SK82093A3 - Xylanase bacillus strain producing xylanase and their use - Google Patents

Xylanase bacillus strain producing xylanase and their use Download PDF

Info

Publication number
SK82093A3
SK82093A3 SK820-93A SK82093A SK82093A3 SK 82093 A3 SK82093 A3 SK 82093A3 SK 82093 A SK82093 A SK 82093A SK 82093 A3 SK82093 A3 SK 82093A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
xylanase
bacillus
xylo
oligosaccharides
culture
Prior art date
Application number
SK820-93A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Samain
Philippe Debeire
Michele Debeire-Gosselin
Jean-Pierre Touzel
Original Assignee
Agronomique Inst Nat Rech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Agronomique Inst Nat Rech filed Critical Agronomique Inst Nat Rech
Publication of SK82093A3 publication Critical patent/SK82093A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01032—Xylan endo-1,3-beta-xylosidase (3.2.1.32), i.e. endo-1-3-beta-xylanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Vynález sa týka xylanázy a kmeňov Bacillus, produkujúcich tento enzým.
Ďalej sa týka použitia tohto enzýmu a týchto baktérií pri bielení buničiny a príprave xylózy alebo xylo-oligosacharidov, hlavne z rastlinných surovín.
Doterajší stav techniky
Boli navrhnuté rôzne použitia xylanáz v oblasti biotechnológií, hlavne v oblasti potravinárstva (Biely, Trends Biotechnol. 3 (11), 286-290, 1985), v papierenskom priemysle (Mora a i. , J. Wood Chem. Technol. 6, 147-165, 1986) alebo pri výrobe chemických zlúčenín z hemicelulózy (Reilly P.J., 1981,
Xylanases: Structure and Function in Trends in the Biology of Fermentations for Fuels and Chemicals, A.J. Hollaender (Ed.) Plénum, New York).
Technická hlavne pomocou aplikácie však uskutočniteľnosť takých aplikácií bola hodnotená enzýmov, produkovaných mezofilnými hubami. Tieto môžu byť uľahčené použitím húb s lepšou tepelnou stabilitou.
Pre produkciu xylanáz sú známe rôzne baktérie a enzýmy (vid hlavne Wing a i., Microbiological Reviews, 52, č. 3, 305317, 1988). Doposiaľ najvyššie výťažky enzýmov boli dosiahnuté pri použití húb (Yu a i., Enzýme Microb. Technol. 9, 16-24, 1987). Medzitým už boli popísané hyperprodukčné kmene Bacillus (Okazaki a i., Appl. Microbiol. Biotechnology 19, 335-340, 1984, Okazaki a i., Agric. Biol. Chem. 49, 2033-2039, 1985). Druhy Bacillus, ktoré sú termofilné a degradujú xylán, môžu byť dobrými kandidátmi na priemyselnú produkciu xylanáz kvôli svojmu významnému rastovému faktoru a dobrej znalosti ich genetiky.
Xylanázy, izolované Okazakim a i., pochádzajú z dvoch kmeňov Bacillus, nazvaných autormi W1 a W2. V každom z týchto kmeňov boli preukázané dve zložky s xylanázovou aktivitou, nazvané la II. Zložky I degradujú xylán na xylobiózu a na oligoméry vyššieho polymeračného stupňa, zatiaľ čo zložky II produkujú okrem uvedených zlúčenín xylózu.
Zložky I (nazvané Wl.I a W2.I) majú molekulovú hmotnosť
21,5 kDa, resp. 22,5 kDa a izoelektrický bod 8,5, resp. 8,3. Zložky II (Wl.II a W2.II) majú molekulovú hmotnosť 49,5 kDa, resp. 50 kDa.
Obe zložky I i II sú inhibované iónami Hg2+ a v menšej miere iónami Cu2+.
Mnohé iné xylanázy boli izolované okrem iného z rôznych druhov Bacillus, Clostridium Aspergillus, Streptomyces alebo Trichoderma (vyššie citovaný Wong a i., 1988).
Napríklad abstrakt japonského patentu JP 13096 84 (Rikagaku Kenkyusho) sa týka xylanázy typu WII s molekulovou hmotnosťou 50 kD alebo 42 kD. Pre túto xylanázu nie je uvedená žiadna hodnota izoelektrického bodu.
1,
i. (Applied Microbiology and október 1990, str. 141-144) sa týka v prírode a produkujúceho xylanázu 60 a 70 °C a pH v rozmedzí 6 až 7.
Článok Rajarama
Biotechnology, zv. 34, č.
kmeňa Bacillus, izolovaného s optimálnou aktivitou medzi
Tento enzým nie je charakterizovaný molekulovou hmotnosťou ani izoelektrickým bodom. Tento kmeň produkuje naviac ďalšie enzýmy, ako sú celulázy.
Iný japonský abstrakt na meno Rikagaku Kenkyusho (JP 85 118 644) popisuje xylanázu s optimálnou aktivitou pri pH v rozmedzí 6 až 7. Tento enzým má molekulovú hmotnosť, stanovenú ultrafiltráciou, v rozmedzí 50 až 100 kD. V abstrakte nie je uvedený izoelektrický bod.
Článok Gruningera a i. (Enzýme Microbiólogy and Technology, zv. 8, máj 1986, str. 309-314) sa týka iného kmeňa Bacillus, izolovaného zo slizu a produkujúceho termostabilnú xylanázu. Enzým je charakterizovaný optimálnou aktivitou pri 78 °C a pri hodnote pH 7,5. Tento enzým nie je charakterizovaný molekulovou hmotnosťou ani izoelektrickým pH.
Priemyselná produkcia xylanáz naráža na súčasnú prítomnosť kontaminujúcich aktivít, ako sú celulázy, spôsobujúce zvýšenie nákladov na čistenie. Na druhej strane použitie geneticky modifikovaných zárodkov môže prinášať problémy, ako je nestabilita plazmidov, nesúcich gény s kódom pre xylanázy.
Podlá znalostí prihlasovatela sa najlepšia produktivita endoxylanázy, získanej pomocou mikroorganizmov neprodukujúceho celulázu, dosiahla pomocou mutantov Streptomyces lividans, zbavenej celulózovej aktivity po zavedení plazmidu, nesúceho gény kódujúce xylanázy A a B. V kultivačných médiách boli pozorované produktivity rádu 6000 až 10 000 U.I. 1/h. Jednako však je treba uviesť, že v tomto prípade sa vyskytli problémy, spojené s ne-hydrolýzou xylánu, nerozpustného xylanázou A a tepelnej stability u xylanázy B (Kluepfel a i., Biochem. J. 267, 47-50, 1990).
Žiaden z enzýmov, popísaných v známom stave techniky, teda podlá vedomosti prihlasovatela, -nemá charakteristiky, umožňujúce priemyselnú aplikáciu, t.j. dobrú tepelnú stabilitu, významnú schopnosť degradácie substrátov a možnosť prípravy pomocou superprodukčných kmeňov.
Podstata vynálezu
Prihlasovatel teda prekvapivým spôsobom preukázal, že určité kmene Bacillus produkujú termostabilné xylanázy s významnou degradačnou aktivitou.
Ešte prekvapujúcejším spôsobom prihlasovateľ preukázal, že tieto kmene Bacillus vylučujú vo velkom množstve uvedené enzýmy bez produkcie významného množstva celuláz.
Predmetom vynálezu sú kmene Bacillus, hyperprodukujúce xylanázu, hlavne kmene, uložené pod číslom 1-1017 a 1-1018 v Národnej zbierke kultúr mikroorganizmov Pasteurovho ústavu (Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de 1' Inštitút Pasteur).
Tieto kmene boli izolované z maštaľného hnoja.
Baktérie majú tvar krátkych rovných tyčiniek, tvoriacich spóry, strednej veľkosti 0,5 až 2,5 μπι. Sú zvyčajne osamotené alebo párové, majú grampozitívne sfarbenie a spóry sú oválne a centrálne.
Tieto kmene sú prísne aeróbne, v neprítomnosti kyslíka sa nepozoruje žiadny rast a nitrát sa používa len ako akceptor elektrónov.
Optimálne pH rastu a produkcie xylanázy je 7,8, zatiaľ čo limitné pH pre rast leží medzi 6,5 a 8,5 a maximálna teplota je 63 °C.
Okrem xylánu zúžitkovávajú tieto kmene xylózu, glukózu, sacharózu, maltózu a škrob. Fruktóza, arabinóza, celulóza, pektín a chitín nie sú zúžitkované. Okrem toho je rast inhibovaný chloridom sodným v koncentrácii 5 %.
Obsah G+C v DNA týchto kmeňov, stanovený termickou denaturáciou, je 57,5 % molárnych.
Tieto kmene sú dobre odlíšené od iných produkčných kmeňov xylanáz, ako je vidno z tabuľky I, pokiaľ sa týka odlišnej doby kultivácie a produktivity xylanázy.
Kmeň 1-1018 bol získaný mutagenézou kmeňa 1-1017. Kmeň 1-1018 má rovnaké všeobecné charakteristiky ako kmeň 1-1017, ale vyznačuje sa hyperprodukciou xylanázy.
Predmetom vynálezu je tiež termofilná xylanáza, majúca molekulovú hmotnosť asi 22 kDa a izoelektrický bod asi 7,7.
Výhodou tohto enzýmu je ďalej velká stabilita pri 60 °C počas doby aspoň 24 h a pH optimálnej aktivity v rozmedzí od 4,8 do 7, výhodne okolo 6.
Je vhodné zaznamenať, že pHi tohto enzýmu je dostatočne vysoké, ale jednako však nižšie ako pHi xylanáz s blízkymi molekulovými hmotnosťami, produkovaných druhmi Bacillus, hlavne popísaných Okazakim a i. (vyššie citovaná publikácia 1985).
pH 6 zodpovedá optimálnemu pH, ale aktivita zostáva vyššia ako 80 % v celom rozmedzí od 4,8 do 7.
Xylanáza podlá vynálezu môže mať túto N-terminálnu sekvenciu aminokyselín: Asn-Thr-Tyr-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala-ThrAsn-Gly-Gln.
Výhodne obsahuje vo svojej sekvencii 15 alanínov, 6 arginínov, 25 aspartátov a asparagínov, 19 glutamátov a glutamínov, 31 glycín, 3 histidíny, 6 izoleucinov, 7 leucínov, 3 lyziny, 1 metionín, 4 fenylalaníny, 8 prolínov, 19 serínov, 13 treoninov, 22 tyrozinov a 14 valínov.
Tento enzým je okrem toho inhibovaný Hg2+, ale nie Ag2+ (1 mM) ani 0,1 % SDS.
Michaelisova konštanta (Km) voči brezovému xylánu je 0,9 g/1.
Neutrálne oligosacharidy, produkované týmto enzýmom z brezového xylénu (5 g/1 brezového xylénu, 500 U/l, 60 °C) sú tvorené:
- pri velmi krátkej dobe enzymatickej inkubácie (15 min) xylotriózou a xylooligosacharidmi vyšších polymeračných stupňov,
- pri dlhých inkubačných dobách (24 až 72 h) xylobiózou, xylotriózou a xylotetraózou, ktorá je prítomná vo velmi slabom podiele.
Táto endoxylanáza je vylučovaná hlavne Bacillom, zvlášť jeho vyššie popísanými kmeňmi 1-1017 a 1-1018.
Je vylučovaná v kultivačnom médiu.
Kultivačné médium týchto kmeňov je charakterizované hlavne absenciou endo-p-l,4-glukanázovej aktivity (celuláza) a prítomnosťou velmi slabej kontaminujúcej β-xylozidazovej aktivity (okolo 0,06 U.I./ml supernatantu kultúry pre oba kmene). Je treba zaznamenať, že supernatant kultúry môže byť lyofilizovaný bez pozorovateľnej straty xylanázovej aktivity a uchovávaný zmrazený počas doby aspoň jedného roku bez straty aktivity.
Endo-β-Ι,4-glukanázové aktivity boli stanovené meraním produkujúcich cukrov, uvoľnených z karboxymetylcelulózy (CMC, 1 %) alebo Avicelu (1 %) v pufre na báze 50 mM acetátu sodného o pH 6, β-xylozidazová aktivita bola stanovená meraním uvoľňovania p-nitrofenolu z p-nitrofenyl-p-D-xylozidu (0,1 %) v pufre na báze 50 mM acetátu sodného o pH 6.
Jednotka xylanázovej aktivity (U.I.) je definovaná ako mikromól redukčného ekvivalentu xylózy, uvoľneného za minútu pri 60 °C.
Koncentrácia redukujúceho cukru sa stanovuje metódou Kidbyho a Davidsona (Anál. Biochem. 55, 321-325, 1973).
Čistený enzým sa uchováva v zmrazenej forme v 20 % etylénglykoltf bez pozorovateľnej straty aktivity počas doby jedného roku.
Predmetom vynálezu je d'alej spôsob výroby vyššie uvedenej xylanázy, spočívajúci v
- koncentrácii supernatantu kultúry Bacillus ultrafiltráciou,
- pasáži kolónou meniča iónov, ako je kolóna O-sepharosy Fast Flow (Pharmacia),
- pasáži kolónou hydrofóbnych interakcií ako je kolóna fenylseparózy (Pharmacia).
Koncentráciu supernatantu je možno hlavne vykonávať ultrafiltráciu na membráne z polysulfónu s vylučovacím prahom vyšším ako 10 kDa.
Tento postup umožňuje získať v podstate čistý xylanázový preparát.
Vynález sa ďalej týka spôsobu výroby vyššie popísanej xylanázy, spočívajúceho v
- v raste baktérií v médiu, obsahujúcom živný substrát, ako je glukóza a
- produkcii xylanázy, vyvolanej kontinuálnym vyživovaním kultúry xylooligosacharidmi v príslušných množstvách.
Predmetom vynálezu je tiež použitie vyššie uvedenej xylanázy pri bielení buničiny.
Výhoda tejto xylanázy spočíva v skutočnosti, že stupeň hydratácie buničiny má malú dôležitosť. Nie je nutné buničinu príliš riediť na dosiahnutie dobrého enzymatického ataku. Použitie tejto xylanázy ako pomocného prostriedku pri bielení buničiny je o to zaujímavejšie, že prípravky sú zbavené celulázových nečistôt.
Táto xylanáza môže byť tiež použitá na prípravu xylózy alebo xylooligosacharidov zo surovín rastlinného pôvodu, ktoré sú málo nákladné a obnovítelné (napríklad osi kukuričných klasov).
Ďalšie použitie xylanáz sú uvedené v literatúre. Prehlad Zeikuse a i. (Thermostable Saccharidases, New Sources, Uses and Biodesigns, in Enzymes in Biomass Conversion, Leatham a Himmel, ACS Washington, D.C., 1991) zhŕňa hlavné aplikácie xylanáz. Používajú sa hlavne pri výrobe potravín, kde ich vlastnosti umožňujú zlepšiť výrobu chleba, čírenia ovocných štiav a vín a nutričnú hodnotu obilnej vlákniny a pri výrobe potravinárskych zahusťovadiel.
Druhá oblasť využitia sa týka priemyslu papiera a vlákien, kde sa používajú na bielenie buničín, výrobu buničiny a čistenie vlákien na výrobu hodvábu.
Je zaznamenané tiež použitie vo výžive hydiny, kde sa xylanázy používajú na zníženie viskozity krmív (Van Paridon a i., Xylans and Xylanases, International Symposium, Wageningen,
8.-11.12.1991; Beford a Classe H.L., Xylans and Xylanases, International Symposium, Wageningen, 8.-11.12.1991).
Použitie xylanáz pri zhodnocovaní vedíajších produktov priemyslu buničiny je podrobnejšie uvedené v článku Bielyho (Trends in Biotechnology, zv. 3, č. 11, 1985).
Je možné tiež uviesť dva európske patenty EP 228 732 a EP 227 159, ktoré sa týkajú použitia xylanáz na zlepšenie filtrovatelnosti glukózového sirupu, resp. piva.
Bola tiež zaznamenaná možnosť používať xylanázy na výrobu chemických zlúčenín z hemicelulózy (vyššie citovaný Reilly).
Tieto rôzne publikácie ukazujú, že xylanázy podlá vynálezu môžu byť používané v mnohých aplikáciách.
Prehlad obrázkov na výkresoch
Vynález je bližšie objasnený v súvislosti s pripojenými výkresmi, ktoré však neobmedzujú jeho rozsah.
Obr. 1 znázorňuje vývoj dikontinuálnych kultúr kmeňa Ι-1Ό17. Na lavej zvislej osi sú vynesené redukujúce cukry a rast v mg/ml, na pravej zvislej osi xylanáza v jednotkách/ml pri 60 °C, na vodorovnej osi čas v h a krížik znamená proteíny, trojuholníček xylanázu a štvorček redukujúce cukry.
Obr. 2 znázorňuje kontinuálny vývoj kultúry kmeňa 1-1017 pomocou roztokov xylo-oligosacharidov s rôznymi koncentráciami. Na lavej zvislej osi je vynesený rast pri 550 nm, na pravej zvislej osi xylanáza v jednotkách/ml pri 60 °C, na vodorovnej osi čas v ha krížik znamená rast, prázdny krúžok násadu 0,26 g/h, prázdny štvorček násadu 0,36 g/h, plný krúžok násadu 0,50 g/h a plný trojuholníček násadu 0,67 g/j.
Obr. 3 znázorňuje 1-1017 a 1-1018 v xylo-oligosacharidov. Na v m.j./ml pri znamená násadu krúžok násadu 0,67 g/h.
°C,m na
1-1017 0?36 porovnanie produkcie xylanáz kmeňmi prítomnosti rôznych koncentrácií zvislej osi sú vynesené vodorovnej osi čas v h a g/h, krížik násadu 1-1018 xylanázy štvorček 0,36 g/h,
1-1017 0,67 g/h a trojuholníček násadu 1-1018
Obr. 4 znázorňuje uvoľňovanie xylo-oligosacharidov zo sulfátovej nebielenej buničiny pomocou rôznych koncentrácií xylanázy. Na zvislej osi je vynesené percento degradácie xylánu, na vodorovnej osi čas v h a plný trojuholníček znamená kontrolu, prázdny štvorček 10 U.I., prázdny trojuholníček 50 U.I., prázdny krúžok 200 U.I. a plný štvorček 1000 U.I.
Obr. 5 znázorňuje uvoľňovanie xylo-oligosacharidov z drvených osi kukuričných klasov. Na zvislej osi je vynesené percento degradácie xylánu a na vodorovnej osi čas v h.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Selekcia kmeňa 1-1017
Na obohatenie xylanolytických kmeňov boli ako inokulum použité rôzne vzorky pôdy, kompostu a hnoja. Po 24 h inkubácie sa v supernataňte kultúry zisúuje xylanázová aktivita a tri obohatenia, vykazujúce najvýznamnejšie aktivity, sa zriedia a rozmiestnia na agarové médium, obsahujúce xylán.
Základné kultivačné médium, obsahujúce minerály a vitamíny (Zeikus a Wolfe, J. Bacteriol. 109, 707-713, 1972) a kvasničný extrakt (0,2 %) sa doplní agarom (2 %) a ovseným xylánom (0,5 %). Po sterilizácii sa pridá KHCO^ (25 mM) z 1 M sterilného zásobného roztoku do izolačného média zmiešaných kmeňov. Naočkované Petriho misky sa inkubujú pri 55 °C v uzatvorených fľašiach.
Kolónie, tvoriace svetlé zóny, sa vyčistia. Vyberú sa najproduktívnejšie izoláty (kmeň 1-1017) a charakterizujú.
Obohacovanie a rast kultúr sa vykonáva aeróbnym spôsobom na miešanom vodnom kúpeli v uzatvorených fľašiach objemu 125 ml, obsahujúcich 10 ml média. Teplota inkubácie je 55 °C a médium sa tlmí na pH 7 prídavkom 50 mM KHCO3.
Príklad 2
Rast kmeňa 1-1017
Kinetika produkcie xylanáz sa vykonáva pri 55 °C vo fermentoroch s objemom 2 1 v počiatočnom objeme média 1,5 1. Po sterilizácii sa pridá 50 ml IM roztoku KHCO-j a pH sa upraví na
7,8 a udržiava na stupni nasýtenia 70 %.
Obr. 1 znázorňuje rast kmeňa 1-1017 v diskontinuálnej kultúre na ovsenom xyláne s koncentráciou 0,5 %. Kmeň 1-1017 produkuje až 110 jednotiek xylanázy/ml. V priebehu prvých hodín kultivácie je pozorovaná prechodná akumulácia redukujúcich cukrov. Táto akumulácia je dôsledkom prítomnosti malých množstiev xylanázy v inokule, kde katalyzujú rýchlu hydrolýzu rozpustného podielu xylánu a xylo-oligosacharidov.
Bakteriálny rast teda umožňuje konzumáciu xylooligosacharidov a syntézu xylanázy, ktorá začína hneď potom, kedy sa ich koncentrácia stane limitujúcou pre rast baktérií.
Produkcia xylanázy je približne konštantná počas doby 4 h (30 U.I. ml/h.).
Pri produkcii xylanázy sa pozoruje velká premenlivosť v závislosti na predchádzajúcej xylanázovej aktivite inokula, významu stacionárnej fázy a fyzikálnych charakteristikách xylánu.
Za účelom získania reprodukovateíných podmienok kultivácie bola produkcia xylanázy testovaná v kultúrach, vyživovaných roztokom v prítomnosti xylo-oligosacharidov. Obr. 2 ukazuje vplyv koncentrácie xylo-oligosacharidov.
Počiatočná koncentrácia cukru je 2 g/1. Substrát je spotrebovaný v priebehu exponenciálnej fázy rastu, v priebehu ktorej nie je detekovaná žiadna produkcia xylanázy.
Len čo sa koncentrácia substrátu začína stávať limitujúcou pre rast, pozoruje sa okamžitá syntéza xylanázy.
Miera a tiež doba produkcie enzýmu je závislá na dodávke substrátu, ktorá sa pohybuje od 0,26 g/h do 0,67 g/h s prietokom substrátu 24 ml/h a počiatočným objemom kultivačného média 1,5 1.
Šipka na obr. 2 zodpovedá prídavku xylo-oligosacharidov.
Najvýznamnejšia produkcia enzýmov (230 U.I./ml.) sa dosiahne, ak sa dodáva substrát rýchlosťou 0,36 g/h. Vyššie množstvo substrátu spôsobuje skrátenie doby produkcie xylanáz.
Ak sa použije na miesto xylo-oligosacharidov glukóza, produkcia xylanázy sa značne zníži (14 U.I./ml) a trvá menej ako 2 h.
Naproti tomu použitie glukózy ako počiatočného substrátu nemení výťažok xylanázy v porovnaní s použitím xylooligosacharidov .
Za účelom prípravy xylo-oligosacharidov ako substrátov v kontinuálnych kultúrach sa inkubuje suspenzia ovseného xylánu s koncentráciou 5 % počas doby 8 h pri 60 °C a pri pH 6 v prítomnosti 5 jednotiek xylanázy na 1 ml. Táto suspenzia sa potom odstredí a získaný supernatant sa autoklávuje.
Príklad 3
Čistenie xylanázy z kultúry kmeňa 1-1017
Postup čistenia xylanázy zahrňuje tieto stupne:
- koncentráciou supernatantu kultúry Bacillus ultrafiltraciou na polysulfónovej membráne s vylučovacím prahom 10 kDa,.
- pasáž kolónou meniča iónov Sepharose Fast Flow (Pharmacia),
- pasáž kolónou hydrofóbnych interakcií fenylseparózy (Pharmacia).
Výsledky tohto čistenia sú zhrnuté v tabuíke II.
Toto čistenie ukazuje, že hlavným proteínom medzi proteínmi vylučovanými v kultivačnom médiu je endoxylanáza (okolo 50 % celkových vylučovaných proteínov).
Príklad 4
Charakterizácia xylanázy μιη xylanázy, čistenej podlá príkladu 3, bolo podrobené stanoveniu sekvencie v plynnej fáze prístrojom typu Applied Biosystems 470 A. Fenyltíodydantoinové (PTH) deriváty všetkých aminokyselín boli identifikované vysokotlakovou kvapalinou chromatografiou (HPLC) pomocou analyzátora PTH, spojeného s prístrojom Applied Biosystems 120 A.
Získaná N-terminálna sekvencia prvých 20 aminokyselín: Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.
Celkové zloženie aminokyselín bolo stanovené tiež po hydrolýze 5,6 N kyselinou chlorovodíkovou pri 100 °C počas doby 24 h.
Výsledky sú uvedené v tabulke III, kde je uvedený molárny percentuálny podiel každej aminokyseliny, odhadnutý počet zvyškov každého typu v proteíne a pre porovnanie počet zvyškov každého typu v N-terminálnych 20 aminokyselinách.
Je nutné poznamenať, že asparagínové a glutamínové zvyšky boli počítané spolu s aspartátovými, resp. glutamátovými zvyškami a že tryptofánové a cysteínové zvyšky neboli merané.
Príklad 5
Mutagenéza kmeňa 1-1017
Kultivácia kmeňa 1-1017 bola vykonaná v médiu, obsahujúcom xylán a etylmetánsulfonát (EMS).
Ošetrené bunky sa dvakrát premyjú, inkubujú cez noc a rozprestrú na médium agar - xylán.
Klony sa kultivujú v sklenených mikroskúmavkách (8 x 35 mm), plnených 100 μΐ kultivačného média doplneného ovseným xylánom (0,5 %). Mikroskúmavky sa proti odparovaniu uzavrú silikónovými zátkami a inkubujú sa na trepačke 24 h pri 55 °C.
Pre výber mutantov sa paralelne testuje 96 vzoriek: 20 μΐ kultúry z každej mikroskúmavky sa prenesie pomocou viackanálovej pipety do polypropyIónových mikroskúmaviek, kde prebieha za teploty miestnosti hydrolýza xylánu. Reakcie sú iniciované prídavkom 300 μΐ suspenzie substrátu do každej skúmavky a zastaví sa 400 μΐ kyseliny 3,5-dinitrosalicylovej. Potom, čo sa vykoná počas doby 15 min var, sa 50 μΐ z každej skúmavky prenesie na mikrotitračnú doštičku k odpočítaniu optickej hustoty.
Klony, vykazujúce najvýznamnejšiu xylanázovú aktivitu, sa opakovane testujú piatimi po sebe idúcimi prepichnutiami a porovnajú sa s rodičovským kmeňom.
Mutanty vykazujúce významný vzrast xylanázovej aktivity, boli vybrané z 500 klonov, izolovaných po mutagenéze pomocou EMS.
Tieto mutanty vykazujú zvýšenie xylanázovej aktivity v diskontinuálnych kultúrach v médiu, obsahujúcom xylán.
Produktivita xylanázy u týchto mutantov sa stanoví tiež v kultúrach, vyživovaných kontinuálne. Pri prietoku xylo-oligosacharidov 0,36 g/h sa výťažok xylanázy u mutantov
1-1018 významne nezvýši (o menej ako 10 %) oproti divokému kmeňu 1-1017, ako ukazuje obr. 3, ktorý znázorňuje rozdielny rast kmeňov 1-1017 a 1-1018 pri dvoch koncentráciách xylo-oligosacharidov.
Ak sa zvýši prietok xylo-oligosacharidov na 0,67 g/1, vykazuje napríklad kmeň 1-1018 dvakrát väčšie zvýšenie produkcie xylanázy oproti kmeňu 1-1017 (rodičovský kmeň).
Získanie mutantov a optimalizácia podmienok kultúry, vyživovanej kontinuálne, umožňuje zvýšenie produkcie xylanázy faktorom 3 v porovnaní s diskontinuálnymi kultúrami divokého kmeňa na xyláne. Tieto zvýšené pomery enzýmov (až 392 U.I./ml) sa získajú po 7 h kultivácie a produktivita xylanázy pomocou 1-1018 je teda značne vyššie ako u najlepších kmeňov húb a baktérií (Bertrand a i. Biotechnol. Bioeng., 33, 791-794, 1989; vyššie citovaný Yu a i., 1987), produkujúcich xylanázu, ktoré potrebujú niekolko dní na získanie takéhoto množstva enzýmov.
Príklad 6
Ošetrenie buničiny (nebielenej sulfátovej) xylanázou
Na 8,5 g vlhkej buničiny (zodpovedajúci 1 g sušiny), pochádzajúcej z borovice prímorskej a obsahujúcej 60 mg xylánu, sa pôsobí pri 60 °c počas doby 24 h 25 ml pufru (obsahujúceho rôzne koncentrácie xylanázy).
Kinetika uvolňovania xylo-oligosacharidov je znázornená na obr. 4. Prejavilo sa spoločné uvoľňovanie derivátov lignínu (meraním optickej hustoty pri 280 nm).
Príklad 7
Získavanie xylo-oligosacharidov z drvených osí kukuričných klasov g (sušina) prášku z osi kukuričných klasov (granulometria > 100 mesh) sa suspenduje v 100 sodného o pH 6, obsahujúceho h pri 60 ° ml pufra
1000 U.I.
na báze 50 mM acetátu xylanázy a inkubuje sa
C.
Obr. 5 ukazuje, transformovať až (xylo-oligósacharidy zlúčeniny je a arabinózy.
že je možné xylánu za týchto podmienok na oligosacharidy a arabino-xylo-oligosacharidy. Tieto možné použiť ako také alebo ako prekurzory xylózy %
Tabulka I
Porovnanie produkcie xylanáz kmeňmi podlá vynálezu a podlá známeho stavu
kmeň substrát produktivita xylanázy doba odkaz kultivácie
υ.ΐ.χαΐ“1^1 h
Clostridium thermo1act i cum Clostridium stercorarlum glukóza xylán 0.65 0.78 40 72 Brodel,B.. E.Samain a P.Debelre 1990 Biotechnol.Lett. 12<1).65-70 Berenger.J.F.. C.Frixon. J. Bigllardi a N. Creuzet 1985 Can.J.Microbiol. 31,635-642
Thermoascus xylán 2,40 240 Yu.E.K.C..L.U.L.
auriantacus Tan.M.K.H.Chan,
L.Deschatelets
a J.N.Saddler
1987, Enzýme
Microb.Technol.
9,16-24
Thlelavia Solka -Floc** 1.04 18 Merchant.R..F.
terrestris Merchant a Ä.
Margaritls 1988 Biotechol.Lett.
Streptomyces xy lán
16.76 livldans A
Streptomyces xylóza
3.25 livldans B
Bacillus sp. xylóza 2,47
alcalophile
10C7>,513-516
Bertrand,J.L.. R.Morosoli.F. Shareck a D. Kluepfel 1989 Biotechnol. Bioeng. 33C6). 791-794
Kluepfel.D.,S.
Vats-Mehta, F. Äumont.F.Shareck a R.Morosol! 1990 Biochem.J.267,45-50
Okazaki V..T.Akiba K.Horikoshi a R. Akahoshi 1984 Appl.Microbiol. Biotechnol. 19, 335-340
Bacillus sp. xylo- 44
podľa oligosacharidy
vynálezu
mutanta xylo- 78.4
Bacillus sp. oligosacharidy podľa vynálezu * Solka-Floc: čistená celulóza obsahujúca 5 až 7 % hemicelulózy
Tabuľka II
stupeŕ i frakcia objem celkové proteíny (mg) celková xylanázová aktivita (U.I.) špecifická aktivita (U.I./mg.) výťažok (%)
supernatent kultúry 1500 216 232000 1071 100
I koncentrácia 150 197 225000 1142 97
II Q Sepharose Fast Flow 250 142 204250 1438 88
III FenylSepharose 205 72 143500 1993 62
Tabuľka III
Celkové aminokyselinové zloženie xylanázy
aminokyselina % molárne odhadovaný sekventovanie
počet počet zvyškov
zvyškov (v čiastočnej
sekvencii 1-20)
alanín 7,5 15 1
arginin 3,0 6 0
aspargin (a) (a) 3
kys. asparágová 14,5 29 1
cystein (C) (c) 0
kys. glutámová 9,5 19 0
glutamin (b) (b) 2
glycin 15,5 31 3
histidín 1,5 3 0
izoleucin 3,0 6 1
leucin 3,5 7 0
lyzin 1,5 3 0
metionín 0,5 1 0
fenylalanín 2,0 4 0
prolin 4,0 8 0
serín 9,5 19 0
treonín 6,5 13 3
tryptofan (C) (c) 2
tyrozin 11,0 22 3
valín 7,0 14 1
(a) počítané ako kyselina asparagová
(b) počítané ako kyselina glutámová
(c) nemerané
PV 820 - 73

Claims (13)

1. Kmeň Bacillus, produkujúci xylanázu uložený pod číslom 1-1017 v Národnej zbierke kultúr mikroorganizmov Pasteurovho inštitútu.
2. Kmeň Bacillus, produkujúci xylanázu, uložený pod číslom 1-1018 v Národnej zbierke kultúr mikroorganizmov Pasteurovho inštitútu.
3. Termofilná xylanáza, vyznačujúca sa tým, že má molekulovú hmotnosť okolo 22 kDa a izoelektrický bod okolo 7,7.
4. Xylanáza podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že je stabilná pri asi 60 °C.
5. Xylanáza podlá niektorého z nárokov 3 a 4, vyznačujúca sa tým, že jej pH pri optimálnej aktivite leží v rozmedzí 4,8 až 7 a je výhodne asi 6.
6. Xylanáza podlá niektorého z nárokov 3 až 5, vyznačujúca sa tým, že má túto N-terminálnu sekvenciu aminokyselín: Asn-Thr-Tyr-Trp-Gln-Tyr-Trp-Thr-Asp-Gly-Ile-Gly-Tyr-Val-Asn-Ala-Thr-Asn-Gly-Gln.
7. Xylanáza podlá niektorého z nárokov 3 až 6, vyznačujúca sa tým, že obsahuje vo svojej sekvencii 15 alanínov, 6 arginínov, 29 aspartátov a asparagínov, 19 glutamátov a glutamínov, 31 glycín, 3 histidíny, 6 izoleucínov, 7 leucínov, 3 lyziny, 1 metionín, 4 fenylalaníny, 8 prolínov, 19 serínov, 13 treonínov, 22 tyrozínov a 14 valínov.
8. Xylanáza podlá niektorého z nárokov 3 až 7, vyznačujúca sa tým, že je vylučovaná Bacillom.
9. Xylanáza vylučovaná jedným pódia nároku 8, z kmeňov Bacillus vyznačujúca sa tým, že je podlá niektorého z nárokov
1 alebo 2.
10. Spôsob prípravy čistenej xylanázy pódia niektorého z nárokov 8 a 9, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje stupne
- koncentrácie supernatantu kultúry Bacillus,
- pasáže kolónou meniča iónov,
- pasáže kolónou hydrofóbnych interakcií.
11. Spôsob produkcie xylanázy pódia niektorého z nárokov
8 a 9, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje stupne
- rastu baktérií v médiu, obsahujúcom živný substrát, ako je glukóza a
- produkcie xylanázy, vyvolanej kontinuálnym vyživovaním kultúry xylo-oligosacharidmi v príslušných množstvách.
12. Použitie xylanázy podlá niektorého bielení buničiny.
z nárokov 3 až 9 pri
13. Použitie xylanázy pódia niektorého z nárokov 3 až 9 pri príprave xylo-oligosacharidov zo surovín rastlinného pôvodu.
SK820-93A 1991-02-01 1992-01-28 Xylanase bacillus strain producing xylanase and their use SK82093A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9101191A FR2672300B1 (fr) 1991-02-01 1991-02-01 Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations.
PCT/FR1992/000077 WO1992013942A1 (fr) 1991-02-01 1992-01-28 Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK82093A3 true SK82093A3 (en) 1994-09-07

Family

ID=9409300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK820-93A SK82093A3 (en) 1991-02-01 1992-01-28 Xylanase bacillus strain producing xylanase and their use

Country Status (21)

Country Link
EP (1) EP0573536B1 (sk)
JP (1) JPH06506107A (sk)
KR (1) KR930703432A (sk)
AT (1) ATE152168T1 (sk)
AU (1) AU666301B2 (sk)
BG (1) BG97987A (sk)
BR (1) BR9205551A (sk)
CA (1) CA2101063A1 (sk)
CZ (1) CZ150093A3 (sk)
DE (1) DE69219325T2 (sk)
DK (1) DK0573536T3 (sk)
ES (1) ES2103934T3 (sk)
FI (1) FI933408A0 (sk)
FR (1) FR2672300B1 (sk)
GR (1) GR3024223T3 (sk)
HU (1) HU214440B (sk)
IL (1) IL100831A0 (sk)
NO (1) NO306562B1 (sk)
SK (1) SK82093A3 (sk)
WO (1) WO1992013942A1 (sk)
ZA (1) ZA92582B (sk)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2807612B2 (ja) * 1993-03-12 1998-10-08 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 新規キシラナーゼ、その製造法、該キシラナーゼによるパルプ処理方法及びキシロオリゴ糖の製造法
US5437992A (en) * 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
JP3435946B2 (ja) * 1994-12-21 2003-08-11 王子製紙株式会社 耐熱性キシラナーゼ
CA2234998A1 (en) * 1995-10-17 1997-04-24 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Xylanase, oligonucleotidic sequence encoding it and its uses
KR20180021777A (ko) * 2015-06-29 2018-03-05 훼링 비.브이. 세균성 질증의 치료를 위한 락토바실러스 람노서스 박테리아
CN112410264B (zh) * 2020-12-09 2022-04-22 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产耐高温碱性木聚糖酶的菌株及生产方法
CN112831436B (zh) * 2021-01-20 2022-05-03 山东大学 一株极地杆菌属1,3/1,4-木聚糖降解菌及其培养方法与应用
CN114457059B (zh) * 2022-01-21 2024-03-19 青岛尚德生物技术有限公司 一种含木聚糖酶的酶制剂及其在用于生产低聚木糖中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0248231B2 (ja) * 1983-09-09 1990-10-24 Rikagaku Kenkyusho Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho
JPH0248232B2 (ja) * 1989-04-24 1990-10-24 Rikagaku Kenkyusho Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho

Also Published As

Publication number Publication date
ZA92582B (en) 1992-10-28
DK0573536T3 (da) 1997-12-01
GR3024223T3 (en) 1997-10-31
IL100831A0 (en) 1992-09-06
ATE152168T1 (de) 1997-05-15
WO1992013942A1 (fr) 1992-08-20
DE69219325D1 (de) 1997-05-28
AU666301B2 (en) 1996-02-08
FR2672300A1 (fr) 1992-08-07
NO932668D0 (no) 1993-07-23
FR2672300B1 (fr) 1994-09-23
AU1376192A (en) 1992-09-07
EP0573536A1 (fr) 1993-12-15
HU9302227D0 (en) 1993-11-29
FI933408A (fi) 1993-07-30
KR930703432A (ko) 1993-11-30
DE69219325T2 (de) 1998-01-29
NO932668L (no) 1993-07-23
CZ150093A3 (en) 1994-01-19
BG97987A (en) 1994-04-25
NO306562B1 (no) 1999-11-22
EP0573536B1 (fr) 1997-04-23
FI933408A0 (fi) 1993-07-30
HU214440B (hu) 1998-03-30
BR9205551A (pt) 1994-06-07
HUT64392A (en) 1993-12-28
ES2103934T3 (es) 1997-10-01
CA2101063A1 (fr) 1992-08-02
JPH06506107A (ja) 1994-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ding et al. High activity xylanase production by Streptomyces olivaceoviridis E-86
Smith et al. Xylanase production by Aspergillus awamori. Development of a medium and optimization of the fermentation parameters for the production of extracellular xylanase and β‐xylosidase while maintaining low protease production
US10017756B2 (en) Mutant xylanase, manufacturing method and use therefor, and method for manufacturing saccharified lignocellulose
BRPI0816478B1 (pt) Processos de fermentação para a produção de uma mistura de celulases e de hidrólise de um substrato de celulose e uso de mistura de celulases em processo de fermentação
Flores et al. β‐Xylosidase and xylanase characterization and production by Streptomyces sp. CH‐M‐1035
US20140363846A1 (en) Process for producing cellulase mixtures from myceliophthora and related organisms
Grajek Production of D-xylanases by thermophilic fungi using different methods of culture
Marimuthu et al. Production and Optimization of Xylanase Enzyme from Bacillus subtilis using Agricultural Wastes by Solid State Fermentation.
JP5718899B2 (ja) 発酵条件による酵素バランスの変更
SK82093A3 (en) Xylanase bacillus strain producing xylanase and their use
Ahmad et al. Effect of corn cobs concentration on xylanase biosynthesis by Aspergillus niger
Bicho et al. The characterisation of a thermostable endo-β-1, 4-mannanase cloned from “Caldocellum saccharolyticum”
Shakoori et al. Screening, optimization and characterization of xylanase by locally isolated bacteria
US6569646B2 (en) Process for the production of an enzyme preparation containing xylanase and carboxymethyl cellulase from termitomyces clypeatus having accession no 11CB-411
Haq et al. Optimization of cultural conditions for the production of xylanase by chemically mutated strain of Aspergillus niger GCBCX-20
De Souza et al. Influence of growth conditions on the production of xylanolytic enzymes by Aspergillus flavus
RU2323254C2 (ru) ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ И КСИЛОГЛЮКАНАЗЫ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ
NZ241453A (en) Xylanase and bacillus strains for its production.
Svarachorn Production of fungal-xylanase using agricultural waste by solid state fermentation
Archana et al. Screening of cellulolytic bacteria for producing cellulase under solid state fermentation using water hyacinth as a substrate
TW201917212A (zh) 具提升活性的木醣苷酶
Periasamy et al. Optimization of xylanase production from Aspergillus flavus in solid state fermentation using agricultural waste as a substrate
Ahmed Partial purification and characterization of xylanase from Bacillus cereus X3
Yadav et al. Isolation, purification and characterization of xylanase produced by fish gut Bacillus cereus through submerged fermentation.
KR20230007077A (ko) 자일란 분해 활성을 갖는 신규 균주 크립토클라인 아르크토스타필리 rn2