CZ150093A3 - Xylanase, bacillus strains producing xylanase and their use - Google Patents

Xylanase, bacillus strains producing xylanase and their use Download PDF

Info

Publication number
CZ150093A3
CZ150093A3 CS931500A CS150093A CZ150093A3 CZ 150093 A3 CZ150093 A3 CZ 150093A3 CS 931500 A CS931500 A CS 931500A CS 150093 A CS150093 A CS 150093A CZ 150093 A3 CZ150093 A3 CZ 150093A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
xylanase
bacillus
xylo
oligosaccharides
xylanase according
Prior art date
Application number
CS931500A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Samain
Philippe Debeire
Michele Debeire-Gosselin
Jean-Pierre Touzel
Original Assignee
Agronomique Inst Nat Rech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agronomique Inst Nat Rech filed Critical Agronomique Inst Nat Rech
Publication of CZ150093A3 publication Critical patent/CZ150093A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká xylanasy a kmenů Bacillus, produkujících tento enzym.
Dále se týká použití tohoto enzymu a těchto bakterií při bělení buničiny a přípravě xylosy nebo xylo-oligosacharidů, zejména z rostlinných surovin.
Dosavadní stav techniky
Byla navržena různá použití xylanas v oblasti biotechnologií, zejména v oblasti potravinářství (Biely, Trends Biotechnol. 3 Cil), 286-290, 1985), v papírenském průmyslu (Mora ad., J. Vood Chem. Technol. 6, 147-165, 1986) nebo při výrobě chemických sloučenin z hemicelulosy CReilly P.J., 1981, Xylanases: Structure and Function in Trends in the Biology of Fermentations for Fuels and Chemicals, ft.J. Hollaender (Ed.) Plenům, New York).
Technická proveditelnost takových aplikací byla hodnocena hlavně pomocí enzymů, produkovaných mesofilními houbami. Tyto aplikace však mohou být usnadněny použitím hub s lepší tepelnou stabilitou.
Pro produkci xylanas jsou známé různě bakterie a enzymy (viz zejména Wing a d., Microbiological Reviews, 52, č. 3, 305-317, 1988). Dosud nejvyšší výtěžky enzymů byly dosaženy při použití hub CYu a d.. Enzyme Microb. Technol. 9, 16-24, 1987). Mezitím již byly popsány hyperprodukční kmeny Bacillus (Okazaki a d., Appl. Mlcrobiol. Biotechnology 19, 335-340, 1984, Okazaki a d., Agric. Bio. Chem. 49, 2033-2039, 1985). Druhy Bacillus, které jsou termofilní a degradují xylan, mohou být dobrými kandidáty pro průmyslovou produkci xylanas pro svůj významný růstový faktor a dobrou znalost jejich genet i ky.
Xylanasy, izolované Okazakim ad., pocházejí ze dvou kmenů Bacillus, nazvaných autory VI a V2. V každém z těchto kmenů byly prokázány dvě složky s xylanasovou aktivitou, nazvané I a II. Složky I degradují xylan na xylobiosu a na oligomery vyššího polymeračního stupně, zatímco složky II produkují kromě uvedených sloučenin xylosu.
Složky I (nazvané VI.I a V2.I) mají molekulovou hmotnost
21.5 kDa, resp. 22,5 kDa, a isoelektrický bod 8,5, resp.
8,3. Složky II (VI.II a V2-II) mají molekulovou hmotnost
49.5 kDa, resp. 50 kDa.
Obě složky I i II jsou inhibovány ionty Hg2+ a v menší míre ionty Cu2+.
Četné jiné xylanasy byly izolovány mimo jiné z různých druhů Bacillus, Clostridium, Aspergillus, Streptomyces nebo Trichoderma (výše citovaní Vong a d., 1988).
Například abstrakt japonského patentu JP 130 96 84 (Rikagaku Kenkyusho) se týká xylanasy typu VII s molekulovou hmotností 50 kD nebo 42 kD- Pro tuto xylanasu není uvedena žádná hodnota isoelektrického bodu.
Článek Rajarama a d. (Applied Microbiology and Biotechnology, sv. 34, č. 1, říjen 1990, str. 141-144) se týká kmene
Bacillus, izolovaného v přírodě a produkujícího xylanasu s op timální aktivitou mezi 60 a 70 °C a pH v rozmezí 6 až 7. Tento enzym není charakterizován molekulovou hmotností ani isoelektrickým bodem. Tento kmen produkuje navíc další enzymy, jako jsou celulasy.
Jiný japonský abstrakt na jméno Rikagaku Kenkyusho (JP 85 118 644) popisuje xylanasu s optimální aktivitou při pH v rozmezí 6 až 7. Tento enzym má molekulovou hmotnost, stanovenou ultrafiltrací. v rozmezí 50 až 100 kD. V abstraktu není uveden isoelektrický bod.
Článek Grilningera a d. (Enzyme Microbiology and Technology, sv. 8, květen 1986, str. 309-314) se týká jiného kmene Bacillus, izolovaného ze slizu a produkujícího termostabilni xylanasu. Enzym je charakterizován optimální aktivitou při 78 °C a při hodnotě pH 7,5. Tento enzym není charakterizován molekulovou hmotností ani isoelektrickým pH.
Průmyslová produkce xylanas naráží na současnou přítomnost kontaminujících aktivit, jako jsou celulasy, způsobující zvýšení nákladů na čištění. Na druhé straně použití geneticky modifikovaných zárodků může přinášet problémy, jako je nestabilita plasmidů, nesoucích geny s kódem pro xylanasy.
Podle znalostí přihlašovatele bylo nej lepší produktivity endoxylanasy, získané pomocí mikroorganismu neprodukujícího celulasu, dosaženo pomocí mutanty Streptomyces lividans, zbavené celulosové aktivity po zavedení plasmidu, nesoucího geny kódující xylanasy A a B. V kultivačních médiích byly pozorovány produktivity rádu 6000 až 10000 U.I. 1/h. Nicméně je třeba uvést, že v tomto případě se vyskytly problémy, spojené s ne-hydrolýzou xylanu, nerozpustného xylanasou A, a tepelné stability u xylanasy B CKluepfel a d.. Biochem. J. 267,
47-50, 1990).
Žádný z enzymů, popsaných ve známém stavu techniky, tedy podle znalostí přihlašovatele nemá charakteristiky, umožňující průmyslovou aplikaci, tj. dobrou tepelnou stabilitu, významnou schopnost degradace substrátů a možnost přípravy pomocí superprodukčních kmenů.
Podstata vynálezu
Přihlašovatel tedy překvapivým způsobem prokázal, že určité kmeny Bacillus produkují termostabi lni xylanasy s významnou degradační aktivitou.
Ještě překvapivějším způsobem přihlašovatel prokázal, že tyto kmeny Bacillus vylučují ve velkém množství uvedené enzymy bez produkce významného množství celulas.
Předmětem vynálezu jsou kmeny Bacillus, hyperprodukujíci xylanasu, zejména kmeny, uložené pod číslem 1-1017 a 1-1018 v Národní sbírce kultur mikroorganismů Pasteurova institutu CCollection Nationale de Cultures des Microorganismes de 1'Institut Pasteur).
Tyto kmeny byly izolovány z chlévské mrvy.
Bakterie mají tvar krátkých rovných tyčinek, tvořících spory, o střední velikosti 0,5 až 2,5 um. Jsou obvykle osamocené nebo párové, mají grampozitivní zbarvení a spory jsou oválné a centrální.
Tyto kmeny jsou přísně aerobní, v nepřítomnosti kyslíku není pozorován žádný rflst a nitrát se používá pouze jako akceptor e1ektronů.
Optimální pH růstu a produkce xylanasy je 7,8, zatímco limitní pH pro růst leží mezi 6,5 a 8,5 a maximální teplota je 63 °C.
Kromě xylanu zužitkovávají tyto kmeny xylosu, glukosu, sacharosu, maltosu a škrob. Fruktosa, arabinosa, celulosa, pektin a chitin nejsou zužitkovávány. Kromě toho je růst inhibován chloridem sodným v koncentraci 5 %.
Obsah G+C v DNA těchto kmenů, stanovený termickou denaturací, je 57,5 % molárních.
Tyto kmeny jsou dobře odlišeny od jiných produkčních kmenů xylanas, jak je patrné z tabulky I, pokud se týká odlišné doby kultivace a produktivity xylanasy.
Kmen 1-1018 byl získán mutagenesí kmene 1-1017. Kmen
1-1018 má stejné obecné charakteristiky jako kmen 1-1017, ale vyznačuje se hyperprodukci xylanasy.
Předmětem vynálezu je rovněž terraofilní xylanasa, mající molekulovou hmotnost asi 22 kDa a isoelektrický bod asi 7,7.
Výhodou tohoto enzymu je dále velká stabilita při 60 °C, po dobu alespoň 24 h, a pH optimální aktivity v rozmezí od
4,8 do 7, výhodně kolem 6.
Je vhodné zaznamenat, že pHi tohoto enzymu je dostatečně vysoké, ale nicméně nižší než pHi xylanas o blízkých molekulových hmotnostech, produkovaných druhy Bacillus, zejména popsaných Okazakin a d. (výše citovaná publikace 1985).
pH 6 odpovídá optimálnímu pH, ale aktivita zůstává vyšší než 80 % v celém rozmezí od 4.8 do 7.
Xylanasa podle vynálezu může mít tuto N-terminální sekvenci aminokyselin:
Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.
Výhodně obsahuje ve své sekvenci 15 alaninů. 6 argininů, 25 aspartátů a asparaginů, 19 glutamátů a glutaminů. 31 glycin, 3 histidiny, 6 isoleucinů, 7 leucinů. 3 lysiny. 1 methionin..4 fenylalaniny, 8 prolinů, 19 serinů. 13 threoninů. 22 tyrosiny a 14 val lnů.
Tento enzym je kromě toho inhibován Hg2+, ale nikoli Ag2 + (1 mM) ani 0,1% SDS.
Michael isova konstanta (Km) vůči březovému xylanu je 0.9 g/1.
Neutrální oligosacharidy. produkované tímto enzymem z březového xylanu (5 g/1 březového xylanu. 500 U/l, 60 °C) jsou tvořeny:
- při velmi krátké době enzymatické inkubace (15 min) xylotriosou a xylooligosacharidy vyšších polymeračních stupňů ,
- při dlouhých inkubačních dobách (24 až 72 h) xylobiosou, xylotriosou a xylotetraosou. která je přítomna ve velmi slabém podílu.
Tato endoxylanasa je vylučována zejména Bacil lem, zvláš7 tě jeho výše popsanými kmeny 1-1017 a 1-1018.
Je vylučována v kultivačním médiu.
Kultivační médium těchto kmenů je charakterizováno zejména absencí endo-β-Ι,4-glukanasové aktivity (celulasa) a přítomností velmi slabé kontaminující β-xylosidasové aktivity (kolem 0,06 U.I./ml supernatantu kultury pro oba kmeny). Je třeba zaznamenat, ze supernatant kultury může být lyofilizován bez pozorovatelné ztráty xylanasové aktivity a uchováván zmrazený po dobu alespoň jednoho roku bez ztráty aktivity.
Endo-β-Ι,4-glukanasové aktivity byly stanoveny měřením redukujících cukrů, uvolněných z karboxymethy1celulosy (CMC,
^) nebo Avlcelu (1 %) v pufru na bázi 50 mM acetátu sodného o pH 6. β-xylosidasová aktivita byla stanovena měřením uvolňování p-nitrofenolu z p-nitrofenyl-β-D-xylosidu (0,1 %) v pufru na bázi 50 mM acetátu sodného o pH 6.
Jednotka xylanasové aktivity (U.I.) je definována jako mikromol redukčního ekvivalentu xylosy, uvolněného za minutu při 60 °C.
Koncentrace redukujícího cukru se stanovuje metodou Kidbyho a Davidsona (Anal- Biochem. 55, 321-325, 1973).
Čištěný enzym se uchovává ve zmrazené formě ve 20¾ ethylenglykolu bez pozorovatelné ztráty aktivity po dobu jednoho roku.
Předmětem vynálezu je dále způsob výroby výše uvedené xylanasy, spočívající v
- koncentraci supernatantu kultury Bačillus ultrafiltrac í,
- pasáži kolonou měniče iontů, jako je kolona O-Sepharosy Fast Flov (Pharmacia},
- pasáži kolonou hydrofobních interakcí, jako je kolona fenylsepharosy (Pharmacia).
Koncentraci supernatantu je možno zejména provádět ultrafiltrací na membráně z polysulfonu s vylučovacím prahem vyšším než 10 kDa.
Tento postup umožňuje získat v podstatě čistý xylanasový preparát.
Vynález se dále týká způsobu výroby výše popsané xylanasy, spočívajícího v
- růstu bakterií v médiu, obsahujícím živný substrát, jako je glukosa, a
- produkci xylanasy, vyvolané kontinuálním vyživováním kultury xylooligosacharidy v příslušných množstvích.
Předmětem vynálezu je rovněž použití výše uvedené xylanasy při bělení buničiny.
Výhoda této xylanasy spočívá ve skutečnosti, že stupeň hydratace buničiny má malou důležitost. Není nutno buničinu příliš ředit k dosažení dobrého enzymatického ataku. Použití této xylanasy jako pomocného prostředku při bělení buničiny je o to zajímavější, že přípravky jsou zbaveny celulasových nečistot.
Tato xylanasa může být rovněž použita k přípravě xylosy nebo xylooligosacharidů ze surovin rostlinného původu, které jsou málo nákladné a obnovitelné (například osy kukuřičných klasů).
Další použití xylanas jsou uvedena v literatuře. Přehled Zeikuse a d. (Thermostable Saccharidases, New Sources, Uses and Biodeslgns, in Enzymes in Biomass Conversion“, Leatham a Himmel, ACS Washington. D.C.. 1991) shrnuje hlavní aplikace xylanas. Používají se hlavně při výrobě potravin, kde jejich vlastnosti umožňují zlepšit výrobu chleba, čiření ovocných šťáv a vín a nutriční hodnotu obilninové vlákniny, a při výrobě potravinářských zahuštovadel.
Druhá oblast využití se týká průmyslu papíru a vláken, kde se používají pro bělení buničin, výrobu buničiny a čištění vláken pro výrobu hedvábí.
Je zaznamenáno rovněž použití ve výživě drůbeže, kde se xylanasy používají ke snížení viskozity krmiv (Van Paridon a d., Xylans and Xylanases, International Symposium, Wageningen, B.-11.12.1991; Bedford a Classe H.L., Xylans and Xylanases, International Symposium, Wageningen, 8.-11.12.1991).
Použití xylanas při zhodnocování vedlejších produktů průmyslu buničiny je podrobněji uvedeno v článku Bielyho (Trends in Biotechnology, sv. 3, č. 11, 1985).
Je možno rovněž uvést dva evropské patenty EP 228.732 a EP 227.159, které se týkají použití xylanas ke zlepšení fi 1trovatelnosti glúkosového sirupu, resp. piva.
Byla rovněž zaznamenána možnost používat xylanasy pro výrobu chemických sloučenin z hemicelulosy (výše citovaný Rei1ly).
Tyto různé publikace ukazují, že xylanasy podle vynálezu mohou být používány v četných aplikacích.
Přehled obrázků na výkresech
Vynález je blíže objasněn v souvislosti s připojenými výkresy, které však neomezují jeho rozsah.
□br. 1 znázorňuje vývoj diskontinuálních kultur kmene
1-1017. Na levé svislé ose jsou vyneseny redukující cukry a růst v mg/ml, na pravé svislé ose xylanasa v jednotkách/ml při 60 °C, na vodorovné ose čas v h a křížek znamená proteiny, trojúhelníček xylanasu a čtvereček redukující cukry.
Obr. 2 znázorňuje kontinuální vývoj kultury kmene
1-1017 pomocí roztoků xylo-oligosacharidů o různých koncentracích. Na levé svislé ose je vynesen růst při 550 nm, na pravé svislé ose xylanasa v jednotkách/ml při 60 °C, na vodorovné ose čas v h a křížek znamená růst, prázdný kroužek násadu 0,26 g/h, prázdný čtvereček násadu 0,36 g/h, plný kroužek násadu 0,50 g/h a plný trojúhelníček násadu 0,67 g/h.
Obr. 3 znázorňuje porovnání produkce xylanas kmeny
1-1017 a 1-1018 v přítomnosti různých koncentrací xylo-oligosacharidů. Na svislé ose jsou vyneseny xylanasy v m.j./ml při 60 °C, na vodorovné ose čas v h a čtvereček znamená násadu 1-1017 0,36 g/h, křížek násadu 1-1018 0,36 g/h, kroužek násadu 1-1017 0,67 g/h a trojúhelníček násadu
1-1018 0,67 g/h.
Obr. 4 znázorňuje uvolňování xylo-oligosacharidů ze sulfátové nebělené buničiny pomocí různých koncentrací xylanasy.
Na svislé ose je vyneseno procento degradace xylanu, na vodo rovné ose čas v h a plný trojúhelníček znamená kontrolu, prázdný čtvereček 10 U.I.. prázdný trojúhelníček 50 U.I., prázdný kroužek 200 U.I. a plný čtvereček 1000 U.I.
Obr. 5 znázorňuje uvolňování xylo-oligosacharidů z drcených os kukuřičných klasů. Na svislé ose je vyneseno procento degradace xylanu a na vodorovné ose čas v h.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Selekce kmene 1-1017
K obohacení xylanolytických kmenů byly jako inoku1um použity různé vzorky půdy, kompostu a mrvy. Po 24 h inkubace se v supernatantu kultury zjistuje xylanasová aktivita a tri obohacení, vykazující nejvýznamnější aktivity, se zředí a rozmístí na agarové médium, obsahující xylan.
Základní kultivační médium, obsahující minerály a vitaminy (Zeikus a Wolfe, J. Bacteriol. 109, 707-713, 1972) a kvasničný extrakt ¢0,2 %) se·doplní agarem ¢2¾) a ovesným xylanem ¢0,5 %) . Po sterilizaci se přidá KHCO3 ¢25 mM) z ÍM sterilního zásobního roztoku do izolačního média smíšených kmenů. Naočkované Petriho misky se inkubují při 55 °C v uzavřených lahvích.
Kolonie, tvořící světlé zóny, se vyčistí. Vyberou se nejproduktivnější izoláty ¢kmen 1-1017) a charakterizují.
Obohacování i růst kultur se provádí aerobním způsobem na míchané vodní lázni v uzavřených lahvích objemu 125 ml, obsahujících 10 ml média. Teplota inkubace je 55 °C a médium se tlumí na pH 7 přídavkem 50mM KHCOgPříklad 2
Růst kmene 1-1017
Kinetiká produkce xylanas se provádí při 55 °C ve fermentorech o objemu 2 1 v počátečním objemu média 1,5 1. Po sterilizaci se přidá 50 ml ÍM roztoku KHCO3 a pH se upraví na
7,8 a udržuje na této hodnotě. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se reguluje a udržuje na stupni nasycení 70 %.
Obr. 1 znázorňuje růst kmene 1-1017 v diskontinuální kultuře na ovesném xylanu o koncentraci 0,5 Kmen 1-1017 produkuje až 110 jednotek xylanasy/ml. Během prvních hodin kultivace je pozorována přechodná akumulace redukujících cukrů. Tato akumulace je důsledkem přítomnosti malých množství xylanasy v inokulu, kde katalyžují rychlou hydrolýzu rozpustného podílu xylanu a xylo-oligosacharidů.
Bakteriální růst tedy umožňuje konzumaci xy lo-oligosacharidů a syntézu xylanasy, která začíná hned poté, kdy se jejich koncentrace stane limitující pro růst bakteri í.
Produkce xylanasy je přibližně konstantní po dobu 4 h (30 U.I. ml/h).
Při produkci xylanasy je pozorována velká proměnlivost v závislosti na předchozí xylanasové aktivitě inokula, významu stacionární fáze a fyzikálních charakteristikách xylanu.
Za účelem získání reprodukovatelných podmínek kultivace byla produkce xylanasy testována v kulturách, vyživovaných roztokem v přítomnosti xylo-olIgosacharidfl- Obr. 2 ukazuje vliv koncentrace xylo-oligosacharidfl.
Počáteční koncentrace cukru je 2 g/1. Substrát je spotřebován během exponenciální fáze růstu, během níž není detekována žádná produkce xylanasy.
Jakmile se koncentrace substrátu začíná stávat limitující pro růst, je pozorována okamžitá syntéza xylanasy.
Míra a také doba produkce enzymu je závislá na dodávce substrátu, která se pohybuje od 0,26 g/h do 0,67 g/h s průtokem substrátu 24 ml/h a počátečním objemem kultivačního média
1,5 1.
Šipka na obr. 2 odpovídá přídavku xylo-oligosacharidfl.
Nejvýznamnější produkce enzymů ¢230 U.I./ml) se dosáhne, dodává-li se substrát rychlostí 0,36 g/h. Vyšší množství substrátu způsobuje zkrácení doby produkce xylanas.
Použije-li se místo xylo-oligosacharidfl glukosa, produkce xylanasy se značně sníží ¢14 U.I./mlj a trvá méně než 2 h.
Naproti tomu použití glukosy jako počátečního substrátu nemění výtěžek xylanasy v porovnání s použitím xylo-oligosacharidfl.
Za účelem přípravy xy1o-oligosacharidfl jako substrátů v kontinuálních kulturách se inkubuje suspenze ovesného xyla14 nu o koncentraci 5 % po dobu 8 h při 60 °C a při pH 6 v přítomnosti 5 jednotek xylanasy na 1 ml. Tato suspenze se pak odstředí a získaný supernatant se autoklávuje.
Příklad 3
Čištění xylanasy z kultury kmene 1-1017
Postup čištění xylanasy zahrnuje tyto stupně:
- koncentraci supernatantu kultury Bacillus ultrafUtrácí na polysulfonové membráně s vylučovacím prahem 10 kDa,
- pasáž kolonou měniče iontů Sepharose Fast Flow (Pharmacia),
- pasáž kolonou hydrofobních interakcí fenylsepharosy (Pharmacia).
Výsledky tohoto čištění jsou shrnuty v tabulce II.
Toto čištění ukazuje, že hlavním proteinem mezi proteiny, vylučovanými v kultivačním médiu, je endoxylanasa (kolem 50¾ celkových vylučovaných proteinů).
Příklad 4
Charakterizace xylanasy pg xylanasy, čištěné podle příkladu 3, bylo podrobeno stanovení sekvence v plynné fázi přístrojem typu Applied Biosystems 470 A. Feny1thiohydantoinové (PTH) deriváty všech aminokyselin byly identifikovány vysokotlakou kapalinovou chromatografi i (HPLC) pomocí analyzátoru PTH, spojeného s přístrojem Applied Biosystems 120 A.
Získaná N-terminální sekvence prvních 20 aminokyselin: Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.
Celkové složení aminokyselin bylo stanoveno také po hyd rolýze 5,6N kyselinou chlorovodíkovou při 100 °C po dobu 24 h.
Výsledky jsou uvedeny v tabulce III, kde je uveden molární procentický podíl každé aminokyseliny, odhadnutý počet zbytků každého typu v proteinu a pro srovnání počet zbytků každého typu v N-terminálních 20 aminokyselinách.
Je nutno poznamenat, že asparaginové a glutaminové zbyt ky byly počítány spolu s aspartátovými, resp. glutamátovými zbytky, a že tryptofanové a cysteinové zbytky nebyly měřeny.
Příklad 5
Mutagenese kmene 1-1017
Kultivace kmene 1-1017 byla provedena v médiu, obsahují cím xylan a ethylmethansulfonát (EMS).
Ošetřené buňky se dvakrát promyjí, inkubují přes noc a rozprostřou na médium agar-xylan.
Klony se kultivují ve skleněných mikrozkumavkách (8 x 35 mra), plněných 100 pl kultivačního média doplněného oves ným xylanem <0,5 %) . Mikrozkumavky se proti odpařování uzavřou silikonovými zátkami a inkubují se na třepačce 24 h při 55 °C.
Pro výběr mutant se paralelně testuje 96 vzorků: 20 jul kultury z každé mikrozkumavky se přenese pomocí vícekanálkové pipety do polypropylenových mikrozkumavek. kde probíhá za teploty místnosti hydrolýza xylanu. Reakce jsou iniciovány přídavkem 300 μΐ suspenze substrátu do každé zkumavky a zastaví se 400 μΐ kyseliny 3,5-dinitrosal icy lové. Poté, co se provede po dobu 15 min var, se 50 μΐ z každé zkumavky přenese na mikrotitrační destičku k odečtení optické hustoty.
Klony, vykazující nejvýznamnější xylanasovou aktivitu, se opakovaně testují pěti po sobě jdoucími prepíchnutími a porovnají se s rodičovským kmenem.
Mutanty, vykazující významný vzrůst xylanasové aktivity, byly vybrány z 500 klonů, izolovaných po rautagenesi pomocí EMS.
Tyto mutanty vykazují zvýšení xylanasové aktivity v diskontinuálních kulturách v médiu, obsahujícím xylan.
Produktivita xylanasy u těchto mutant se stanoví rovněž v kulturách, vyživovaných kontinuálně- Při průtoku xylo-oligosacharidů 0,36 g/h se výtěžek xylanasy u mutanty
1-1018 významně nezvýší Co méně než 10 oproti divokému kmeni 1-1017, jak ukazuje obr. 3, který znázorňuje rozdílný růst kmenů 1-1017 a 1-1018 při dvou koncentracích xylo-oligosacharidů.
Zvýší-li se průtok xylo-oligosacharidů na 0,67 g/1, vykazuje například kmen 1-1018 dvakrát větší zvýšení produkce xylanasy oproti kmeni 1-1017 (rodičovský kmen).
Získání mutanty a optimalizace podmínek kultury, výživo17 váné kontinuálně, umožňuje zvýšení produkce xylanasy faktorem 3 v porovnání s diskontinuálními kulturami divokého kmene na xylanu. Tyto zvýšené poměry enzymů (až 392 U.I./ml) se získají po 7 h kultivace a produktivita xylanasy pomocí 1-1018 je tedy značně vyšší než u nej lepších kmenů hub a bakterií (Bertrand a d. , Biotechnol. Bioeng., 33, 791-794, 1989: výše citovaný Yu a d., 1987), produkujících xylanasu, které potřebují několik dní k získání takového množství enzymu.
Příklad 6
Ošetření buničiny (nebělené sulfátové) xylanasou
Na 8,5 g vlhké buničiny (odpovídající 1 g sušiny), pocházející z borovice přímořské a obsahující 60 mg xylanu, se působí při 60 °C po dobu 24 h 25 ml pufru (obsahujícího různé koncentrace xylanasy).
Kinetika uvolňování xylo-oligosacharidů je znázorněna na obr. 4. Projevilo se společné uvolňování derivátů ligninu (měřením optické hustoty při 280 nm).
Příklad 7
Získávání xylo-oligosacharidů z drcených os kukuřičných klasů g (sušina) prášku z os kukuřičných klasů (granulometrie > 100 mesh) se suspenduje ve 100 ml pufru na bázi 50 mM acetátu sodného o pH 6, obsahujícího 1000 U.I. xylanasy, a inkubuje se 18 h při 60 °C.
Obr- 5 ukazuje, že je možno za těchto podmínek transformovat až 38 % xylanu na oligosacharidy (xylo-oligosacharidy a arabino-xylo-oligosacharidy. Tyto sloučeniny je možno použít jako takové nebo jako prekursory xylosy a arabinosy.
Tabulka I
Porovnání produkce xylanas kmeny podle vynálezu a podle známého stavu produktivita xylanasy doba kultivace kmen_substrát
Clostridium glukosa thermo1acticum
U.I.ml~1h~Í h odkaz
0.65
Clostridium xylan stercorar i um
0.78
Thermoascus xylan auriantacus
2.40
Thielavla Solka-Floc5* terrestris
1,04
Brode1. B. . E.Samain a P.Debeire 1990 B i otechno1.Lett. 12(1).65-70
Berenger,J.F., C-Frixon, J. Bigliardi a N. Creuzet 1985 Can.J.M i crob i o1. 31.635-642
240 Yu.E.K-C-.L.U.L. Tan.M-K.H.Chan,
L.Deschate1ets a J.N.Saddler 1987, Enzyme Microb.Technol. 9.16-24
Merchant, R., F. Merchant a A. Margaritis 1988
Biotechol.Lett.
10(7),513-516
Streptomyces lividans A xy lan 16,76 72 Bertrand,J.L., R.Morosoli , F. Shareck a D. Kluepfel 1989 Biotechnol. Bioeng. 33(6), 791-794
Streptomyces lividans B xylosa 3,25 65 Kluepfel,D.,S. Vats-Mehta, F. Aumont,F.Shareck a R.Morosoii 1990 Biochem.J.267,45-50
Bacillus sp. alcalophile xylosa 2,47 48 Okazaki V-,T.Akiba K.Horikoshi a R. Akahoshi 1984 Appl.Microbiol. Biotechnol. 19, 335-340
Bacillus sp. podle vynálezu xy lo- oligosacharidy 44 7
mutanta Bacillus sp. podle vynálezu xylo- 78,4 o1Igosacharidy 7
^Solka-Floc- čištěná celulosa obsahující 5 až 7 % hemicelulosy
Tabulka IX celková stupeň celkové xylanasová specifická proteiny aktivita aktivita výtěžek frakce_objem (ng) <U. I. )_(U. I. /mg) (¾) supernatant
I
II
III
kultury 1500 216 232000 1071 100
koncentrace 150 197 225000 1142 97
Q Sepharose
Fast Flov 250 142 204250 1438 88
fenyl-
Sepharose 205 72 143500 1993 62
Tabulka III
Celkové aminokyselinové složení xylanasy sekvenování
am i nokyse1 i na % molárni odhadovaný počet zbytků počet zbytků (v částečné sekvenci 1-20)
alanin 7,5 15 1
arginin 3,0 6 0
asparagin Ca) Ca) 3
kyselina asparagové 14,5 29 1
cystein Cc) Cc) 0
kyšelina g1utamová 9,5 19 0
glutamin Cb) Cb) 2
glycin 15,5 31 3
histidin 1,5 3 0
isoleucin 3,0 6 1
leuc in 3,5 7 0
lysin 1,5 3 0
methionin 0,5 1 0
fenylalanin 2,0 4 0
prolin 4,0 8 0
šeřin 9,5 19 0
threonin 6,5 13 3
tryptofan Cc) Cc) 2
tyrosin 11,0 22 3
val in 7,0 14 1
Ca) počítáno jako
Cb) počítáno jako
Cc) neměřeno
kyselina asparagové kyšelina g 1utamová

Claims (13)

  1. . i I
    PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Kmen Bačillus, produkující xylanasu, uložený lem 1-1017 v Národní sbírce kultur mikroorganismů Pasteurova institutu.
  2. 2- Kmen Bačillus, produkující xylanasu, uložený pod číslem 1-1018 v Národní sbírce kultur mikroorganismů Pasteurova institutu.
  3. 3. Termofilní xylanasa, vyznačující se tím, že má molekulovou hmotnost kolem 22 kDa a isoelektrický bod kolem 7,7.
  4. 4. Xylanasa podle nároku 3, vyznačující se tím, že je stabilní při asi 60 °C.
  5. 5. Xylanasa podle některého z nároků 3 a 4, vyznačující se tím, že její pH při optimální aktivitě leží v rozmezí 4,8 až 7 a je výhodně asi 6.
  6. 6. Xylanasa podle některého z nároků 3 až 5, vyznačující se tím, že má tuto N-terminální sekvenci aminokyselin: Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.
  7. 7. Xylanasa podle některého z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje ve své sekvenci 15 alaninů, 6 argininů,
    29 aspartátů a asparaginů, 19 glutamátů a glutaminů, 31 glycin, 3 histidiny, 6 isoleucinů, 7 leucinů, 3 lysiny, 1 methionin, 4 fenylalaniny, 8 prolinů, 19 serinů, 13 threoninů, 22 tyros iny a 14 valinů23
  8. 8. Xylanasa podle některého z nároků 3 až 7, vyznačující se tím, že je vylučována Bacil lem.
  9. 9. Xylanasa podle nároku 8, vyznačující se tím, že je vylučována jedním z kmenů Bacillus podle některého z nároků 1 nebo 2.
  10. 10. Způsob přípravy čištěné xylanasy podle některého z nároků 8 a 9, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně
    - koncentrace supernatantu kultury Bacillus,
    - pasáže kolonou měniče iontů,
    - pasáže kolonou hydrofobních interakcí.
  11. 11. Způsob produkce xylanasy podle některého z nároků 8 a 9, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně
    - růstu bakterií v médiu, obsahujícím živný substrát, jako je glukosa, a
    - produkce xylanasy, vyvolané kontinuálním vyživováním kultury xylo-oligosacharidy v příslušných množstvích.
  12. 12. Použití xylanasy podle některého z nároků 3 až 9 při bělení buničiny.
  13. 13. Použití xylanasy podle některého z nároků 3 až 9 při přípravě xylo-oligosacharidů ze surovin rostlinného původu.
CS931500A 1991-02-01 1992-01-28 Xylanase, bacillus strains producing xylanase and their use CZ150093A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9101191A FR2672300B1 (fr) 1991-02-01 1991-02-01 Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations.
PCT/FR1992/000077 WO1992013942A1 (fr) 1991-02-01 1992-01-28 Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ150093A3 true CZ150093A3 (en) 1994-01-19

Family

ID=9409300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS931500A CZ150093A3 (en) 1991-02-01 1992-01-28 Xylanase, bacillus strains producing xylanase and their use

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0573536B1 (cs)
JP (1) JPH06506107A (cs)
KR (1) KR930703432A (cs)
AT (1) ATE152168T1 (cs)
AU (1) AU666301B2 (cs)
BG (1) BG97987A (cs)
BR (1) BR9205551A (cs)
CA (1) CA2101063A1 (cs)
CZ (1) CZ150093A3 (cs)
DE (1) DE69219325T2 (cs)
DK (1) DK0573536T3 (cs)
ES (1) ES2103934T3 (cs)
FI (1) FI933408A (cs)
FR (1) FR2672300B1 (cs)
GR (1) GR3024223T3 (cs)
HU (1) HU214440B (cs)
IL (1) IL100831A0 (cs)
NO (1) NO306562B1 (cs)
SK (1) SK82093A3 (cs)
WO (1) WO1992013942A1 (cs)
ZA (1) ZA92582B (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2807612B2 (ja) * 1993-03-12 1998-10-08 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
US5437992A (en) * 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
JP3435946B2 (ja) * 1994-12-21 2003-08-11 王子製紙株式会社 耐熱性キシラナーゼ
CA2234998A1 (en) * 1995-10-17 1997-04-24 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Xylanase, oligonucleotidic sequence encoding it and its uses
CA2989977A1 (en) * 2015-06-29 2017-01-05 Ferring B.V. Lactobacillus rhamnosus bacterium for treatment of e.g. bacterial vaginosis
CN112410264B (zh) * 2020-12-09 2022-04-22 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产耐高温碱性木聚糖酶的菌株及生产方法
CN112831436B (zh) * 2021-01-20 2022-05-03 山东大学 一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用
CN114457059B (zh) * 2022-01-21 2024-03-19 青岛尚德生物技术有限公司 一种含木聚糖酶的酶制剂及其在用于生产低聚木糖中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0248231B2 (ja) * 1983-09-09 1990-10-24 Rikagaku Kenkyusho Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho
JPH0248232B2 (ja) * 1989-04-24 1990-10-24 Rikagaku Kenkyusho Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho

Also Published As

Publication number Publication date
FR2672300B1 (fr) 1994-09-23
HUT64392A (en) 1993-12-28
FI933408A0 (fi) 1993-07-30
ES2103934T3 (es) 1997-10-01
EP0573536B1 (fr) 1997-04-23
HU214440B (hu) 1998-03-30
IL100831A0 (en) 1992-09-06
BR9205551A (pt) 1994-06-07
NO306562B1 (no) 1999-11-22
BG97987A (en) 1994-04-25
NO932668L (no) 1993-07-23
FI933408A (fi) 1993-07-30
ZA92582B (en) 1992-10-28
DK0573536T3 (da) 1997-12-01
ATE152168T1 (de) 1997-05-15
HU9302227D0 (en) 1993-11-29
GR3024223T3 (en) 1997-10-31
DE69219325D1 (de) 1997-05-28
SK82093A3 (en) 1994-09-07
KR930703432A (ko) 1993-11-30
AU666301B2 (en) 1996-02-08
CA2101063A1 (fr) 1992-08-02
FR2672300A1 (fr) 1992-08-07
AU1376192A (en) 1992-09-07
DE69219325T2 (de) 1998-01-29
JPH06506107A (ja) 1994-07-14
EP0573536A1 (fr) 1993-12-15
WO1992013942A1 (fr) 1992-08-20
NO932668D0 (no) 1993-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Smith et al. Xylanase production by Aspergillus awamori. Development of a medium and optimization of the fermentation parameters for the production of extracellular xylanase and β‐xylosidase while maintaining low protease production
EP2183363B1 (en) Fungal xylanase
EP2197893B1 (en) Novel fungal enzymes
Gomes et al. Production of a high level of cellulase-free xylanase by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus in laboratory and pilot scales using lignocellulosic materials
Ding et al. High activity xylanase production by Streptomyces olivaceoviridis E-86
Hrmová et al. Specificity of cellulase and β-xylanase induction in Trichoderma reesei QM 9414
WO2012027374A2 (en) Novel fungal carbohydrate hydrolases
Grüninger et al. A novel, highly thermostable D-xylanase
Flores et al. β‐Xylosidase and xylanase characterization and production by Streptomyces sp. CH‐M‐1035
Grajek Production of D-xylanases by thermophilic fungi using different methods of culture
US20140363846A1 (en) Process for producing cellulase mixtures from myceliophthora and related organisms
Marimuthu et al. Production and Optimization of Xylanase Enzyme from Bacillus subtilis using Agricultural Wastes by Solid State Fermentation.
CZ150093A3 (en) Xylanase, bacillus strains producing xylanase and their use
Bicho et al. The characterisation of a thermostable endo-β-1, 4-mannanase cloned from “Caldocellum saccharolyticum”
Éthier et al. Cloning of two xylanase genes from the newly isolated actinomycete Actinomadura sp. strain FC7 and characterization of the gene products
JP2020065514A (ja) 新規アラビノフラノシダーゼ
Senior et al. Xylanase production by Trichoderma harzianum E58
Shakoori et al. Screening, optimization and characterization of xylanase by locally isolated bacteria
De Souza et al. Influence of growth conditions on the production of xylanolytic enzymes by Aspergillus flavus
US6569646B2 (en) Process for the production of an enzyme preparation containing xylanase and carboxymethyl cellulase from termitomyces clypeatus having accession no 11CB-411
Rahmani et al. Endo-xylanase enzyme from marine actinomycetes and its potential for xylooligosaccharide production
NZ241453A (en) Xylanase and bacillus strains for its production.
Ahmed Partial purification and characterization of xylanase from Bacillus cereus X3
Yadav et al. Isolation, purification and characterization of xylanase produced by fish gut Bacillus cereus through submerged fermentation.
KR20230007077A (ko) 자일란 분해 활성을 갖는 신규 균주 크립토클라인 아르크토스타필리 rn2