rozšířená. Při dané použité stringentnosti však nebyly získány žádné jednoznačné proužky v případě DNA z Arabidopsis nebo kávy.

Příklad 5 Geny PttHBl a PttHB2 jsou exprimovány v cévní tkáni

Aby bylo potvrzeno, že cDNA PttHB jsou exprimovány v kambiální vrstvě, byl proveden Nothem blot celkové RNA, izolované z několika různých částí rostliny hybridní osiky. Ten ukázal, že próba, odpovídající celé sekvenci PttHBl hybridizovala s RNA xylémového původu, ··»· • · · · · ···· » * · · ·«·« « · · · · · · · · · • · ··· · · · · • »· ·« · ·« ·· ·· méně s RNA z listu, ještě méně s RNA z floému a kůry a vůbec nehybridizovala s RNA z kořene (obr. 4). Naopak, próba PttHB2 dávala pozitivní signál s xylémovou i floémovou RNA, slabší signál s RNA kůry a listu a poměrně velmi slabý signál s RNA kořene.

Příklad 6 Gen PttHBl je exprimován ve vrstvě zrání xylému

Aby byl podrobněji definován průběh exprese genů PttHBl a PttHB2, byla provedena další analýza exprese při vyšším rozlišení. Tkáně byly izolovány z odlišných vrstev kambiální oblasti pomocí kryo-mikrotomového sekcionování. Celkové cDNA amplifikované PCR, syntetizované z mRNA, která byla izolována z těchto tkání, byly hybridizovány s krátkou próbou PttHBl. Přesná anatomická lokalizace různých tkáňových řezů, použitých pro izolaci RNA je ukázána na obr. 5A. Jak je patrné z obr. 5B, exprese mRNA PttHBl, která je odrážena amplifikovanými cDNA, byla zřetelně omezena na xylém. Fakticky byl gen PttHBl exprimován v jediné vývojové vrstvě, jmenovitě ve zrajícím xylému (C4) (obr. 5B). Navzdory amplifikaci PCR mohou být v jiných vrstvách kambiální oblasti detekovány pouze slabé proužky. Gen PttHB2 vykazoval velmi odlišný průběh exprese v porovnání s genem PttHBl. Tento gen je exprimován hlavně v kambiální (C2) vrstvě, ve vrstvě zvětšování xylému (C3) a ve vrstvě zvětšování floému (Cl) a méně pak ve vrstvě zrání xylému (obr. 5B).

Protože buňky ve vrstvě zrání xylému podléhají jedinečnému typu diferenciace buněčné stěny, zajímali jsme se zejména o expresi PttHBl. Během této fáze jsou xylémové buňky mechanicky zesilovány zvětšováním tloušťky buněčné stěny. Mikrofilamenty pomáhají při stanovení množství a průběhu zvětšování tloušťky. Kortikální mikrotubuly pomáhají při umístění a ukládání celulózy a ligninu v matrici buněčné stěny. V zásadě vzato se jednotlivé buňky diferencují na jeden z několika možných typů xylémových buněk, přičemž každý typ buňky obsahuje buňky s odlišnostmi v ultrastruktuře. Nakonec xylémové buňky ztrácejí svou cytoplasmu a cytoplasmatickou membránu a umírají. Je velmi pravděpodobné, že PttHBl HD protein je zahrnut ve spouštění specifického vývojového spínače, který iniciuje sekundární tvorbu stěny ve vrstvě zrání xylému.

Předcházející vývoj ukázal úzký vzájemný vztah mezi expresí homeoboxního genu a iniciací nových vývojových cest nebo regulačních cyklů. Geneticky identifikované mutantní fenotypy v různých vývojových procesech byly také často uváděny jako mutanty HB genu. Podobně, jestliže byl HB gen izolován na základě sekvenční podobností a byla identifikována jeho molekulární funkce, pak ve všech případech kódoval klíčovou regulační funkci v definované vývojové nebo prostředím indukované cestě.

► φφ ·* ·φ φφφ * φ · φ # φφφ φφφφ φ« φφφ φφ φ ι·· > > » * φφφφφ φφ e φ «φφφ

Předběžná stanovení u vláken, izolovaných z transgenních rostlin pomocí namáčení v H2O2 a kyselině octové při 100 °C po dobu 4 h v zařízení Kajaani FiberLab ukázala, že rostliny s nižšími hladinami mRNA PttHBl, jakožto výsledek začleněné antisense exprese cDNA PttHBl, což bylo provedeno pomocí genové technologie, mají ve srovnání swt trochu slabší buněčné stěny (uváděno jako relativní jednotky podle Kajaaniho CWT). Toto naznačuje, že izolované geny PttHB mohou být použity jako prostředky k modifikaci vláknitých charakteristik sekundární stěny in šitu a to již v průběhu jejich tvorby.

Ačkoliv byl vynález popsán s ohledem na jeho výhodnější provedení, které je tvořeno nejlepším způsobem, který je dosud známý autorům vynálezu, mělo by být zřejmé, že mohou být učiněny různé změny a modifikace, které by měly být zřejmé osobám, které mají běžné znalosti vdané oblasti techniky. Důsledkem těchto změn a modifikací by nemělo být odchýlení od rozsahu vynálezu, který je obsažen v dále připojených nárocích.

Claims (17)

1. Sekvenční třída homeoboxních genů PALE pro regulaci vláknitosti vláknitých rostlin vyznačující se tím, že proteiny, kódované geny, které patří do zmíněné třídy, vykazují pentaaminokyselinové prodloužení smyčky.

2. Sekvenční třída podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněná pentaaminokyselinová smyčka obsahuje aminokyselinový motiv QKIK.

3. Sekvenční třída podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že charakteristický motiv WTP je ve většině proteinů zmíněné třídy PALE začleněn do N-koncového raménka homeodomény a motiv ITXE do druhého helixu, čímž ho poněkud rozděluje.

4. Sekvenční třída podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že DNA sekvence, patřící do této třídy, vykazují alespoň 50% identitu s alespoň jednou z následujících sekvencí:

sekvence s identifikačním číslem 1 a sekvence s identifikačním číslem 3.

5. Izolovaná sekvence DNA, regulující vláknitost vláknitých rostlin, vykazuje alespoň 50% identitu s alespoň jednou z následujících sekvencí:

sekvence s identifikačním číslem 1 a sekvence s identifikačním číslem 3.

6. Izolovaná sekvence DNA, regulující vláknitost vláknitých rostlin, je schopna hybridizovat alespoň s jednou z následujících sekvencí:

sekvence s identifikačním číslem 1 a sekvence s identifikačním číslem 3.

7. Homeodoménový protein nebo proteiny, regulující buněčnou diferenciaci vláknitých rostlin, vykazuje/í alespoň 40% identitu alespoň s jednou z následujících sekvencí: sekvence s identifikačním číslem 2 a sekvence s identifikačním číslem 4.

8. Použití homeoboxního genu, náležícího do sekvenční třídy PALE podle jakéhokoliv nároku 1 až 4, k regulaci vláknitosti vláknitých rostlin.

• ·

9. Použití homeoboxního genu, náležícího do sekvenční třídy PALE podle jakéhokoliv nároku 1 až 4, k regulaci vláknitosti dřevin, patřících do skupiny, obsahující jehličnaté (měkké dřevo) a dvouděložné (měkké dřevo) stromy.

10. Použití sekvence DNA podle jakéhokoliv nároku 5 až 6 k regulaci vláknitosti vláknitých rostlin.

11. Použití sekvence DNA podle jakéhokoliv nároku 5 až 6 k regulaci vláknitosti dřevin, patřících do skupiny, zahrnující jehličnaté (měkké dřevo) a dvouděložné (měkké dřevo) stromy.

12. Použití homeodoménového proteinu podle nároku 7 k regulaci vláknitosti vláknitých rostlin.

13. Použití homeodoménového proteinu podle nároku 7, k regulaci vláknitosti dřevin patřících do skupiny, zahrnující jehličnaté (měkké dřevo) a dvouděložné (měkké dřevo) stromy.

14. Způsob přípravy transgenních vláknitých rostlin, které produkují vlákno s pozměněnými vlastnostmi vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) sestrojení rostlinného expresního vektoru, který obsahuje v sense orientaci sekvenci ze sekvence s identifikačním číslem 1 nebo sekvence s identifikačním číslem 3 a který, jestliže je začleněn do rostlinných buněk, bude exprimovat onu sekvenci v sense orientaci; nebo

b) sestrojení rostlinného expresního vektoru, který obsahuje vantisense orientaci sekvenci ze sekvence s identifikačním číslem 1 nebo sekvence s identifikačním číslem 3 a který, jestliže je začleněn do rostlinných buněk, bude exprimovat onu sekvenci v antisense orientaci; nebo

c) sestrojení rostlinného expresního vektoru, nesoucího sekvenci ze sekvence s identifikačním číslem 1 nebo sekvence s identifikačním číslem 3 a který, jestliže je začleněn do rostlinných buněk, bude jinými způsoby přímo měnit expresi zmíněné sekvence;

d) začlenění rostlinného expresního vektoru do vláknité rostliny tak, že sekvence v sense orientaci v rostlinném expresním vektoru je exprimována v kambiální vrstvě vznikajících transgenních rostlin tak, aby byla produkována vlákna, která mají ve srovnání s odpovídajícími vlákny netransformovaných rostlin pozměněné vlastnosti; nebo

e) začlenění rostlinného expresního vektoru do vláknité rostliny tak, že sekvence v antisense orientaci v rostlinném expresním vektoru je exprimována v kambiální vrstvě vznikajících transgenních rostlin tak, aby byla produkována vlákna, která mají ve srovnání s odpovídajícími vlákny netransformovaných rostlin pozměněné vlastnosti; nebo

f) začlenění rostlinného expresního vektoru do vláknité rostliny tak, že jinými způsoby změněná sekvence v rostlinném expresním vektoru je exprimována v kambiální vrstvě vznikajících transgenních rostlin tak, aby byla produkována vlákna, která mají ve srovnání s odpovídajícími vlákny netransformovaných rostlin pozměněné vlastnosti;

g) výběr transgenních rostlin z jakéhokoliv kroku d), e) a f), které ve srovnání s vlastnostmi netransformovaných rostlin vykazují změněné vláknité vlastnosti; a

h) rozmnožování transgenních rostlin z kroků d), e) a f).

15. Transgenní vláknitá rostlina obsahuje alespoň jeden funkčně inzertovaný gen, náležící do třídy homeoboxních genů podle jakéhokoliv nároku 1 až 4.

16. Transgenní vláknitá rostlina podle nároku 15 je vybrána z rostlin, náležících do skupiny, zahrnující jehličnaté (měkké dřevo) a dvouděložné (měkké dřevo) stromy.

17. Transgenní vláknitá rostlina podle nároku 15 je vybrána z rostlin, náležících do skupiny, zahrnující jednoleté angiospermy.