CZ149499A3 - Diagnostický a/nebo léčebný prostředek - Google Patents

Description

Vynález se týká diagnostických a/nebo léčebných prostředků, zvláště takových, které obsahují skupiny s afinitou pro místa a/nebo struktury v organismu, takže mohou zlepšit podmínky při diagnostickém zobrazování a/nebo při léčebných zákrocích v organismu. Vynález se zvláště týká zlepšených diagnostických prostředků pro zobrazování ultrazvukem.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že zobrazování ultrazvukem je diagnosticky velmi cenné například při sledování cévního systému, zejména v kardiografii.a při sledování zásobení tkání.· Byla již navrhována celá řada kontrastních prostředků za účelem zvýraznění takto získaného obrazu včetně suspenzí pevných Částic, emulgovaných kapalných částic, bublinek v plynu a zapouzdřených plynů nebo kapalin. Obecně je uznáváno, že kontrastní prostředky s nízkou hustotou, které jsou snadno stlačitelné jsou zvláště účinné při odrazu zvuku. Z tohoto důvodu je věnován velký zájem přípravě systémů, které obsahují plyn nebo které plyn vytvářejí.

Je také známo, že kontrastní prostředky s obsahem plynů je možno využít i při zobrazování pomocí magnetické rezonance MR, například jako kontrastní prostředky, které sníží intanzitu signálu MR. Potenciálně použitými' kontrastními látkami pro paramagnetickou MR jsou také prostředky s obsahem kyslíku.

I

Mimoto bylo při zobrazování pomocí rtg-záření pozorováno, že je možno použít plyny, například oxid uhličitý, *« ♦··· • · « · · • « · · · · • · · · v · » • · ♦ · · · « · Λ · · · ···· 9 9 ·9 9 9 jako negativní perorální kontrastní prostředky nebo jako nitrožilně podávané kontrastní prostředky.

Použití radioaktivních plynů, například radioaktivních isotopů inertních plynů, například xenonu bylo rovněž navrhováno pro scintigrafii, například při zobrazování cév.

Cílené kontrastní prostředky pro zobrazování ultrazvukem jsou takové prostředky, které obsahují i) reportérovou skupinu, schopnou interakce se zvukovými vlnami za vzniku rozlišitelného signálu, ii) jeden nebo větší počet vektorů s afinitou pro určité cílové místo a/nebo cílovou strukturu v organismu, například pro specifické buňky nebo pathologicky změněné oblasti a iii) nejméně jeden spojovník, spojující reportérovou skupinu a vektor nebo vektory v případě, že nejsou spojeny přímo.

Molekuly a/nebo struktury, na něž se má kontrastní prostředek vázat, jsou označovány jako cílové struktury. Aby bylo možno specificky zobrazit určitou vybranou oblast nebo strukturu v organismu, musí být v této oblasti přítomna cílová struktura pro tento prostředek. V ideálním případě dochází k expresi takové struktury pouze v oblasti, která má být zobrazena, obvykle však bude taková struktura přítomna i jinde v organismu, čímž mohou vznikat problémy. Cílová struktura může být tvořena definovaným druhem cílových molekul nebo neznámými molekulami nebo složitější strukturou, přítomnou v oblasti zobrazování a má se specificky nebo selektivně vázat na molekulu použitého vektoru.

Vektor je spojen s reportérovou skupinou tak, aby se tyto skupiny mohly vázat na zobrazenou oblast nebo strukturu. Vektor se může specificky vázat na cílovou strukturu nebo se váže pouze selektivně a může mít afinitu také pro omezené množství jiných molekul nebo struktur, čímž opět vznikají problémy.

·· ··»· • 9 ·· «« _wv • » · 9 9 · 999* • · 9 9··· 9 9»· • ··· 99 ·· 9 « 9 999

9 9 9 · 9 · < _v •999 99 99 9« 99 99

Existuje omezené množství údajů, které se týkají známých kontrastních prostředků pro cílené zobrazování ultrazvukem. Například US 5 531 980 popisuje systémy, v nichž reportér je tvořen vodnou suspensí mikrobublinek vzduchu nebo plynu, stabilizovanou nejméně jedním smáčedlem, vytvářejícím film a přítomný alespoň z Části v lamelární nebo laminární formě, přičemž toto smácedlo je vázáno na jeden nebo větší počet vektorů, tvořených bioaktivními materiály pro specifické zacílení prostředku. Uvádí se, že mikrobublinky nejsou přímo zapouzdřeny ve smácedle, nýbrž smácedlo se spíše nachází v liposomech, naplněných kapalinou, které stabilizují mikrobublinky. Je zřejmé, že lamelární nebo laminární smácedlo, například fosfolipid bude nezbytně přítomno ve formě jedné nebo většího počtu lipidových dvojvrstev s lipofilními zakončeními a hydrofilním koncem na opačné straně, jak je popsáno v Schneider M., Liposomes as drug carriers: 10 years of research, Drug targeting, Nyon, Švýcarsko, 3. až 5. října 1984, Buri P. a Gumma A., (ed.), Elsevier, Amsterdam 1984.

V EP 727 225 se. popisuje cílené kontrastní činidlo pro zobrazování ultrazvukem, v němž je reportér tvořen chemickou látkou s dostatečným tlakem par, takže část této látky se nachází při teplotě organismu ve formě plynu. Tato chemická látka je spojena s nosičem typu smáčedla nebo albuminu, jako vektor je použita molekula typu bílkoviny, peptidů nebo uhlohydrátů. Receptorové skupiny v těchto kontrastních látkách' odpovídají posunu fáze koloidních systémů, popsanému v mezinárodní přihlášce WO 94/16 739. Nyní bylo zjištěno, že při podávání koloidů s posunem fáze může dojít ke vzniku mikrobublinek, které mohou neřízené růst do té míry, že dojde k nebezpečné embolizaci například v srdečních nebo mozkových cévách, jak bylo popsáno v Schwarz, Advances in Echo-Contrast, 1994, (3), str. 48 až 49.

* · fcfcfcfc fcfc fc · fc fc fcfcfc

V mezinárodní patentové přihlášce WO 93/20 802 se navrhuje dosáhnout zlepšení obrazu při zobrazování ultrazvukem s použitím oligolamelárních liposomů, konjugovaných se specifickými vaznými látkami pro určité tkáně, například protilátkami, peptidy, lektiny a podobně pro lepší odraz zvuku. Liposomy se volí tak, aby byly prosté plynu a neměly tedy výhodné echogenní vlastností. Další údaje o této technologii, například při zacílení na fibrin, thromby a atherosklerotické oblasti je možno nalézt v publikacích Alkanonyuksel H, a další, J. Pharm. Sci., 1996, 85(5), 486 až 490, J. Am. Coli. Cardiol., 1996,27(2) Suppl. A, 298A a Circulation, 68 Sci. Sessions, Anaheim 13. až 16. listopadu 1995.

Existuje také řada publikací, týkajících se kontrastních prostředků k zobrazování ultrazvukem a uvádějících možnost použití monoklonálních protilátek jako vektorů, aniž by však byly uváděny praktické podrobnosti a/nebo reportérové materiály, které by mohly být přijímány retikuloendotheliálním systémem a tak umožnit zlepšené zobrazování některých orgánů, například jater. Tyto údaje byly uvedeny zejména ve WO 93/00933, WO 94/01140, WO 94/08627, WO 94/28874, US č.

088'499, US 5 348 016 a US 5 469 854.

Vynález je založen na zjištění, že mikrobublinky, vyplněné plynem a stabilizované vrstvami filmotvorného smáčedla jsou zvláště,vhodnými reportéry v diagnostických a/nebo léčebných prostředcích, u nichž se vyžaduje zacílení; Ohebnost a deformovatelnost takové tenké jednovrstevné membrány podstatně zvyšuje echogenitu reportérů relativně k liposomovému systému s obsahem lipidových dvojvrstev nebo většího poctu takových dvojvrstev. Tím se umožní použití velmi malých dávek reporterového materiálu k dosažení vysocekontrastního obrazu pomocí ultrazvuku, což současně zvyšuje bezpečnost postupu.

• * * ·· « • * Β Β · v • · · Β Β ·

Β Β » · · · · · · Β Β * Β Β * · · ΒΒ «Μ · Β Β

ΒΒΒ···· · · ···· ·· *· ΒΒ ΒΒ ·Β

- 5 Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří diagnostický a/nebo léčebný prostředek s možností zacílení, například kontrastní prostředek pro zobrazování ultrazvukem, který je v suspenzi vodné nosné kapaliny, například injekční nosné kapaliny tvořen reportérem, sestávajícím z mikrobublinek, vyplněných plynem a stabilizovaných vrstvou filmotvorného smáčedla, přičemž prostředek dále obsahuje nejméně jeden vektor.

Pod pojmem vrstva nebo jednoduchá vrstva se rozumí skutečnosti, že amfifilní skupiny smáčedla vytvářejí jednovrstevné filmy nebo membrány, podobné tak zvaným Langmuir-Blodgettovým filmům na rozhraní plynu a kapaliny, lipofilní části amfifilních skupin jsou při tom přivráceny k plynné fázi a hydrofilní části se dostávají do interakce s vodnou fází.

Jak bylo uvedeno v mezinárodní patentové přihlášce WO 97/29783 je pravděpodobné, že elektrostatické napětí mezi nabitými fosfolipiďovými membránami přispívá ke tvorbě stálé a stabilizační vrstvy na rozhraní mezi mikrobublinkou a nosnou kapalinou. Ohebnost a deformovatelnost takových tenkých membrán pravděpodobně zlepšuje echogenltu prostředků podle vynálezu relativně k liposomům, vyplněným plynem, které obsahují jednu nebo větší počet lipidových dvojvrstev. Množství fosfolipidu, užitého ke stabilizaci vodných suspenzí s obsahem mikrobublinek může být množství, dostatečné pro tvorbu jednoduchých vrstev smáčedla kolem mikrobublinek plynu, výsledná struktura, podobná filmu pak stabilizuje mikrobublinky proti praskání nebo spojování. Při tak nízké koncentraci fosfolipidu nedochází ke tvorbě mikrobublinek s dvojvrstvou, podobnou jako u liposomů.

Jedno z výhodných provedení prostředku podle vynálezu je založeno na dalším zjištění, že omezené spojení s cílovou φφ φφ • φ φ φ • · φ ·

Φ φ φ · φ · · «φφφ φφ φφ «φ strukturou, takové vlastnosti je u diagnostických a/nebo léčebných prostředků možno s výhodou dosáhnout při použití různých vektorů, které jsou schopné se dočasně vázat na cílovou strukturu spíše než se na ni trvale fixovat. Znamená, že takové prostředky nejsou fixně vázány na specifických místech, nýbrž může jít například o zpomalený průchod podél cévního endothelu vzhledem k přechodné interakci s buňkami této struktury. Takové prostředky se tedy mohou koncentrovat u stěn krevních cév a mohou zlepšit zobrazování těchto cév v určitých orgánech. Tímto způsobem může dojít ke zlepšenému zobrazení kapilárního systému a tím k usnadnění rozlišení mezi normální a nedostatečně zásobenou tkáni, například v srdečním svalu a mimoto může také jít ke zviditelnění některých struktur, jako jsou Kupfférový buňky, thromby, atherosklerotická poškození nebo oblasti zánětlivé tkáně a tkáně s nově vytvořenými cévami v případě nádoru. Prostředek podle vynálezu je také schopen zobrazit změny cév, k nimž dochází v oblasti nekrosy tkáně.

V dalším provedení vynálezu je možno s reportérem spojit nebo do reportéru zařadit jeden nebo větší počet vektorů, které nejsou přímo vystaveny cílové struktuře nebo receptoru pro cílovou strukturu. Zvýšené specifičnosti pro určitou tkáň je tedy mošno dosáhnout až použitím dalšího postupu k expozici vektoru, například po zásahu ultrazvukem k modifikaci schopnosti difúze skupin s obsahem vektoru,

V kontrastních prostředcích podle vynálezu může být obsažen jakýkoliv biokompátibilní plyn. Pod tímto pojmem se v průběhu přihlášky rozumí jakákoliv látka včetně směsí látek, které jsou v podstatě nebo úplně v plynné formě včetně formy par při běžné teplotě lidského organismu, 37 °C. Plynem tedy může být například vzduch, dusík, kyslík, oxid uhličitý, vodík, inertní plyn, jako helium, argon, xenon nebo * · »»»· ·· «4 • Φ 9 « · 9 ♦ · · · ·♦· • · · · · * • · · * « «»·» ·· «· 1« • 9 «« « ♦ · · • 9 9 · • 9 ·· ·· krypton, fluorid sírový, jako hexafluorid sírový, dekafluorid dvojsírový nebo pentafluorid trifluormethylsíry, fluorid selenový a případně halogenované silany, jako methylsilan nebo dimethylsilan, uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotností, například o až 7 atomech uhlíku, například alkany, jako methan, ethan, propan, butan nebo pentan, cykloalkany, jako cyklopropan, cyklobutan nebo cyklopentan, alkeny, jako ethylen, propen, propadíen nebo buten nebo alkiny, jako acetylen nebo propin, ethery, jako dimethylether, ketony, estery, halogenované uhlovodíky s nízkou molekulovou hmotnosti, například až o 7 atomech uhlíku, nebo může jít o směs svrchu uvedených látek. S výhodou jsou alespoň některými atomy halogenu y halogenovaných plynech atomy fluoru. Biologicky kompatibilní halogenované uhlovodíky je možno volit například ze skupiny: b r omchl o rdi f luormethan, chlordif luormethan, dichlordif luormethan, bromtrifluormethan, chlortrifluormethan, chlorpentafluorethan, dichlortetrafluorethan, chlortrifluorethylen, fluorethylen, ethylfluorid, 1,1-difluorethan a také perfluorované uhlovodíky, například perfluoralkany, jako jsou perfluormethan, perfluorethan, perfluorpropany, perfluorbutany, například perfluor-n-butan, popřípadě ve směsi s dalšími isomery, například s perfluorisobutanem, perfluorpentany, perfluoralkeny, například perfluorpropen, perfluorbuteny, například perfluorbut-2-en a perfluorbutadien, perfluoralkiny, jako perfluorbut-2-in a perfluorcykloalkany, například perfluorcyklobutan, perfluormethylcyklobutan, perfluordimethylcyklobutany, perfluortrimethylcyklobutany, perfluorcyklopentan, perf luormethyl cyklopentan, perf luordime thy 1cyklopentany, perfluorcyklohexany, perfluormethylcyklohexan a perfluorcykloheptan. Další halogenované plyny zahrnují methylchlorid, fluorované, například perfluorované ketony, jako jsou perfluoraceton a také fluorované, například pérfluorované ethery, jako perfluordiethylether. Použití perfluorovaných plynů, například fluoridu sírového a perfluoro44 4444

94

I · ·

I » ·4 ·

- 8 váných uhlovodíků, například perfluorpropanu, perfluorbutanu a perfluorpentanu, může být zvláště výhodné vzhledem k uznávané vysoké stálosti mikrobublinek s obsahem těchto plynů v krevním řečišti.

Plyn může obsahovat například butan, cyklobutan, n-pentan, isopentan, neopentan, cyklopentan, perfluorpentan·, per- fluorcyklopentan, perfluorhexan nebo směs jednoho nebo většího poctu těchto plynů, které jsou kapalné při teplotě skladování a zpracování, avšak plynné při tělesné teplotě, jek bylo například popsáno ve svrchu uvedené patentové přihlášce S.

WO 94/16.739. Jednoduché vrstvy smáčedla, vytvářejícího film, mohou v reportérových jednotkách podle vynálezu stabilizovat výsledné mikrobublinky proti neřízenému růstu.

Zásadně je možno využít pro tvorbu jednoduchých vrstev ' pro zapouzdření plynů využít jakýkoliv vhodný materiál typu smáčedla, tvořícího film včetně nepolymerních a nepolymerovatelných smáčedel, vytvářejících stěny bublinek, tak jak byly tyto,látky popsány v patentové přihlášce WO 95/21631, dále může jít o polymerní smáčedla, například podle WO 95/06518 a o fosfolipidy, například podle WO 92/11873, WO 92/17212,

WO 92/22247, WO 94/28780, WO 95/03835 nebo WO 97/29783. S výhodou je 75 %, s výhodou však veškeré množství smáčedla přítomno v jednoduchých vrstvách na rozhraní mezi bublinkami plynu a kapalinou.

Jako příklady použitých fosfolipidů je možno uvést leči thiny, to' znamená fosfatidylcholiny, například přírodní lecithiny, jako lecithin z vaječného žloutku, sojový lecithin a syntetické nebo polosyntetické lečithiny, například dimyristoylfosfatidylcholin, dipalmitoylfosfatidylcholin, nebo distearoylfosfatidylcholin, fosfatidové kyseliny, fosfatidyl- 9 φφ φφφφ

ΦΦ « « · · · Φ * · · · · Φ ·

Φ · · ♦ φ Φ « · φ φφφ φ φ φ Φ • · φ · •ΦΦ φφφ φ * ethanolaminy, fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, kardiolipiny, sfingomyeliny, fluorované analogy kterékoliv z uvedených látek a směsi kterýchkoliv z těchto látek a také jejich směsi s dalšími fosfolipidy, například s cholesterolem.

Bylo zjištěno, že může být zvláště výhodné užít fosfolipidy, které převážně, například nejméně se 75 % obsahují molekuly, nesoucí náboj, a to zvláště v případě, že běží o jedinou amfifilní složku reportéru, toto uspořádání může zvýšit stálost produktu a jeho akustické vlastnosti. Aniž by bylo zapotřebí se vázat na teoretické úvahy, je pravděpodobné, že elektrostatické odpuzování mezi nabitými fosfolipidovými membránami může napomáhat tvorbě stálých jednoduchých vrstev na rozhraní mezi plynem a kapalinou. Jak již bylo svrchu uvedeno, ohebnost a deformovatelnost těchto tenkých membrán bude zvyšovat echogenitu použitých reportérů ve srovnání s liposomy, vyplněnými plynem, které jsou tvořeny jednou nebo větším poetem lipidových dvojvrstev.

Při použití nabitých fosfolipidů je rovněž možno připravit reportéry s dalšími výhodnými vlastnostmi, jako jsou stálost, dispergovatelnost a odolnost proti spojování bublinek, aniž by bylo nutno přidávat další smáčedla a/nebo látky, zvyšující viskozitu, čímž je možno snížit na minimum množství cizorodých látek po podání kontrastního prostředku. Například nabité povrchy mikrobublinek mohou zabránit jejich shlukování nebo je snížit na co nejmenší míru v důsledku elektrostatického odpuzování.

Je žádoucí, aby nejméně 75 %, s výhodou však veškerý fosfoíipidový materiál, použitý v reportérech v prostředcích podle vynálezu byl tvořen molekulami, nesoucími náboj v průběhu přípravy a/nebo použití, přičemž tento náboj může být kladný nebo s výhodou záporný. Jako příklady fosfolipidů •9 »·«·

- 10 4444 44

4« ·· » 4 4

I 4 »4 4 ·· 44 » 4 4 « » 4 4 a ► 4 « |

4· 44 s kladným nábojem, je možno uvést estery fosfatidových kyselin, jako kyseliny dipalmitoylfosfatidové nebo distearoylfosfatidové s aminoalkoholy, například hydroxyethylethylendiaminem. Jako příklady fosfolipidů se záporným nábojem je možno uvést přírodně se vyskytující látky, odvozené například ze sojových bobů nebo vaječného žloutku, polosyntetické látky, například částečně nebo plně hydrogenované a také syntetické fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, fosfatidové kyseliny a kardiolipiny. Acylové skupiny mastných kyselin v těchto fosfolipidech budou typicky obsahovat 14 až 22 atomů uhlíku, půjde tedy například o palmitoylovou nebo stearoylovou skupinu. Použitelné jsou také lysoformy nabitých fosfolipidů, přičemž předpona lyso označuje fosfolipidy, které obsahují pouze jednu acylovou skupinu, odvozenou od mastné kyseliny a s výhodou vázanou esterovou vazbou na uhlíkový atom v poloze 1 glycerylové skupiny. Takové lysoformy nabitých fosfolipidů je s výhodou možno užít spolu s nabitými fosfolipidy, obsahujícími dvě acylové skupiny, odvozené od mastných kyselin.

Fosfatidylseriny představují zvláště výhodné fosfolipidy pro použití v prostředcích podle vynálezu a s výhodou tvoří podstatnou Část, například nejméně 80 % obsahu fosfolipidů, například 85 až 92 %, Aniž by bylo zapotřebí se vázat na teoretické úvahy, je pravděpodobné, že iontové můstky mezi karboxylovými skupinami a aminoskupinami serinových zbytků přispívají ke stálosti těchto reportérových systémů. Z výhodných fosfatidylserinů je možno uvést nasycené, například hydrogenované nebo syntetické přírodní fosfatidylseriny' a syntetické dístearoylfosfatidylseriny, dipalmitoylfosfatidylserin a diarachidoylfosfatidylserin.

Dalšími použitelnými lipidy jsou například fosfatidylethanolaminy, popřípadě ve směsi s dalšími lipidy, jako jsou kyselina stearová nebo palmitová, stearylamin, palmitylamin, • ft ·«·· • ft • · ftftft • ftftft ft· ft ftft • ftft • ftftftft ftft · ftft ftft • ft ftft • ftft · • ftft ft • ftft ftftft ft · ftft ftft cholesterol, bisalkylglyceroly, sfingoglykolipidy, syntetické lipidy, jako N,N-dimethyl-N-oktadecyl-l-oktadekanamoniumchlorid nebo -bromid, DODAC nebo DODAB a/nebo bisalkylestery kyseliny maleinové.

Jako příklady dalších použitelných lipidů pro přípravu kontrastních prostředků s obsahem plynu je možno uvést mastné kyseliny, jako kyselinu stearovou, palmitovou, 2-n-hexa-’ decylstearovou, olejovou a další lipidové struktury kyselé povahy. Tyto lipidové struktury mohou být vázány amidovou vazbou na aminoskupiny, které obsahují jednu nebo větší počet amínoskupin. Výsledné aminokyseliny, modifikované lipidem, například dipalmitoyllysin nebo kyselina distearoyl-2,3-diaminopropionová, mohou být užitečnými prekursory pro vazbu vazných prvků při spojování jedné nebo většího počtu molekul vektoru.

Dalšími vhodnými stabilizátory jsou například lipopeptidy, které jsou tvořeny lipidem, vázaným na peptidovou spojovací skupinu s vhodnými funkčními skupinami pro vazbu na jednu nebo větší počet molekul vektoru. Zvláště výhodné je zařazení kladně nabitého peptidového spojovacího prvku, například obsahujícího dva nebo větší počet lysinových zbytků a schopného zakotvení v míkrobublinkách, stabilizovaných negativně nabitým fosfolipidem nebo v jiných membránách, vytvořených pomocí smáčedla.

V dalším provedení vynálezu se vynález týká mikrobublinek, které nesou jednu nebo větší počet reaktivních skupin pro nespecifické reakce s molekulami receptoru, uloženými na buněčném povrchu. Například mikrobublinky, které obsahují thiolovou skupinu se mohou vázat na receptory na povrchu buněk výměnou disulfidových skupin. Reversibilní povaha takových reakcí znamená, še proud mikrobublinek může být řízen ·· fcfc·· *· · ♦» ..

• · · fcfcfc· • · fcfcfc fcfc fc • fcfc fc fcfc fcfc • · » fcfc** *·

- 12 změnami redox potenciálu v okolním prostředí. Podobně je možno použít mikrobublinky s funkčními skupinami a s membránami, tvořenými aktivovanými estery, například estery s N-hydroxysukcinimidem pro reakci s aminoskupinámi, které se necházejí v řade molekul na povrchu buněk.

Dříve známé kontrastní prostředky s obsahem mikrobublinek na bázi fosfolipidů, například podle WO 94/09829 byly typicky připravovány tak, že práškové smáčedlo, například lyofilizované předem připravené lyposomy nebo roztok fosfolipidů, lyofilizovaný nebo sušený rozprašováním se smísí se vzduchem nebo jiným plynem a pak s vodným nosným prostředím a mícháním se vytvoří suspenze mikrobublinek, kterou je nutno podat krátce po přípravě. Postupy tohoto typu však mají tu nevýhodu, že je nutno použít při míchání značnou energii k dosažení požadované disperze, přičemž rozměr a střední průměr mikrobublinek závisí na množství energie a za praktických podmínek je není možno řídit.

Na druhé straně je možno reportéry nebo prostředky podle vynálezu s výhodou připravit tak, že se vytvoří disperze mikrobublinek plynu v příslušném vodném prostředí s obsahem smáčedla, například fosfolipidu, popřípadě předem sterilizovaného, například v autoklávu a pak se s výhodou po promytí a/nebo frakcionaci mikrobublinek podle velikosti disperze lyofilizuje, například v přítomnosti látek, chránících bublinky při zmrznutí, čímž se získá sušený produkt, který je možno snadno rekonstituovat ve vodě nebo vodných roztocích za vzniku reprodukovatelné disperze mikrobublinek. Tento postup je podrobněji popsán ve WO 97/29783. Možnost odstranit bublinky nežádoucího rozměru i přebytek smáčedla je velmi výhodná ve srovnání s postupem podle WO 94/09829 a také WO 96/08234, kde se bublinky vytvářejí přímo před vstřikováním protřepáváním suspenze různých fosfolipidů a látek, zvyšujících viskozitu, jako propylenglykolu a glycerolu.

ftft ftft·· «· ♦· ftft ftft «ft ftftft ftftftft ftft ftft ftft« « ftft ft « · · · ftft ftft ·»···« «•«•ftft « · ftftftft ftft ftft ftft ftft ftft

- 13 Svrchu popsaný postup je možno použít k získání mikrobublinek reportéru s velmi úzkým rozmezím distribuce, kde například více než 90 %, například nejméně 95 a zvláště nejméně 98 % mikrobublinek má objemový střední průměr v rozmezí 1 až 7 mikrometrů a méně než 5 %, například méně než 3 a s výhodou nejvýše 2 % mikrobublinek má střední průměr vyšší než 7 mikrometrů. Promývací stupeň je možno užít k zajištění čistoty reportéru, tak, aby byl prostý nežádoucích složek, například zbytků přebytečných lipidů nebo látek pro zvýšení viskozity. Prostředky s obsahem reportérů připravených tímto způsobem mohou mít zvláštní výhody ve srovnání s dříve užívanými kontrastními prostředky.

Echogenita ve vztahu k dávce je velmi zvýšena vzhledem k tomu, že se v podstatě veškeré smáčedlo účastní stabilizace mikrobublinek ve formě jednoduchých vrstev. Zkoušky s použitím ultrazvuku u psů in vivo prokázaly, že při použití kontrastního prostředku podle vynálezu je možno zvýšit odra-. žený signál od srdečního svalu o 15 dB po nitrožilní Injekci nízkých dávek, například 0,1 mikrolitrů mikrobublinek na jeden kilogram tělesné hmotnosti.

Z týchž důvodů je zvýšena bezpečnost in vivo vzhledem k tomu, že použité dávky fosfolipidu jsou 0,1 až 10, například 1 až 5 mikrogramů/kg. Použití takových nízkých dávek smáčedla je zřejmě velmi výhodné vzhledem k minimalizaci případných toxických vedlejších účinků.

Vysoká účinnost ve vztahu k dávce je rovněž zvláštní výhodou těchto prostředků s možností zacílení, vzhledem k tomu, že reportér se bude hromadit pouze v místech, k nimž má použitý vektor afinitu. Tyto výhodné reportéry podle vynálezu mohou tedy podstatně zlepšit kontrast v místech, v nichž se nacházejí cílové struktury. Vysoká účinnost může umožnit vidět” jednotlivé bublinky při použití ultrazvuku, což je «000 *

· • · 0 • ·

9

0 0

9999 99 »· • 0« * 9 999 • ·9 · ·· ··

0 ' 00 citlivost, která se blíží nebo potenciálně i převyšuje citlivost scintigrafie, která je v současné době pravděpodobně nejcitlivějším postupem při zacílení, přestože kontrast některých scintigrafických zobrazení není příliš výrazný.

Zvláštní výhodou prostředků na bázi fosfatidylserinu je jejich biokompatibilita. Z těchto důvodů není možno pozorovat žádné akutní známky toxicity, jako směny krevního tlaku nebo srdeční frekvence u psů, jimž byly tyto prostředky podány nitrožilně, a to ani v případě, že byl podán desetinásobek dávky, užívané při zobrazování.

Použití nabitých fosfolipidu má také tu výhodu, že tyto látky obsahují funkční skupiny, jako karboxylové skupiny nebo aminoskupiny, které dovolují přímou vazbu vektorů, popřípadě přes spojovací prvky. Je nutno uvést, že do těchto systémů je možno, začlenit i jiné skupiny použitím směsi lipidů s obsahem těchto skupin před tvorbou mikřobublinek.

Obvykle není zapotřebí používat další přísady, jako emulgační činidla a/nebo látky pro zvýšení viskosity, tak jak je to zapotřebí u řady známých prostředků. Jak již bylo svrchu uvedeno, poskytuje tato skutečnost další výhodu vzhledem k tomu, že se do organismu přivádí co nejmenší množství cizorodých složek. Vzhledem k tomu, .že příprava prostředků podle vynálezu typicky zahrnuje lyofilizační stupeň, jak již bylo svrchu uvedeno, může být výhodné přidat látku, chránící pří zmrznutí, například alkohol, s výhodou alifatický alkohol i

jako terč.butanol, polyol, jako glycerol, uhlohydrát, například cukr, jako sacharosu, mannitol, trehalosu nebo cyklodextrin nebo polysacharid, jako dextran nebo polyglykol, jako polyethylenglykol. Výhodné je zejména použití fyziologicky dobře snášených cukrů, například sacharosy.

4444 4· 1«, WT * · »444 444* «4 · ♦ *4* 4 4 4 4 « 144 44 44 444 Ml

44*4444 4 ·

444» *· *· 44 *4 ·»

Lyofilizované sušené produkty, připravené svrchu uvedeným způsobem jsou zvláště snadno rekonstituovatelné ve vodě za pouze minimálního míchání, například opatrným protřepáváním rukou po dobu několika sekund. Velikost vytvořených bublinek je reprodukovatelná a je nezávislá na množství energie, použité při protřepávání a je určována pouze rozměrem bublinek, vytvořených v původní disperzi. Je velmi překvapující, že tento rozměr se udrží i v lyofilizovaném a rekonstituovaném produktu. Vzhledem k tomu, že rozměr mikrobublinek v původní disperzi je možno snadno řídit parametry postupů, jako způsobem míchání, jeho rychlostí a jeho trváním, je možno snadno řídit také výsledné rozměry mikrobublinek.

Bylo rovněž prokázáno, že lyofilizované sušené produkty jsou při skladování stálé nejméně několik měsíců při podmínkách okolí. Disperze mikrobublinek po rekonstituci ve vodě je stálá nejméně 8 hodin, což poskytuje dostatek času mezi přípravou rekonstituovaného produktu a jeho vstřiknutím.

Vysoká účinnost uvedených výhodných reportérů umožní použití menších bublinek při zachování požadovaného kontrastního účinku podstatně nad úrovní detekce běžného zařízení pro zobrazování ultrazvukem. Malé bublinky mají značné výhody, například snížení ucpávání cév, delší poločas v krevním oběhu, větší schopnost dosáhnout cílové struktury a menší hromadění v plicích a jiných necílových orgánů. Prostředky s malými mikrobublinkami tedy představují další výhodné provedení vynálezu.

Je také možno použít malé bublinky ke zvýšení kontrastu při zobrazování ultrazvukem pomocí shluků bublinek. Teoreticky je známo, že kontrastní účinek specifického množství, bublinek s celkovým objemem V ve zředěné dispersi se zvyšuje v případě, Že se bublinky shlukují za vzniku větší plynné fáze

- 16 99 · ·♦· ·· ·· β to • · to «toto ·«** • to ···«· ·*«· • to«· ·· «« ·<· to··

9 9 9 9 9 9 9 · • tototo to· toto «· ·· toto se stejným celkovým objemem V. Může tedy být možné využít malé bublinky, v podstatě nezvyšující kontrast při zobrazování ultrazvukem po jejich nahromadění na cílových strukturách.

Malé bublinky mohou být také vytvořeny tak, aby došlo ke spojování bublinek při interakci s cílovou strukturou a tím i ke zvýšení kontrastu. Splývání bublinek může nastat také v případě, že reportér, nesoucí vektor pro udržení na specifických místech obsahuje ještě nezreagované vazné skupiny, schopné reakce s funkčními skupinami na jiných bublinkách.

Reportérova jednotka obvykle zůstane vázána na vektor. Avšak při jednom způsobu zacílení, který se někdy nazývá předběžné zacílení, se vektor, kterým je často monoklonální protilátka, podává jako takový a až po něm se podává reportér, vázaný na skupinu, schopnou se specificky vázat na předem zacílenou molekulu vektoru. V případě, že předem zacílený vektor je protilátka, může být reportér vázán na molekulu pro vazbu imunoglobulinu, jako je bílkovina A nebo protilátka proti imunoglobulinu. Výhoda tohoto postupu spočívá v tom, že je možno odstranit molekuly vektoru, které se nenavázaly na cílovouo strukturu, čímž se podstatně sníží problém pozadí, který je spojen s přítomností přebytku konjugátu reportéru a vektoru. Je tedy možné předem podat specifický předem zacílený vektor a pak reportérové jednotky, spojené s jiným vektorem a se skupinou, která se váže na první vektor.

Pomocí prostředku podle vynálezu je například možno zjis tit rychlost prokrvení v cílových oblastech, například srdečním svalu, je také zajímavé měřit rychlost, s níž se kontrastní prostředek, vázaný na cílovou strukturu, opět uvolní. Toho je možno dosáhnout řízeným způsobem podání dalšího vektoru a/nebo další látky, schopné uvolnit kontrastní prostředek z jeho cílové struktury nebo jej na této struktuře nahradit.' »· ♦» ► · · l * · · > · * « « · »

► · · · »·· *· ·»·· ···· ··

Spojovací: prostředky, použité v rámci vynálezu budou obvykle spojovat vektor s reportérem nebo reportér s reportérem s určitou specifičností a rovněž je možno tyto prostředky užít k navázání jednoho nebo většího počtu látek s léčebným účinkem.

Zařízení pro zobrazování ultrazvukem, použitelná v souvislosti s vynálezem zahrnují dvojrozměrné a trojrozměrné zobrazovací postupy, například zobrazování.pomocí B-postupů s amplitudou signálu, která se mění v čase, signál je vytvářen ze základní frekvence vysílaného ultrazvukového pulsu od subharmonické nebo vyšší harmonické nebo ze součtu nebo rozdílu frekvencí, odvozených od vysílaného pulsu a takových harmonických, přičemž obrazy, vytvořené ze základní frekvence nebo její druhé harmonické jsou výhodnější. Je možno použít také barevného Dopplerova zobrazování a kombinace obou postupů. Bylo neočekávaně zjištěno, že druhé harmonické signály ze zacílených mikrokuliček byly velmi kvalitní. Aby bylo možno snížit účinek pohybu, je možno vytvářet postupné obrazy tkání, například srdce nebo ledvin při použití vhodné .synchronizační techniky, například spojením s ECG nebo s ohledem na dýchací pohyby zobrazovaného jedince. Měření změn rezonanční frekvence nebo ztráty odrazu frekvence, které doprovázejí zastavené nebo zpožděné mikrobublinky jsou rovněž použitelné pro detekci přítomnosti kontrastního prostředku.

Vynález dává k disposici také prostředek pro aplikaci látek s léčebným účinkem v kombinaci se směrováním produktu pomocí vektoru na požadované místo. Pod pojmem látka s léčebným účinkem se rozumí látka, která má příznivý účinek na určité onemocnění u člověka nebo jiného organismu. Kombinace takových látek s kontrastním prostředkem pro zobrazování ultrazvukem již byly navrhovány například ve WO 94/28 873 nebo WO 95/07072, materiály, použité v těchto přihláškách vsak • · « « · • · · · • · « · • · · · • · · · • · · · « · • · *· ·« ·· · ·« · • * * «

* · · « * · ti·· ·· neobsahovaly vektory s afinitou pro určité místo a docházelo proto k jejich poměrně nízkému zachycení na požadovaných místech v průběhu uvolnění účinných látek.

Látky s léčebným účinkem, užité v souvislosti s vynálezem mohou být zapouzdřeny uvnitř mikrobublinek nebo spojeny s jejich stěnami. Účinná látka může být vázána na část stěny bublinek například kovalentní nebo iontovou vazbou nebo může být fyzikálně smísena se zapouzdřeným materiálem, zvláště v případě, že má taková látka obdobnou polaritu nebo rozpustnost jako materiál membrány, tak, aby nedocházelo k výstupu produktu z mikrobublinky před místem určení. Uvolněním účinné látky může být zahájeno jednoduchým smočením krví po podání nebo v důsledku jiného popudu, například rozpouštěním, katalyzovaným enzymy nebo působením ultrazvuku. Destrukce' mikročástic s obsahem plynu ultrazvukem z vnějšího prostředí je známým jevem u kontrastních prostředků a bylo popsáno například ve VO 93/25 241. Rychlost uvolnění účinných látek se může měnit v závislosti na způsobu podání a na použitém množství energie ultrazvuku.

Látka s léčebným účinkem může být kovalentne vázána na povrch membrány například svrchu uvedeným způsobem. Je tedy možno postupovat například tak, že se připraví fosfolipidový nebo lipopeptidový derivát, na nějž se naváže účinná látka pomocí biologicky degradovatelného nebo selektivně štěpitelného spojovníku, načež se tento materiál začlení do materiálu pro tvorbu mikrobublinek. Do membrány je možno přímo začlenit také lipidované molekuly účinné látky, které nevyžadují další zpracování pro uvolnění účinné složky. Takový derivát účinné látky může být uvolněn pouze zvýšením intenzity ultrazvuku.

Jako příklad systému pro aplikaci účinných látek podle vynálezu je možno uvést jakoukoliv známou účinnou látku nebo • · • to · ·

- 19 ·· · · «· její účinný analog s obsahem thiolové skupiny, tyto látky jsou vázány na mikrobublinky s obsahem thiolových skupin za oxidativních podmínek a za vzniku disulfidových můstků, V kombinaci s vektorem nebo vektory se pak mohou mikrobublinky, modifikované tímto způsobem hromadit v cílové tkáni. Podáním redukčního činidla, například redukovaného glutathionu je pak možno uvolnit molekulu účinné látky z mikrobublinky v blíz^ kosti cílových buněk a tak'zvýšit místní koncentraci účinné . látky a zvýšit také léčebný účinek. Produkt může být také připraven bez účinné látky a teprve potom může být účinná látka navázána na mikrobublinky nebo na ně uložena jako povlak. Je například možno přidat účinnou látku k suspenzi mikrobublinek ve vodném prostředí a protřepáváním spojit bublinky s účinnou složkou.

Další systémy pro aplikaci účinné látky na určené místo zahrnují vektorem modifikované fosfolipidové membrány, dopované lipopeptidovými strukturami ,· obsahujíc.ími. poly-L-lysin nebo poly-D-lysin v kombinaci s vektorem. Při použití v genové therapii se zvláštním důrazem na spojení účinné látky s receptorem je možno mikrobublinky jako nosič kondenzovat s DNA nebo RNA elektrostatickou interakcí s polykationtem. Tento postup má tu výhodu, že vektor nebo vektory, užité pro zacílení mikrobublinek nejsou přímo spojeny s nosnou polylysinovou skupinou, polylysinový řetězec je také pevněji zakotven v membráně mikrobublinek vzhledem k přítomnosti lipidového řetězce. Za užitečné se také považuje použití ultrazvuku ke zvýšení účinnosti zacílení.

Je také mošno nejprve modifikovat volné polylysinové řetězce molekulami účinné látky nebo vektoru a pak je kondenzovat s negativním povrchem mikrobublinek, zacílených na cílové struktury v organismu.

- 20 • ft ··· « « · ft • ft ft · · · • · ft ftftftft ft · ft · « « « ft ftft · · · ft • ft·· ftft ftft ftft • · ftft

Jako příklady látek, které je mošno aplikovat při využití vynálezu, je možno uvést protinádorové látky, jako yinkristin, vinblastin, vindesin, busulfan, chlorambucil, spiroplatin, cisplatin, carboplatin, methotrexat, adriamycin, mitomycin, bleomycin, cytosin arabinosid, arabinosyladenin, merkaptopurin, mitotan, prokarbazin, daktinomycin (aktinomycinD), daunorubicin, doxorubicinhydrochlorid, taxol, plikamycin, aminoglutethimid, estramustin, flutamid, leuprolid, megestrolacetát, tamoxifen, testolakton, trilostan, amsakrin (m-AMSA), aspargináza (L-asparagináza), etoposid, interferon alfa, 2a a 2b, krevní produkty, jako hematoporfytiny a jejich deriváty, dále může jít o látky, modifikující biologickou odpověď, jako jsou moramylpeptidy, antifungální látky,, jako ketoconazol, nistatin, griseofulvin, flucytosin, miconazol nebo amfotericin B, hormony nebo jejich analogy, jako růstový hormon, hormon, stimulující melanocyty, estradiol, beclomethasondipropionát, betamethason, kontisonacetát, čexamethason, flunisolid, hydrokortizon, methylprednisolon, paramehasonacetát, prednisolon, prednison, triamcilonol nebo fluorokortisonacetát, vitaminy, jako kyanokobalamin nebo retioidy, enzymy, jako jsou alkalická fosfatáza nebo dismutáza peroxidu manganu, antialergické látky, jako jsou amelexanox, inhibitory tkáňových faktorů, jako monoklonální protilátky a jejich fragmenty Fab, syntetické peptidy, nepeptidové látky a sloučeniny, řídící expresi tkáňových faktorů, inhibitory shlukování krevních destiček, jako jsou GPIa, GPIb a GPIIb-IIIa, receptory ADP, receptory thrombinu, von Willebrandův faktor, prostaglandiny, aspirin, ticlopidin, clopigogrel a repro, inhibitory koagulace bílkovin, jako jsou Fila FVa, FVIIa, FVIIIa, FIXa, tkáňový faktor, hepátiny, hirudin, hirulog, argatroban, DEGR-rFVIIa a annexin V, inhibitory tvorby fibrinu a promotory fibrinolýzy, jako jsou t-PA, urokináza, plamin, streptokinása, rt-aktivátor plasminogenu a r-stafylokinása, antiangiogenní faktory, jako jsou medroxyprogesterol, pentosanpolysulfát, suramin, taxol, thalidomid, angiostatin, interferon-alfa, • * · e ·♦ «·«* • · · • Λ

0 • 0 · ···0 9 · • ♦ 9 · • 0 0 · • · · ·0

Inhibitory metaloproteinázy, faktor 4 krevních destiček, somatostatin, .thrmbospondin, látky, upravující krevní oběh, jako propranolol, potenciátory metabolismu, jako glutathion, antituberkulotické látky, jako kyselina p-aminosalicylová, isoniazid, capreomycinsulfát, cyklosexin, ethambutol, ethionamid, pyrazinamid, rifampin nebo streptomycínsulfát, protivínové látky, jako acyclovir, amantadin, azidothymidin, ribavirin nebo vidarabin, látky, rozšiřující cévy, jako diltiasem, nífedipin, verapamil, erythriroltetranitrát, isosorbit dinitrát, nitroglycerin nebo pentaerythritoltetranitrát, antibiotika, jako dapson, chloramfenikol, neomycin, cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefradin, erythromycin, clindamycin, linkomycin, amoxicillin, ampicillin, bakampicillin, carbenicillin, dicloxacilin, cyclacillin, pokloxacillin, hetacillin, methicillin, nafcillin, penícillin, polymyxin nebo tetracyklin, protizánětlivé látky, jako diflunisal, ibuprofen, indomethacin, mclefenemát, kyselina mefenamová, naproxen, fenylbutazon, piroxikam, tolmetin, aspirin nebo salicyláty, látky, účinné proti prvokům, jako chlorochin, metronidazol, chinin nebo megluminantimonát, antirheumatické látky, jako penícilamin, narkotika', jako paregoric, opiáty, jako kodein, morfin nebo opium, srdeční glykosidy, jako deslanesid, digitoxin, digoxin, digitalin nebo digitalis, blokátory nervosvalového přenosu, jako atracuriummesylát, gallamintriethiodíd, hexafluoreniumbromid, metocurinjodid, pancuroňiumbromid, sukcinylcholinchlorid, tubokurarinchlorid nebo vecuroniumbromid, sedativa, jako amobarbital, sodná sůl amobarbitalu, apropbarbital, sodná sůl butabarbitalu, chloralhydrát, ethchlorvynol, ethínamát, flurazepamhydrochlorid, glutethimid, methotrimeprazinhydrochlorid, methyprylon, midazolamhydrochlorid, paraldehyd, pentobarbital, sodná sůl sekobarbitalu, talbutal, temazepam nebo triasolam, místní anestetika, jako bupivakain, chlorprokain, etidokain, lidokain, mepivakain, prokain nebo tetrakaín, celková anestetika, jako droperidol, etomidát, fentanylcitrát s droperidolem, ketaminhydrochlorid, sodná sůl methohexitalu u ·Μ· ·» ·* ···» · « · • « * · · * · o »9 • · · ««·« , 9999 99 99 99 «·

- 22 nebo thiopental a farmaceuticky přijatelné soli, například adiční soli s kyselinami, jako hydrochloridy nebo hydrobromidy nebo soli s bázemi, například soli sodné, vápenaté nebo hořečnaté nebo jiné deriváty těchto látek, například acetáty. Dalším' příkaldem látek s léčebným účinkem mohou být genetické materiály, jako nukleové kyseliny, RNA a DNA přírodního nebo syntetického původu včetně rekombinantní RNA a DNA. Kódová DNA pro určité bílkoviny může být užita k léčení různých ty^ pů onemocnění. Je například možno použít geny pro faktor nekrosy nádorů nebo pro interleukin-2 k léčení pokročilých nádorů, geny pro thymidinkinázy je možno užít k léčení nádorů r

vaječníků nebo mozku, geny pro interleukin-2 je možno užít při léčení neuroblastomu, zhoubného melanomu nebo nádoru ledvin a geny pro interleukin-4 je možno obecně užít k léčení různých typů zhoubných nádorů.

Lipofilní deriváty účinných látek, vázané na stěnu mikrobublinky hydrofobními interakcemi mohou mít léčebný účinek jako část mikrobublinky nebo po uvolnění z mikrobublinky například působením ultrazvuku. V případě, že účinná látka nemá požadované fyzikální vlastnosti, je možno použít lipofilní skupinu k zakotvení účinné látky na membránu. Lipofilní skupina by měla být s výhodou zavedena takovým způsobem, aby nedošlo k ovlivnění účinnosti molekuly in vivo nebo je možno lipofilní skupinu odštěpit a účinnou látku uvolnit. Lipofilní skupiny je možno zavést různými chemickými prostředky v závislosti na funkčních·skupinách, které jsou k disposici v molekule účinné látky. Kovalentní vazbu je možno uskutečnit v případě, Že účinná látka obsahuje funkční skupiny,.schopné kovalentní reakce s lipofílními sloučeninami. Jako příklady lipofilních skupin je možno uvést přímé nebo rozvětvené alkylové řetězce, cyklické sloučeniny, aromatické zbytky a kondenzované aromatické a nearomatické cyklické systémy. V některých případech bude • ·

ΒΒΒΒ • *

Β Β Β ΒΒΒ ΒΒΒΒ Β» ΒΒ ·β

ΒΒ lipofilní skupina tvořena steroidem s vhodnými funkčními skupinami, například cholesterolem a příbuznými sloučeninami.

Jako příklad funkčních skupin, zvláště vhodných k tomuto účelu je možno uvést nukleofilní skupiny, jako aminoskupiny, hydroxyskupiny a sulfhydrylové skupiny. Vhodné postupy pro vytvoření lipofilního derivátu jakékoliv účinné látky, obsahující sulfhydrylovou skupinu, například captoprilu, mohou zahrnovat přímou alkylaci, například reakci s alkylhalogenidem v alkalickém prostředí a tvorbu thiolesteru reakcí s aktivovanou karboxylovou kyselinou. Jako příklad tvorby derivátu účinné látky s obsahem karboxylové funkce, jako atenololu je možno uvést tvorbu amidu a esteru vazbou aminu nebo alkoholu s požadovanými fyzikálními vlastnostmi. Výhodnou vazbou cholesterolu na účinnou látku je tvorba degradovatelné esterové vazby.

Vynález je možno účinně užít při angiogenese, to znamená tvorbě nových krevních cév rozvětvením existujících cév* Primárním popudem pro tento postup může být neadekvátní přívod živných látek nebo nedostatečný' přívod kyslíku k určité tkáni. Buňky této tkáně reagují vylučováním angiogenetických faktorů, například růstového faktoru pro endothelium a tyto faktory zahájí sekreci proteolytických.enzymů, které rozruší bílkoviny základní membrány a také sekreci inhibitorů, omezujících působení těchto potenciálně škodlivých enzymů. Kombinované účinky z receptoru pro angiogenetické faktory mohou způsobit pohyb a množení endotheliálních buněk s následným přeskupením těchto buněk a vytvořením základní membrány okolo nově vytvořených cév.

Rostoucí nádory musí zahájit tento angiogenetický postup při dosažení rozměru 1 mm, aby mohly udržet rychlost svého růstu. Vzhledem k tomu, že tvorba nových cév je doprovázena charakteristickými změnami endotheliálních buněk a jejich bezprostřednícho okolí, je tato tvorba cév slibným cílem pro léčebný zásah a je ji také možno poměrně snadno

9999 «9 • 9 9 • . 9 · 99

9999 99 • . 9 ·99 9 • 9 9 99 • · 9 9

diagnostikovat, například při nádorovém růstu, avšak také při řadě zánětlivých pochodů. Tytéž faktory se také účastní tvorby nových cév po infarktu srdečního svalu po zúžení původních cév.

V následujících tabulkách bude uvedena řada systémů receptorů/cílových struktur, spojených s tvorbou nových cév. Na základe svrchu uvedených principů zacílení podle vynálezu je možno tvorbu nových cév prokázat většinou zobrazovacích postupů, současně užívaných v lékařství. Například vyšetření ultrazvukem se zesílením kontrastu může přinést další výhody v případě, že kontrastním prostředkem jsou mikrokuliČky, jejichž výskyt je omezen na vnitřní prostor krevních cév. I když se v tomto případě cílové antigeny nacházejí na řade typů buněk, mikrokuliČky se budou vázat výlučně na endothe1iální buňky.

V případě kontrastních látek podle vynálezu je možno využít také tak zvané prekursory účinných látek. Účinné, látky mohou být derivátizovány tak, aby došlo ke změně jejich fyzikálně-chemických vlastností a k jejich vhodné úpravě pro začlenění do reportéru. Tyto látky jsou obvykle neúčinné a teprve po odštěpení skupiny, vytvářející derivát, se opět uvolní účinná forma takové látky.

Zacílením mikrobublinky s obsahem plynu á enzymu, aktivujícího ‘prekursorovou látku do oblasti drobných směn je možno učinit cílovou tkáň viditelnou, přičemž současně nedochází k rozptýlení‘bublinek do necílových oblastí. Tímto způsobem je možno stanovit nejvhodnější dobu pro injekci prekursoru u jednotlivých nemocných.

Další možností je začlenit prekursor účinné látky, enzym, aktivující tento prekursor a vektor do téže. mikrobublinky v systému, v němž dojde k aktivaci prekursoru až na zevní popud. Takovým popudem může být například proteása, •fc fc··· • fc * fc ·· · fc • · fc fcfcfcfc • fc ··· fc · I fc • •••fcfcfc · « • fcfcfc fcfc fcfcfcfc fcfcfcfc specifická pro určitý nádor, tak jak bylo svrchu popsáno, nebo je možno po nahromadění bublinek v určité cílové tkáni zasáhnout ultrazvukem.

Při využití vynálezu je možno snadno dopravit látky s líčebným účinkem do chorobných oblastí nebo k nekrotickým tkáním včetně srdce a cévního systému a také do jater, sleziny, ledvin á dalších oblastí, například od lymfatického systému, tělesných dutin nebo zažívací soustavy.

Produkty podle vynálezu mohou být užity pro zacílení látek s léčebným účinkem in vivo i in vitro. Pokud jde o využití in vitro, může jít o systémy pro diagnostiku,různých onemocnění nebo charakterizaci různých složek ve vzorku krve nebo tkáně. Obdobným postupem může být postup, podobný vazbě některých krevních složek nebo buněk na polymerní částice, například magnetické částice in vitro k oddělení těchto částic od zbylých složek vzorků. V takovém případě je možno využít nízké hustoty reportérových jednotek v prostředcích podle vynálezu k oddělení materiálu s obsahem plynu a. jeho opakovaným promytím.

Vazba reportérové jednotky na požadované vektory se provádí kovalentním nebo nekovalentním způsobem a obvykle zahrnuje interakcí s jednou nebo větším počtem funkčních skupin, uložených na reportéru a/nebo na vektorech. Jako příklad chemicky reaktivních funkčních skupin, vhodných k tomuto účelu je možno uvést aminoskupiny, hydroxylové, sulfhydrylové, karboxylové a karbonylové skupiny a také zbytky uhlohydrátů, dioly s hydroxyskupinami na sousedních atomech uhlíku, thioethery, 2-aminoalkoholy, 2-aminothioly, guanidínyl, imidazolyl a fenolové skupiny.

Kovalentní vazba reportéru a vektorů může tedy být uskutečněna při použití vazných činidel, obsahujících reaktivní skupiny, schopné reakce s uvedenými funkčními skupinami. Jako příklady reaktivních skupin, schopných reakce se sulfhydrylovými skupinami je možno uvést alfa-halogenacetylové fc* ·«·· • · « • · • fc • · v··· «fc

- 26 fc# fcfc fc fcfc » fcfcfc· fc fcfc « • fc fcfc ·· ·· fc fcfc fc • fcfc « • « • fc ·· sloučeniny typu X-CH^CO-, kde X znamená atom bromu, chloru nebo jodu, tyto látky mají zvláštní reaktivitu pro sulfhydrylové skupiny, je vsak možno je použít také k modifikaci imidasolylových skupin, thioetherových skupin, fenolových skupin a aminoskupin podle publikace Gurd F.R.N., Methods Enzymol., 1967, 11, 532. N-maleimidové deriváty se rovněž, považují za selektivní látky pro sulfhydrylové skupiny, mimoto je však v některých případech možno je za určitých podmínek použít pro vazbu na aminoskupiny. N-maleimidy je možno začlenit do vazných systémů pro konjugaci reportéru a vektorů způsobem podle publikace Kitagawa T. a další, Chem. Pharm. Bull., 1981, 29, 1130 nebo mohou být použity k zesítění polymerů ke stabilizaci bublinek způsobem podle pub* likace Kovacic P. a další, J. Am. Chem. Soc., 1959, 81, 18-87. Reakční činidla typu 2-iminothiolanu, popsaná například v publikaci Traut R. a další, Biochemistry, 1973, 12, 3266, která zavádějí thiolovou skupinu přes přeměnu aminoskupiny je možno považovat za reakční Činidla pro sulfhydrylové skupiny v případě, že k vazbě dochází tvorbou disulfidových můstků. To znamená, že jsou použitelná reakční činidla, sloužící k zavedení reaktivních disulfidových vazeb do reportéru nebo vektoru vzhledem k tomu, že k tvorbě dochází výměnou disulfidu mezi vektorem a reportérem. Jako příklady vhodných reakčních činidel je možno uvést Ellmanovo reakční činidlo DTNS, 4,4*-dithiodipyridin, methyl-3-nitro-2-pyridyldisulfid a methyl-2-pyridyldisulfid, popsané v publikaci Kimura T. a další, Analyt. Biochem., 1982,-122, 271.

Jako příklady reaktivních skupin, schopných reakce s aminoskupinami je možno uvést alkylaČní a acylační činidla.

Z alkylačních Činidel je možno uvést například látky z následujících skupin:

i) alfa-halogenacetylové sloučeniny se specifičností vzhle dem k aminoskupinám v nepřítomnosti reaktivních thiolových ·· «« ·· ·· • · · · · · ·*«· • * · ··· * * * * to to v * to ·* ·«···· • tototo··· « · • toto· to· to· ·» ** **

- 27 skupin typu X-CF^CO-, kde X znamená atom chloru, bromu nebo jodu, tak jak byly popsány například v publikaci Wong Y.H.H., Biochémistry, 1979, 24, 5337, ii) N-maleimidové deriváty, které mohou reagovat s aminoskupinami reakcí Michaelova typu nebo acylací na karbonylové skupině kruhu způsobem podle publikace Smyth D. G. a další,

J. Am. Chem. Soc., 1960, 82, 4600 a Biochem. J., 1964, 91, 589, iii) arylhalogenidy, například reaktivní nitrohalogenaromatické sloučeniny, iv) alkylhalogenidy, například popsané v publikaci McKenzie

J. A. a další, J. Protein Chem., 1988, 7, 581,

v) aldehydy a ketony, schopné tvorby Schiffovy baze s aminoskupinami, přičemž adiční produkty jsou obvykle stabilizovány redukcí za vzniku stálého aminu, vi) epoxidové deriváty, například epichlorhydrin a bisoxirany, které mohou reagovat s aminoskupinami, sulfhydrylovými skupinami nebo fenolovými hydroxyskupinami, vii) deriváty s-triazinů s obsahem chloru, které jsou velmi reaktivní vzhledem k nukleofilním skupinám, jako je aminoskupina, sulfhydrylová skupina a hydroxyskupina, viii) aziridiny na bázi svrchu uvedených s-triazinových sloučenin, popsané například v publikaci Ross W.C.J., Adv. Cancer Res., 1954, 2, 1, které reagují s nukleofily, například aminoskupinami za otevření kruhu, ix) díethylestery kyseliny squarové, popsané v publikaci Tietze L. F. , Chem. Ber., 1991, 124, 1215 a

x) alfa-halogenalkylethery, které jsou reaktivnějšími alkylačními činidly než normální alkylhalogenidy vzhledem k aktivací, způsobené přítomností atomu kyslíku etherové skupiny, «φ φφφφ φ φ · Φ·· φφφφ φ φ φφφφφ φφφφ ♦ φφφ φφ φφ φφφφφφ φφφφφφφ φ φ φφφφφφ φφ φφ φφ φφ

- 28 tyto látky byly popsány v publikaci Benneche T. a další, Eur. J. Med. Chem,, 1993, 28, 463.

Jako příklady aminoreaktivních acylačních činidel je možno uvést:

i) isokyanáty a isothiokyanáty, zvláště aromatické deriváty, tvořící stálé deriváty močoviny a thiomočoviny -a obvykle užívané pro zesítění bílkovin podle publikace Schick A. F.

a další, J. Biol. Chem., 1961, 236, 2477, * J.

ii) . sulfonylchloridy, popsané v publikaci Herzig D, J. a další, Biopolymers, 1964, 2, 349, použitelné pro zavedení fluorescenční reportérové skupiny do spojovníku, iii) halogenidy kyselin, iv) aktivní estery, například nitrofenylestery nebo N-hydroxysukcinimidylestery,

v) anhydridy kyselin, například směsné nebo symetrické anhydridy nebo N-karboxyanhydridy, vi) další činidla, použitelná pro tvorbu amidové vazby, popsaná v publikaci Bodansky M. a další, Principíes of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, vii) acylazidy, například takové, v nichž je azidová skupina vytvořena z předem přítomného hydrazidového derivátu při použití dusitanu sodného způsobem podle publikace Wetz K. a dál ší, Anal. Biochem., 1974, 58, 347, viii) azlaktony, vázané na polymery, například bis-akrylamid podle publikace Rasmussen J. K., Reactive Polymeřs, 1991, 16, 199 a ix) imidoestery, tvořící stálé amidiny reakcí s aminoskupinami, například podle publikace Hunter M.J. a Ludwig M.L. ,

J. Am. Chem. Soc., 1962, 84, 3491.

** *99«

- 29 99 99 9« 99

4 4 4 4 99·· · · 444· 4 44 4 • 444 49 4 4 444 444

4444444 4 4

4949 44 49 44 «« ·4

Karbonylové skupiny, například aldehydové funkce mohou reagovat se slabými basemi typu bílkovin například při pH, při němž dochází k protonaci nukleofilních bílkovinných funkcí na postranní řetězce. Slabé baze zahrnují 1,2-aminothioly, nacházející se například na N-terminálním cysteinovém zbytku, tyto skupiny selektivně tvoří stálé 5-členné thiazolidinové kruhy s aldehydovými skupinami, například podle publikace Ratner S. a další, J. Am. Chem. Soc., 1937, 59, 200. Je také možno použít další slabé baze, jako fenylhydrasonu, popsané v publikaci Heitzman H. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1974, 71, 3537.

Aldehydy a ketony mohou rovněž reagovat s aminy za vniku Schiffových baží, které je možno s výhodou stabilizovat reduktivní aminací. Alkoxyaminoskupiny snadno reagují s ketony a aldehydy sa vzniku stálých aikoxaminů, například podle publikace Webb R. a další, Bioconjugate Chem., 1990, 1, 96.

Příklady reaktivních skupin, schopných reakce s karboxylovými skupinami zahrnují diazoslouceniny, například estery typu diazoacetátu a diazoacetamidy, které reagují velmi specificky za vzniku esterových skupin, například podle publikace Herriot R. M., Adv. Protein Cgem., 1947, 3, 169. Reakční činidla, modifikující karboxylové kyseliny, například karbodiimidy, reagující pres O-acylmočovinu s následnou tvorbou amidové vazby je rovněž možno použít. Vazba může být usnadněna přidáním aminu nebo může dojít k přímé vazbě vektoru na receptor. Jako použitelné ve vodě rozpustné karbodiimidy lze uvést l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-4-ethyl)karbodiimid CMC, l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy 1 )karbodiimid EDC, popsané v publikacei Zot H. G.- a Puett D., J. Biol. Chem., 1989, 264, 15552. Další použitelná reakční činidla, modifikující karboxylovou kyselinu zahrnují isoxasolíové deriváty, jako Woodwardovo reakční činidlo K, chlormravenčany., jako p-nitrofenylchlormravenčan, karbonyldiimidazoly, jako 1,1 '-karbony 1*4 <444

4» V «44 · » * ·

4· 44 444 4 * 4 4 • »44 44 44 444444

4»«4444 4 « >444 44 44 »4 «4 >»

- 30 diimidazol a N-karbaalkoxydihydrochinoliny, například N-(ethoxykarbonyl)-2-ethoxy-l, 2-dihydrochinolin.

Další potenciálně použitelné reaktivní skupiny zahrnují díony s ketonovými skupinami na sousedních atomech uhlíku, například p-fenylendiglyoxal, tyto látky je možno použít k reakci s guanidinylovými skupinami, například podle publikace Wagner a další, Nucleic acid Res., 1978, 5, 4065 a diazoniové soli, schopné elektrofilních substitučních reakcí například podle publikace Ishizaka K. a Ishizaka T., J. Immunol., 1960, 85, 163. Bis-diazolyové sloučeniny se snadno připraví působením aryldiaminů na dusitan sodný v kyselém roztoku. Je zřejmé, že funkční skupiny v reportéru a/nebo vektoru je v případě potřeby možno přenést na jiné funkční skupiny před reakcí, například k dosažení další reaktivity nebo selektivity. Příkladem postupů, vhodných k tomuto účelu mohou být přeměna aminů na karboxylové kyseliny působením například anhydridů bikarboxylových kyselin, přeměny aminů na thioly, například při použití N-acetylhomocysteinthiol.aktonu, anhydridu kyseliny S-acetylmerkaptojantarové, 2-iminothiolanu nebo sukcinimidylových derivátů s obsahem thiolových skupin, přeměna thiolů na karboxylové kyseliny, například při použití alfa-halogenacetátů, přeměna thiolů na aminy, například při použití ethyleniminu nebo 2-bromethylaminu, přeměna karboxylových kyseliny na aminy, například působením karbodiimidů a pak diaminů a přeměna alkoholů na thioly, například působením tosylchloridu s následnou transesterifikací thioacetátem a hydrolýzou na thiol působením octanu sodného.

Vazbu vektoru na receptor je rovněž možno uskutečnit při použití enzymů jako činidel pro zesítěhí s nulovou délkou. K získání zesítěných produktů byly použity například enzymy transglutamináza, peroxidáza a xantinoxidáza. Obdobně je možno použít proteolýzu k zesítění tvorbou amidových vazeb.

44

4 4 »

4 4 4

4» 4444 · * • 4 ·

• · · «444 *·

Β» 4 4 4 Η Β

4 444 • 4 « • 4 44 »

44

Nekovalentní spojení vektoru a receptoru je například možno uskutečnit interakcí elektrostatických nábojů, například mezi reportérem s polylysinylovými funkčními skupinami a vektorem s polyglutamylovými funkčními skupinami, chelatací ve formě stálých komplexů kovů nebo afinitní vazbou, například vazbou typu avidin/biotin. Polylysin, nekovalentně vázaný na negativně nabitý povrch membrány může také nespeci ficky zvýšit afinitu mikrobublinek pro interakce s nabitým povrchem buněk.

Je také možno vektory vázat na sekvenci bílkoviny nebo peptidu, schopnou, vázat fosfolipidy. V řadě případů je možno navázat na bílkovinu jedinou molekulu fosfolipidu, například v případě translokázy, kdežto v dalších možných případech se mohou bílkoviny vázat na povrchy, tvořené převážně jedním ze zakončení fosfolipidových skupin a tak mohou být použity k vazbě vektorů na fosfolipidové kuličky. Jedním příkladem takové bílkoviny je beta2-glykoprotein I podle publikace Chonn A., Semple S. C. a Cullis P. R., Journal fo Biological Chemistry, 1995, 270, 25845 až 25849. Byly popsány také bílkoviny, schopné vázat fosfatidylserin, například v publikaci Igarashi K. a další, Journal of Biological Chemistry, 270, (49), 29075 až 29078. Annexiny jsou skupinou fosfolipidů, schopných vázat bílkoviny. Řada z nich se váže zejména na fosfatidylserin podle publikace Raynal P. a Η. B. Pollard. Annexins: the problém of assessing the biological role for a gene family of multifunctional calsium- and phospholipid-binding proteins, Biochim. Biophys. Acta, 1197, 53 až 93. Konjugát vektoru s takovou bílkovinou, schopnou vázat fosfatidylserin je tedy možno použít ke spojení vektorů s mikrobublinkami, zapouzdřenými ve fosfatidylserinu. V případě, že sekvence aminokyselin vazné bílkoviny je známá, je možno syntetizovat nebo izolovat Část pro vazbu fosfolipidu a užít ji pro konjugasti s vektorem, Čímž je možno se vyvarovat biologické účinnosti, která může být spojena s jinými částmi molekuly.

fc fc ♦

fcfc fcfcfcfc

♦ · ** • · · « * fcfc * ·*· fcfcfc

Je také možno získat molekuly se specifickou vazbou na povrch mikrokuliček nebo na jejich membránu přímým sledováním molekulárních bank pro molekuly pro vazbu na mikrokuličky. Pro takovou selekci je například možno použít banky fágů s obsahem malých peptidů, Výběr je možno jednoduše uskutečnit tak, že se mikrokuličky smísí s bankou fágů a oddělí se fágy, vázané na mikrokuličky. V případě potřeby je tento postup možno uskutečnit za fyziologických podmínek, napří^ klad v krvi k vyloučení peptidů se zkříženou reakcí se složkami krve. Výhoda tohoto typu selekce spočívá v tom, že jsou vybírány pouze molekuly, které nedestabilizují mikrokuličky vzhledem k tomu, že budou isolovány pouze molekuly, vázané na neporušené mikrokuličky. V průběhu tohoto výběru je také možné na krátkou dobu zavést pro mikrokuličky nepříznivé podmínky, například zvýšit tlak tak, aby skutečně nedošlo k selekci molekul, destabilizujících mikrokuličky. Mimoto je možno výběr provádět za střihového namáhání, například tak, že se nejprve nechá směs fágů reagovat s mikrokuličkami a pak se mikrokuličky nechají procházet po porvchu s povlakem protilátek proti fágu. Tímto způsobem může být možno vybrat vazné látky, odolávající obdobným podmínkám in vivo. Vazné skupiny, identifikované tímto způsobem je možno vázat na molekulu vektoru chemicky pomocí syntézy peptidů nebo při použití rekombinantních vektorů a tak získat obecný prostředek pro spojení jakékoliv molekuly vektoru s mikrokuličkami.

Vektor, který obsahuje nebo je vázán na peptidový nebo lipopeptidový spojovník s obsahem prvku pro zprostředkování spojení s membránou je také použitelný. Příklad takového vektoru je popsán například v publikaci Leenhouts J. M. a další, Febs Letters, 1995, 370(3), 189 až 192. Pro některé účely je také možno použít biologicky neaktivní molekuly, tvořené známými skupinami pro zakotvení do membrán, jde ······ · · ···» ftft ·* ·· *« ·· například o hydrofobní segment Hl z enzymu Na,K-ATPázy, zejména o jeho podjednotku alfa, popsanou v publikaci Xie Y. a Morimoto T., J. Biol. Chem., 1995, 270(20), 11985 až 11991. Zakotvující skupinou může také být zbytek mastné kyseliny nebo cholesterol.

Vazba může být také uskutečněna s.použitím avidinu nebo streptavidinu, které mají čtyři vazná místa s vysokou afinitou pro biotin. Avidin je proto možno použít ke spojení vektoru s reportérem v případě bio.tinylace obou těchto látek. Příklady jsou uvedeny v publikaci Bayer E. A. a Wilchek Μ., Methods Biochem. Anaí., 1980, 26, 1. Postup je mošno rozšířit také na vazbu reportéru na reportér, jde o postup, který může zlepšit shlukování bublinek a. tím dále potenciálně zvýšit kontrast zobrazení.

Nekovalentní vazbu je možno uskutečnit také s využitím bifunkční povahy bis-specifických imunoglobulinů. Tyto molekuly se mohou specificky vázat na dva antigeny, čímž je spojí. Jako vazné činidlo tohoto typu je možno užít například bispecifický IgG nebo chemicky pozměněný bispecifický fragment F(ab)'2. Byly také uváděny heterobifunkční bispecifické protilátky pro vazbu dvou odlišných antigenů, například podle publikace Bode C. a další, J. Biol. Chem., 1989, 944 a Staers U. D. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., ÍJSA, 1986,

83, 1453. Obdobně jakýkoliv reportér a/nebo vektor, obsahující nejméně dvě antigenní determinanty, například podle publikace Chen Aa. a další, Am. J. Patholi, 1988, 130, 216 může zesítit molekuly protilátek a tím vytvořit zesítěné shluky většího počtu bublinek se zvýšením kontrastu obrazu.

Tak zvaná vazná činidla s nulovou délkou, která vyvolávají přímé kovalentní spojení dvou reaktivních chemických skupin bez zavedení dalšího materiálu pro spojení, tak jak

- 34 je tomu například při tvorbě amidových vazeb s použitím karbodiimidů nebo enzymů je rovněž možno v některých případech použít stejně jako různá další činidla jako biotin/ avidin, vyvolávající nekovalentní spojení reportéru a vektoru a také činidla, vyvolávající hydrofobní nebo elektrostatické interakce.

Nejčastěji však bude vazné činidlo obsahovat nejméně dvě reaktivní skupiny, spojené spojovacím prvkem, tak jak bylo svrchu popsáno. Přítomnost takového spojovacího prvku dovoluje reakci bifunkčních spojovníků se specifickými funkčními skupinami v molekule nebo ve dvou odlišných molekulách, čímž vzniká vazba mezi oběma složkami a do konjugátu reportéru a vektoru je zaveden, materiál, odvozený od spojovníku. Reaktivní skupiny ve vazném činidle mohou být stejné v homobifunkčních činidlech nebo různé v heterobifunkčních činidlech nebo v heteromultifunkčních činidlech v případě, že je přítomno několik různých reaktivních skupin.

Tím vzniká velká řada potenciálních činidel pro kovalentní spojení mezi jakýmikoliv chemickými látkami intramo'lekulárně nebo intermolekulárně.

Povaha cizorodého materiálu, zavedeného spojovníkem může mít zásadní vliv na schopnost zacílení a obecně na stálost výsledného produktu. Může být například žádoucí uskutečnit labilní spojení, například obsahující biologicky degradovatelná místa nebo místa, citlivá na působení chemických látek, například enzymů. Mohou být zahrnuty také polymerní složky, působící například jako smáčedla ke zvýšení stálosti bublinek. Tento materiál může také obsahovat reaktivní skupiny, například k usnadnění zesítění nebo fluorescenční sondy nebo radioaktivní látky.

- 35 ·· ···· ·» ·· • · « • · · · * •v ·· • · · 4 • · · 4 • · · · · ι ···* ·· ·» ||

Spojovací prvky budou v typických případech tvořeny alifatickými řetězci, účinně oddělujícími reaktivní skupiny spojovníků na vzdálenost 5 až 30 X. Mohou také obsahovat makromolekulami struktury, například polyethylenglykoly PEG. Jde o jednoduché neutrální polyethery, užívané pro biotechnické a lékařské aplikace a podrobně popsané například v publikaci Milton Harris J., (ed), Polyethylene glycol chemistry, biotechnical and biomedičal applications, Plenům Press, New York, 1992. Tyto látky jsou rozpustné ve většině rozpouštědel včetně vody a jsou ve vodném prostředí vysoce hydratovány za vazby dvou nebo tří molekul vody na každý seg ment ethylenglykolu. Tím se brání' adosrpci dalších polymerů nebo bílkovin na povrchy, modifikované PEG. PEG jsou netoxic ké a nepoškozují bílkoviny nebo buňky, kovalentne vázané lát ky tohoto typu nevyvolávají tvorbu antigenů. ani reakci imunitního systému. Mimoto je možno je snadno modifikovat a vázat na další molekuly bez velkých modifikací. .Výhodná rozpustnost a biologické vlastnosti těchto látek jsou zřejmé z jejich širokého použití včetně tvorby sledových kopolymerů, jako PEG-polyurethanů a PEG-polypropylenů.

Molekulová hmotnost spojovacích prvků typu PEG může být například v rozmezí 120 až 20 000.

Hlavním mechanismem pro příjem částic buňkami retikulo endotheliálního systému RES je ópšonisace plasmatickými bílkovinami v krvi. Dochází k označení cizorodých částic, které jsou pak přijímány RES..Biologické vlastnosti PEG, použitých jako spojovacích prvků mohou sloužit k prodloužení doby cirkulace kontrastního prostředku podobně jako v případě liposo mů s obsahem PEG podle publikací Klibanov A. L. a další,

FEBS Letters, 1990, 268, 235 až 237 a Blume G. a Cevc G., Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1029, 91 až 97.

• 9 · 9*· ·· ·· 99 ·· • · · 9 9 9 999» • · 9 9999 9 99 9

999 > φ 99 999 999

9999999 · ·

9999 99 99 99 *9 99

- 36 Další potenciálně vhodné modifikace bílkovin, které mohou být provedeny ve vektorech, zahrnují částečnou nebo úplnou deglykosidaci působením neuraminidázy, endoglykosidázy nebo jodistanu, vzhledem k tomu, že po této reakci dochází k nižšímu příjmu v játrech, slezině, příjmu makrofágy a podobně, kdežto po opětné glykosylaci bílkovin často dochází ke zvýšení příjmu játry a makrofágy. Příprava zkrácených forem bílkovin pomocí štěpení vede ke snížení velikosti bílkoviny a zkrácení poločasu v krevním oběhu a také ke tvorbě kationtů podle publikací Kumagi a další, J. Biol. Chem., 1987, 262, 15214 až 15219, Triguero a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1989, 86, 4761 až 4765, Pardridge a další, J, Pharmacol. Exp. Therap., 1989, 251, 821 až 826 a Pardridge a Boado, Febs Lett., 1991, 288, 30 až 32.

Zvýšené účinnosti vazby na oblasti zájmu je také možno dosáhnout použitím protilátek, vázaných na konce spojovacích prvků typu PEG podle publikace Maruyama K. a další, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1234, 74 až 80 a Hansen C. B. a další, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1239, 133 až 144.

V některých případech se považuje za výhodné použít složku PEG jako stabilizátor ve spojení s vektorem nebo vek v

tory nebo přímo s reportérem v téže molekule v případě, že PEG není obsažen jako spojovací prvek.

Dalšími spojovacími prvky mohou být některé typy póly fl sacharidů, jako kyselina polygalakturonová, glykosaminoglykany, heparinoidy, celulosa a polysacharidy z mořských živo Čichů, jako chitosany, algináty á carrageenany, zásobní polysacharidy, jako škrob, glykogen, dextran a aminodextrany, polyaminokyseliny a jejich methyl- a ethylestery, jako homo a kopolymery lysinu, kyseliny glutamové nebo asparagové a také polypeptidy, oligonukleotidy a oligosacharidy, popřípadě obsahující místa štěpení různými enzymy.

BB ♦♦·· • Β

- 37 • · · Β Β Β BBB* ♦ * Β Β Β·· · « · · • BBB > Β < Β ΒΒ* ΒΒΒ

Β * * Β Β Β Β Β ·

ΒΒ·· ΒΒ ΒΒ ΒΒ ♦ * ··

Obecně mohou spojovací prvky obsahovat štěpitelné skupiny, jako glykolové skupiny, asoskupiny, zbytky sulfonů, esterů, thioesteru a disulfidové skupiny. Spojovací řetězce mohou také obsahovat biologicky degradovatelné methylendiesterové nebo diamidové skupiny obecného vzorce . -(«„j.x.clsVu.T.líg.

kde

X a 2 se volí se skupiny -0-, -S- a -NR-, kde R znamená atom vodíku nebo organickou skupinu,

Y nezávisle znamená karbonyl, thiokarbonyl, sulfonyl, fosforyl nebo obdobnou skupinu pro tvorbu kyseliny, man znamenají celé číslo 0 nebo 1,

R a R znamenají atom vodíku, organickou skupinu nebo skupinu -X.Y.(Z) - nebo společně tvoří dvojvaznou organic kou skupinu.

Jak bylo uvedeno například v mezinárodní patentové při <

hlášce WO 92/17436, jsou takové skupiny snadno biologicky degradovatelné v přítomnosti esteráz, například in vivo, avšak v nepřítomnosti takových enzymů jsou stálé a je proto s výhodou možno je použít v léčebných prostředcích ke zpomalenému uvolnění účinné složky.

Poly/N-(2-hydroxyethyl)methakrylamidy/ jsou potenciálně použitelné spojovací skupiny vzhledem k nízkému stupni in terakce s buňkami a tkáněmi, jak bylo popsáno v publikaci Volfová I., Říhová B. a Větvička P., ’J. Bioact. Comp. Polymers, 1992, 7, 175 až 190. Práce s podobným polymerem, tvořeným převážně příbuzným 2-hydroxypropylovým derivátem proká žaly, že docházelo k endocytoze mononukleárním fagočytárním ·· fcfc fc* ·· • * · · * · · · * fc · · · fcfc fc · · * · • fcfcfc fcfc fcfc fcfcfc fcfcfc • •••fcfcfc · · fcfcfcfc ·· fcfc ·· fcfcfcfc

- 38 fc* ··· systémem jen v poměrně malém rozsahu, jak bylo popsáno v publikaci Goddard P., Williamson I., Bron J., Hutchkinson L. E., Nicholls J. a Petrák K., J. Bioct. Compat. Polym., 1991, 6, až 24.

Další potenciálně použité polymerní materiály pro spojovací skupiny zahrnují následující látky;

i) kopolymery methakrylátu s methakrylovou kyselinou, popsané v publikaci Lee P. I., Pharm. Res., 1993, 10, 980, jejich karboxylátové substituenty však mohou vyvolat vyšší bobtnání než při použití neutrálních polymerů, ii) sledové kopolymery polymethakrylátů s biologicky degradovatelnými polyestery podle publikace San Roman J. a Guillen-Garcia P., Biomaterials, 1991, 12, 236 až 241, iii) kyanoakryláty, to znamená polymery esterů kyseliny 2-kyanoakrylové, jde o biologicky degradovatelné látky, užívané ve formě nanočástic pro selektivní aplikaci účinných látek podle publikace Forestier F., Gerrier P., Chaumard C., Quero A. Μ., Couvreur P. a Labarre C., J. Antimicrob. Chemoter., 1992, 30, 173 až 179, iv) polyvinylalkoholy, které jsou ve vodě rozpustné a jsou obecně považovány za biokompatibilní podle publikace Langer R., J_tlČontrol. Release, 1991, 16, 53 až 60,

v) kopolymery vinylmethy1etheru s anhydridem kyseliny male lnové, které jsou v biologickém prostředí narušovány podle publikace Finne U.,.Hannus M. a Urtti A., Int. J. Pharm.,

1992, 78, 237 až 241, vi) polyvinylpyrolidony, například s molekulovou hmotností nižší než 25 000, které jsou rychle filtrovány v ledvinách podle publikace Hespe W., Meier A. M. a Blankwater Y.M., Arzeim. Forsch./Drug Res., 1977, 27, 1158 až 1162,

- 39 00 ·00· «0 • 0 > 0 · · * « *· • 0· ·

Φ 0 0 · ·» vii) polymery a kopolymery alifatických hydroxykyselin s krátkým řetězcem , například kyseliny glykolové, mléčné, máselné, valerové a kapronové podle publikace Carli F., Chim. Ind. (Milan), 1993, 75, 494 až 499, včetně kopolymeru s obsahem aromatických hydroxykyselin ke zvýšení rychlosti degradace podle publikace Imasaki K., Yoshida M., Fukusaki H.,

Asano M., Kumakura M., Mashimo T., Yamanaka H. a Nagai T.,

Int. J. Pharm., 1992, 81, 31 až 38, viii) polyestery, tvořené střídajícími se jednotkami ethylenhlykolu a kyseliny tereftalové, například Dacron , tyto látky nejsou degradovatelné, jsou však vysoce biokompatibilní, ix) sledové kopolymery, obsahující biologicky degradovatelné segmenty polymerů alifatických hydroxykyselin podle publikace Younes H., Nataf P. R., Cohn D., Appelbaum Y. J., Pizov G. a Uretzky G., Biomater. Artif. Cells Artif. Organs, 1988, 16, 705 až 719, například ve spojení s polyurethany podle publikace Kobayashi H. Hyon S. H. a Ikada Y., Water-curable and biodegradable propolymers, J. Biomed. Mater. Res., 1991, 25, 1481 až 1494,

x) polyurethany, dobře snášené v implantátech a kombinovatelné s měkkými” segmenty, například obsahující polytetramethylenglykoi, _fpolypropylenglykol nebo polyethylenglykol a' aromatickými tvrdými segmenty, například obsahující 4,4*-methylenbisfenylenisokyanát podle publikace Ratner B. D., Johnston A. B. a Lenk T. J., J. Biomed. Mater. Res.: Applied Biomateriais, 1987, 21, 59 až 90, Sa Da Costa V. a další,

J. Coli. Interface Sci., 1981, 80, 445 až 452 a Affrossman Ξ. a další, Clinical Materials, 1991, 8,-' 25 až 31, xi) poly-1,4-dioxan-2-ony, kreré mohou být považovány sa biologicky degradovatelné estery vzhledem k jejich hydrolyzovatelným esterovým vazbám podle publikace Song C. X., Cui X. M. a Schindler A., Med. Biol. Eng, Comput., 1993, 3l, 147 až 150 a které mohou obsahovat glykolidové jednotky ke zvýšení ** »· * · · • * · · ·

- 40 ·« ···· • « · • · • · • · · ··«« «t * ♦ β ♦

99

9t • ♦ ♦ · • · · ·· ·» ·· jejich vstřebatelnosti, jak je popsáno v publikaci Bezwada R. S., Shalaby S. W. a Newman H.D.J., Agricultural and synthetic polymers: Biodegradability and utilization, 1990, ed. Glass J. E. a Swift G., 167 až 174 - ACS symposium Series,

433, Washington D. C., USA - American Chemical Society, xii) polyanhydridy, například kopolymery kyseliny sebakové s bis(4-karboxyfenoxy)propanem, které byly zkoušeny na králících podle publikace Brém H., Kadeř A., Epstein J. I., Tamargo R. J., Domb A,, Langer R. a Leing K. W., Sel. Cancer Ther, 1989, 5 55 až 65 a na krysách podle publikace Tamargo R. J., Epstein J. I., Reinhard C. Ξ., Chasin M, a Brém Η.,

J Biomed. Mater. Res., 1989, 23, 253 až 266 jako látky pro řízené uvolnění účinných látek v mozku bez toxických účinků, xiii) biodegradovatelné polymery s obsahem orthoesterových skupin, užívané pro řízené uvolnění in vivo podle publikace Maa Y. F. a Heller J., J. Control.Release, 1990, 14, 21 až 28, xiv) polyfosfazeny, které jsou anorganickými polymery, tvořenými střídajícími se atomy fosforu a dusíku a které byly popsány v publikaci Crommen J. Η. , Vandorpe J. a Schacht E..

Η., J. Control. Release, 1993, 24, 167 až 180.

V následující tabulce jsou uvedena spojovací činidle a Činidla pro modifikaci bílkovin, která je možno použít při přípravě zacílených kontrastních prostředků v souladu s řešením podle vynálezu.

fcfc fcfcfcfc •fc *♦ fcfc ·· * * · ♦ · · · « fc · • * fc fcfcfcfc ««fcfc «

	« · · · »» ♦ ··*· ·· ·· ·· - 41 -	fc · fcfc fcfc
Heterobifunkční	spojovací prostředky
spojovací prostředek	reaktivita	1 reaktivita 2	poznámky
ABH	uhlohydrát	fotoreaktivní
. ANB-NOS	-NH2 ..	fotoreaktivní
APDP (1)	-SH	fotoreaktivní	jodovatelný disulfidový spojovník
APG	-nh2	fotoreaktivní	reaguje selektivně s. Arg při pH 7-8
ASIB (1)	-SH	fotoreaktivní	jodovatelný
ASBA (1)	-COOH	fotoreaktivní	jodovatelný
EDC	-nh2	-COOH ‘	spojovník s ! délkou	nulovou
' GMBS	-nh2	-SH
sulfo-GMBS	-nh2	-SH	rozpustný ve	vodě
HSAB	-nh2	fotoreaktivní
sulfo-HSAB	-nh2	fotoreaktivní	rozpustný ve	vodě
MBS	-nh2 '	-SH
sulfo-HBS	-NH2	-SH	rozpustný ve	vodě
m2c2 h	uhlohydrát	-SH
MPBH	uhlohydrát	-SH
NHS-ASA (1)	-nh2	fotoreaktivní	jodovatelný
sulfo-NHS-ASA(l)	-nh2	fotoreaktivní	rozpustný ve jdodovatelný	vodě,
sulfo-NHS-LC- ASA (1)	-nh2	fotoreaktivní	rozpustný ve jodovatelný	vodě,

·» ···

	·» ··· ·· • · · ♦ · * • · · · • · · · » · · • · * · ♦ · · — 42**1»· ·* ·· ··	·» • · · · • · · · • ♦·· *·· ♦ · ··
PDPH	uhlohydrát	-SH	disulfidový spojovník
PNP-DTP	-nh2	fotoreaktivní
SADP	-nh2	fotoreaktivní	disulfidový spojovník
sulfo-SADP	,.NH2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný disulfidový ' spojovník
SAED	-nh2	fotoreaktivní	disulfidový spojovník
SAND	-NH2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný disulfidový spojovník
SANPAH	-nh2	fotoreaktivní
Sulfo-SANPAH	-nh2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný
SASD (1)	-NH2	fotoreaktivní	ve vodě rozpustný jodovatelný disulfidový spojovník
SIAB	-NH2	; -SH
sulfo-SIAB	-nh2	-SH	ve vodě rozpustný
SMCC	-NH2	-SH
sulfo-SMCC ..	-nh2 ř	-SH	ve vodě rozpustný
SMPB	-NH2	-SH.
sulfo-SMPB	-nh2	-SH	ve vodě rozpustný
SMPT	-nh2 .	-SH
sulfo-LC-SMPT	-NH2	-SH	ve vodě rozpustný
SPDP	-nh2	-SH
sulfo-SPDP	-nh2	-SH	ve vodě rozpustný
Sulfo-LC-SPDP	-nh2	-SH	ve vodě rozpustný

·· toto·* sulfo-SAMCA (2) -NH₂ sulfo-SAPB -NH₂ • to toto ·· ·· ·* ···· • · ·· ·«· to · · « to ··· toto ·· ··· ··· to······ · · • · · to · ·· «to ·· *· fotoreaktivní fotoreaktivní ve vodě rozpustný

Poznámka: 1) = jodovatelný,

2) = fluorescenční.

Homobifunkční spojovací prostředky

spojovací prostředek	reaktivita	poznámka
0	-nh2
BMH	-SH
BASED (1)	fótoreaktivní	jodovatelný disulfidový spojovník
BSCOES	-nh2
Sulfo-BSCOES	-nh2	ve vodě rozpustný
DFDNB	-nh2
DMA	-nh2
DMP *	-nh2
DMS	-NH2
DPDPB	-SH	disulfidový spojovník
DSG	-nh2
DSP	-nh2	disulfidový spojovník
DSS	-nh2
DST	-nh2	*
sulfo-DST	-NH2	ve vodě rozpustný
DTBP	-NH2	disulfidový spojovník

• · · ·· »· ·· * ··« · · · · • ···· · · · ·

	- 44 -	♦·····♦ · ft ···· ·· ·♦ ·· ·* ··
DTSSP	-nh2	disulfidový spojovník
EGS	-nh2
sulfo-EGS	-nh2	ve vodě rozpustný
SPBP	-nh2

Biotinylovaná činidla	poznámka
činidlo	reaktivita
biotin-BMCC	-SH
biotin-DPPEX		příprava biotinylovaných liposomů
biotin-LC-DPPEX		příprava biotinylovaných liposomů
biotin-HPDP	-SH	disulfidový spojovník
biotin-hydrazid	uhlohydrát
biotin-LC-hydrazid	uhlohydrát
jodacetyl-LC-biotin	-nh2
NHS-iminobiotin	-nh2	snížená afinita pro avi din
NHS-SS-biotin	-nh2	disulfidový spojovník
fotoaktivovatelný biotin .	nukleové kyseliny
sulfo-NHS-biotin	-nh2	ve vodě rozpustný
sulfo-NHS-LC-biotin	-nh2

Poznámka: DPPE = dipalmitoylfosfatidylethanolamin

LC = dlouhý řetězec.

to· · ► ·· · « to · · « · ·· «toto· ·» *« » · · » · to · · ···· ··

Činidla pro modifikaci bílkovin

činidlo	reaktivita	funkce
Ellmanovo Činidlo	-SH	kvantifikuje/ detekuje/chrání
'DTT . -	-S.S-	redukce
2-merkaptoethanol	-S.S-	redukce
2-merkaptoamin	-S.S-	redukce
Trautovo činidlo	-nh2 .	zavádí -SH zavádí chráněnou skupinu SH
ŠATA	-nh2 '
amca-nhs	-nh2	fluorescenční značení	*
AMCA-hydrazid	uhlohydrát	fluorescenční značení
AMCA-HPDP	-S.S-	fluorescenční značení
SBF-chlorid	-S.S-	fluorescenční detekce skupin -SH	*
N-ethylmaleimid	-S.S-	blokuje -SH
NHS-acetát	-NH2	blokuje a acetyluje skupiny -NH2
anhydrid kyseliny citrakonové	-nh2	reversibilně blokuje a zavádí negativní náboje
DTPA	-nh2	zavádí chelatační látku
BNPS-skatol	tryptofan	štěpí tryptofanový zbytek
Bolton-Hunter	-NH2	zavádí jodovatelnou skupinu

* *· ftftftft

- 46 ftft ftft ·· ft • · « · · · ftftftft ft « · «ftftft · · · · ft ftftft ftft ftft ····«· ftftft··»· ft · ftftftft ftft ftft ftft ftftftft

Další potenciálně použitelné modifikace bílkovin zahrnují částečnou nebo úplnou deglykosidaci působením neuraminidázy, endoglykosidásy nebo jodistanu vzhledem k tomu,

Že po deglykosidaci často dochází ke sníženému příjmu v játrech, ve slezině, u makrofágů a podobně, kdežto po opětné glykosidaci bílkovin často dochází ke zvýšenému příjmu v játrech a u makrofágů. Mimoto je možno připravit proteolytickým štěpením zkrácené formy těchto látek, což vede ke zmenšení velikosti molekul a tím ke kratšímu poločasu v krevním oběhu. Dále je možno vytvořit kationty, například podle publikací Kumag i a další, J. Biol. Chem., 1987, 262, 15214 až 15219, Triguero a další, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 1989,

86, 4761 až 4765, Pardrídge a další, J. Pharmacol. Exp. Therap. 1989, 251, 821 až 826 a Pardridge a Boado, Febs Lett., 1991,. 288, 30 až 32.

Vektory, které je možno použít v prostředcích podle vynálezu s možností zacílení zahrnují následující látky:

i) Protilátky, které je možno užít jako vektory pro velmi širokou škálu cílů a které mají výhodné vlastnosti, jako· vysokou specifičnost, v případě potřeby i vysokou afinitu, možnost modifikace této afinity podle potřeby a podobně. Biologická účinnost protilátky bude záviset na specifické kombinaci vektoru a cílové tkáně. Je možno užít běžných protilátek i geneticky pozměněných protilátek, přičemž v tomto druhém případě je protilátky možno upravovat pro určité potřeby, například pro různou afinitu nebo specifičnost. Použití lidských protilátek je výhodnější, aby bylo možno se vyvarovat imunitních reakcí proti molekule vektoru. Další použitelnou skupinou protilátek jsou tak zvané bispecifické protilátky, to znamená protilátky se specifičností pro dvě odlišné cílové molekuly v jediné molekule protilátky. Takové protilátky je možno využít například ke tvorbě shluků bublinek, zejména pro některé léčebné účely, například ·· ···· pro zacílení toxických skupin na cílové tkáně. Různé bispecifické protilátky jsou popsány v publikacích McGuinness Β. T. a další, Nat. Biotechnol., 1996, 14, 1149 až 1154, George A. J. a další, J. Immunol., 1994, 152, 1802 až 1811, Bonardi a další, Cancer Res., 1993, 53, 3015 až 3021 a French R. R. a další, Cancer Res., 1991, 51, 2353 až 2361.

ii) Molekuly, schopné'přilnutí k buňkám, jejich receptory, cytokiny, růstové faktory, peptidové hormony a jejích části. Vektory tohoto typu se účastní normálních biologických interakcí mezi bílkovinami na receptoru pro cílovou molekulu a budou v řadě případů vyvolávat biologickou reakci svou vazbou na cílové tkáně a budou tedy biologicky účinné. V případě vektorů se zacílením na proteoglykany budou takové účinky vektorů poměrně nevýznamné.

iii) Nepeptidové agonistické/antagonistické látky nebo vazné látky pro receptory bez biologického účinku, schopné se vázat na cytokiny, růstové faktory a peptidové hormony. Může jít i o biologicky neaktivní vektory, které nemají ani agonistický ani antagonistický účinek, avšak mohou splnit požadavek na zacílení, iv) Oligonukleotidy a modifikované oligonukleotidy, které mohou vázat DNA nebo RNA Watson-Crickovým způsoben nebo jiným způsobem párováním baží. DNA je obvykle přítomno pouze v mimo buněčném prostoru v důskedku rozrušení buněk, takže takové oligonukleotidy, které budou obvykle biologicky neoaktivní, bude možno využít například pro zacílení odumírajících tkání, spojených s celou řadou různých pathologických stavů. Oligonukleotidy mohou být také vytvořeny tak, aby se vázaly na bílkoviny, schopné specifické vazby na DNA nebo. RNA, například faktory pro transkripci, k jejichž vysoké expresi nebo aktivaci velmi často dochází u nádorových buněk nebo u aktiΦΦ ΦΦΦΦ «Φ »Φ «V

ΦΦ φ * Φ · · * · Β • Φ φ Φ ΦΦ« · « Φ ·

Φ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦΦΦ

ΦΦΦΦΦΦΦ Φ · . _Λ ΦΦΦΦ ΦΦ Φ· ΦΦ Φ· ΦΦ

- 48 vovaných buněk imunitního systému nebo endotheliálních buněk. K získání oligonukleotidů se schopností specifické vazby na určité cílové molekuly od bílkoviny až do kofeinu a které je možno použít jako vektory pro zacílení je také možno využít kombinační banky oligonukleotidů.

v) Látky, schopné vázat DNA se mohou chovat podobně jako oligonukleotidy, avšak po příjmu do buněk mohou mít biologickou účinnost a/nebo toxické účinky.

vi) Substráty/inhibitory proteázy. Proteázy se účastní vzniku řady pathologických stavů. Řada substrátů/inhibitorů nemá peptidovou povahu, avšak alespoň v případě inhibitorů je často biologicky aktivní.

vii) Molekuly vektoru mohou být vytvořeny z kombinačních bank, aniž by bylo nezbytné znát přesnou molekulovou cílovou strukturu, je možno uskutečnit funkční selekci in vitro, ex vivo nebo in vivo ke zjištění molekul, schopných se vázat na zobrazovanou oblast nebo strukturu.

viii) .Různé malé molekuly včetně biologicky účinných látek, schopných se vázat na biologické receptory různých typů. Takové vektory nebo jejich cílové tkáně je možno využít ke tvorbě biologicky neúčinných látek, schopných se vázat na tytéž cílové tkáně.

wr fc · « » • ·· »

999 999

9

99

- 49 •t *·«· • · · • · • · · • · · ···# ·· ·· *· • 9 V • · 999

9 9 9 9 • · · 9 *· 99 ix) Bílkoviny nebo peptidy, schopné vazby na glukosaminoglukanový postranní řetězec, například haparansulfát, včetně části větších molekul, schopných se vázat na glukosoaminoglykan vzhledem k tomu, že při takové vazbě má glukosoaminoglykanové postranní řetězce, nedochází ke vzniku biologické odpovědi. Proteoglykany se nenacházejí na Červených krvinkách, takže tímto způsobem je možno vyloučit nežádoucí adsopci na tento typ buněk. '

Dále budou uvedeny ještě jiné pleptidové vektory a lipopeptidy pro zacílení při zobrazování pomocí ultrazvukem: může jít o peptidy,schopné se vázat na atherosklerotické pláty, jako YRALVDTLK, YAKFRETLEDTRDRMY a RALVDTEFKVEKQEAGAK, peptidy, schopné se vázat na krevní sraženiny, jako NDGDFEEIPEEYLQ a GPRG, peptidy s vazbou na destičky, jako

PLYKKIIKKLLES a cholecystokínin, alfa-melanocyty stimulují+ cí hormon,, enterotoxiň-1,stálý za tepla, vasoaktivní peptid se střevní sliznice, syntetický peptid alfa-M2 z determinační oblasti pro třetí dlouhý řetězec komplementu a analogy uvedených látek pro zacílení nádorů.

V následujících tabulkách jsou popsány různé receptory, které mohou být zacíleny při použití určitých typů vektorů a oblasti, zacílitelné pro zvýšení kontrastu při zobrazování ultrazvukem při použití kontrastních látek s obsahem takových vektorů.. * • · 9 · 9 * • 9 99

9 · ·

9 9 · • ··!

- 50 ··♦· ·9 • · · 9

99

Vektory-protllátky (bílkoviny a peptidy)

typ vektoru	receptor	poznámky/oblast použití	citace
protilátky	CD34	cévní choroby obecně,	1
(obecně) 11	ICAM-l	normální cévní stěna, například v myokardu, aktivovaný endothel, imunitní buňky 11	i·
II	ICAM-2	II	1;
11	ICAM-3	II	1
υ	E-selectin	II	. 1
11	p-selectin	fl	1.
If	PECAM	fl	1
H	integriny,		2
i n	jako VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, beta^alfa?, beta^alfag,. beta^alfa^, LFA-1, Mač-1, CD41a, a pod. GlyCAM	cévní stěny v uzlinách,	3
H	MadCaml	specifické pro uzliny II

- 51 • φ φφφφ φφ ·· • Φ φ · · » φφφ • · ♦ · ·φ· · ·· φφφφφφφ φ φ φφφφ φ* φφ φφ φφ φφ

Η	fibrin	thromby	4
ιι	tkáňový faktor	aktivovaný endothel,nádory	5
II	myosin	nekrosa, infarkt srdečního svalu	6
Η	CEA (kar- cinoembryonální antigen)	nádory	7
tr 1	muciny	nádory	8
11	bílkovina pro odolnost proti léčivům	nádory	9'
η	specifický antigen prostaty C	nádory prostaty	10
II	Cathepsin B	nádory (k expresi proteáz specificky často dochází u různých nádorů, jednou z nich je Cathepsin B)	11
π	receptor pro transferrin	nádory, stěna buněk cév	12
MoAb 9.2.27	t	nádory, antigeny, závislé na růstu buněk	13 .
	VAP-1 '	lnoucí molekula
	bílkovina pásu 3	vzniká při Činnosti fagocytů

·· · · · · ·» · · ·· · * • · · Β « β « • · !♦· Β ΒΒ · ··**··· · · ··** ·· ♦♦ ·· ΒΒ ΒΒ

	CD44	nádorová buňka
	beta2-mikro- globulin	obecně	r
	MHC skupina 1	obecně
protilátky	integrin alfavbeta3	nádory, angiogenese	c
protilátky	CD44	nádorové buňky	a
protilátky	beta2-mikro- globulin	obecně	b
protilátky	MHC skupina 1	obecně	b

a) Heider Κ. Η., Sproll Μ., S. Susani, Ε. Pezelt, Ρ. Beaumier Ε. Ostermann, Η. Ahorn a G. R. Adolf, 1996, Characterization a high-affinity monoclonal antibody specific .for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinoman, Cancer Immunology Immunotherapy, 43, 245-253.

b) I. Roitt, J. Bristoff a D. Male, 1985, Immunology; Londýn: Gowér Medical Publishing, str. 4-7.

c) Stromblad S., a D. A. Cheresh., 1996, Integrins, angiogenesis and vascular cell suvivaí, Chemistry and Biology, 3, 881 až 885.

·· ···· « 9 44 ► · 4

Bílkovinné a peptidové vektory - molekuly s adhesí k buňkám a podobně f

typ vektoru receptor poznámky/použití ref.

L-selectin

CD34 MadCAMl GlyCam 1 jiné selectiny uhlohydrátové ligandy (sialyl Lewis x) heparansulfát cévní onemocnění obecně normální stěna cév,např, v srdci, aktivovaný endothel, mízní uzliny 3 cévní choroby obecně, 14 normální cévní stěna, např. v srdci, aktivovaný endothel

RGD-peptidy integriny angiogenese

PECAM

PECAM a další endothel, buňky 15 imunitního systému integriny, jako VLA-1, VLA-2, VLA-3 VLA-4, VLA-5, VLA-6 beta^alfa?, beta^alf&₈, beta^alfa^, LFA-1, Mac-L, CD4la a pod.

Laminin, kolagen, fibronectin, : VCAM-1, thrombospondín, vitro- nectin a pod.

endothel, stěny buněk a pod.

receptory integrinu, jako Laminin, kolagen, fibronectin, VCAM-1, thrombospondin, vitronectin a pod.

integriny, jako buňky imunitního

VLA-1, VLA-2,VLA-3, systému, buněčná

VLA-4, VLA-5, stěna a pod.

VLA-6, beta,alfa„, ' _t beta₁alfa_Q, beta^alfay, LFA-1,

Mac-1, CD41a, a pod.

ftft ftftft·

- 54 • * · ft ft ft · • ftft • ftftft · · * ftft • ftftftft • ftft ft ftft ftft ftft «· • ftft ft • ftft · ft « • ft ftft molekuly s adhesí k nervovým buňkám (N-CAN) RGD-peptidy proteoglykany ₁₉

N-CAM (homofilní) integriny angiogenese c

Vektroy, obsahující oytokiny/růstové faktory/peptidové hormony a jejich fragmenty

typ vektoru	receptor	poznámky/použití	ref
faktor růstu epidermis	ÉGF-recepto.r nebo příbuzné receptory	nádory	20
faktor růstu nervových buněk	NGF-receptor	nádory	21
somatostatin	ST-receptor	nádory	22
endothelin	receptor pro endothelin	cévní stěna	23
Interleukin-1	IL-l-receptor	záněty, různé aktivované buňky	24
Interleukin-2	IL-2- receptor	11	25
chemikiny (20 různých cytokinů se společnými receptory)	receptory pro chemokiny, proteoglykany	záněty

• · • to · · • to •to ···· to· toto to · · toto·· ·· • «» · ·· ·· • to to ·

faktor nekrosy nádorů	TNF-receptory	záněty
parathyroidní hormon	PTH-receptory	onemocnění kostí a ledvin
morfogenetický kostní protein	BMP-receptory ,	..kostní choroby
Calčitonin	CT-receptory	kostní choroby .
faktory pro růst kolonií (G-CSF, GM-CSF, M-CSF, IL-3)	odpovídající specifické receptory, proteoglykamy	endothel 26
růstový faktor I, podobný insulinu	IGF-1, receptor	nádory, jiné rostoucí tkáně »
atriový natriuretický ANF-receptory faktor	ledviny, stěna cév
Vasopresin	receptor vassopresinu	ledviny, stěna cé\
VEGF	VEGF-receptor	endothel, oblasti aangiogenese
růstový faktor fibroblastů	FGF-receptory, proteohglykany	endothel ^7 angiogenesse
růstový faktor Schwannových buněk	proteoglykany, specifcické receptory	28

···♦ ·· »4 4» • · 4 · · 4 44·· • 4 4 4444 4 44 4

444 44 · 4 *44 444 • 4*4444 4 »

44*4 44 »4 · 4444

- 56 Různé bílkovinné a peptidové vektory

typ vektoru	receptor	poznámky/použití	ref.
Streptavidin	ledvina	choroby ledvin	29
bakteriální bílkoviny s vazbou na fibronectin	fibronectin	cévní stěna	30
Fc-část protilátek	Fc-receptory	monocyty, makrofágy, 31 játra
transferrin	receptor pro transferrin	nádory, stěna cév	11
střeptokináza/ tkáňový aktivátor plasminogenu	thromby	thromby
plasminogen, plasmin	fibrin	thrmoby, nádory	32
protelnázy tukových buněk	proteoglykany		33
elastáza	proteoglykany		34
lipoprotein, lipáza	proteoglykany		35
koagulační enzymy	proteoglykany		36
mimobuněcná superoxidismutáze	proteoglykany		37

φφ »·*· . . ♦* ** ·· ·· • * · » · * φ Φ a « • * φφφφφ φ φ φ · ···«*·· φ · ···* ·· φ φ φφ «· ««

kofaktor II heparínu	proteoglykany	38
faktor přežití sítnicových buněk	proteoglykany specifické receptory	39
mozkový mitogen pro vazbu heparínu.	proteoglykany specifické receptory	40
apolipoproteiny, jako apolipoprotein B	proteoglykany,. specifické receptory, jako LDL-receptor	41
apolipoprotein E	LDL-receptor proteoglykany	42
bílkoviny, vyvolávající adhesi, jako purpurin		proteoglykany 43
virové obalové bílkoviny, jako HIV, virus oparu	proteoglykany 44
mikrobiální adhesiny k	komplex antigenů 85 mycobacterií	fibronectin, kolagen, fibri- nogen, vitro- nectin, .heparan sulfát 45
prekursor beta- -amyloidu	1 proteoglykany t	beta-amyloid se hromadí při Alzheimerově chorobě 46
tenascín, jako tenascin C	heparansulfát, integriny	47

·· ····

99

0 9

9 99 9

- 58 9 9 9

9 *

9 9

9999 99

9 9 9

99 • · « β • » « 9 « · 99 99

Vektory, obsahující nepeptidové agonisty/antagonisty cytokinů/růstových faktorů/peptidových hormonů/molekul, adherujících k buňkám (řada těchto látek je známá pro

faktory, působící přes receptory, spojené s bílkovinou G)	48, ref
typ vektoru	receptor	Poznámka/použití
antagonista	receptor	buněčná stěna cév
endothelinu	endothelinu
desmopressin	receptor vaso-	ledviny, cévní stěny
(analog vaso-	pressinu
pressinu)
demoxytocin	receptor oxytoxinu reproduktivní orgány
(analog oxytoxinu)		mléčná žláza, mozek
angiotensin II	receptory	cévní stěna, mozek,
(antagonista	angiotensinu II	nadledvinky
receptoru),
CV-11974, TCV-116
nepeptidové RGD-	integriny	buňky Imunitního systému,
-analogy		cévní stěny a pod.	50

·· ftftftft ·· ftft ·« ftft • ftft ftftftft • ftftftft · ftft · • · ftft ftft ftftft *·♦ • ftftft · ft ftft ftft ftft ftft

- 59 Vektory,, obsahující antiangiogenní faktory typ vektoru cíl poznámka/poušití ref.

angiostatin	EC nádorů	fragment plasminogenu K
inhibitor, . . odvozený od chrupavky	EC nádorů	J
beta-cyklodextrin- tetradekasulfát	nádory, záněty	C
fumagillin a analogy	nádory, záněty	E
interferon-alfa	EC nádorů	K
interferon-gamma	EC nádorů	E
interleukin-12	EC nádorů	E
linomid	nádory, záněty	A
medroxyprogesteron	EC nádorů	K
inhibitory metalloproteinázy	- EC nádorů	K
pentosanpoly- sulfát	EC nádorů	K
faktor destiček 4	EC nádorů	M
somatostatin	EC nádorů	K

···· • · fcfc ► · · * fc · · » ¹ · · • fcfcfc fcfc • · · a • · · · • · · · ♦·· ··· • # fc· «fc ♦ fc

- 60 -
suramin	EC nádorů		K
.taxoi	EC nádorů		K
thalinomid	EC nádorů		K
thrombospondin	EC nádorů		K
Vektory s obsahem	angiogenních	faktorů
typ vektoru	cíl	i poznámka/použití —, —	‘ ref

kyselý růstový	EC	nádorů	K
faktor fibroblastů				<
adenosin	EC	nádorů		K
angiogenin	EC	nádorů		K
i angiotensin II	EC	nádorů		K
složky základní membrány	nádory	> např. tenascin, kolagen IV	M
základní růstový faktor fibroblastů	EC	nádorů		K
bradykinin	EC	nádorů		K
peptid, příbuzný genu kalcitoninu	EC	nádorů k		K
růstový faktor	EC	nádorů		K

epidermis ·· «*·· ·· ·· ·· ·· • · · · β _ · ··*··· · · — 61 — ···· ·· ·» ·· ·* «*

fibrin	nádory	K
fibrinogen	nádory	K
heparin	EC nádorů	K
hlstamin	EC nádorů	K
kyselina hyalu- ronová a fragmenty	EC nádorů	K
interleukin-Ialfa	EC nádorů	K
laminin, a jeho fragmenty	EC nádorů	K
nikotinamid	EC nádorů	K
faktor, aktivující destičky	EC nádorů	K
endotheliální růstový faktor, odvozený od destiček	EC nádorů i	'K
prostaglandiny El, E2	EC nádorů	K
spermin	EC nádorů	K
substance P	EC nádorů	K
transformující růstový faktor alfa	EC nádorů	K

·· to· • · · · « ·· · ·· to··· toto · · • · · • · · * to to to to · to * ··· toto ·· toto

transformující růstový faktor beta	EC nádorů
faktor nekrosy	EC nádorů
nádorů-alfa

vaskulární endo- EC nádorů K theliální růstový faktor pro propustnost cév vitronectin

Molekuly vektoru, odlišné od angiogenetických faktorů se známou afinitou pro receptory, spojené s tvrbou nových cév

typ vektoru	cíl		poznámka/poušití re:
angiopoetin	nádory, záněty		B
alfa2-antiplasmin	nádory,	záněty	-
sloučeniny z kombinačních bank	nádory,	záněty	např. látky s vazbou na základní membránu po degradaci
endoglin	nádory,	záněty	' D
endosialin	nádory,	záněty	D
endostatin (fragment	nádory,	záněty	M

kolagenu) • fcfc « · ·· · fc · » • · fcfc fc · « • fcfcfcfc • fcfc « • fcfc · ·· fc* antigen, příbuzný faktoru VII fibrinopeptidy základní růstový faktor fibroblastů růstový faktor hepatocytů růstový faktor, podobný insulinu interleukiny inhibiční faktor leukemie nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty inhibitory metallo- nádory, záněty proteinázy monoklonální protilátky nádory, záněty peptidy, např. cyklický nádory, záněty RGDDFV .

placentami růstový faktor placentární faktor, příbuzný proliferinu nádory, záněty nádory, záněty

D

ZC

E

I

R např. IL-8 I

A např. batimastat E,

A např. proti angiogenetickému faktoru nebo receptorů nebo složkám fibrinolytického systému , '

B, Q

J f

E *· ···»

plasminogen	nádory,	záněty	M
aktivátory plasmínogenu	nádory,	záněty	D
inhibitory aktivátoru plasmínogenu	nádory,	záněty	u, V
látky, antagonlzujicí . faktor pro aktivaci destiček	nádory,	záněty inhibice angio- genese	A'
růstový faktor, odvozený od destiček.	nádory.	, 2áněty	E
pleiotropin	nádory,	záněty	ZA
proliferin	nádory,	záněty	E
bílkovina, příbuzná proliferinu	nádory,	záněty	E
selektiny	nádory,	záněty např. E-selektin	D
SPARC	nádory,	záněty -	M
hadí jed - . (s obsahem RGD)	nádory,	záněty •i	Q
tkáňový inhibitor metalloproteináz	nádory,	záněty např. TIMP-2	U
thrombin	nádory,	záněty	H
tetradekapeptid, aktivující receptor thrombinu	nádory,	záněty	H

• · · ·

4 · ♦ • 4* ··*

4· 4 · ··

thymidinfosforyláza	nádory,	záněty	D
faktor růstu nádorů	nádory,	záněty	ZA

Receptory/cíle spojené s angiogenesí	poznámka/použití	ref
typ vektoru	cíl
biglykan	nádory,	záněty	dermatansulfát, proteoglykan	X
CD34	nádory,	záněty		L
CD44	nádory,	záněty		F
kolagen typu I, IV, VI á VIII	nádory,	záněty		A- ·
dekorin	nádory,	záněty	dermatansulfát proteoglykan	Ý
dermatansulfát proteoglykany	nádory,	záněty		X
endothelin	nádory,	záněty		G
receptory endothelinu	nádory,'	záněty		G
fibronektin	nádory			P
Flk-1/KDR, Flt-4	nádory,	záněty	receptor VEGF	D

FLT-1 (tyrosinkináza, podobná fms) nádory, záněty receptor VEGF-A 0 • · fc fc « · · • · fc · • fc fc·· · fcfc heparansulfát nádory, záněty receptor růstového nádory, záněty faktoru hepatocytů (c-met) růstový faktor, podobný nádory, záněty insuliňu/receptor pro mannoso-6-fosfát integriny: beta„ a beta_c, integrin alfa^beta^, integrin alfa^beta^, integriny alfa^, integriny beta-ρ integrin akfa^beta^, integrin alfa^beta^, -integrin álfa^ integrin alfa^.beta^, receptory fibrinu molekula 1 a 2 pro nitrobuněčnou ádhesi produkt zkráceného genu

Ly-6 nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty

D, P receptor lamininu podjednotka receptoru fibronektinu

P

T

í.' protein, aktivující lymfócyty . N • · * · » * · · • · • • · · _ C *7 — *··· ·»

metalloproteinázy matrice	nádory,	záněty	D
MHC skupina II	nádory, záněty
produkty genu	nádory,	záněty		T
osteopontin	nádory		' -	Z
PECAM	nádory,	záněty	alias CD31	P
receptor aktivátoru plasminogenu	nádory,	záněty		ZC
receptory růstových faktorů, odvozených od destiček-	nádory,	záněty		E
selektiny E a P	nádory,	záněty		D
sialyl Lewis-X	nádory,	záněty	antigeny krevních skupin	M
stresové bílkoviny včetně bílkovin tepelného šoku	nádory,	záněty	doprovodné molekuly
synděkan	nádory,	záněty		T
thrombospondin	nádory,	záněty	Λ f	M
TIE-receptory	nádory,	záněty	tyrosinkinásy s oblastmi Ig a EGF	E

• · · ♦ # · ··* *·#

Μ ·*·« tkáňový faktor tkáňový inhibitor me tallopro te ináz receptor transformačního růstového faktoru receptor aktivátoru plasminogenu typu urokinázy molekuly, lnoucí ke stěně cév, VCAM bílkovina, příbuzná faktoru růstu cévního endothelu receptor faktoru A růstu cévního endothelu antigen,, příbuzný von Willebrandovu faktoru nádory, záněty nádory, záněty nádory, záněty nádory,-záněty nádory, záněty nádory·, záněty nádory, záněty nádory, záněty

Z např. TIMP-2 U ·· .····

^:1

- 69 poznámka/použití ref.

- -. . - - - - ' - ----Oligonukleotidové vektory typ vektoru. receptor

oligonukleotidy, komplementární např, ke genům pro RNA ribosomů, Alu-sekvence	DNA je dostupná* až po nekrose	infarkt myokardu 51 a ostatní choroby, zahrnující nekrosu
oligonukleotidy,	DNA je dostupná	nádory	51 ’
komplementární ke	až po nekrose v
specifickým mutacím	oblasti chorobných
jako mutovaným	změn
onkogenům
oligonukleotidy,	DNA původce t	virové nebe	i bakte- 51
komplementární k DNA	infekce	riální infekce
původce infekce
oligonukleotidy, tvo-	jako Svrchu	jako svrchu 51
řící trojitý nebo
čtyřnásobný helix
oligonukleotidy	bílkovina s vaz-	nádory,
se sekvenci, roz-	bou na DNA, jako	aktivovaný	endothel
poznávanou bílkovi-	faktory trans- ' .	aktivované	buňky
nami , schopnými	kripce, jejichž	imunitního	systému
vazby ha DNA nebo RNA	exprese je akti-	-

vována u nádorů nebo buněk endothelů/imunitního ' systému

4444 • 4· »4 4» 44

4 4 4 4 4 4

4444 4 44 4

44 ·4 444 444 > 4 4 4 4

44 44 44

- 70 Modifikované oligonukleotidové vektory typ vektoru receptor poznámka/použití . ref.

fosfothioátový oligonukleotid jako pro jako pro nemodifikovaný nemodifikovaný oligonukleotid 51 oligonukleotid

-0-methylsubstituované oligo- , nukleotidy cirkulární oligonukleotidy oligonukleotidy s vlásenkovou strukturou pro snížení rozkladu oligonukleotidy s koncovou fosfothioátovou skupinou a^-fluorooligonukleotidy 51

-aminooligonukleotidy

II látky, schopné vázat DNA, konjugované s oligonukleotidy peptidové nukleové kyseliny (PNA, oligonukleotidy s peptidovou kostrou) zvýšená afinita vazby ve srovnání s' čistými oligonukleotidy 52 zvýšená afinita vazby a stálost ve srovnání s běžnými oligonukleotidy *· toto • ·· · • «· · • ♦*· ··· » · ·· «· • to ···· • to to « to • « to • to to • toto to · • to ·· ·' toto to toto to • toto · « toto · • to ··

Nukleosídové a nukleotidová vektory typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

'adenosin nebo receptory cévní stěna, srdce 54 analogy adenosinu

ADP, UDP, UTP. a další různé recep-' řada'tkání, 'jako '55 tory nukleotidů mozek, mícha, ledviny, slezina

Receptory, obsahující látky, schopné vázat DNA typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

akridinové deriváty DNA je dostup- nádory, infarkt distamycin, netropsin, ná až po myokardu a další actinomycin D, echino- nekrose. choroby s nekrosou mycin, bleomycin a pod. nebo uvolněním DNA z buněk

Receptory, obsahující substráty pro proteázu

typ vektoru	receptor	poznámka/použití
peptidové nebo nepeptidové substráty	Cathepsin B	nádory, u nichž chází k vysoké expresi proteázy

jako Cathepsinu B

- 72 ·· ····

Receptory s obsahem inhibitorů proteázy typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

peptídové nebo nepeptidové inhibitory, jako N-acetyl-Leu-Leu- -norleucinal	Cathepsin B	nádory, u nichž 10 dochází k vysoké expresi různých proteáz, například Cathepsinu B
beštatin /(2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-fenylbutanoyl/-L-leucinhydrochlorid	aminopeptidáza	nádory, například na povrchu buněk
pefabloc, 4-(2-aminoethyl)benzensulfonylfluoridhydrochlorid	serinproteázy	nádory, buněčné stěny a pod.
běžně dodávané inhibitory. jako kaptopril, enalapríl nebo ricionopril v	enzym pro přeměnu angiotensinu	endotheliální buňky
nepeptidové sloučeniny s nízkou spéci- ficností	koagulacní faktory	poranění buněčných stěn, nádory a pod.
nexiny proteáz (jejich mimobuněČné inhibitory)	proteoglykany	56

antithrombin proteoglykany, koagulacní faktory ·♦ »»«· • · • · • · * «·«· ·»

- 73 ·» ·· • · « • · ··« • · « * Γ · • · * · • V ··' «« ·« • · · · • · · « ··· ··· • · ·· 99

Vektory z kombinačních bank

typ vektoru	receptór	poznámka/použití	ref
protilátky se	kterýkoliv z	jakákoliv normální	58,
strukturou,	uvedených cílů	nebo patologická	59,
určenou při vzniku	nebo neznámý při funkční selekc i.	struktura jako thrómby, nádory, srdeční cévy	60
peptidy se sekvencí stanovenou v průběhu tvorby	ir	II	58, 59, 60
oligonukleotidy se sekvencí, stanovenou v průběhu tvorby *	II	II	58, 59, 60
modifikace oligonukleotidů, vytvořené jako svrchu	II	It	58, 59, 60
jiné chemické látky,. se strukturou, stanovenou v průběhu tvorby	ir	II	58, 59, 60

Uhlohydrátové vektory typ vektoru receptór neoglykoproteiny makrofágy poznámka/použití ref.

obecná aktivace/ zánět ·· φφφφ φφ ·· φφφ • · · • φ • φ φ φ φ φφφ φ φφ φ φ φφ' φφ • · φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ • · φ φ φ φ

oligosacharidy s koncovou galaktosou	receptor pro játra gy asialoglyko- protein
hyaluronan J . .... v	aggrecan (proteo- 62 glykan), vazné bílkoviny, receptory na povrchu buněk: CD44
mannosa	mozkomíšní bariera, 53 mozkové nádory a další choroby se změnami BBB
bakteriální glykopeptidy	. 64

(Glyko)lipidové vektory
typ vektoru	cílová struktura	poznámky/použití
GM1 gangliosidy	bakterie cholery v zažívacím traktu	diagnosa/léčení cholery
antagonista PAF	receptory PAF	diagnosa zánětu
antagonista prostaglandinu (zánět)	receptor prostaglandinu	diagnosa zánětu
antagonista thromhoxanu (zánět)	receptor leukotrienu diagnosa zánětu Ί

• fc ···· • « • · fcfcfc fcfc· · fcfc ·· ·♦ • fc · fc fcfcfcfc fc fcfc fcfc • ♦ · · • fc fcfc • fc fcfc • · · · • fcfc fc • fcfc fcfcfc fcfc

Vektory s obsahem malých molekul typ vektoru receptor poznámka/použití ref.

adrenalin beta-biokátory alfa-blokátory.

benzodiazepiny analogy serotoninu antihistaminy antagonisté receptorů acetylcholinu verapami1 nifedipin amilorid odpovídající receptory adrenergní beta-receptory adrenergní alfa-receptory receptory serotoninu receptory histaminu receptory acetylcholinu blokátory

Ca²⁺-kanálů blokátory

Ca²¹⁺-kanálů výměna Na⁺/H⁺

Části myokardu, citlivé na beta-1-blokátory cévní stěna buněčná stená srdeční sval srdeční sval blokování výměny v ledvinách, řízení buňkami, stuniulo vánými růstovými faktory «·« . *· ·· toto • » .· · ·· ··..*·.

• · ··,·« *«*, ··: ...... .........

digitalisové glykosidy

Na⁺/K⁺-ATP-ázy srdeční sval, periferní cévy, centrální nervový systém látky, antágonizující nebo s agonistickým účinkem na receptory thromboxanu/prostaglandinu glutathion receptory thromboxanu/ prostaglandinu cévní stěny, endothe1 receptory plíce, mozek glutathionu a leukotrienu * biotin folát riboflavin transport biotinu na povrch buněk transport fólátu, nádory na povrch buněk transport ribofla-' 67vinu na povrch buněk ·· ··«·

- ΊΊ Literární údaje k tabulkám:

A. Aurbach W. a R. Auerbach, 1994, Angiogenesis inhibítion: a review. Pharmac. Tber., 63, 265 až 311.

B. Barinaga Μ., 1997, Designing Therapies That Target Tumor Blood Vassels. Science, 275, leden 24), 482 až 484.

C. J. Folkman, P. B. Weisz, M.M. Joullié, W. W. Li, a

W. R. Ewing, 1989, Control of Angiogenesis With Synthetic Heparin Substitutes. Science 243, 1490 až 14930 s í

D. Fox S. A. a A. L. Harris, 1997, Markers of tumor angiogenesis: Clinical applications in prognosis and anti-angiogenic therapy. Investigational New Drugs 15, (1), až 28.

E. Gastl G., T. Hermann, M. Steurer, J, 'Zmija, E. Gunsilius,

C. Unger a A. Kraft, květen 1997, Angiogenesis as a target for tumor treatment. Oncology 54, (3), 177 až 184.

F. Griffioen A. W. , M. J. H. Coenen, C. A. Damen, S. Μ. M. Hellwig, D. H. J. Venweering, W. Vooys, G. H. Blijham, a G. Groenewegen, ‘1. srpna 1997, CD44 is involved in tumor angiohenesis, an activation antigen on human endothelial cells. Blood 90, (3), 1150 až 1159.

G. Hlatky L., P. Hahnfeldt, a C., N. Coleman, 1996, Vascular endothelial growth factor: environmental Controls and effects in angiogenesis,· Brit. J. Cáncer, 74, (Suppl. XXVII): 151 až 156.

H. Maragoudakis Μ. E., E. Pipili-Synethos, E. Sakkoula,

D. Panagiotopoulos, N. Craniti a J. M. Matsoukas,

9· 9999

- 78 9 9 · • 9 • · 9 9 ·

9999 «·

99 • 9

999 9 9 « • 9 9 • 9 ·9 *· 99 • · 9 9 • 9 9 9

999 »·« * 9

9« 99

1996, Inhibition of TRAP-induced angiogenesis by the tripeptide Phe-Pro-Arg, a thrombin-receptor-derived peptide analogue, Letters in Peptide Science, 3, 227 až 232.

I. Nguyen Μ., 1997, Angiogenic factors as tumor markers. Investigational New Drugs 15, (1>, 29 až 37.

J. Ono Μ., H. Izuml, S. Yoshida, D. Gtot, S. Jimi, N. Kawahára, T. Shono, S. Ushiro, M. Ryuto, K. Kohno,

Y. Sáto a M. Kuwano, 1996. Angiogenesis as a new target for cancer treatment. Cancer Chemoter. Pharmacol.,. 38, (Suppl), 78 až 82.

K. Passe T. J., D. A. Bluemke, a S. S. Siegelman,

June 1997, Tumor angiogenesis: Tutoriál on implications for imaging. Radiology, 203 (3), 593 až 600.

L. Saclarides T. J., únor 1997, Angiogenesis in colorectal cancer, Surgical Clinics of North America 77, (1), 253.

M. Sage Ε. H., květen 1997. Pieces of eight: Bioactive fragments of extracellular proteins as regulators of angiogenesis. Trends in Cell Biology, 7 (5), 182-186.

N. Sagi-Assif 0., A. Traister, B. Z. Katz, R. Anavi,

M. Eskenazy a I. P. Witz, 1996, TNFálfa and anti-Fas antibodies regulate Ly-6E.l expression by tumor cells:

A possible link between angiogenesis and Ly-6E.l. Immunology Letters, 54, 207 až 213.

O. Strawn L. Μ., G. McMahon, H. app, R. Schreck, W. R. Kuchler, Μ. P. Longhi, T. H. Hui, C. Tang, A. Levitzki, A. Gazit, I. Chen, G. Keři, L. Orfi, W. Risau, I. Flamme A. Ullrich, Κ. P. Hirth, a L. K. Shawyer, 1996.

• · · · »· φ · • β • « · ···· ··

- 79 • · · · Φ · • · ·· «Φ

Flk-1 as a Target for Tumor Growth Inhibition, Cancer Res.,

56, 3340 až 3545.

P. Stromblad Ξ., a D. A. Cheresh., února 1996, Cell adhesion and angiogenesis. Trends in Cell Biology 6, (12),

462 až 468.

Q. Stromblad S. a D. A. Cheres, listopad 1996, Integrins, angiogenesis and vascular cell survival. Chemistry and Biology, 3, (11), 881 až 885.

R. Volpert 0., D. Jackson, N. Bouck a D. I. H. Linzer, prosinec 1996, The insulin-like growth factor II/mannose 6-phosphate receptor is required for proliferin-induced angiogenesis. Endocrinology, 137 (9), 3871 až 3876.

S. Yoshida 0. Μ., T. Shono, H. Isumi, T. Ishibashi, H. Suzuki, a M. Kuwano, 1997. Involvement of Interleukin-8, Vascular Eňdothelial Growth Factor, and Basic Fibroblast Growth Factor in Tumor Necrosis Factor Alpha-Dependent Angiogenesis. Mol. Cell. Biol., 17, 4015 až 4023.

T. Zimrin A. B„, M. S. Pepper, G. A. McMahon, F. Nguyen,

R. Montesano a T. Maciag, 1996. An Antisense Oligonucleo.tide to the Notch Ligand Jagged Enchances Fibroblast Growth Factor-induceď Angiogenesis in vitro.

J. Biol. Chem., 271, prosinec 20, 3499 až 3502.

U. Albini A., R. Soldi, D. Giunciuglio, E. Giraudó, R. Benelli, R. Primo, D. Noonan., M. Salio, G. Camussi,

W. Rockl a F. Bussolino, 1996. The angiogenesis induced by HIV-1- Tat protein ia= mediatedvby the Flk-l/KDŘ receptor on vacular eňdothelial cells. Nátuře Medicine,

2, (12 prosinec), 1371 až 1374.

» · · · · ·

V. Ferrara, 1996, The biology of vascular endothelial growth factor, Molecular, Cellular and Clinical Aspects of Angiogenesis, ed. Μ. E. Maragoudakis, New York;

Plenům Press.

X. Jackson R. L., Ξ. J. Busch a A. J. Cardin, 1991, Glycosaminoglycans: Molecular Properties, Protein Interactions, and Role in Physiological Processes. Physiological Reviews, 71 (2), 481 až 435.

Y. Kinsella M. G., C. K. Tsoi, Η. T.’ Jarvelainen a,T. N. Wight, 1997, Selective expression and Processing of bíglycan during migration of bovine aortic endothelial cells - The. role of endogenous basic fibroblast growth factor. Journal fo Biological Chemistry, 272, 318 až 325.

Z. Folkman J., 1996, Tumor angiogenesis and tissue factor. Nátuře Medicine, 2, 167 až 168.

ZA. ' Relf M. 3.» LeJeune, P. A. Scott, S. Fox, K. Smith,

R. Leek, A. Moghaddam, R. Whitehouse, R. Bícknell a A. L. Harris, 1997» Expression of the angiogenic factors vascular endothelial cell growth factor, acidic and basic fibroblast growth factor, tumor growth factor beta-1, platelet-derived endothelial cell growth factor, breast cancer and its relation to angiogenesis. Cancer Res., 57,.963 až 969.

ZB. Carmeliet Ρ., L. Moons, M. Dewerchin, N. Mackman,

T. Luther, G. Breier, V. Ploplis, M. Mllller, A. Nagy,

E. Plow, R.Gerard, T. Edgington, W. Risau, D. Collen, 1997, Ann., N. Y. Acad. Sci., 811, 191 až 206.

I».

ZC. Van Hinsberg, P. Koolwijk, R. Haanemaijer, 1997,

Role of fibrin and plasminogen activators in repairassociated angiohenesis: in vitro studies with human endothelial cells, EXS 79, 391 až 411.

·· ···* • * · ··· «·«· * * * » ·»♦ · · · · v *·· ·· · · «|Ι II) ······♦ · » _ ₈₁ γ............

Passe T. J,, D. A. Blumke a S. Ξ. Siegelman, 1997,

Radiology 203, 593 až 500.

1. Nourshargh S. a Williams T. J., 1995, Semin. Ceel. Bol., 6, 317 až 326.

2. Simmons D. L., 1996, TIBTECH 14, 221· až 222.

3. Baumhueter S., Dybdal N., Kýle C. a Lásky L. A., 1994, Bllod 84, 2554 až 2565.

4'.. Rosenthall L. a Leclerc J.,1995, Clin, Nucl. Med., 20,

398 až 402.

5. Contrino J. Hair G., Kreutser D. L. a Rickles F. R.,

1996, Nátuře Med., 2, 209 až 215.

6. . Torchilin V. P., Narula J., Halpern E. a Khaw B. A.,

1996, Biochim. Biophys. Acta, 1279, 75 až 83.

7. Wittig Β. M,, Hach A., Hahn K., Meyer Β., KH, a Dippold

W. G., 1993, Eur. J, Cancer, 29A, 1327 až 1329.

8. Mariani G., Molea N., Bacciardi D., Boggi U., Fornaciari G., Campani D., Salvadoři P. A., Giulianotti P. C., Mosca

F. a Gold D. V., 1995, Cancer Res., 55, 5911 až 5915.

v

9. ‘ Scott A. M., Rosa E., Mehta Β. M., Divgi C. R., Finn

R. D., Biedler J. L., Tsuruo T., Kalaigian H., a Larson

S. M. , 1995, Nucl. Med. Biol., 22, 497 až 504.

10. Panchal' R. G. a další, 1996, Nat. Biotechnol., 14,

852 až 856.

BB ΒΒΒΒ

Β Β

ΒΒΒ

ΒΒ·Β ΒΒ

- 82 Β BB B • B 4

B · 4

11. Wagner Ε. a další, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev., 14,

113 až 115.

12. Ballou B., Fisher G. W., Waggoner A. S., Farkas D. L., Reiland J. Μ., Jaffe R., Mujumdar R. B., Mujumdar S.R. a Hakala T. R., 1995, Cancer Immunol, Immunother,, 41, 257 až 263.

13. Salmi M. a Jalkanen S., 1995, Eur. J. Immunol., 25, 2803 až 2812.

14. McEver R. P., 1992, Curr. Opin. Cell Biol., 4,’ 840-849

15. DeLisser Μ. Η., Newman P. J, a Albelda S. A., 1994, Immunol. Today, 15, 490 až 495.

16. Metcalf B. W. a další, eds., 1994, Cellular Adhesion. Molecular Definítion to Therapeutic Potential, Plenům Press, New York, 1994.

17. Felding-Habermann B. a Cheresh D. A., 1993, Curr. Opin Cell Biol., 5, 864 až 868.

18. Schwarsbauer J. E., 1991, Curr. Opin. Cell. Biol., 3, 786 až 791,

19. Burg M. A., Halfter W., Cole G. J., 1995, J. Neurosci. Res., 41, 49 až 64.

20. Dean C. J., Eccles S. A., Valeri Μ;., Box G., Allan 8., McFarlane C. , Sandle J. a Styles J., 1993, Cell, Biophys,, 22, 111 až 127.

21. LeSauter L. a další, 1996, Nat. Biotechnol., 14,

1120 až 1122.

«· ····

22. Wiseman G. A. a Kvols L, K., 1995, Semin. Nucl. Med., 25, 272 až 278.

23. van der Laken C. J., Boerman 0. C., Oyen W. J., van de Ven Μ. T., Claessens R. A., van der Meer J. W., a Corstens F. Η., 1995, Eur. J. Nucl. Med., 22, 1249-1255

24. Signore A., Chianelli Μ., Ferretti E., Tošcano A., Britton K. E., Andreani D., Gale E. A. a Pozzilli P., 1994, Eur. J. Endocrinol., 131.

25. Howard 0. M. Z. a další, 1996, TIBTECH, 14, 46 až 51.

26. Korpelainen Ε. I., Gamble J. R., Smith W. B., Bottore M., Vadas M. A. a Lopez A. F., 1995, Blood 86, 176-182.

27. Klagsbrun Μ., 1990, Curr. Opin. Cell Biol., 2, 857-863.

28. Ratner N.,D. Hong,M. A. Lieberman, R. P. Bunge a L. Glaser, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85,

6992 až 6996.

29. Schechter B., Arnon R., Colas C., Burákova T. a Wilchek Μ., 1995, KIDNEY INTERNATIONAL. 47, 1327-1335.

30. Valentin-Weigand P., TalayS., R. Kaufhold A., Timmis

K. N. a Chhatwal G. S., 1994, Microbial. Pathogenesiš., 17, 111 až 120.

31. Betageri G. V., Black C. D., Szebeni J,, Eahl L. M., a Weinstein J. N. , 1993, J. Pharm. Pharmacol., 45, až 53.

32. Blime G., Cevc G., Crommelin M. D., Bakker-Woudenberg I. A., Kluft C. a Storm G., 1993, Biochim. Biophys.

Acta 1149, 180 až 184.

« · *· « ·« • · * · · • «··· · · * · *·'· ·· » ·«* · · »

33. Stevens R. L. a K. F. Austen., 1989, Immunology Today, 10, 381 až 386.

34. Redini F., J. M. Tixier, M. Petitou, J. Chouay, L. Robert a W. Hornebeck., 1988, Biochem. J., 252,

515 až 519.

35. Persson B., 0. G. Bengtsson Ξ., Enerback T., Olivecrona a H. Jprnvall., 1989, Eur. J. Biochem., 179, 39-45.

36. Danielsson A., E. Raub, U. Lindahl a U. Bjork, 1986,

J. Biol. Chem.., 261, 15467 až 15473.

37.	Adachi T. 264, 8537	a S. L. Marklund, 1989 až 8541.	, J .. Biol. Chem. ,
38.	Maimone M.	M. a D. M. Tollefsen,	1990, J. Biol. Chem.,
	265, 18263	až 18271.
39.	Berman P.,	P. Gray, E. Chen., K.	Keyser a D. Eherlich,
	1987, Cell, 51, 135 až 142.
40.	Huber D,,	P. Gautschi-Sova a P .-	Bohlen, 1990,
	Neurochem.	Res., 15, 435 až 439.

41. P. Vřjayagopal, B. Radhnakrishnamurthy, G. S. Berenson, 1995, Biochim. Biophys..Acta, 1272,- 61 až 67.

42. Dyer C.. A., a L. K. Curtiss, 1991J. Biol. Chem.,

266 (34), 22803 až 22806.

43. Rauvala Η., J. Merenmies, R. Pihlaskari, M. Kormalainen, , ₍M, L. Huhtala a P. Panula, 1988, J. Cell. Biol., 107,

2293 až 2305.

- 85 4* 444 · ·· ·· 44 4« · *44 ···»

4 4>44· 4*4« * 444 4 * 44 444 4*4 · ♦ 4 * * * 4 _e

44*4 44 44 *4 44 44

44. WuDunn D. a P. G. Spear, 1989, J. Virol., 63, 52 až 58

45. Patti J. M. a M. Hbdk,· 1994, Curr. Opin. Cell Biol'.,

6, 752 až 758.

46. Snow A. D., M. G. Kinsella, E. Parks, R. T. Sekiguchi a další, 1995, Arch. Viochem. Biophys., 320, 84.- 95.

47. Fisher D., R. Chiquet-Ehrismann, C. Bernasconi, M. Chiquet.,.1995, J. Biol. Chem., 270, 3378 až 3384.

48. Wells J. A., 1996, Science, 273, 449 až 450.

49. Longo F. M. a Mobley W. C., 1996, Nat Biotechnol., 14, 1092.

50. Samanen J. M. a další, 1994, Metcalf B. W. a další, (eds.): Cellular Adhesion. Molecular Definition to Therapeutic.Potential, 259 až 290. Plenům Press,

New York, 1994.

51. Ellington A. D. a Conrad R., 1995, Biotechnology Annual Reviee, sv. 1, M. R. Elgewely, ed. (Elsevir

	Science Pub),	185 až 214.
52.	Asseline V. a	další, 1994, PNAS USA, 81, 3297 až 3301.
53.	Nielsen Ρ. E.	a další, 1991, Science 254, 1497 až 1500
54.	Shepherd R. K,	, a další, 1996, Circ·. Res., 78, 627 až

634.

55. Webb Τ. E. a další, 1996, Mol. Pharmacol., 50, 258 až 265.

·*·· »· · · · » · · · * 4 · 44«·· · · · ·

4 4 · «φ 4 4 ······

4 » · 4 4 · + • 444 44 44 4· ·4 ··

- 86 56. Farrell D. Η., a D. D. Cunningham, 1986, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 83, 6858 až 6862.'

57. Craig P. A., S. T. Olson a J. D. Shore, 1989, J. Biol. Chem., 264, 5452 až 5461.

58. Abelson J. N. ed., 1996, Meth. Enzymol., 267, Combinatotial Chemistry, Academie Press, San Diego, 1996.

59. Cortese R., ed., 1996, Combínatorial Libraries. Synthe sis, Screening and Application Potential., Walter de Gruyter, Berlín 1996.

60. Wu A. Μ. , 1996, Nat. Biotech., 14, 429 až 431.,

61. Wadhwa M. S., 1995, Bioconj. Chem., 6, 283 až 291.

62. Toole Β. P., 1990, Curr. Opin. Cell Biol., 2, 839 až 844.

63. Umezawa F. a Eto_xY., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 1038 až 1044.

64. Spellerberg Β., Prasad S., Cabellos C., Burroughs Μ. , Cahill P. a Tuomaneri E., 1995, J. Exp. Med., 182,

1037 až 1043.

65. Shi F. L., C. Bailey, A. W. Malick a K. L. Audus., 19983, Pharmaceutical Research, 10, 282 až 288.

66. Lee R. J. a P. S. Low., 1995, Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes, 1233, 134 až 144.

67. Said Η. Μ., D. Hollander a R. Mohammadkhani, 1993, Biochim. Biophys. Acta, 1148, 263 až 268.

4·44

4

- 87 68 • 4 4 • · • · 4 • 4 · • 44« 44 •4 44 • · 4 • · 444 • · 4 • 4 4

44

44 > · 4 • 4 4 · ·· 444 • 4

44

Passe T. J., D. A. Bluemke a S Radiology, 203, 592 až 600.

S. Siegelman, 1997,

Následující příklady slouží k ilustraci koncepce mnohonásobné specifičnosti pro různé receptory. Je samozřejmé, že by bylo možno navrhnout ještě další kombinace vektorů, vazných prvků a reportérů a také technologií, kterými by bylo možno připravit další vektory. Potvrzení mikročásticové povahy produktu je mošno, uskutečnit mikroskopicky podle mezinárodní patentové přihlášky WO 96/07434. Měření průchodu ultrazvuku je možno uskutečnit běžným způsobem pomocí převaděče se širokým pásmem tak, aby bylo mošno identifikovat produkty, schopné zvýšeným způsobem zeslabit zvuk ve srovnání se standardním prostředkem. K potvrzení vazby protilátek na produkty je možno použít průtokovou cytometrickou analýzu. Schopnost cílených prostředků specificky se vázat na buňky, u nichž dochází, k expresi cílové látky je mošno sledovat mikroskopicky a/nebo při použití průtokové komory, s obsahem· zmobilizovaných buněk, například při použití skupiny buněk,, u nichž dochází k expresi cílové struktury a další skupiny buněk, u nichž k této expresi nedochází. K...analýze vazby biotínu je možno použít streptavidin/avidin, značený radioaktivními látkami, fluorescenčními látkami nebo značený enzymatickým způsobem.

I • toto· ·« ·· * toto • · « ··

• · to v to to to toto • «i · toto toto

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ačhese mikrobublinek zapouzdřených ve fosfatidylserinu a potahovaných poly-L-lysinem k endoteliálním buňkám

Ve 400 μΐ vody se rozpustí 8 mg poly-L-lysinu s molekulární hmotností 115 000. Čerstvě připravených '40μ1 disperze mikrobublinek plněných perfluorbutanem a zapouzdřených fosfatidylserinem se inkubuje 15 minut při teplotě místnosti ve 400 μί vody nebo v roztoku poly-L-lysinu. Měřením zeta potenciálu se zjistilo, že mikrobublinky potahované poly-L-lysinem jsou nabity positivně, zatímco neobalené bublinky jsou nabity negativně. Provedla se zkouška buněčné adheze shora popsaných mikrobublinek k lidským endoteliálním buňkám rostoucích na kultivačních miskách, neobalené bublinky se použili jako kontrola. Mikroskopickým sledováním endoteliálních buněk po inkubaci se zjistil zvýšený počet mikrobublinek obalených poly-L-lysinem adherujících k endoteliálním buňkám*ve srovnání s počtem neobalených mikrobublinek.

Příklad 2

Mikrobublinky plynu obsahující fosfatidylserin a RGDC-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE • · 0·· · • « *

···· • « ·· • 0 0 0« 00 část a: Boc-NH-PEG₃₄₀₀-DSPE (t-butylkarbamát póly(etylenglykol)distearoylfosfatidyl-etanolaminu)

Do roztoku 150 mg Boc-NH-PEG₃₄₀₀-SC (t-butylkarbamát póly(etylenglykol)sukcinimidylkarbonátu) ve 2 ml chloroformu se přidá 31 mg DSPE (distearoyl-fosfatidyl'etanolaminu - Sygena lne.), a následně se přidá 33 μΐ trietylaminu. Reakční směs se 10 minut míchá při teplotě 41°C za vzniku čirého roztoku. Rozpouštědlo se odpařuje v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje 5 ml acetnitrilu. Vytvořená disperze se zchladí na teplotu 4°C a centrifuguje se. Rozdělí se roztok a nerozpustný materiál. Oddělený roztok se odpařuje dosucha. Složení vytvořeného produktu se ověří NMR.

část b: H₂N-PEG₃₄₀₀-DSPE (amino-poly(etylenglykol)distearoylfosfatidyl-etanolamin)

V 5 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpustí 167 mg Boc-NH-PEG₃₄₀₀-DSPE a reakční směs se 2,5 hodiny míchá při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří v rotačním odpařovači, a zbytek se zpracuje 1,5 ml chloroformu a dvakrát se promyje 1,5 ml vody. Organický podíl se odstraní odpařováním v rotačním odpařovači. Po chromatografii na tenké vrstvě při eluci směsí chloroformu, metanolu a vody v poměru 13:5:0,8 vznikne produktu s hodnotou Rf = 0/6. Složení produktu, ninhydrin positivního, se ověří NMR.

• 4 · »44 »44» • · · · a · · ♦ · * * • •« 4 4 4 · · *

44«· ·· «· ·· ·· ·« část c: Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE (3-maleímidopropionát póly(etylenglykol)distearoylfosfatidyl-etanolaminu)

Do roztoku 65 mg {0,12 mmol) H₂N“PEG_3ll00-DSPE v 1 ml tetrahydrofuranu a 2 ml O,1M roztoku pufru s fosfátem sodným o pH 7,5 se přidá roztok 5,6 mg (0,018 mmol) N-sukcinimidyl-3-maleimidopropionátu v 0,2-ml tetrahydrofuranu. Reakční směs se zahřívá na 30°C, produkt se čistí TLC, načež se rozpouštědlo odpaří.

část d: RGDC-Mal-PEG_34OO-DSPE

Do 0,010 mmol peptidu RGDC se přidá 0,010 mmol

Mal-PEG_340Q-DSPE v 0,lM roztoku pufru fosfátu sodného o pH 7,5. Reakční směs se eventuálně zahřívá na teplotu 37°, provede se TLC a odpařování rozpouštědla.

část e: příprava mikrobublinek plněných plynem a obalených fosfatidylserinem a RGDC-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE

Do 5 mg. směsi 90-99, 9mol% fosfatidylserinu a 10-0,lmol%

Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívámaximálně 5 / minut na teplotu 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,’8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se infranatant fc fcfcfc • · fcfc

vymění za O,1M roztok pufru s.fosfátem sodným o pH 7,5. Do promytých mikrobublinek, umístěných na výkyvnou třepačku, se přidá se roztok RGDC v O,1M roztoku pufru s fosfátem sodným o pH 7,5. Promývání se znovu opakuje.

část f: Alternativní příprava mikrobublinek'plněných ' plynem obalených fosfatidylserinem a RGDC-Mal~PEG₃₄₀₀-DSPE '

Do 5 mg fosfatidylserinu se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá maximálně 5 minut na teplotu 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu- l· ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfíuorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugací se infranatant vymění za O,1M roztok pufru s fosfátem sodným o pH 7,5. Do promytých mikrobublinek, umístěných na výkyvnou třepačku, se přidá se roztok RGDC v O,1M roztoku pufru s fosfátem sodným o pH 7,-5. Promývání se znovu opakuje s následným zapojením RGDC-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE do membrán mikrobublinek. .

Příklad 3Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, fosfatidylcholinem a • · • * · · • ·

biotin-amidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolem část a: Z-Ala-cholesterol (3-0-(karbobenzyloxy-L-alanyl)cholesterol)

Ve směsi 20 ml dimetylformamidu a 5 ml tetrahydrofuranu se rozpustí 4 mmol.cholesterolu, 5 mmol Z-alaninu a 4 mmol dimetylaminopyridinu. Po přidání dicyklohexylkarbodiimidu se reakční směs přes noc míchá při teplotě místnosti. Filtraci se odstraní dicyklohexylmočovina a rozpouštědlo se odpaří na rotačním odpařovači. Zbytek se zpracuje chloroformem, dicyklohexylmočovina se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odstraní na rotačním odpařovači. Vytvořený zbytek se umístí na kolonu silikagelu a Z-Ala-cholesterol se eluuje směsí toluenu a petroleteru v poměru 20:2, a následně směs toluenu a dietyleteru v poměru 20:2. Podíly obsahující výslednou sloučeninu se sloučí a rozpouštědlo se odstraní na rotačním odpařovači. Složení produktu se ověří NMR..

část b: Ala-cholesterol (3-0-(L-alanyl)-cholesterol)

Reakční směs 0,48 mmol Z-Ala-cholesterolu ve 20 ml tetrahydrofuranu a 3 ml ledové kyseliny octové se hydrogenuje 2 hodiny za přítomnosti 5¾ roztoku paladia na aktivním uhlí. Reakční směs se filtruje a zahustí ve vakuu.

část c: Boc-NH-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterol

Do roztoku Boc-NH-PEG₃₄₀₀-SC (t-butylkarbamát • « «φφ · • * φ φ φφ ·Φ φ · « · φ φ · · · * Φ · ··Μ ΦΦ·φ

- ·,·»;!· · · φφφφ · Φ· ·Φ φφ φφ póly(etylenglykol)sukcinimidylkarbonátu) v chloroformu se přidá Ala-cholesterol, a následně trietylamin. Suspenze se 10 minut míchá při teplotě 41°C. Surový produkt se čistí chromatografií.

část d: H₂N-PEG_3i|00-ÁÍa-cholešterol.......

Při teplotě místnosti se 2,5 hodiny míchá směs

Boc-NH-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolu ve 4M roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Rozpouštědlo se odstraní v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje chloroformem, promyje se vodou a organický podíl se odpaří v rotačním odpařovači dosucha. Surový produkt se.čistí chromatografií.

část e: biot inamidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterol i

Do roztoku H₂N-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolu v tetrahydrofuranu a 2 ml 0,1 M roztoku pufru fosforečnanu sodného o pH 7,5 se přidá roztok

N-hydroxysukcinimidesteru biotin- amidokaproátu v tetrahydrofuranu. Reakční směs se zahřívá na 30°C. Ukončení reakce se ověří chromatogra- fií na tenké vrstvě a rozpouštědlo se odstraní odpařo- váním.

část f: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené f osfatidylserinem·, fosfatidylcholinem a biotin-amidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolem

Do 5 mg směsi fosfatidylserinu a fosfatidylcholinu (celkem 90-99,9mol%) a 10-0,lmol% biotinamidokaproát«· toto ·· tt to « a to « « « to · · · · to to· to to * · · « to toto toto ·· toto • to · · · to to· to to · * to » to ♦ ••toto *·

-- 94 -PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolu se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá maximálně 5 minut na teplotu 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se '

umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se infranatant slije a přidá se voda a promýván! se opakuj e.

část g: Alternativní příprava mikrobublinek plněných plynem a zapouzdřených fosfatidylserinem, fosfatidylcholinem a biotinamidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolem

Do 5 mg směsi fosfatidylserinu a fosfatidylcholinu se přidá 1 ml 5¾ roztoku propylenglykol-glycerolu ve, vodě Disperze se zahřívá maximálně 5 minut na teplotu 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se infranatant vymění za vodu. Do promytých mikrobublinek, umístěných na výkyvnou třepačku, si přidá se roztok biotinamidokaproát-PEG_3l|₀₀-Ala-cholesterolu ve vodě. Promýván! se znovu opakuje s následným zapojením biotinamidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolu do * ·

membrán mikrobublinek.

Příklad 4

.....’ ' r —

Mikrobublinky 'plněné plynem, tvořené fosfatidylserinem, fosfatidylcholinem, biotin-amidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolem a vázaným cholesterolem s účinnou látkou část a: vázaný cholesterol s účinnou látkou

Ve směsi 20 ml dimetylformamidu a 5 ml tetrahydrofuranu se rozpustí 4 mmol cholesterolu, účinná látka obsahující kyselou skupinu a 4 mmol dimetylaminopyridinu a do reakční směsí se přidá dicyklohexylkarbodiimid. Reakční směs se přes noc míchá při teplotě místnosti, dicyklohexylmočovina se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odstraní odpařováním na rotačním odpařovači. Výsledný produkt se čistí chromatografií.

' i číst b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, fosfátidylcholinem, biotin-amidokaproát-PEG₃₄₀₀-Ala-cholesterolem a vázaným cholesterolem s účinnou látkou

Do 5,mg směsí fosfatidylserinu a fosfatidylcholinu (celkem 90-99,9mol%), biotinamidokaproát-PEG₃₄₀₀‘-Ala-cholesterolu (příklad 3) a 10-0,lmol% vázaného., cholesterolu s účinnou látkou se přidá 1 ml 5% roztoku • · · · * · · »

- 96 ····<»♦ · 1

4*·· ·* ·· «· ·· propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se -naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se ínfranatant slije, přidá se voda a promývání se opakuje.

Příklad 5

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a thiolovaným anti-CD34-Mal-Peg₃₄₀₀-DSPE část a: thiolované protilátky anti-CD34

Thiolace protilátek anti-CD34 se provede podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144.

část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a thiolovaným anti-CD34-Mal-Peg₃₄₀₀-DSPE

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu a 10-0,1 mol% Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE (příklad 2) se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se

I fc· • » • ♦·· • fc · · zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfÍuorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na- výkyvnou třepačku. Po centrifugaci.se infranatant vymění za odpovídající pufr. Vazby thioíované protilátky na mikrobublinky se provede podle postupu A.Goundalkara, T. Ghose a M. Mezei publikovaného v J.Pharm.Pharmacol. (1984), 36, 456-66 nebo podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim.Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144.

Mikrobublinky se na několik hodin umístí na výkyvnou třepačku a promyjí se. Průtokovou cytometrickou analýzou vytvořených mikrobublinek (za použití sekundárních protilátek označených fluorescenční látkou) se potvrdí upevnění protilátek anti-CD34 na mikrobublinky.

Shopnost specifické vazby mikrobublinek na buňky s CD-34 antigenem se sledovala mikroskopicky za použití populace buněk s expresí antigenu CD34 a buněk, které bez exprese tohoto antigenu.

Příklad 6

Biotin vázaný na mikrobublinky naplněné plynem

Vazbu biotinu na mikrobublinky lze provést několika postupy, např. podle P.Corley a H.C. Loughrey publikovaného v Biochim.Biophysis.Acta (1994) 1195, ·* fcfcfcfc fc· fcfc fcfc »» • * fcfcfc fcfcfcfc • · fc fcfcfcfc · fc* ·

149-156.

Vytvořené mikrobublinky lze sledovat průtokovou cytometrií za použití streptavidinu značeného fluorescenční látkou, která ukáže vazbu biotinu na mikrobublinky.

Jako alternativní detekci pevného spojení biotinu a mikrobublinek lze použít streptavidin/avidinu značeného radioaktivní látkou nebo enzymem.

Příklad 7

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené distearoylfosfatidylserinem a biotin-DPPE

Do 22,6 mg distearoylfosfatidylserinu (DSPS) se přidá 4 ml 4% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Přidá se vodní disperze 1,5 mg biotin-DPPE v 1 ml 4% roztoku propylenglykol-glycerolu. Vzorek se na 1-2 hodiny umístí na výkyvnou třepačku.

• Suspenze se plní do' zkumavek a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřené zkumavky se 45 sekund protřepávají, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po 7 minutách centrifugace se ínfranatant'vymění za vodu a promývání se dvakrát zopakuje.' Detektorem s rozptýleným světlem normální fáze HPLC se potvrdí, že membrány mikrobublinek obsahují 4mol% bíotín-DPPE. Počítačem Coulter Counter určený střední průměr částic je 4 μπι. Měřením průchodu ultrazvuku za použití širokopásmového

BB BBB·

ΒΒ Β* ·* • Β · « ΒΒΒΒ • · Β ΒΒΒ · Β Β

transduktoru při 3,5MHz došlo v disperzi částic menší než 2 mg/ml k zeslabení zvukových ozev o více než 5 dB/cm.

Příklad 8

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené .ri fosfatidylserinem a biotinylovanou protilátkou nekovaletně vázanou na streptavidin-Sukc-PEG-DSPE část a: Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Karboxylace NH₂-PEG₃₄₀₀-DSPE (příklad 2) za použití anhydridu kyseliny jantarové se provede podle postupu R.Nayara a A.J.Shroita uvedeného v Biochemistry (1985), 24, 5967-71.

Část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené ' fosfatidylserinem a Sukc-PEG_34OO-DSPE

Do 5 mg směsí 90-99,9mol% fosfatidylserinu a 10-0,1 mol% Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycérolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut ri na teplotu nejvýše 80°C-, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku..Po cehtrifugaci se infranatant vymění za vodu

É*t·

- 100 0· 0« ·· 00 * · · 0 0 0 0 • 0 0 00 0 0« 0 ••»0000 · 0 ···· ·· 00 00 ·♦ «0 a promýván! se opakuje. Alternativní způsob přípravy míkrobublinek je uveden v části f) příkladu 2.

část c: vazebná reakce streptavídínu na mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a. Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Kovalentní vazba streptavídínu na Sukc-PEG_3<í00-DSPE v membráně míkrobublinek se docílí standartními postupy * za použití ve vodě rozpustného karbodiímidu. Během reakce je vzorek umístěn na výkyvné třepačce. Po centrifugaci se infranatant vymění za vodu a promývání se opakuje. Funkční skupina vázaného streptavidinú se analyzuje vazbou na fluorescenční - látkou značený biotin, biotinylované protilátky (detekované fluorescenční látkou označenou sekundární protilátkou) nebo fluorescenční nebo radioaktivní látkou značený biotinylovanými oligonukleotidy. Analýza se provede fluorescenční mikroskopií nebo scintilačním počítačem.

* část d: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylšérinem a biotinylovanou protilátkou nekovaletně vázanou na streptavidin-Sukc-PEG_34OO-DSPE *

Mikrobublinky připravené podle postupu části c příkladu 8 se inkubují v roztoku obsahujícím biotinylované vektory - biotinylované protilátky. Vektorem potahové mikrobublinky se promyjí podle shora uvedeného postupu.

ftft ··♦· ·· ftft ft· ftft • · · · · · · · ftft* * · « «

- 101 • ftft ftftftft ftft • · · · « · • ft ft· ·· ftft

Příklad 9

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotinylovaným oligonukleotidem nekovaletně vázaným na streptavidin-Sukc-PEG-DSPE část a: Sukc-PEG_34OO-DSPE

Karboxylace NH₂-PEG_340Q-DSPE (příklad 2) za použití anhydridu kyseliny sukcinové se provede podle postupu R.Nayara a A.J.Shroita uvedeného v Biochemistry (1985), 24, 5967-71.

část b: mikrobublinky plněné plynem a 'zapouzdřené fosfatidylserinem a Sukc-PEG_34OO-DS'PE

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu a 10-0,lmol%

Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml ¥ vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se infranatant vymění za vodu a promýván! se opakuje. Alternativní způsob přípravy mikrobublinek je uveden v části f) příkladu 2.

část c: vazebná reakce streptavidinu na mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a Sukc-PEG_34OO-DSPE • 4 ··'

- 102 ·· 44*4 ·· * · · · 4 • · 4

4 · « ·· 44

Kovalentní vazba streptavidinu na Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE v membráně mikrobublinek se docílí standartními postupy za použití ve vodě rozpustného karbodiimidů. Během reakce je vzorek umístěn na výkyvné třepačce. Po centrifugaci se inf-ranatant vymění za .vodu a .promýván! se opakuje. Funkční skupina vázaného streptavidinu se analyzuje vazbou na fluorescenční látkou značený biotin, biotinylované protilátky (detekované fluorescenční látkou označenou sekundární protilátkou) nebo fluorescenční nebo radioaktivní látkou značený biotinylovanými oligonukleotidy. Analýza se provede fluorescenční mikroskopií nebo scintilačním počítačem.

část d: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené ' fosfatidylserinem a biotinylovanou protilátkou nekovaletně vázanou na streptavídin-Sukc-PEG₃,---DS?E i t

Mikrobublinky připravené podle postupu části c,příkladu 9 se inkubují v roztoku obsahujícím biotinylovaný oligonukleotid, Oligonukleotidem potahové mikrobublinky se promyjí podle shora uvedeného postupu. Vazba oligonukleotidu na mikrobublinky se detekuje za použití 'fluorescenční látkou značených oligonukleotidů pro vazbu na mikrobublinky nebo hybridizací vázaného oligonukleotidu na značený (fluorescenční nebo radioaktivní látkou) komplementární oligonukleotid..Funkční skupina oligonukleotidu vázaného na mikrobublinky se analyzuje hybridizací mikrobublinek znehybněnoú' DNA, která obsa• ·*· • ·

- 103 «, ·' · · · 4 • · · · · · »·· ♦ ·» ·· · · « « *· ·· huje komplementární sekvence k vázanému oligonukleotidu. K tomu účelu je například vhodné použití oligonukleotidu komplementárního k ribosomální DNA (existuje v řadě kopií haploidního genomu) a oligonukleotidu -komplementárního k-onkog.enu . (ras-onkogen, který existuje v jediné kopii haploidního genomu).

Příklad 10

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a folát-PEG-Sukc-DSPE

Část a: folát-PEG-Sukc-DSPE

Syntéza folát-PEG-Sukc-DSPE se provede podle postupu R.J..Leea a P.S.Lowa publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1233, 134-144.

část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a folát-PEG-Sukc-DSPE

Ďo 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfátidylserinu a 10-0,lmol% folát-PEG-DSPE se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na • ft ftftftft ft* · ftftft ftftft· • · ftft ftftft · ft * ft ft ftft.'····· ftftft ftftft • «•••ftft · · ••ftft ft* ftft ftft ·· «

- 104 výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se ínfranatant vymění za vodu a promývání se opakuje. Alternativní způsob přípravy mikrobublinek je popsán v částech e) a f) příkladu 2. Analýzu vazby folátu lze například provést mikroskopicklým sledováním vazby.mikrobublinek obsahujících folát k buňkám s rozlišnou expresí folátových receptorů.

Příklad 11

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené,.

fosfatidylserinem, thiolovaným anti-CD34-Mal-PEG_34OO-DSPE, thiolovaným anti-ICAm-l-Mal-Mal-PEG₃₁₀₀-DSPE a thiolovaným anti-E-Selectin-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE část a: thiolované protilátky anti-CD34

Thiolace protilátek anti-CD34 se provede podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144.

část b: thiolované protilátky anti-ICAM-1

Thiolace protilátek anti-ICAM-1 se provede podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144, ·· ··*·

105 • * • · ·· • · · * » · « *· ··

část c: thiolované protilátky anti-E-selektin

Thiolace protilátek anti-E-selektín se provede podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144.

část d: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, thiolovaným anťi-CD34-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE, thiolovaným anti-ICAM-l-Mal-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE a thiolovaným anti-E-Selectin-Mal-PEG_34ŮO-DSPE

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu a 10-0,lmol%. Mal-PEG_34ŮŮ-DSPE (přiklad 2) se přidá 1 ml 5%. roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na „ teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po· centrifugaci se infranatant vymění za odpovídájící. pufr. Vazby thiolovaných protilátek, jejichž příprava je popsána v příkladech 11a), 11b) a 11c)·, na mikrobublinky se provede podle postupu A.Goundalkara, T. Ghose a M„ Mezei publikovaného v J.'Pharm. Pharmacol. (1984), 36, 456-66 nebo podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144.

Mikrobublinky se na několik hodin umístí na výkyvnou třepačku a promyji se.

• · • · • fc ««fcfc ý

f, r

106 • * · · · fc • · * fcfc·· * ····· • · · · · fc · fcfcfcfc fcfc fcfc

Příklad 12

Peptid FNFRLKAGQKIRFGAAAWEPPRARI vázaný na mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem

- - · - - - · · ♦

Připraví se peptid FNFRLKAGQKIRFGAAAWEPPRARI, který obsahuje vazebná místa fosfatidylserinu a heparinu. Peptid se přidá do předem připravených perfluorbutanových mikrobublinek zapouzdřených fosfatidylserinem a směs se důkladně promíchá.

Příklad 13

Fibronektin kovalentně vázaný na mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a fosfatidyletanolaminem.

část a: příprava mikrobublinek

Do čistých zkumavek se přidá 25 mg DSPS a 5,0 mg DSPE a přidá, se 5 ml' roztoku 1>4% propylenglykolu a 2,4% , glycerolu. Reakční směs se 5 minut zahřívá na teplotu 80°C, a pak se vzorek zchladí na teplotu místnosti.

. Prostor nad kapalinou se naplní perfluorbutanovým plynem. Zkumavky se promíchávají v ponorném míchadle 45 vteřin a mikrobublinky se dvakrát promyjí’destilovanou vodou opět se uvedou do suspenze v O,1M roztoku boritanu sodného o pH 9.

- 107 to· toto·· to· · • to • · • to to··· toto ·· toto ·· • toto tototo· • toto·· to ·· · • · · to · · ··« «·· • · · · · · *· ·· to· φ* část b: modifikace fíbronektinu.

Směs 1,0 mg fibronektinu v 5 ml 0,01M roztoku Hepes pufru o pH 8 se přidá do 0,1 mmol sesíťujícího řetězce SDBP. Reakční směs se 2 hodiny inkubuje na ledu.

část c: modifikace mikrobublinek

Do suspenze připravené v části a/ se přidá roztok proteinu vytvořený po.dle postupu části b/.V inkubaci se pokračuje 2 hodiny při teplotě místnosti na výkyvné třepačce. Mikrobublinky se nechají, vznášet, a pak se pufr zamění za O,1M roztok pufru obsahujícího boritan sodný o pH 9, čímž se materiál, který nepodlehl reakci, odstraní. Tento postup se třikrát opakuje, část d: Analýza in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázáných na buňky. „

Příklad 14

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a

3β-[Ν-(Ν', N'-dimetylaminoetan)karbamoyl]cholesterolem část a: 3β-[Ν-(Ν',N'-dimetylaminoetan)karbamoyl]cholesterol - (DC-chol) ·· ··»* ·· ·· 44 ·· • 4 · 4 · · · 4 · · * 4 4 444 44«· · 4 ·4 «4 4·· ··· • •44··· · ·

4··4 ·· 4· 44 «· ··

- 108 (H.Farhood, X.GAo, J.Barsoum a L.Huang (1995), Anal.Biochem. 225, 89-93)

Do míchaného roztoku 19,40 mg (0,22 mmol, 24:1) 2-dimetylaminoetylaminu a 310 μΐ (2,23 mmol) trietylaminu ve 3 ml dichlórmetanu se při teplotě místnosti - pomalu přidá roztok 100 mg (0,22 mmol) cholesterylchlormravenčanu v 1,4-dioxanu. Po ukončení reakce se směs odpařuje dosucha a vytvořený zbytek se čistí rychlou chromatografií při elucí směsí chloroformu a metanolu v poměru 4:1. Vznikne 105 mg bílé pevné látky s výtěžkem 95%. Struktura produktu se ověří NMR a MALDI.

část b: disperze mikrobublinek

Ze směsi 90% fosfatidylserinu a 10% DC-chol, která vznikne smícháním 4,5 mg DSPS a 0,5 mg DC-chol do zkumavky o objemu 2 ml, se vytvoří vrstva skládající se z jedné řady zapouzdřených mikrobublinek, obsahujících perfluorbutan. Přidá se 0,8 ml 4% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Roztok se zahřívá 5 minut na teplotu 80°C a protřepává se. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle při frekvenci 4450 kmitů za minutu, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách centrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu se infranatant odstraní stříkačkou a objem se doplní destilovanou vodou. Prostor na směsí se znovu naplní perfluorbutanem a vzorek se umístí na výkyvnou třepačku do vzniku

- 109 «« »»«· »a »· «« • ¹ · · « ··«· • · t · ··· « · « · • ««···»» 611 _M| • · · · · » ♦ a « · ······ · · ·· a a · homogenního vzhledu. Promývací procedura se znovu opakuje.

Příklad 15...... , . .

Mikřobubliňky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a WEPPRARI-PE

Fosfatidyletanolamin (PE) se uvede do reakce s ekvimolárním množstvím sesíťujícího řetězce N-hydřoxysukcin-imidyl-2,3-dibrompropionátu ve směsi dioxanu a 0,02M Hepes pufru o pH 8,0 v poměru 1:1. Po 2 hodinách inkubace na ledě se do reakční směsi se přidá ekvímolární množství heparinu vážícího peptid WEPPRARI. Přidáním 0,2M roztoku hydrogen tetraborítanu sodného se upraví ph na pH 9 a v inkubaci se pokračuje 2 hodiny při teplotě místnosti. Produkt se čistí chromatografií. Jednovrstevně zapouzdřené mikřobubliňky obsahující perfluorbutan se připraví ze směsi 80-95% fosfatidylserinu (PS) a 5-20% peptidem substituovaného PE.

Příklad 15

Mikřobubliňky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a inaktivovaným lidským trombin-Sukc-PEG₃,,₀₀-DSPE část a: inaktivace lidského trombinu ···· «· * “ «

110 ·*··

Lidský trombin se inaktivuje inkubací 30 minut při teplotě 37 °C s 20% molárním přebytkem D-Phe-L-Pro-L-Arg-chlormetylketonu v 0,05M roztoku

Hepes pufru o pH 8,0.

část br mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosf atidylserinem a Sukc-PEG_34OO-DSPE

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu a 10-0,lmol% Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE (část a/ příkladu'9) se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se infranatant vymění za vodu a promýván! se opakuje. Alternativní způsob přípravy mikrobublinek je uveden v Části f) příkladu 2.

část c: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a inaktivním lidským trombin-Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE

Kovalentní vazba inaktivniho lidského trombinu na Sukc-PEG_34OQ-DSPE v membráně mikrobublinek (připravených podle postupu části b příkladu· 16) se docílí standartními postupy za použití ve vodě rozpustného karbodiimidu. Do dobu reakce se vzorek umístí na výkyvnou třepač·· ···· ·* ·· » · ♦

I · ·

- 111 » · · fl • · ·· ku. Po centrifugací se infranatant vymění za vodu a promývání se opakuje.

Příklad 17

Mikrobublinky plněné plynem s připojením metotrexátu a enzymu aktivujícího prekurzor účinné látky část a: metotrexát vázaný na mikrobublinky plněné plynem pomocí peptidového vazného řetězce

Postupy,' které vedou k vazbě aminokyselin na látku účinnou proti rakovině - metotrexát (MTX), jsou dostatečně popsány v literatuře (např. F.M. Huennekens (1994) Tibtech 12, 234-239 a odkazy na literaturu zde uvedené). Namísto jedné aminokyseliny lze obdobnou technologií na MTX navázat celý peptid, který obsahuje vazný řetězec pro MTX a pro povrch mikrobublinek.

Jednu skupinu vazných řetězců tvoří peptidy obecné struktury (MTX)-F-K/R-X-R-Z-C, kde X je aminokyselina a Z je hydrofobická aminokyselina. Specifickým příkladem takového činidla je (MTX)-F-K-L-R-L-C. Skupinou SH- ve zbytku cysteinu se zapojí MTX-peptid do mikrobublinek (tvořených z fosfatidylserinu a Mal-PEG-DSPE) standartními postupy podle příkladu 2. Vazebné činidlo tohoto druhu lze štěpit enzymaticky katepsinem B, který je selektivně v nadměrném množství přítomen vně a na povrchu tumorových buněk (R.G. Panchal a spol. (1996), • 0

- -112 ·* 0000

0 · 00·· *0

0

0 00

Nat. Bitechnol. 14, 852-856). 2 toho vyplývá, že prekurzor účinné látky (MTX)-F-K/R-X-R bude selektivně uvolňován právě v tumorech. Z tohoto prekurzoru účinné látky lze také uvolnit účinnou látku MTX působením karboxypeptidáz, které jsou endogenně přítomné v tumorech nebo cílené na tumor prostřednictvím protilátek spojených s tumorem (viz níže).

část b: Kovalentně vázaný enzym aktivující prekurzor * účinné látky na mikrobublinky plněné plynem.

Příkladem enzymu aktivujícího prekurzor účinné látky je karbopeptidáza A (CPA), která je konjugována s.povrchem mikřobublinek zapouzdřených např. směsí fosfatidylserinu a fosfatidyletanolaminu pomocí póly(etylenglykol) řetězce (molekulární'hmotnost 3400), který nese N-hydroxysukcinimidovou skupinu na obou koncích (M.J.Perron a M.Page, Br.J.Cancer 73, 281-287), přičemž mikrobublinky jsou připraveny standartnimi postupy. Mikrobublinky obsahující CPA lze cílit do patologických oblastí začleněním vhodného cíleného vektoru v mikrobublinkách obsahujících CPA. Jinou možností je přímé napojení CPA ha vektor (na protilátku), například postupem shora uvedeným. V tomto druhém případě bude konjugát CPA-vektor napojen na povrch mikřobublinek postupem popsaným C.B.Hansenem (1995) v Biochim.Biophys.Acta 1239, 133-144. Příklady mnoha vhodných párů prekurzoru účinné látky a'enzymu popsal F.M. Huennekens (1994) v Tibtech 12, 234-239.

*· · · to • to ··

- 113 • · • · • · to ♦ ••to ·« • · toto • · • « · · • » • to · » • to ··

Příklad 18 :

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, thiolovaným anti-CEA-Mal-Peg₃₄₀₀-DSPE a prekurzorem účinné látky proti rakovině '35'-0-dipalmitoyl-5-fluor-2'-deoxyúridinem část a: příprava thiolované protilátky anti-CEA

Thiolaci protilátek anti-CEA lze provést podle postupu C.B.Hansena a spol. (1995) v Biochim.Biophys.Acta 1239, 133-144.

část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, thiolovaným anti-CEA-Mal-Peg₃₄₀₀-DSPE a prekurzorem účinné látky proti rakovině 3',5'-O-dipalmitoyl-5-fluor-2'-deoxyúridinem.

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu, 10-0,lmol% Mal-PEG_3íl00-DSPE (příklad 2) a prekurzor účinné látky proti rakovině 3',5'-O-dipamitoyl-5-fluor-2'-deoxy-uridinu (A.Moři. a spol. (1995) Cancer Chemother. PharZ' h macci. 35, 447-456) se přidá 1 ml 5% roztoku prcpylenglykol-giycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o' objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou

- 114 « «···· · · 4

444 44 4» · · 4 444

4β#··«* a · • 44 4 ·· aa 44 ·« 4* třepačku. Po centrifugaci se ínfranatant vymění za odpovídající pufr. Vazba thiolované protilátky na mikrobublinky se provede podle postupu A.Goundalkara,

T. Ghose a M. Mezei publikovaného v J.Pharm.Pharmacol. (1984), 36, 456-466 nebo podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144. Mikrobublinky se na několik hodin umístí na výkyvnou třepačku a promyjí se.

Příklad 19

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, thiolovaným anti-CEA-Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE a prekurzorem účinné látky proti rakovině N-trifluoracetyl-adriamycin-14-valerátem část a: příprava thiolované protilátky anti-CEA

Thiolaci protilátek anti-CEA lze provést podle postupu C.B.Hansena a spol. (1995) v Biochim.Biophys.Acta 1239, 133-144.

část b: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem, thiolovaným anti-CEA-Mal-Peg₃₄₀₀-ĎSPE .a prekurzor účinné látky proti rakovině N-trifluoracetyl-adriamycin-14-valerátem

Do 5 mg směsi 90-99,9mol% fosfatidylserinu, 10-0,lmol% • · φφφφ • Φ φ* φ φ

- 115 «λ φ φ * * · φφφ • φ φ φφφφ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φφφφφφ φφ φφ

Mal-PEG₃₄₀₀-DSPE (přiklad 2) a prekurzoru účinné látky proti rakovině N-trifluoracetyl-adriamycin-14-valerátu {A.Moři a spol. (1993) Pharm.Res. 10, 507-514) se přidá 1 ml 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu .nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Do zkumavky o objemu 1 ml se přemístí 0,8 ml vytvořené disperze a prostor nad disperzí se naplní perfiuorbutanem, Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po centrifugaci se ínfranatant vymění za odpovídající pufr. Vazba protilátky na mikrobublinky se provede podle postupu A.Goundalkara,

T. Ghose a M. Mezei publikovaného v J.Pharm.Pharmacol. (1984), 36, 456-466 nebo podle postupu C.B.Hansena a spol. publikovaného v Biochim. Biophys. Acta (1995), 1239, 133-144. Mikrobublinky se na několik hodin umístí na výkyvnou třepačku,· a pak se promyjí.

Příklad 20

Způsob použití

Činidlo tvořené mikrobublinkami zapouzdřenými fosfatidylserinem s navázaným inaktivovaným lidským trombin-Sukc-PEG₃₄₀₀-DSPE do membrány mikrobublinek se lyofilizuje z 0,01M roztoku o pH 7,4. Produkt se znovu uvede do disperze ve sterilní vodě a intravenózně se podá pacientovi se suspektní žilní trombózou dolní končeti• fc

- 116 • · * · ·♦ fc· 99 99 ny. Dolní končetina se vyšetřuje standartními ultrazvukovými postupy. Trombus se oproti okolní tkání jeví jako kontrastní ložisko.

Příklad 21

Příprava a biologické vyhodnocení mikrobublinek plněných plynem zapouzdřených DSPS dopovaným lipopeptidem tvořeným peptidem vázajícím heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI)

Tento příklad je zaměřen na přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohotné peptidové vektory seskupené do lineárního řetězce.

část a: lipopeptíd skládající se z peptidů vázajícího heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidem (WOPPRARI)

Lipopeptíd se připraví na automatickém syntezátoru peptidů 433A za použití pryskyřice Fmoc-Ile-Wang v množství řádu 0.1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC se • · · · · · • ·

- 117 » · < • 9 99

NH z

- 118 • · φ φ ·· φφ φ· φ • Φ φ * φ φ φφφ • · φφφφφ Φφφ * φφφ · φ φφ Φφφφ • ΦΦ φφφφ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φ čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 16 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekcí v UV 260 a fluorescencí Ex₂₈₀, Em₃₅₀ - doba retence produkti = 19,44 minut).

Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno M+H 2198, nalezeno 2199.

část b: příprava mikrobublinek plněných plynem zapouzdřených DSPS dopovaným mnohoúčelovým lipopeptidem skládajícího se z peptidů vázajícího heparin-sulfát (KRKR) a fibronektin-peptid (WOPPRARI)

Do každé ze dvou zkumavek se přidá 4,5 mg DSPS a 0,5 mg lipopeptidu vyrobeného v částí a) a do každé zkumavky se dále přidá 0,8 ml roztoku 1,,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanem. Zkumavky se 45 vteřin protřepávají v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se počítačem Coulter Counter [velikost l-3mikrony (87%),

0·

0 0 ·

0 0 «

0 00 • *0 0 0 0 *·0 00 00 ·β • · ♦ 0 ·*

- 119

3-5mikronů (11,5%)] a zeslabením zvukových ozev (frekvence při maximálním zeslabení; 3,5MHz). Mikrobublinky jsou stálé při tlaku-15,960 kPa (120 mmHg). Analýzou hmotového spektra MALDI se potvrdí včlenění lipopeptidu do DSPS míkrobublinek následovně; přibližně 0,05-0,1 ml suspenze mikrobubli- nek se přemístí do čisté zkumavky a přidá se 0,05-0,1 ml metanolu. Suspenze se 30- vteřin zpracovává působením ultrazvuku a roztok se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI - M+H 2200' (pro lipopeptid vypočteno 2198) .

část c: zkouška in vitro míkrobublinek plněných plynem zapouzdřených DSPS dopovaným mnohoúčelovým lipopeptidem skládajícím se z peptidu vázajícího heparin-sulfát (KRKR) a fibronektin-peptid (WOPPRARI): vazba míkrobublinek k endoteliálním buňkám během průtoku

V 260 ml kultivační misce Nunc (chutney 153732) se na živném prostředí RPMI 1640, do kterého se přidá 200 mM L-glutaminu, směs 10000 U/ml penicilinu a 10000 pg/ml streptomycinu a 10% fetálního hovězího séra, se kultivuje lidská'endoteliální buněčná linie ECV 304 odvozená z normální pupeční šňůry (ATCC CRL-1998). Buňky se předem kultivují (split ratio 1:5 do 1:7) k vytvoření . souvislé vrstvy. Krycí sklo o průměru 22 mm se po sterilizaci umístí na dno kultivačních misek s 12 prohlubněmi a na ně se přidá 0,5 ml kompletního kultivačního media

120 • · ·· · Β ·· Β · · · ·· * · · * Β * · · Β • Β Β Β Β · · » · Β • · · I Β * « _ν »·«·· » * * · · Β Β «

Β·ΒΒ ΒΒ «Β ΒΒ *· Β· se sérem. Když dojde k vytvoření souvislé vrstvy buněk přemístí se krycí sklíčka do k tomu účelu zhotovené průtokové nádoby, kterou tvoří žlábek ve skleněné desce, nad kterým je umístěno krycí sklíčko s buňkami otočeným směrem do žlábku, takže vytvoří průtokový kanál. Mikrobublinky (připravené podle postupu části b) umístěné při teplotě 37°C v zásobní nádobě se za použití peristaltického čerpadla nechají procházet ze zásobní nádoby do průtokové nádoby a zpět do zásobní nádoby. Rychlost průtoku simuluje fysiologické střihové namáhání. Průtoková komora se umístí pod mikroskop, kterým se přímo sleduje interakce mezi mikrobublinkami a buňkami. Do mikroskopu zavedená kamera je spojená s barevným monitorem a tiskárnou. Míra postupného hromadění míkrobublinek na buňkách byla závislá na rychlosti průtoku. Při zvýšení průtoku docházelo k oddělování buněk z krycího sklíčka, ale mikrobublinky zůstaly vázané na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a unikaly z průtokové komory již pří velmi malém průtoku.

část d: Zkouška, in vivo - pokus na psovi

Případ 1

Kříženec psa o hmotností 22 kg se uvedl do anestezie pentobarbitalem a mechanicky se ventiloval. Hrudník byl otevřen střední sternotomií, odstranilo se přední perikardium a mezi srdce a převaděč P5-3 snímače ultrazvuku ATL HDI-3000 se umístí vložka ze silikonové pryže.

121 ·· · ·· · · ftft ftft ftft •ft ft ··« ftftftft • · ftftft*· · · » · • ··· ftft » · ··««·* «••ftftftft · ft ftftftft ftft ftft ftft ftft ftft

Snímač ultrazvuku se nastaví na intermitentní snímání krátké osy se zobrazením jednou na konci každé systoly při zpožděném spouštění EKG. Jako rychlá intravenózní dávka se aplikuje přesně 2 ml mikrobublinek popsaných v části b) a o. tři vteřiny později zobrazovaná pravá komora obsahovala kontrastní materiál. 0 další tři vteřiny později byla také levá komora naplněna a zadní části levé komory se objevilo přechodný .stín zeslabení, který činil tyto části levé komory nezřetelné. V myokardu došlo k značnému zjasnění a stín zeslabení ubývá v dolní části srdce směrem k levé komoře. Po průchodu počáteční dávky se ultrazvukový skenr nastaví na kontinuální zobrazování při vysokém výkonu. Tento postup vede ke zničení kontrastních ultrazvukových činidel amikrobublinek v zobrazované tkáni. Po několika vteřinách se skenr nastaví zpět do počátečního nastavení. Myokard byl pak tmavší a téměř na úrovni bazálních hodnot. Posunutím zobrazení do nové polohy dojde k znovuobjevení kontrastu, přesunutím zpět do počáteční polohy dojde opět ke snížení jasnosti na bazální hodnoty.

Případ 2 (porovnávací)

Stejným způsobem jako v předchozím případu se aplikují přesně 2 ml mikrobublinek připravených podle postupu části b), přičemž přípravek neobsahoval žádný lipopeptíd. Zjasnění myokardiálního UV obrazu trvalo kratší dobu a bylo mnohem méně intenzivní. Po odeznění přechodného oslabení v levé komoře došlo téměř k úplné ·· ·*·· · ·· • « · · « * · *

- 122 ··♦ ♦ ·· ztrátě kontrastních účinků. Také nedošlo ke zlepšení myokardiálního echa v zadních částech levé komory uvedené v příkladě 1.

Příklad 22

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS obsahujícím thiolovaný anti-CD34-Mal-PEG_2OOO-PE část a: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS PE- PEG₂₀₀₀-Mal

Do čisté zkumavky se umístí 4,5 mg (3,9 mmol) DSPS a 0,5 mg PE-PEG_2ů00-Mal (příklad 50) a přidá se 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakčni směs se 5 minut zahřívá na teplotu 80°C, a pak se filtruje přes filtr s velikostí ok 4,5 mikronu. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se třikrát promyjí destilovanou vodou.

část b: thiolace protilátek anti-CD₃₄

V 0,5 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (PBS) o pH 7 se rozpustí 0,3 mg protilátek anti-CD34 a do reakčního roztoku se přidá 0,3 mg Trautova činidla. Roztok se 1 hodinu míchá' při teplotě místnosti.

Přebytek činidla se z upraveného proteinu oddělí na

- 123 *· ·*·· ·· ·· ·« 44 • · · ··« 4 4 4 « • 4 · t 4 ·· 4 · · β * 4 4 4 · 4 4 4 ·44 444

4 4 4 4 · 4 4

4444 4« «4 44 44 · 4

ΝΑΡ-5 koloně.

část c: Konjugace thiolované protilátky anti-CD34 s mikrobublinkami plněnými plynem a zapouzdřenými DSPS obsahujícím DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL

Do podílu mikrobublinek připravených v části a) se přidá 0,5 ml thiolovaných protilátek připravených v části b). Konjugace probíhá 30 minut, přičemž je směs umístěna na výkyvnou třepačku. Infranatant se oddělí během 5 minut centrifugaci s rychlosti 2000 otáček za minutu. Mikrobublinky se dále promyjí třikrát vodou.

část d: Detekce protilátky zapouzdřené v mikrobublinkách za použití sekundární protilátky konjugované s FITC

Do suspenze mikrobublinek vyrobené v části c) se přidá 0,025 ml kozí protilátky proti myším tkáním konjugované s FITC. Reakční směs umístěná na výkyvné třepačce se inkubuje 30 minut v tmavé místnosti při teplotě místnosti, a pak se 5 minut centrifuguje rychlostí 2000 otáček za minutu. Infranatant se odstraní a mikrobublinky se třikrát promyjí vodou. Při průtokové cytometrii je suspenze mikrobublinek z 98% fluoreskující.

Příklad 23

Mikrobublinky -plněné plynem a zapouzdřené DSPS fcfc ····

- 124 ♦ fcfc « fc *· ·« • · · * · ··» • fc fc· • fcfc · • fcfc · fcfcfc · · • fc fcfc fcfc fcfc obsahujícím thiolovanou anti-CD62-Mai-PEG_2OOO-PE

Mikrobublinky obsahující anti-CD62 protilátky se připraví podle postupu uvedeného v příkladě 22.

Příklad 24

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS obsahujícím thiolovanou - anti-ICAM-l-Mai-PEG₂₀₀₀-PE

Mikrobublinky obsahující anti-.ICAM-lrMal-PEG_zooo-PE protilátky se připraví podle postupu uvedeného v příkladě 22.

Příklad 25

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS, thiolovanou anti-ICAM-l-Mal-PEG_200D-PE a thiolovanou anti-CD62-Mal-PEG₂₀₀₀-PE

Tento příklad je zaměřen na přípravu mikrobublinek obsahujících vektory s řadou protilátek pro cílené ultrazvukové zobrazení.

část a: mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené DSPS PE-PEG₂₀₀₀-Mal

Do čisté zkumavky se umístí 4,5 mg DSPS a 0,5 mg PE-PEG₂₀₀₀-Mal (část a příkladu 2) a přidá se 1 ml • ft ftftft· • ft ftft ftft ftft «· ft ftftft ftftft • ft ftft ··· · ftft • ftftrft · · » ft >·· ftftft ftft·· ft ft··· ftft «· ftft ft· ft· roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zahřívá na teplotu 80°C, a pak se filtruje přes filtr s velikostí ok 4,5 mikronu. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se protřepává 45 vteřin v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se třikrát promyjí destilovanou vodou.

část b: thiolace protilátek anti-CD62 a anťi-ICAM-1

V 0,5 ml PBS o pH 7 se rozpustí 0,3 mg protilátky anti-CD62 (resp. 0,3 mg anti-ICAM-1) a do reakčních roztoků se přidá Trautovo· činidlo. Roztoky se 1 hodinu míchají při teplotě místnosti. Přebytek činidla se z upraveného proteinu oddělí na NAP-5 koloně.

část c: Konjugace thiolovaných protilátek anti-CD62 a antí-ICAM-1 s mikrobublinkami plněnými plynem, zapouzdřené DSPS a DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL

Do podílu mikrobublinek připravených v části a) se přidá 0,5 ml smíchaných thiolovaných protilátek připravenývh v^části b). Konjugace reakční směsi umístěné na výkyvnou třepačku probíhá 30 minut, ínfranatant se během 5 minut oddělí centrifugaci rychlostí 2000 otáček za minutu. Mikrobublinky se dále. třikrát promyjí vodou.

Vmezeřený řetězec PEG může být delší (PEG₃₄₀₀ a PEG₅₀₀₀) nebo kratší (PEG₆₀₀ nebo PEG_eoo) řetězce.· Lze přidat třetí

- 126 «· · · · · »· * « fc* • · · · · fc fcfcfcfc fc · fc · · · · · · · fc fcfcfc fcfc fcfc fcfcfc ··· fcfcfc ···· · · • fcfcfc ·· fcfc fcfc fcfc fcfc protilátku, např. thiolovanou protilátkou anti-CD34.

Příklad 26

Cílené mikrobublinky plněné plynem tvořené DSPS' potahovaným nekovalentně vázaným polylysinem a složeným peptidem tvořeným složkou vázající PS a sekvencí fibronektin-peptidu FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI část a*, složený peptid obsahující složku vázající PS a fibronektinový fragment FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Ile-Wang pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a postranního řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT a 5% vody za vzniku 302 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 25 mg podíl tohoto surového materiálu pří eluci gradientem rozpouštědel od 20 do 40% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v ace.tnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 10 mg čistého produktu.

··«»

- 127 • 0 » ·· 00 00 · 0 0 0 0··

0 0 0 0 0'β 000

000 >0 00 00000 0 0 0 0000 · 0000 «0 00 00 00 ·0

Analytická HPLC: gradient 20-50% Β. (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm a 260nm - doba retence produktu = 12,4 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2856, nalezeno 2866.

Část b: mikrobublinky plněné plynem obsahující DSPS potahovaný nekovalentně vázaným polylysínem a složeným peptidem, který tvoří složka vázající Ρ.Ξ a sekvence fibronektin-peptidu FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI

Do čisté zkumavky se naváží 5 mg DSPS, 0,2 mg poly-L-lysinu a 0,2 mg peptidu připraveného v části a). Do zkumavky se dále přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zahřívá k 80°C. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se centrifugují 3 minuty frekvencí 1000 otáček za minutu. Následuje důkladné promývání vodou, PBS a vodou. Ve výsledném roztoku se pomocí MALDI hmotové spektrometrie sleduje obsah polylysinu a peptidu. Konečný promývací roztok neobsahuje žádný polypeptid. Přidá se 0,5 ml acetnitrilu a mikrobublinky se zničí působením ultrazvuku. Za použití MALDI hmotové spektrometrie se sleduje přítomnost polylysinu a složeného peptidu • to toto toto « to · «to* · · « to to · · · · ·« ««>· * ··· ·· · · «*··· • •tototo· to

128 - ···· ·· ·· *· ·· ·* ♦ to «tototo obsahujícího složku vázající PS a fibronektin:

Poly-L-lysin

Peptid vázající DSPS

MALDI vypočteno

786, 914, 1042, 1170

2856

MALDI nalezeno

790, 919, 1148, 1177

2866

Vmezeřený prvek (-GGG-) ve složeném peptidu obsahujícím složku vázající PS a fibronektin lze zaměnit za jiný vmezeřený prvek, jako např. PEG₂₀₀₀ nebo polyalanin (-AAA-). Metodou předběžného cílení lze nejprve složený peptid tvořený ze složky vázající PS a sekvence fibronektinu spojit s buňkami prostřednictvím peptidu vázajícího fibronektin, a následně zapojením PS mikrobublinek , které sé pak vážou s peptidem vázajícím PS,

Příklad 27

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotin-PEG₃₄₀₀-alanyl-cholesterolem a s navázaným streptávidin/biotinyl-endotelin-l-peptidem (biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp· OH) a biotinylovaným peptidem bránícímu polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS- NH,) * ^Δ

Tento příklad je zaměřen na přípravu cílených, mikrobublinek zobrazitelných ultrazvukem, zatímco streptavidin slouží jako spojovací činitel mezi ·· ···· ·· ·· · «V « · · * · · · · · · • · · · ··« · fc · · • fcfcfc ·« · · ·«·*·· ••••••fc · · ···« fcfc ·· ·· ·· ·· biotinylovaným(i) nositelem(y) informací a vektorem(y).

část a: biotin-PEG₃₄₀₀-5-Alanin-cholesterol

Do roztoku 15 mg (0,03 mmol) cholesteryl-fi-alanin-hydrochloridu (příklad 59) ve _3 ml směsi chloroformu a vodného metanolu v poměru 2,6:1 se přidá 42 ml (0,30 mmol) trietylaminu. Reakční směs se 10 minut míchá při teplotě místnosti a po kapkách se přidá roztok 100 mg (0,03 mmol) biotin-PEG₃₄₀₀-NHS v 1 ml 1,4-dioxanu. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se směs dosucha odpaří a zbytek se čistí rychlou chromatografii za vzniku 102 mg bílých krystalů s výtěžkem 89%. Struktura -produktu se ověří MALDI-hmotovou spektrometrií a NMR.

i část b: biotinylovaný endotelin-l-peptid (bíotín-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp OH)

Peptid se připraví ha automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Trp(Boc)-Wang pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice se a postranního řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% anisolu a 5% vody za vzniku 75 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 20 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 30 do 80% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B 44 4* 4« ·· · a 44·· * a ♦ · · a ··· ·

- íéTO·♦ a · · • 9 99 99 9·

0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnítrilu) při rychlostí průtoku 9 ml/mín. Po lyofilizaci vzniknou 2 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 30-80% B (B = 0,1% roztok kyseliny trif luoroctové v acetnítrilu, A =. 0,01% .vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm doba retence produktu = 12,6 minut).

MALDI hmotová spektrometrie; vypočteno M+H 1077, nalezeno 1077.

část c: bíotinylovaný peptid bránící polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS -NH₂)

Tento peptid se vyrobí a čistí podle postupu uvedeného v předchozí části b). Charakteristika čistého produktu se provede HPLC a MALDI hmotovou spektrometrií.

část d: Víceúčelové mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotin-PEG_3l00-b-Alanin-cholesterolem

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg biotin-PEG₃₄₀₀-b-Alanin-cholesterolem (část a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 8Q°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavky se 45 vteřin protřepávají v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou

4· ···♦

4· 44 «β «« · 4 4 4 4 4 4 4 • · 4 4 4*4 · * · 4 • 4 4 4 4 4 4 4 444 444

4 4 4 4 9 9 4 · **···· 44 »4 ·« 4«

- 131 a analyzuji se počítačem Coulter Counter a měřením zeslabení ultrazvukových ozev.

část e: Konjugace fluoresceinem značeného streptavidinu a biotinylovaných peptidů popsaných v částech b) a c)

Do mikrobublinek připravených v části d) se přidá roztok 0,2 mg streptavidinu konjugovaného s fluoresceinem v 1 ml PBS. V reakční směsi umístěné na výkyvné třepačce probíhá 3 hodiny konjugace při teplotě místností. Provede se důkladné promývání vodou a analýza fluorescenční mikroskopií. Mikrobublinky se 2 hodiny inkubují v 1 ml ΡΒΞ obsahujícím 0,5 mg biotinyl-endotelin-l-peptídu (část b) a 0,5 mg biotinylovaného peptidu bránícího polymeraci fibrinu (část c}. Důkladným promýváním dojde k odstranění nekonjugovaného peptidu.

Příklad '28

Mikrobublinky plněné plynem a zapouzdřené fosfatidylserinem a biotin-DPPE k přípravě 'sandwich' produktu se streptavídínem a se směsí biotiny1-endotelin-l-peptidu (bíotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH) a biotinylovaný peptid bránící polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS NH₂) ·* · * · * •« φ· · · · · · φ ♦ · · 4 φ * · • φ Φφφφφ φφφφ

Φ Φ Ο Φ ΦΦ Φ· ΦΦΦΦΦΦ φφφφφφφ φ φ φφφφ φφ φφ φφ «φ φφ

- 132 část at mikrobublinky obsahující biotin

·. ►

Do 5 mg směsí fosfatidylserinu a 0,6 mg biotin-DPPE, která se umístí do čisté zkumavky se přidá 1 ml. 5% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Disperze se zahřívá 5 minut na teplotu nejvýše 80°C, a pak se zchladí na teplotu místnosti. Prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem a uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle. Po centrifugaci se infranatant odstraní a mikrobublinky se promyjí důkladně vodou.

část b: Konjugace mikrobublinek plněných plynem a zapouzdřených· fosfatidylserinem a biotin-DPPE se streptavidínem a se směsí biotinyl-endotelin-1-peptidů (bioťin-D-Trp-Leu-Asp-Ilé-Ile-Trp ·0Η) a biotinylovaný peptid bránící i

polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS NH₂)

Princip přípravy produktu je popsán v příkladě 27.

Příklad 29

Mikrobublinky plněné plynným perfluorbutanem a

1« zapouzdřené DSPS s navázaným peptidem vázajícím heparinsulfát, fibronektinpeptidém, RGD peptidem a ' fluoresceinem

Μ ···

- 13;?·*-· ·· část a: lipopeptid obsahující sekvencí RGD a fluoresceinovou reportérovou skupinu: dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Lys- [acetyl-Arg-Gly-Asp-Lys(fluorescein)]Gly -OH

Lipopeptid se připraví podle postupu popsaného v části a) příkladu 21 za použití na trhu dostupných aminokyselin a polymerů. Lipopetid se 2 hodiny odděluje z pryskyřice v roztoku kyseliny trifluoroctové obsahující 5% vody, 5% fenolu a 5% EDT. Surový produkt se čistí odpařováním ve vakuu za vzniku sraženiny, která se rozetře s dietyleterem. Preparativní HPLC se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 60 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 10 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 60-100% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 260nm doba retence produktu = 20-22 minut). ·

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1922, nalezeno 1920.· část b: lipopetid obsahující sekvenci pro vazbu heparinsulfátu a fibronektinpeptidu

Příprava a čištění se provede podle části a) příkladu 21.

« ····

ο • · φ φ · φ ·· · » ·»

135 část c: Víceúčelové mikrobublinky plněné perfluorbutanem a zapouzdřené DSPS s navázaným peptidem vázajícím heparinsulfát, fibronektinpeptidem, RGD peptidem a fluoresceinem

Do každé ze dvou zkumavek obsahujících 4 mg (3, 9 mmol·)· DSPS, 0,5 mg (0,2 mmol) výsledného lipopeptidu části b) a 0,58 mg výsledného lipopeptidu části a) se přidá .0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se. současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se MALDI hmotovou spektrometrií popsanou v části b) příkladu 21. Analýza mikroskopií prokáže velikost mikrobublinek v rozmezí od 1 do 5 mikronů. Mikrobublinky jsou fluoreskující.

Příklad 30

Mikrobublinky plněné plynem obsahující. DSPS upravený kovalentní vazbou s protilátkou proti CD71 transferinovému receptoru značenou FITC a dopovaný lipopeptidem s afinitou k endoteliálním buňkám

Tento příklad vede k přípravě činidel zobrazitelných ·· ···· *

137·*- · • · · « · · · · • >··· · · · » ·'··*· * * • · ·· · * ·· ultrazvukem a cílených mnohočetnými vektory.

část a: lipopeptid vážící se k endoteliálním buňkám: 2-n-hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH₂ ' '

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití amidové pryskyřice Rink v množství řádu 0,1 mmol a předem připravených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyseliny. Před vazebnou reakcí se všechny aminokyseliny a kyselina 2-n-hexadecylstearová aktivují použitím HB.TU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparátivní HPLC se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 50 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 10 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 90-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm. a fluorescencí Ex₂₈₀ , Em₃₅₀ - doba retence, = 23 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2369, nalezeno 2373.

- 138

• ’ · · ’ · · · • ♦ · * · · ft· ftft ftft · · · • ft ftft ft· ftft část b: mikrobublinky plněné plynem a obsahující DSPS dopovaným lipopeptidem vážícího se k endoteliálním buňkám a PE-PEG₂₀₀₀-Mal

Do čisté zkumavky se přidá 4,5 mg DSPS, 0,5 mg lipopeptiďu připraveného v části a) a 0,5 mg'

PE-PEG₂₀₀₀-Mal (příklad 50) a do zkumavky se dále přidá 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorky se zchladí na 'teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se třikrát promyjí destilovanou vodou.

část c: thiolace protilátky proti transferinovému receptoru značené FITC

Do 0,7 ml roztoku protilátek proti transferinovému receptoru Ab(CD71) značených FITC v PBS (100 -mg/ml) se přidá-0,9 mg Trautova činidla. Roztok se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti. Přebytek činidla se z upraveného proteinu oddělí na NAP-5 koloně.

část d:_t Konjugace thiolovaných protilátek proti' transferinovému receptoru značených FITC s . mikrobublinkami plněnými plynem a obsahujícími DSPS dopovaným lipopeptidem vážícího se k endoteliálním buňkám a PE-PEG₂₀₀₀-Mal ♦· ··*·

- 139 ··.

• ···

Do mikrobublinek připravených v části b) se přidá 0,5 ml podílu proteinových frakcí (celkem 2 ml) připravených v části c) . Konjugace probíhá 10 minut v reakční směsi umístěné na výkyvné třepačce. Infranatant se oddělí centrifugaci rychlostí 1000 otáček za 3 minuty. Konjugace se dvakrát opakuje s 1 ml a 0,5 ml podíly roztoku proteinu. Mikřobubliňky se dále promyjí čtyřikrát destilovanou vodou. Ve vzorku se zjišťuje přítomnost protilátky průtokovou cytometrii a mikroskopií. Více než 92% buněk je fluoreskujícich.

Graf č.l znázorňuje srovnání průtokové cytometrie kontrolních mikrobublinek DSPS (levá křivka) s bublinkami konjugovanými s protilátkou proti transferínovému receptoru CD71 značenou FITC (plná křivka vpravo) a ukazuje, že 92% populace je fluoreskuj ící.

Včlenění lipopeptidu do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií popsanou v části b) příkladu 21.

Příklad 31

Mikřobubliňky plněné plynem a tvořené DSPS, lipopeptidem cíleným k endoteliálním buňkám a molekulou obsahující kaptopril

Jde o přípravu látky zobrazitelné ultrazvukem, která je namířena k endoteliálním buňkám a má terapeutický

ΒΒ BB··

Β Β ΒΒΒΒ · • * Β Β·«· · • Β Β ·

účinek.

část a: lipopetid s navázaným kaptoprilem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje pro výrobu dusíkatých bublinek a pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,123 mmol. Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA protokolů. Za použití DIC preaktivace se kyselina bromoctová váže skrze postranní řetězec Lys jako symetrický anhydrid. Kaptopril se rozpustí v DME a uvede se do styku s pevnou fází za použití DBU jako baze. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT, 5% vody a 5% etylmetylsulfidu. Preparativní kapalinovou chromatografií se čistí 10 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 2 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut {B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 26 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno a nalezeno M+H 1265.

• 0 ·· • · · · • 0 0··

- 142

0 0 0 0 0 0 0*

0

00 >0 0 0· 0 • 0 0 0 část b: lipopeptid s afinitou k endoteliálním buňkám dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Iie-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH₂

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidu ABI 433A za použití pryskyřice Rink amid v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyseliny palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranní, řetězec ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT a 5% vody za vzniku 160 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 35 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 20 mg čistého produktu. Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm a 26Qnm - doba retence produktu = 16 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2050, nalezeno 2055.

část c: mikrobublinky plněné plynem a tvořené DSPS lipopeptidem cíleným k endoteliálním buňkám a molekulou obsahující kaptopril pro přenos účinné látky

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg pro44

143 ·*

Μ »♦«·

4 4 4 ·

4 • 4 *4

4 ·

4 4

444 444

44

• fc fcfcfcfc • fc fcfc ·· · ·· fc fcfcfc fcfcfcfc • · ··«· fcfcfcfc fc fcfc· fcfc fcfc ··♦·· •«•••fc · fc fc··· ·♦ fcfc fcfc ·· »·

- 144 duktu části a) a 0,5 mg produktu části b) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4¾ propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 8Q°C. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se.naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a na 1 hodinu se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI není v konečném promývacím roztoku průkazná přítomnost počátečního materiálu. Hmotovou spektrometrií MALDI se potvrdí včlenění produktu části a) a části b) do mikrobublinek popsaných v části b) příkladu 21.

část d: zkouška in vitro mikrobublinek plněných plynem tvořených DSPS, lipopeptidem cíleným k endoteliálním buňkám a molekulu obsahující kaptopril pro terapeutické aplikace

Zkouškou in vitro popsanou v části c) příkladu 21 se sleduje vazebná shopnost buněk v podmínkách průtoku. V závislosti na rychlosti průtoku docházelo k postupnému hromadění mikrobublinek na buňkách. Při dalším zvyšování průtoku, kdy docházelo k oddělení buněk od krycího sklíčka, zůstávaly mikrobublinky pevně vázány na buňky. Kontrolní mikrobublinky, které nenesly vektor, neadherovaly k endoteliálním buňkám a již při velmi nízkém průtoku vymizely z průtokové komory.

«· ·4 ·« ·· « · * 4 4 444

4 4 4 «·4 4444 «44 44 44 · 4 · * 4

4444·«· 4 4

44*4 44 44 44 44 44

4« 44·«

Příklad 32

Mikrobublinky plněné plynem, tvořené DSPS s uloženým lipopeptidem tvořeným šroubovicovým peptidem s afinitou k buněčným membránám a peptidovým antibiotikem polymyxin B sulfátem

Tento příklad popisuje přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohotné peptidové vektory k terapeutickému působení i za účelem cílení.

část a: Lipopeptid tvořený šroubovicovým peptidem s afinitou k endoteliálním buňkám: hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-AlaLeu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH₂.

Příprava tohoto lipopeptidu je popsána v části a} příkladu 30.

část b: Víceúčelové mikrobublinky plněném plynem

Do čisté zkumavky obsahující' 5,0 mg DSPS, 0,3 mg lipopeptidu části a) a 0,5 mg polymyxin B sulfátu se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylehglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorek se zchladí na' teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin, protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu.

·· «··· «β *. ,9 9 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 999 · · · · • · · » · · * a »·· aaa • • 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 «· <

146

Mikrobublinky se tak dlouho promývají vodou až hmotovou spektrometrií MALDI není v infranatantu průkazná přítomnost počátečního materiálu. Mikroskopií se potvrdilo, že se velikost mikrobublinek pohybuje v požadovaném rozmezí 1-8 mikronů.

Do přibližně 0,2 ml mikrobublinek se přidá 0,5 ml metanolu a směs se na 2 minuty umístí do ultrazvukové lázně. Výsledný čirý roztok obsahuje podle hmotového spektra MALDI lípopeptid i polymyxin B sulfát (vypočteno 1203, nalezeno 1207).

Příklad 33

Mikrobublinky plněné plynem, tvořené DSPS dopovaným lipopeptidem tvořeným sekvencí vázající IL-1 receptor a upraveným větvenou strukturou obsahující metotrexát

Tento příklad popisuje přípravu cílených mikrobublinek obsahujících mnohotné vektory k terapeutickému působení i za účelem cílení.

část a: lípopeptid tvořený peptidem vázajícím inťerleukin-1 'receptor:

dipalmitoyl-Lys-Giy-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-GlyLeu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala-OH

Lípopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Ala-Wang pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol a předem vyrobených zásobníků s

9 9

- 147 · 99 • 9 9 9 9 9

9 9 9999 « 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 9 99 99 99

2-=

2-2

2*2 ±

2-2 \«0

'ο, >0

>=0

*0 000*

00 00 0· • 0 0 0 0 0 •000 0 00 0

0 « 0 * • 0 0* 00 00

- 148 «000 00 obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování lípopeptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny, ve směsi kyseliny. trif luoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 30 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 4 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 90-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm - doba retence = 23 minut).

MALDI hmotová spektrometrie; vypočteno M4-H 2083, nalezeno 2088.

část b: Struktura jádra větveného metotrexátu obsahujícího thiolovou skupinu

Metotrexát se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Cys(Trt)Tentagel pryskyřice v množství řádu 0,1 mmol. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 160 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 30 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od • ft ftftftft ftft ftft • · · ftftft * « · · · · * • ft ftft • ftft ftftft ftftftft ftft ftft ftft « ft

- 149 COOH

«I ·«·· ·· ·· • · · I • » * '

- 150 do 30% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 9 mg čistého produktu. Analytická HPLC: gradient 5-50% Β.(B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm doba retence produktu =9,5 minuty).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1523, nalezeno 1523.

část c: Víceúčelové mikřobubliňky plněném plynem

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS, 0,5 mg lipopeptidu obsahující thiol (část a příkladu 64) a 0,2 mg výsledného lipopeptidu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, vytvořené mikřobubliňky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu a infranatant se odloží.

část d: Konjugace větveného metotrexátu s thíolovanými mikrobublinkami

V PBS o pH 8,0 se rozpustí 0,5 mg metotrexátu částí b)

- 151 «•fcfc •fc «fcfcfc «· fcfc » · · fcfcfc · · fcfcfcfc fcfcfcfc t fl tohoto příkladu a roztok se přidá do mikrobublinek obsahujících thiol (část c). K vytvoření disulfidických vazeb dochází během 16 hodin. Po promývání PBS a vodou se mikrobublinky sledují mikroskopií a MALDI hmotovou, spektrometrií. ... ... . .. ...

Mikrobublinky v kombinaci s tumor specifickým vektorem tvoří systém k přenosu účinné látky. Disulfidické vazby spojující metotrexát s mikrobublinkami lze in vivo rozvolnit redukcí, tak aby došlo k uvolnění molekuly účinné látky. Takovým fyziologicky vhodným redukčním činidlem je glutathion.

Příklad 34

Mikrobublinky plněné plynem potahované komplexem poly-L-lysinu a fragmentu DNA z plasmidu pBR322 označeného fluoresceinem

Tento příklad popisuje přípravu mikrobublinek. určených pro genovou terapii při použití nesmyslných.sekvencí. Specifické cílení lze dosáhnout dalším dopováním membrán mikrobublinek lipidovými strukturami modifikovanými vektorem tak, jak je tento postup popsán v příkladě 21.

část a: mikrobublinky plněné plynem zapouzdřené DSPS

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS se přidá 1 ml • φ φ

- 152 « φ φφφ» « φφφ » φ « φ «φ φφ φφφ «φφ φφφ φ φ roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 2 minuty zpracovává ultrazvukem, a pak se 5 minut zahřívá k 80°C. Ohřátý roztok se ihned filtruje přes 4 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45· vteřin protřepává v ponorném míchadle. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a infranatant se odloží. Mikrobublinky' se znovu uvedou do suspenze v 0,5 ml vody.

část b: komplex poly-L-lysinu a DNA a vložení mikrobublinek zapouzdřených DSPS

Do čisté zkumavky obsahující 1 mg poly-L-lysinu (molekulární hmotnost 70000-150000) se přidá 0,1 ml rozštěpeného plasmidů pBR322 označeného fluoresceinem a rozpuštěného v pufru TE (10 mM tris-HCl, pH 8).

Přidáním vody se roztok doplní do celkového objemu 0,6 ml a pH se upraví na hodnotu pH 8. Tvorba komplexu probíhá 1 hodinu, a následně se 0,05 ml roztoku komplexu polylysin-DNA přidá do shora uvedené (část a) suspenze mikrobublinek. Po 1 hodině se mikroskopií potvrdí přítomnost fluoreskujících mikrobublinek a přítomnost DNA.

153 *·*· ··

Příklad 35

Plynem plněné mikrobublinky obsahující větvený peptid tvořený dabsylovanou sekvencí vážící aterosklerotický plak a RGDS

Tento příklad popisuje přípravu mikrobublinek s thiolovou skupinou na povrchu pro modifikaci s thiol obsahujícími vektory k cílení, přenosu účinné látky a jejího uvolnění.

část a: Větvený peptid dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Lys- (NH₂-Arg-Gly-Asp-Ser) Gly-Cys.OH

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití pryskyřice Fmoc-Cys(Trt)Tentagel v množství řádu 0,1 mmol a za použití předem vyrobených zásobníků aminokyselin s obsahem 1 mmol. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT a 5% vody za vzniku 160 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 30 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 10 do 60% B během 40 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = acetnitril) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 2,5 mg čistého produktu.

·· ··*· toto toto to· ··

• ft ····

155 • · • · · • ft

Analytická HPLC: gradient 10-50% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm a 435 nm - doba retence produktu = 21 minuta). MALDL hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2070, nalezeno 2073.

část b: plynem plněné mikrobublinky obsahující thiol

Příprava mikrobublinek·se provede podle postupu části a) příkladu 64.

část c: Oxidační vazebná reakce thiolovaných mikrobublinek s víceúčelovým peptidem při vytvoření disulfidových vazeb

Centrifugaci mikrobublinek části b) vznikne infranatant, který se odloží a vymění za roztok 1 mg dabsyl-peptidu vyrobeného v části a) v 0,7 ml ředěného roztoku amoniaku (pH 8). Do této směsi se přidá 0,2 ml zásobního roztoku obsahujícího 6 mg ferokyanátu draselného ve 2 ml vody. Zkumavka se uloží na výkyvnou třepačku a oxidace thiolu se'nechá 2 hodiny probíhat. Mikrobublinky se následně promyjí důkladně vodou za vzniku .infranatantu, který podle HPLC a hmotového' spektra MALDI neobsahuje dabsyl-peptid. Detekce mikrobublinek vázaných na peptid se provedla redukcí disulfidových vazeb za použití ve vodě rozpustného redukčního činidla tris-(2-karboxyetyl)fosfinu. Po redukci obsahoval infranatant podle HPLC a hmotového

- 156 to· ···· i · . *· ** ·· ·· * ϊ * · to to ·*·· • * ····· · « · · * ·*· · · ·· · ·« ·’· ··· · J • · · · * · «· ·· e« ·· spektra MALDI volný dabsyl-peptid.

• ·'

K počátečnímu uvolnění lžě použít jiné fyziologicky vhodné redukční činidlo, jako například redukovaný glutathion.

Příklad 36

Plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené DSPS a biotin-PEG₃₄₀₀-acyl-fosfatidyletanolaminem a s navázaným streptavidinem, s oligonukleotidem biotin-GAAAGGTAGTGGGGICGTGTGCCGG a biotinylovaným peptidem bránícímu polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS. NH₂) část a: bíotin-PEG₃₄₀₀-acyl-fosfatidyletanolamin

Při teplotě místnosti se 2 hodiny míchá směs 21,00 mg (0,03 mmol) dipalmitoyl-fosfatidyl-etanolaminu, 100 mg (0,03 mmol) biotin-PEG-C0₂-NHS· a 42 μΐ (0,30 mmol) trietylaminu v roztoku chloroformu a metanolu v poměru 3:1. Rozpouštědla se odstraní odpařováním za sníženého tlaku a zbytek se čistí rychlou chromatografií při eluci směsí metylenchloridu, metanolu a vody v poměru 40:8:1. Vznikne 112 mg žluté pryže výsledného produktu s výtěžkem 94% a struktura se ověří pomocí NMR a hmotové spektrometrie MALDI.

část b: Navázání streptavidinu konjugovaného s fluoresceinem k mikrobublinkám plněných plynem ·· ·» * · · » • » « · ·· *·« • · ·· 4· ·* MM ·· ·· • » · • · ·♦* • · · • · · ·* »«

- 157

Mikrobublinky plněné plynem se připraví smícháním DSPS a biotin-PEG_340ů-acyl-fosfatidyletanolaminu podle postupu uvedeného v předchozí části. Suspenze mikrobublinek rozdělí do 0,2 ml podílů, do kterých se přidá streptavidin konjugovaný.s fluoresceinem podle níže uvedené tabulky. Vzorky se 15 nebo 30 minut inkubují na výkyvné třepačce při teplotě místnosti, a přebytek proteinu se následně odstraní promytím PBS. Vzorky se analyzují průtokovou cytometrií a počítačem Coulter Counter. Výsledky jsou přehledně uvedené v níže uvedené tabulce.Výsledky:

Podíl číslo	Množství přidaného strepta- vidinu (mg/vzorek 200:1)	Doba inkubace (při teplotě místnosti)	% fluoreskuj ících částic	střední průměr částic v mikronech
1	0		2,0	—
2	0		-	12 (pěna)
3	0,2 (3xl0’9mmol)	30 min	7,8	3,9
4	0,2 (3x10 smmol)	30 min	26,2	4,2
5	10 (1,5 x 10’7mmol)	15 min	30,5	nebylo analyzováno
6	20 (3x10''mmol)	30 min	97,9	5,2
7	40 (6xl0'7mmol)	15 min	96,7	5,1

• fc • fcfcfc

-158 • · · fcfcfc· fcfc ·♦ ·· • fcfc · • fcfc · ·*· fcfcfc • « ·· ·♦

‘8 DSPS kontrola

20 (3xl0'7mmol)

15 min

0,6

3,7

část c: konjugace mikrobublinek potahovaných streptavidinem s oligonukieotidem biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a biotinylovaným peptidem bránícímu polymeraci fibrinu (biotin-GPRPPERHOS. NH₂)

Částice z podílu číslo 6 ve shora uvedené tabulce se centrifugují a supernatant se vymění za 1 ml PBS pufru o pH 7,5, který obsahuje 0,2 mg biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG a 0,2 mg biotin-GPRPPERHQS (jejichž příprava je popsána v částech b) a c) příkladu 27). Po 24 hodinách inkubace se částice důkladně promyji PBS a vodou.

Tímto postupem lze provést konjugaci ostatních biotinylovaných vektorů a terapeutických látek s mikrobublinkami potahovanými streptavidinem nebo avidinem.

Příklad 37

Plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené DSPS a s navázaným lipopeptidem cíleným na tromby a s aktivátorem trombolitického enzymu tkáňového plasminogenu ·· 9···

ά ·· 4 • 4 • · ···· 44

- 160

44 • · · 4 • 4 4

4 4 * · « • 4

Příklad je zaměřen na přípravu kontrastních látek pro ultrazvuk cílených na trombus a obsahujících terapeuticky výhodné trombolytické činidlo.

část a: lipopeptid s afinitou k trombům {dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-GluIle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH₂)

Lipopeptid se připraví na automatickém sýntezátoru peptidů ABI 433A za použití amidové pryskyřice Rink v množství řádu 0,1 mmol· a předem připravených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyseliny. Před vazebnou reakcí se všechny aminokyseliny a kyselina palmitová aktivují použitím HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anosolu a 5% vody za vzniku 80 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 20 mg podíl tohoto surového materiálu a po lyofilizaci vznikne 6 mg čistého produktu. Produkt se dále sleduje analytickou HPLC a MALDI hmotová spektrometrie.

část b: modifikace aktivátoru tkáňového plasminogenu použitím sulfo-SMPB

Do roztoku 0,1 ml pufru s uhličitanem amonným, obsahujícím 0,1 mg t-PA se do celkového objemu 0,2 ml přidá voda. Do tohoto roztoku se přidá 0,4 mg sulfo-SMPB (rozpuštěného v 0,05 ml DMSO). Roztok •9 999·

9 9 9

151 •9 9 9 •9 9

999 9 • 9, 9 * 9

proteinu se nechá 45 minut stát při teplotě místnosti, načež se provede čištění na koloně Superdex 200.

Produkt se eluuje v.PBS a podíl modifikovaného proteinu se sebere.

část c: plynem-plněné mikrobublinky zapouzdřené DSPS', lipopeptidem vážící tromby a lipopeptidem obsahujícím thiol a konjugace modifikovaného aktivátoru tkáňového plasminogenu

Do čisté zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS, 0,5 mg výsledného lipopeptídu vyrobeného v části a) a 0,5 mg lipopeptidu obsahujícího thiol (část a příkladu 64) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu, Reakčni směs se 2 minuty zpracovává působení ultrazvuku, pak se 5 minut zahřívá k 80°C. Ihned po zahřátí se směs filtruje přes 4 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakčni směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se dvakrát promyjí deionizovanou vodou.

ínfranatant se odloží a vymění za 1 ml podíl roztoku *

proteinu připraveného v části b). Konjugace se nechá 1 hodinu probíhat, mikrobublinky se pak centrifugují a ínfranatant se vymění za 1 ml roztok proteinu. Inkubace se opakuje do úplného spotřebování roztoku proteinu. Mikrobublinky se důkladně promyjí vodou a analyzují se v počítači Coulter Counter. Provede se zkouška mikrobublinek v průtokové komoře tak, jak je popsána v

162 fcfc fcfcfcfc fc· fcfc ► · · 4 > · * 4 fcfcfcfc fcfc části c) příkladu 21. Podle této zkoušky se k buňkám váže více mikrobublinek modifikovaných proteinem než mikrobublinek obsahujících lipopeptid a DSPS nebo mikrobublinek obsahujících pouze DSPS.

Cílení a terapeutické a ultrazvukové vlastnosti se vyhodnotí ve zkouškách trombogeneze in vivo a in vitro.

Příklad 38

Mikrobublinky plněné plynem a tvořené DSPS s vloženým lipopeptidem obsahujícím šroubovicový peptid s afinitou k membránám buněk

Příklad je zaměřen na přípravu cílených mikrobublinek tvořených peptidovými vektory cílenými ke strukturám buněčné membrány.

část a: lipopeptid tvořený šroubovicový peptid s afinitou k buněčným membránám

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití amidové pryskyřice Rink v množství řádu 0,2 mmol a předem připravených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyseliny. Před vazebnou reakcí se všechny aminokyseliny a kyselina 2-n-hexadecylstearová aktivují použitím HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové ·· · ·»«· «t «' »φ _#B ·«·· *·*

·« Μ«·* • · * · · · Β Β « Β ♦ · ΒΒΒΒΒ · Β · Β » » Β · · » · Β ΒΒΒ ΒΒΒ β β · β β β β β β

- 164 ···· ·· ·· ·· »· ·· obsahující 5% vody za vzniku 520 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 30 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. 'Po lyofilizaci vznikne 10 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 90-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm - doba retence = 23 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 2369, nalezeno 2375.

část b: plynem plněné mikrobublinky

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného lipopeptidu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mm filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu. Mikrobublinky se promyjí vodou do vymizení lipopeptidu, které se ověří hmotovou spektrometrií MALDI. Mikrobublinky se dále analyzují počítačem Coulter Counter Mikroskopií, zeslabením akustických ozev a zkouškami tlakové stability.

MM · ·

- 165 Do přibližně 0,2 ml podílu mikrobublinek se přidá 0,5 ml metanolu a směs .se na 2 minuty umístí do ultrazvukové lázně. Výsledný čirý roztok neobsahuje podle hmotové spektrometrie MALDI· lipopeptid.

část c: zkoušky in vitro a in vivo

Mikrobublinky měly obdobné charakteristiky in vitro a in vivo jako mikrobublinky v příkladě 21.

Příklad 39

Plynem plněné mikrobublinky zapouzdřené fosfatidylserinem a biotinylovaným lipopeptidem část a: lipopeptid dipalmitoyl-lysinyl-tryptofanyl-lysínyl-lysinyl-iysinyl (biotinyl) -glycin

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů 433A za použití Fmoc-Gly-Wang pryskyřice v množství řádu 0.1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC se • · • · « » ··« ·

- 160·*- ·· čisti 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 14 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A =

0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekcí v UV 2 60 a fluorescencí Ex₂₈₀ , Em_3S0 - doba retence produktu = 22 minut).

*

Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno M+H 1478, ' nalezeno 1471.

část b: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS dopovaným biotinylovanou lipopeptidovou sekvencí připravenou v části a)

Do každé ze dvou zkumavek obsahujících 4,5 mg DSPS a 0,5 mg (0,2 mmol) lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% přopylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavky se 45 vteřin protřepávají v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou ♦ + třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a analyzují se· počítačem Coulter Counter a zeslabením zvuku ozev.· Analýzou hmotového spektra MALDI se potvrdí včlenění lipopeptidu do DSPS mikrobublinek následovně: přibližně 50-100 ml • · · • ·

- 167 mikrobublinek se přemístí do čisté zkumavky a přidá se 50-100 ml vody. Na suspenzi se akusticky působí ultrazvukem po dobu 30 sekund, a pak se směs nanese na čistý cílový disk hmotové spektrometrie (1 ml+0,5 ml ACH matrix). Hmotová spektrometrie MALDI - M+H.nalezeno 1474 (pro lipopeptid vypočteno· 1478).

Příklad 40

Plynem plněné víceúčelové mikrobublinky tvořené DSPS s vloženým lipopeptidem tvořeným nebioaktivním peptidem vážícím receptor pro interleukin-1

Příklad je zaměřen na přípravu cílených mikrobublinek obsahujících nebioaktivní peptidový vektor pro cílení na IL-1 receptor, který nevyvolává přenos signálu a nebrání vazbě na IL-1.

část a: lipopeptid tvořený nebioaktivním peptidem, který se váže k receptoru pro interleukin-1

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů 433A za použití Fmoc-Ala-Wang pryskyřice v množství řádu 0.1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za ·· fcfc ► · ·

I fcfcfcfc * · fcfcfc· fcfc fcfc > · · , • V 4 o-x ~Ý· s-z >0

\ >0

x-z •O

·· 00 00 • · · · · ♦ · · 0 0 · · 0000 0 00 0

000 00 0· 00* 000 *••*»00 * *

- .................

vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 30 mg podíl tohoto'surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 4 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 90-100% B během 2Ό minut (B = - metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekcí v UV 214 nm - doba retence produktu = 23 minut).

Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno M+H 2083, nalezeno 2088část b: mikrobublinky plněné plynem

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného lípopeptidu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 3-5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut k 80°C, a pak se filtruje přes 4,5 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční-směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se 3 minuty centrifugují rychlostí 1000 otáček za minutu. Mikrobublinky se promyjí vodou do vymizení lípopeptidu, které se ověří hmotovou ' spektrometrií MALDI. Do přibližně 0,2 ml promytých ·· ·· «* ·* • · · * · · « • « · · · *· ···· * · · · · · ·· «·«*·· • ••••·· * * *··» v* ·· · · · * * ·

- 170 - 7 mikrobublinek se přidá 0,5 ml metanolu a směs se na 2 minuty umístí do ultrazvukové lázně. Výsledný čirý roztok podle hmotové spektrometrie MALDI obsahuje lipopeptid (vypočteno 2083, nalezeno 2088}.

Příklad 41

Mikřobubliňky plněné perfluorbutanem obsahující DSPC, DSPS a lipopeptid vážící endotelové buňky pro cílené zobrazení ultrazvukem

Do 0,8 ml roztoku obsahujícího DSPC a DSPS v poměru 3:1 (5 mg/ml) ve 4% vodném roztoku propylenglykolu a glycerolu se přidá 0,5 mg lipopeptidu části b) příkladu 31. Roztok se 5 minut zahřívá na teplotu 80°C a protřepává se. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad disperzí se naplní perfluorbutanem.

Uzavřená zkumavka se· 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách se provede centrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu, po 5 minutách se infranatant odstraní a vymění za destilovanou vodu. Prostor na směsí se znovu naplní perfluorbutanem a .vzorek se umístí na výkyvnou třepačku do vzniku homogenního vzhledu. Promývací procedura se znovu opakuje. Výsledná kontrastní látka • ft ftftftft ft* ft· • · « ·· a • · * ···· ft «····* • «· ···· ··*· ftft · ft* ftft ftft • ·· 1 • · · 1 ft ft ftft ftft

- 171 pro ultrazvuk se analyzuje na počítači Coulter Counter, zeslabením zvukových ozev a stanovením rezistence k vnějšímu tlaku. Provede se zkouška in vitro podle příkladu 21: došlo k postupné akumulaci mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 42

Mikrobublinky plněné fluoridem sírovým a tvořené DSPC, DSPS a lipopeptidem vážícím endotelové buňky pro cílené zobrazení ultrazvukem »

Do 0,8 ml roztoku obsahujícího DSPC a DSPS v poměru 3:1 (5 mg/ml) v 4% vodného roztoku propylenglykolu a glycerolu se přidá 0,5 mg výsledného lipopeptidu částí b) příkladu 31. Roztok se zahřívá 5 minut na teplotu 80^ttC a protřepává se. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad disperzí se naplní plynem fluoridu sírového. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na ’ výkyvnou třepačku. Po 5 minutách se provede centrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu, po 5 minutách se infranatant odstraní a vymění za destilovanou vodu. Prostor nad směsí se znovu naplní fluoridem sírovým a vzorek se umístí na výkyvnou třepačku do vzniku homogenního vzhledu. Promývací • · fcfc • · · · • * · ·

- 172 fc · fc *· fcfc procedura se znovu opakuje. Výsledná kontrastní látka pro ultrazvuk se analyzuje na počítači Coulter Counter, zeslabením zvukových ozev a stanovením rezistence k vnějšímu tlaku.

Příklad 43

Mikrobublinky plněné plynem a tvořené DSPG a lipopeptidem vážícím endotelové buňky pro cílené zobrazení ultrazvukem

Do 0,8 ml roztoku obsahujícího DSPG (5 mg/ml) v 4% vodného roztoku propylenglykolu a glycerolu se přidá 0,5 mg výsledného lipopeptidu části b) příkladu 31. Roztok se zahřívá 5 minut na teplotu 80°C a protřepává se. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad disperzí se naplní perfÍuorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách se provede centrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu, po 5 minutách se infranatant odstraní a vymění za destilovanou vodu. Prostor nad směsí se znovu naplní perfluorbutanem a vzorek se umístí na výkyvnou třepačku do vzniku homogenního vzhledu. Promývací procedura se znovu'opakuje. Výsledná kontrastní látka pro ultrazvuk ·· · ♦··

- 173 ·* ·* ftft ftft • · · · · ♦ · « · · * * ftft··· · · ft · * ··· ·· ·· · · · ··· ·♦····♦ · « • •ftft ft« ftft ft· ft· ·· se analyzuje na počítači Coulter Counter, zeslabením zvukových ozev a stanovením rezistence k vnějšímu tlaku. Provede se zkouška in vitro podle příkladu 21: došlo k postupné akumulací mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 44

Mikrobublinky plněné perfluorpropanem a tvořené DSPG a lipopeptidem vážícím endotelové buňky pro cílené zobrazení ultrazvukem

Do 0,8 ml roztoku obsahujícího DSPG (5 mg/ml) v 4% vodného roztoku propylenglykolu a glycerolu se přidá 0,5 mg výsledného lipopeptidu části b) příkladu 31. Roztok se zahřívá 5 minut na teplotu 80°C a protřepává se. Roztok se zchladí na teplotu místnosti a prostornad disperzí se naplní perfluorpropanem. Uzavřená zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách se provede čentrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu, po 5 minutách se ínfranatant odstraní a vymění za destilovanou vodu. Prostor na směsí se znovu naplní perfluorpropanem a vzorek se umístí na výkyvnou třepačku'do vzniku homogenního vzhledu. Promývací procedura se znovu opakuje. Výsledná kontrastní látka · · 9 ·· ·ι 9 9 9 • · » · 949 4 9 9 4 * *99 99 94 9·9 »99

9 * 9 9 4 4 9 4

- 174-*· ·* ’· ·· pro ultrazvuk se analyzuje na počítači Coulter Counter, zeslabením zvukových ozev a stanovením rezistence k vnějšímu tlaku. Provede se zkouška in vitro podle příkladu 21: došlo k postupné akumulaci mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 45

Mikrobublinky plněné fluoridem sírovým a tvořené DSPG a lipopeptidem vážícím endotelové buňky pro cílené zobrazení ultrazvukem

Do 0,8 ml roztoku obsahujícího DSPG (5 mg/ml) ve 4% vodném roztoku propylenglykolu a glycerolu se přidá 0,5 mg výsledného lipopeptidu části b) příkladu 31. Roztok se zahřívá 5 minut na teplotu 80 °C, protřepává se, zchladí se na teplotu místnosti a prostor nad disperzí se naplní plynem fluoridu sírového. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle, a pak se umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách se provede centrifugace rychlostí 2000 otáček za minutu, po 5 minutách se Ínfranatant odstraní a vymění za destilovanou vodu. Prostor nad směsí se znovu naplní fluoridem sírovým a vzorek se umístí na výkyvnou třepačku do vzniku homogenního vzhledu. Promývací procedura se znovu opakuje. Výsledná kontrastní látka pro ultrazvuk se analyzuje na počítači Coulter Counter, zeslabením zvukových ozev a stanovením rezistence k fcfc fcfcfcfc

- 175 ·· ·· fc* »· » · * fc · fc · • · · fcfc · · · · • · * fcfc · · · * · · • · · · fc · ·· fcfc fcfc · · vnějšímu tlaku.

Příklad 46

Cílené mikrobublinky plněné plynem, tvořené DSPS potahovaným nekovalentně vázaným polylysinem

Do čisté zkumavky se naváží 5 mg DSPS a 0,2 mg poly-L-lysinu. Do zkumavky se dále přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zahřívá k 80°C. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se centrifugují 3 minuty frekvencí 1000 otáček za minutu. Následuje důkladné promývání vodou, PBS a vodou. Ve výsledném roztoku se pomocí MALDI hmotové spektrometrie sleduje obsah polylysinu. Konečný promývací roztok neobsahuje žádný polypeptid. Přidá se 0,5 ml acetnitrilu a mikrobublinky se zničí působením ultrazvuku. Za použití MALDI hmotové spektrometrie se sleduje přítomnost polylysinu:

MALDI vypočteno MALDI nalezeno

Poly-L-lysin 786, 914, 1042, 1170 790, 919, 1048, 1177

Příklad 47 • Β

176·· ·· * Β ·< BB ·· • · Β * Β Β · • Β ·»· Β Β Β Β • · Β · · ΒΒΒ Β · ·

Β Β Β « · « *

ΒΒ ·« ·Β « ·

Cílené mikrobublinky plněné plynem, jejich navázání na buňky

Příklad popisuje přípravu mikrobublinek s reakční skupinou na povrchu k nespecifickému cílení. Vazby k většímu počtu buněčných cílů se dosáhne reakci, při ftíž dojde k výměně disulfidu.

část a: lípídová molekula s- navázaným thiolem

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Cys(Trt)-Wang pryskyřice v množství řádu 0,25 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyseliny palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězec ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi 'kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 250 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při elucí gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 50 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 24 mg čistého produktu.

Analytická HPLC; gradient 70-100% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm doba retence produktu = 23 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1096, nalezeno 1099.

φφ φφφφ »· φφ φφ φφ • φ φ φφφ φφφφ φ φ φφφφφ φφφφ • φφ. φ φφ φφ φφφφφφ • •••φφφ φ φ

- ................

část b: mikrobublinky plněné plynem tvořené DSPS dopovaným lípídovou strukturou obsahující thiol

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg (0,4 mmol) výsledného lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% přopylenglykolu a 2,4% glycerolu ve vodě. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Ještě horký se filtruje přes 40 mm filtr. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfiuorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a začlenění thiolové skupiny se analyzuje Ellmanovým činidlem.

Příklad 48

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS dopovaným lipopeptidém vázajícím trombus část a: lipopeptid s afinitou,k trombům (dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-GluIle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH₂)

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití amidové pryskyřice Rink v množství řádu 0,1 mmol a předem připravených zásobníků

Φ *·♦* φφ Φ· φ · · * · · • · 9 9 999

9 9 9 9 9 9

Ί 70 · · * · · · · / ·· ·· ·· φφ φ«

ο • to «toto· ·· toto *· toto * * · *·· ···· * toto*·· ·«·· to tototo ·· · * to·· ·** • •••••to « to

ISO*’*· ·· ·« ·· ♦· ·· s obsahem 1 mmol aminokyseliny. Před vazebnou reakcí se všechny aminokyseliny a kyselina palmitová aktivují použitím HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 80 mg surového' produktu. Preparativní HPLC se čistí 20 mg podíl tohoto surového materiálu a po lyofilizaci vznikne 6 mg čistého produktu. Produkt se sleduje analytickou HPLC-a MALDI hmotovou spektrometrií.

část b: k trombům cílené mikrobublinky kontrastní pro ultrazvukové zobrazení

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 1,0 mg výsledného lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu ve vodě. Reakční směs se 5 minut zahřívá k 80°C, a pak se filtruje přes 40 mikron filtr, Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se několikrát důkladně promyjí deionizovanou vodou. Mikrobublinky se sledují mikroskopií a počítačem Coulter Counter. Hmotovou spektrometrií MALDI se potvrdí přítomnost lipopeptidutak, jak je popsáno v předchozích příkladu.

• fc fcfcfc· fcfc fcfc fcfc fcfc • * · · · fc fcfcfcfc • fc fcfc··· fcfcfcfc fc «fcfc fcfc fcfc fcfcfc fcfcfc ._»·♦♦·· · · - 181··*·....... ·· ··

Příklad 49

Plynem plněné a transferinem potahované mikrobublinky pro cílené ultrazvukové zobrazení část a: lipídová molekula s navázaným thiolem

Peptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití Fmoc-Cys(Trt)-Wang pryskyřice v množství řádu 0,25 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a postranního řetězec ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 250 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 50 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 24 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm doba retence produktu = 23 minut). MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1096, nalezeno 1099.

část b: mikrobublinky plněné plynem tvořené DSPS

- 183 • ft ftftftft ftft ftft ftft ft* ftft ft ftftft ftftftft • * ftft ftftft ft ftft « • ··« ftft ftft ftftft ftftft «ftftftft· ft ft •ftftft «· ftft ftft ftft ftft dopovaný lipidovou strukturou obsahující thiol

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg (0,4 mmol) lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu ve vodě. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 8.0°C. Ještě horká se filtruje přes 40 mm filtr. Vzorky se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, přes noc se uloží na výkyvnou třepačku a mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou. Začlenění thiolové skupiny se analyzuje Ellmanovým činidlem.

Část c: modifikace transferinu pomocí fluorescein-NHS a sulfo-SMPB

Do 4 mg lidského transferinu (Holo) v 1 ml PBS se přidá 0,5 ml roztoku DMSO obsahujícího 1 mg sulfo-SMPB a 0,5 mg fluorescein-NHS. Reakční směs se 45 minut míchá při teplotě místnosti, a pak se nechá projít přes kolonu Sephadex 200 pří elucí PBS. Proteinový podíl se sebere a skladuje se při teplotě 4 oc.

část d: konjugace mikrobublinek s transferinem

Do' mikrobublinek obsahujících thiol se přidá 1 ml roztoku modifikovaného transferinového proteinu «· ···· v · • « · · • · · · · • fcfc * · · • · fc · · fc · fcfc fcfc fcfc • fcfc · fc fcfc · • fcfcfc fcfcfc • · • fc fcfc

- 185 V 5 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu se rozpustí 167 mg Boc-NH-PEG₂₀₀₀-DSPE a reakční směs se 2,5 hodin míchá při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odpaří v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje 1,5 ml chloroformu a dvakrát se promyje 1,5 ml vody. Organický podíl se odstraní odpařováním ve vakuu. Po chromatografii na tenké vrstvě při elucí směsí chloroformu, metanolu a vody v poměru 13:5:0,8 vznikne ninhydrin positivní skvrna s hodnotou Rf = 0,6. Složení produktu se ověří NMR.

P část c: Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE (3-maleimidopropionát póly(etylenglykol)distearoylfosfatidyletanolaminu)

Do roztoku 65 mg (0,012 mmol) K₂N-PEG₂₀₀₀-DSPE v 1 ml tetrahydrofuranu a 2 ml 0,lM roztoku pufru s fosfátem sodným ’o pH 7,5 se přidá roztok 5,6 mg (0,018 mmol) N-sukcinimidyl-3-maleímídopropionátu v 0,2 ml tetrahydrofuranu. Reakční směs se zahřívá na 30°C, produkt se čistí TLC, načež se rozpouštědlo odpaří ve vakuu. Výsledný materiál se čistí rychlou chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 80:20. Složení produktu se ověří NMR a hmotovou spektrometrií.

část d: plynem plněné mikrobublinky DSPS dopovaného PE-PEG₂₀₀₀-DSPE •β φφφφ

- 186 ♦ φ · φφφ • φφφ φφ φ φ φ φ ♦ Φ φφ

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg PE-PEG₂₀₀₀-Mal vyrobeného v části c) se přidá 1 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu ve vodě. Reakční směs se současně 5 minut zahřívá k 80°C. Ještě 'horký se filtruje přes 4,5 mm filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se třikrát důkladně promyjí destilovanou vodou.

část e: trypsin označený fluoresceinem

Do 5 mg trypsinu v 1 ml PBS se přidá 0,2 ml roztoku DMSO obsahujícího 1 mg fluorescein-NHS. Reakční směs se 45 minut míchá při teplotě místnosti, a pak se nechá projit přes kolonu Sephadex 200 při eluci PBS s rychlostí průtoku 1 ml/min. Proteinový podíl (5 ml) se sebere a skladuje se při teplotě 4 °C.

část f: thiolovaný trypsin označený fluoresceinem

Do proteinového podílu připraveného v předchozí části e) se přidá 1 mg Trautova činidla a reakční směs se 1 hodinu míchá při teplotě místnosti. Přes kolonu Sephadex 200 se nechá projít 4 ml produktu modifikovaného Trautovým činidlem při eluci PBS. Proteinový podíl, jehož intensita fluorescenčního záření je největší, se sebere. Tímto způsobem se získá « 0 00 0 • 000

- 187 * · · 0 * · «0 «*· «*· 0000··· 0 · 0000 · «0 «0 0« »* celkem 6 ml produktu.

část g: Konjugace míkrobublinek s thiolovaným trypsinem označeným fluoresceinem

Mikrobublinky připravené podle postupu uvedeného v části d) se inkubují v 1 ml proteinového roztoku připraveného podle postupu uvedeného v části f) na výkyvné třepačce. Konjugace probíhá 10 minut při pH

7,3-7,8, následuje centrifugace a odstranění infranatantu. Postup se třikrát opakuje, a pak se mikrobublinky zbaví proteinu promytím čtyřikrát vodou.

D. Podle štěpení Arg-pNA derivátu v PBS obsahovali mikrobublinky aktivní enzym.

E. Byla provedena analýza počítačem Coulter Counter a měření echogenity.

Mikrobublinky byly tlakově stabilní.

	FEK-022-015
celková koncentrace	0,83 .
průměr 1-3 mm	40
průměr 3-5 mm	28
průměr 5-7 mm	13
frekvence max. zeslabení	3, 3

188 ·· ·»·· «4 44 tt _ν» • · * «44 4 4·· • · * 4444 « 44 4

4 4 » *4 »4 4*4 444 •••••44 · 4 • 44 4 44 44 · 4 4« 44

zeslabení při 2, MHz	4,9
zeslabení při 3,5MHz	7,8
zeslabení při 5,0MHz	7,2

obrázek č. 2:

Znázornění výsledků průtokové cytometrie ve srovnání s kontrolními mikrdbublinkamí' (levá křivka). Podle výpočtu je 98% mikrobublinek fluoreskujících.

Příklad 51

Plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS a molekulou obsahující kaptopril část a: lipopeptíd s navázaným kaptoprilem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol. Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Za použití DIC preaktivace se kyselina bromoctová se váže skrze postranní řetězec LYS jako symetrický anhydrid. Kaptopril se rozpustí v DMF a' uvede na pevnou fázi za použití DBU jako baze. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a' ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT, 5% vody a % etylmetylsulfidu.

• 0 «0*0

« *

- 190 * · · · · a · ··· ·· ·» «· ·♦ ··

Preparativní kapalinovou chromatografií se čistí 10 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vzniknou 2 mg čistého produktu. ......

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové. v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v

UV 214 nm - doba retence produktu = 26 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1265, nalezeno 1265.

část b: plynem plněné mikřobubliňky tvořené DSPS a sloučeninu obsahující kaptopril

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut se současným protřepáváním k 80°C, Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor naď reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikřobubliňky se důkladně promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI není v konečné prací lázni «4 «··

- 191 · 4 > 4 4 » 4 4 4 4 průkazná přítomnost počátečního materiálu. Hmotovou spektrometrií se potvrdí začlenění lipopeptídu obsahujícího kaptopril do mikrobublinek: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI - vrchol M+H odpovídající lipopeptídu uvedeného v části a).

Příklad 52

Plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS a vektorem s afinitou k adrenergním receptorům část a: derivát chráněného atenololu vhodného pro vazebnou reakci na pevné fázi

1. metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetát

Reakční směs 4,98 g {0,030 mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 μΐ (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85°C. Reakční směs zchladí a.přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého pří • 0 « « * 0 ·· 00 *0 00 • · · 0 0 0 » • * 0 0000 0 00 0 * * 0 0 00 00 000 000

0 0 0 0 0 0 0 0

0000 0» 00 00 00 00

- 192 eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ³H (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

2. metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy] fenylacetát.

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetátu, ť

ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) *

vody. Reakční směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje/ který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze.

Struktura se ověří analýzou ³H a ¹³C NMR..

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se. Spektrum ^JH a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268.

• Φ « φφ ·

ΦΦ • * «

Φ Φ « «•ΦΦΦ» « φ ··· · · · Φ· · φΦ φφ

- 193

4. N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctová kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyl-etyl)amino]propoxy]fenyloctové ve 2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol) hydrogenuhličitanu sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyldikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným .roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čisti chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou ³Η a ¹³C NMR.

část b: lipopeptid s navázaným atenololem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, • · ftftftft ftft ftft ftft ftft « « ftftftft • » · · · · · · ftft ft » ftftft ftft ftft ftftft ftftft ftftftftftftft · · ftftftft ftft ft* ·· ft* ftft

- 194 -

- 195 • · Μ·» • 4 4>

• · • · 4 · #*· * ····>· • · 4 4 · · ···♦ 99 99 ··

99 • 4 4 · • · « 4 «

• 4 4· pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Surový materiál se zpracuje eterem a sraženina se čistí preparativní kapalinovou chromatografií při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100%

B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 38 mg čistého produktu. Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 25 minut).

MALDI hmotová spektrometrie (ACH matrix) : vypočteno M+H 1257, nalezeno 1258.

část c: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím atenolol

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části b) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zpracovává působením ultrazvuku, 5 minut se zahřívá k 80°C se současným protřepáváním . Vzorek se

» toto « ·*· ··«

196 « · ♦ · · to zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se důkladně promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI není v konečné prací lázni průkazná přítomnost výsledné sloučeniny části b). Spektrometrií se potvrdí začlenění, lipopeptídu. obsahujícího atenolol do mikrobublinek: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzuje se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH-matrix)- vrchol M+H 1259 odpovídající lipopeptídu uvedeného 'v části b) .

část d: analýza in vitro

Provede se zkouška mikrobublinek in vitro, která je popsána v příkladě 21. Dojde k postupnému hromadění mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 53

Příprava mikrobublinek plněných plynem tvořených DSPS, lípopeptidem skládajícího se z peptidu vázajícího heparinsulfát (KRKR) .a fibronektin-peptidu (WOPPRARI) pro cílení a lípopeptidem obsahujícím atenolol k terapeutickým účelům

4* *9 ·4

9 4 · * «4 *

- 197 * · ♦ 4 9 4 * · · 4 ··♦ * 4 4 » 4 4 ♦ 4· «44

4·· «4 44 β · část a: lipopeptid skládající se z peptidu vázajícího heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidu (WOPPRARI)

Lipopeptid se připraví na automatickém syntezátoru peptidů 433A za použití Fmoc-Ile-Wang pryskyřice v množství řádu 0.1 mmol a předem vyrobených zásobníků s obsahem 1 mmol aminokyselin. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a vedlejšího řetězce ochranných skupin se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% fenolu, 5% EDT, 5% anisolu a 5% vody za vzniku 150 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 40 minut (A = 0,1% vodného'roztoku kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 16 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = metanol, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekcí v UV 260 nm a fluorescencí Ex_2go, Em_3í;o - doba retence produktu = 19,44 minut).

Hmotová spektrometrie MÁLDI: vypočteno M+H 2198, nalezeno 2199.

část b: chráněný derivát atenololu vhodný pro vazebnou reakci na pevné fázi

«fc fcfcfcfc

- 199 9 · · • fc « fc · fcfc· fc·· «fc fcfc fcfc fc fcfc fc fcfcfcfc fc fcfc * • fcfc * fcfc · * » fc • fcfc

1. metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetát

Reakční směs 4,98 g (0,030 mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 pl (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85’C. Reakční směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ^;H (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

. metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]I propoxy]fenylacetát

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetátu, 23 ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) vody. Reakční směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze. Struktura se ověří analýzou ²H a ¹³C NMR.

*· ftft··

- 200 ♦ · · ftftft • · 9 9 ftftft *««··* ftft* ···· ftftftft ftft «» «· • ftft · * ftft ft • ftft ftftft «

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí .v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se. Spektrum ^LH a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268.

4. N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctové kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2-hydroxy-3- [ (1-metyl-etyl)amino]propoxy]fenyloctové ve 2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7/2 mmol) hydrogenuhličitanů sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 mmol) di-terc.butyl-díkarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce' se sleduje chromatografíí na tenké vrstvě na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyldikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí • 0 00

0 0

- 201 - ···· ·· ·*·· «0 ·· « ·0 0 • 0 0 · 000 000 0 0 00 00 chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou Ή a ¹³C NMR.

část b : lipopeptid s navázaným atenololem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol, odpovídajících aminokyselin, kyseliny palmitové a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Přidáním eteru vznikne sraženina surového materiálu, která se čistí preparativní kapalinovou chromatografií při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 38 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost ·· «*··

Β· Β·Β· ·♦ ♦·

Β Β Β

Β Β ΒΒΒ

Β · Β Β Β

Β Β Β Β

ΒΒ βΒ

- 203

ΒΒ ΒΒ

Β · Β ·

Β Β Β Β

ΒΒΒ ·»·

ΒΒΒΒ ·· průtoku 1 ml/min, detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 25 minut:

MALDI hmotová spektrometrie(ACH matrix): vypočteno M+H 1257, nalezeno 1258.

část d: příprava mikrobublinek plněných plynem tvořených DSPS, lipopeptidem skládajícího se z peptidu vázajícího heparinsulfát (KRKR) a fibronektin-peptidu (WOPPRARI) a lipopeptidem obsahujícím atenolol *

Do zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS, části a} a 0,5 mg produktu části c) roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4%

0,5 mg produktu se přidá 1,0 ml glycerolu. Reakční směs.se 5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut se současným protřepáváním k 80°C, vzorek se filtruje a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se důkladně promyjí deionizovanou vodou. Spektrometrií se potvrdí začlenění lipopeptidu obsahujícího atenolol do mikrobublinek: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH-matrix)- vrchol M+H 2202 (lipopeptid a) a 1259 (lipopeptid c).

část e) analýza in vitro »« 4··· « ♦ »··« ·· ♦ · * • »

··· «

204

Provede se zkouška mikrobublinek in vitro, která je popsána v příkladě 21. Dojde k postupnému hromadění mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 54

Plynem plněné mikřobubliňky tvořené DSPS a lipofilickým derivátem atenololu s afinitou k adrenergním receptorům pro diagnostické a terapeutické účely část a: N-hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetamid

1.

metyl-4- [ (.2,3-epoxy) propoxy] fenylacetát

Reakční směs 4,98 g (0,030 mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 μΐ (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85°C. Reakční směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý zbytek se zpracuje etylacetátem, promyjě se nasyceným roztokem chloridu Sodného a suší senad 'síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografií na.koloně oxidu křemičitého při eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ^ΧΗ (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

- 205 ftft «··· ft· ftft • · ft · · · * * * ···· ft ftftftft·· • ftft ftftftft ·♦·· ftft «· ftft • ft ftft • · ft • ftft ft ftftft ftftft • · . metyl-4- [2-hydroxy-3- [ (1-metyletyl) amino] propoxy]fenylacetát

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[ (2,3-epoxy) propoxy] fenylacetátu, 23 ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) vody. Reakční směs se v rotačním odpařovačí zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze. Struktura se ověří analýzou 'H a ¹³C NMR.

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino] propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny · chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovačí a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se Spektrum ^XH a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268'.

. ·Ν-Βοο-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctová kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2206 •t ·**« «to · to · « «to • * · ···· «· toto ·· « ·· • toto·· • toto · • to· · ·· «· «· toto « « · i ·· · • to«« ·«· • to ·» ··

-hydroxy-3-[(1-metyl-etyl)amino]propoxy]fenyloctové ve 2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol] hydrogenuhličitanu sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyldíkarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofílizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou a ¹³C NMR.

. N'-Boc-N-hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenylacetamid

Roztok 92 mg (0,25 mmol) N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(l-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctové kyseliny a 60 mg (0,25 mmol) hexadecylaminu'v 5 ml DMF se zchladí na teplotu 0°C. Do roztoku se přidá 39 mg (0,25 mmol) HOBt a 48 mg (0,25 mmol) hydrochloridu N-(3-dimetylamino·* fc··· • · · • · • · • · · fc··· ·· • · ·· *· • · • fc·· • · · • · 4 fc· ·· ·· ·« fc · · • · · · ··· fc·· • · fcfc 4·

207 propyl)-N'-etylkarbodiimidu (karbodiimid ve vodě rozpustný). Reakční směs se 1 hodinu míchá při teplotě 0°C, a pak přes noc při teplotě místnosti. Reakční směs se vlije na 25 ml vody, obsahující 2,5 g uhličitanu sodného a 4,0 g chloridu sodného. Vytvořená sraženina se odstraní filtrací, promyje se vodou a zpracuje se chloroformem. Chloroformový podíl se promyje 5% roztokem uhličitanu sodného a vodou a suší se nad síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí za vzniku 150 mg žlutobílého surového materiálu. Produkt se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 95:5 za vzniku 118 mg bílého materiálu s výzěžkem 80%.

Struktura se ověří ^ΓΗ (500 MHz) a (125 MHz) NMR.

Hmotnostní spektrometrie MALDI: M+Na vrchol při 614.

6. N-hexádecyl-4 - [2-hydroxy-3- [· (1-metyletyl) amino]propoxy]fenylacetamid

Do roztoku 10 mg N'-Boc-N-hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetamidu v 9 ml , I dichlormetanu se přidá. 1 ml kyseliny trifluoroctové. Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti. Chromatografii na tenké'vrstvě oxidu křemičitého a při eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 95:5 se prokáže zpracování veškerého počátečního materiálu. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se zpracuje roztokem vody a acetnitrilu a lyofilizuje se. Vznikne bílá pevná látka v kvantitativním výtěžku. Struktura se ověří ^:H — ίϊ£)& *»· • ·· · · ·· · · • · · * ···· * · ··· · ·» · • t · t I · * *· ·· ·· · * (500 MHz) a ^l3C (125 MHz) NMR. Hmotnostní spektrometrie MALDI - vypočteno a nalezeno: M+Na 514, M+H 492.

část b: plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS a N-hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetamídem

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS, 0,5 mg N-hexadecyl4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetamidu se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Reakční směs se 5 minut zpracovává působením ultrazvuku, zahřívá se 5 minut se současným protřepáváním k 80°C. Vzorek se filtruje a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a vytvořené mikrobublinky se důkladně promyjí deíonizovanou vodou. Spektrometrii se potvrdí začlenění výsledného lipopeptídu části a) obsahujícího aťenolol do mikrobublinek: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzuje se hmotovou spektrometrií MALDI - vrchol M+H při 492 odpovídá N-hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyíacetamidu

Příklad 55 ·» 4444 • ·

• 4

4 4 * · ♦ 4 • · 4

4 4 4 • 4 4 4

4 4 4

Z z

NH

• Φ Φφφφ * · · · Φ Φ Φ φ 4

210*- ..........

Plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické účely tvořené DSPS a sloučeninou obsahující kyselinu listovou část a: lipopeptid obsahující kyselinu listovou

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmocv množství řádu 0,125 mmol, odpovídajích aminokyselin, kyseliny·· palmítové a kyseliny listové. Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA pos.tupů. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Přidáním eteru vznikne sraženina surového materiálu, která se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI: M+H nalezeno 1435, vypočteno 1430. Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1,0 ml/min,· detekce v UV 368 nm - doba retence produktu = 27 minut).

část b: plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické účely tvořené DSPS a sloučeninou obsahující kyselinu listovou

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% • * ♦ · « « propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Po přidání ředěného amoniaku k pH 8 a 40 μΐ DMSO se na reakční směs 5 minut působí ultrazvukem. Reakční směs se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorek se filtruje a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát -promyjí' deionizovanou vodou a analyzují se MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix) - vrchol M+H 1238 odpovídá struktuře produktu části a).

část c: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 56 ~ '

Plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeuťické účely tvořené DSPS a cholesterylesterem chlorambucilu ·· ·»»« ··· I»

212 • * · · «· ·» část a: cholesteryl-4-[4-[bis(2-chloretyl)amino]fenyl]butanoát

Do roztoku 669 mg (2,20 mmol) chlorambucilu v 15 ml bezvodého dichlormetanu se přidá 170 μΐ (1,10 mmol)

DIC. Reakční směs se míchá 0,5 hodiny při teplotě místnosti, a pak se přidá do roztoku 387 mg (.1,00 mmol) cholesterolu a 122 mg (1,00 mmol) DMAP v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá a vlije se na 5% roztok hydrogenuhličitanusodného. Podíly se oddělí a organický podíl se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se filtruje a zahustí. Produkt se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci chloroformem za vzniku 560 mg bezbarvého oleje s výtěžkem 83%. Produkt se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 674.

Struktura se ověří ^rH (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR.

část b: plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS a cholesterylesterem chlorambucilu

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem. Reakční směs se 5 minut ·· *··· «·*· ·4

- 213 » 4 · « »4 protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorek se filtruje a zchladí na teplotu místnosti. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou a nepřítomnost výsledné sloučeniny části a) v konečném promývacím rozto-ku- se potvrdí hmotovou spektrometrií MALDI. Začlenění cholesterylesteru chlorambucilu do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzuje se hmotovou spektrometrií MALDI - vrchol M+H při 668 odpovídá struktuře výsledného produktu části a) .

Příklad 57

Plynem plněné mikrobublinky pro diagnostické a terapeutické účely tvořené DSPS, lipopeptidem obsahujícím atenolol a cholesterolovým derivátem chlorambucilu část a: chráněný atenolový derivát vhodný k vazebné reakci na pevné fázi

1.

metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetát

0 000 * · 0 · 0 0 0 0 0 0 • · 00000 0 00 0 *0000« 0 * •000 00 04 ||

- 214 Reakční směs 4,98 g (0,030 mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 μΐ (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85°C, Reakční směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridusodného a suší - se nadsíranemsodným. Roztok se filtruje a zahusti. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí hexanu a 'etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ^XH (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

2. ' metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetát

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[ (2,3-epoxy) propoxy] fenylacetátu, 23 ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) vody. Reakční směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze. Struktura se ověří analýzou ¹H a ¹³C NMR.

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny » ·« • 9 » ··· •fc ····

- 21*5’-·· » fcfc 4 * · ·

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofiiizuje se. Spektrum ’Ή a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a 'nalezeno M+H' 268.

. N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctová kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu'kyseliny 4— [2—

-hydroxy-3- [ (1-metyl-etyl) amino] propoxy] fenyloctové ve 2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol) hydrogenuhličitanu sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografii na tenké vrstvě na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5.· Di-terc.butyldikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru • · » fcfc * fcfc

216.

• · ·*· fc» • · fcfcfc!

♦ · fcfc

85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou ^XH a ¹³C NMR.

část b: lipopeptíd s navázaným atenololem

Sloučenina shora uvedené struktury se.připraví ra· použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol, odpovídajích aminokyselin,,kyseliny palmitové a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Přidáním eteru vznikne sraženina surového materiálu, která se čistí preparativní kapalinovou chromatografií při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut {A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 38 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min, detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 25 minut).

- 217 44 4 444 _ . · · 99 44 *· 4 444 4··. 4 • · · · *»· 4 4 9 4 *· 9444* **< **J ···* ·· ·· 44 ·« 44 zx

HH

·· · · · · ·· · φ φφ φφ * · * · · φ φφφφ φ φ φφφφφ φφφφ • Φ · · ΦΦ «« ΦΦΦ Μι • ••ΦΦΦΦ Φ φ ·· · · ΦΦ ΦΦ φφ φ« φφ

- 218 MALDI hmotová spektrometrie(ACH matrix): vypočteno M+H 1257, nalezeno 1258.

část c: cholesteryl-4-[4-[bis(2-chloretyl)amino]fenyl]butanoát

Do roztoku 669 mg (2,20 mmol) chlorambucilu v 15 ml bezvodého dichlormetanu se přidá 170 pl (1',,ΤΟ mmol)

DIC. Reakční směs se míchá 0,5 hodiny při teplotě místnosti, a pak se přidá do roztoku 387 mg (1,00 mmol). cholesterolu a 122 mg (1,00 mmol) DMAP v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá a vlije se na 5% roztok hydrogenuhlíčitanu sodného. Podíly se oddělí, organický podíl se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se filtruje a zahustí. Produkt se se čistí· chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci chloroformem za vzniku 560 mg bezbarvého oleje s i

výtěžkem 83%. Produkt se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 674. Struktura se ověří Ti (500 MHz), a ¹³C (125 MHz) NMR.

část d: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS, lipopeptidem obsahujícím atenolol a cholesterylesterem chlorambucilu

Do zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS, 0,5 mg výsledného produktu části b) a 0,5 mg výsledného produktu části c) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% • 0 00 » ·· ·

- 219 ·* ·«··

0000 «« glycerolu. Na reakční směs se 5 minut..působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Vzorek se filtruje a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném michadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát důkladně promyjí deionizovanou vodou.. Začlenění výsledných,..s.lo.učeni.n. části c) a b) do míkrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 pl míkrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 pl 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix)'- vrchol M+H odpovídá struktuře lipopetidu části b) a cholesteryleste.ru v části c).

část c: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.' ' ^{r S}

Příklad 58

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS, lipopetídem obsahujícím atenolol pro cílení na buňky a lipofilickým thiolesterem s kaptoprilem pro terapeutické účely.

*«*« ···· 44

- 220 část a: chráněný atenolový derivát vhodný k vazebné reakci na pevné fázi

1. metyl-4-[ (2,3-epoxy)propoxy]fenylacetát

Reakčni směs 4,98 g (0,030 mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 pl (1,5 mmol) pyridinu se 2- hodiny míchá při -teplotě 85°'C .· Reakčni směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným · roztokem chloridů sodného a suší se nad-síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ^XH (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

2. metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetát *

*

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy] fenylacetátu, 23 ml .(0,27 mol) isopropylaminu-a 1,35 ml- (74,7 mmol) vody. Reakčni směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a-suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez ·* ··

Β Β · * • · Β Β ··· ·Β Β • Β

ΒΒ Β» ♦» ΒΒΒΒ •··♦ «Β

- 221 ·· ΒΒ ♦ · · • · φ Β · • « · • · ς • Β ΒΒ dalšího čištění použije v následující syntéze.

Struktura se ověří analýzou ^:H a ¹³C NMR.

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyločtové kyseliny

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metylM-(2-hydroxy-3-[ (1-metyletyl) amino] - -propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se. Spektrum ^!H a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268.

. N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctová kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyl-etyl)amino]propoxy]fenyločtové ve .

ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol) hydrogenuhličitanu sodného v 15 ml směsi' vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 ' mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě na koloně oxidu křemičitého při eluci- směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyldikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs ¹ * se vlije na· vodu nasycenou hydrogensíraném draselným a

Φ·

- 222 φφ φφφ* • Φ *· • φ φ · φ φφφφ organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v .poměru 85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s .výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou ^:H a ¹³C NMR.

část b: lipopeptid s navázaným atenololem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc.v množství řádu 0,125 mmol, odpovídajích aminokyselin, kyseliny palmítové a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody.' Přidáním eteru vznikne sraženina surového materiálu, která se čistí preparatívní kapalinovou chromatografií při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 38 mg čistého φ» φφφφ • · φ · • φ φ ' · φφφ _ Λ Λ · ΦΦΦ

223·« ··

Μ . ·Φ • · · φ

ΦΦΦΦ Φ φ * Φ Φ «φφ • Φ Φ φ ·· ΦΦ ΦΦ

ΦΦ • Φ

Φ Φ • Φ Φ

Φ • Φ

224··*·*·· • · « 9

9 ««« • ·' · · · · « • · · · · *·

produktu.

Analytická HPLC: gradient 70—100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min, detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 25 minut).

MALDI hmotová spektrometrie(ACH matrix): vypočteno M+H 1257, nalezeno 1258.

část c: thiolester cholanové kyseliny s kaptoprilem

Reakční směs 361 mg (1,00 mmol) 5-fi-cholanové kyseliny a 77 μΐ (0,50 mmol) DIC v 5 ml dichlormetanu se 10 minut míchá. Směs se přidá do 130 mg (0,600 mmol) kaptoprilu a 180 μΐ (1,20 mmol) DBU v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá, vlije se na zředěnou kyselinu chlorovodíkovou a přidá se 30 ml chloroformu. Podíly se oddělí, organický podíl se promyjě vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Po filtraci a zahuštění se surový materiál čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 95:4:1. Produkt se lyofilizuje ze směsi acetnitrilu, vody a etanolu. Vznikne 137 mg' špinavě bílé pevné látky s výtěžkem 49%. Struktura se ověří (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR.. Hmotová spektrometrie'MALDI: m/z 584.

část d: plynem plněné mikřobubliňky tvořené DSPS a «4 44 • 4 4

4 4 • 4

• ···· • · · « • · 4 4

4· «·

lipopetidem obsahujícím atenolol pro cílení na buňky a lipofilickým thiolesterem s kaptoprilem pro terapeutické účely

Do zkumavky obsahující 5,0 mg DSPS, 0,5 mg výsledného produktu části c) a 0,5 mg výsledného produktu části b) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem. Reakční směs se 5 minut se protřepává a zahřívá k 80°C, a pak se zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se neprokáže detekovatelné množství produktů částí b) a c) v konečné prací lázni. Začlenění výsledných sloučenin částí b) a c)· do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix) - výsledky odpovídají struktuře produktů částí b) a c) .

část e: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.

9· toto • < · · .

• • to ««toto to to · toto · to · · · ·

*. to

226

Příklad 59

Plynem plněné mikrobublinky obsahující fosfatidylserin a biotinamid-PEG-ů-Ala-cholesterol a cholesterylester chlorambucilu pro diagnostické a terapeutické použití část a: cholesteryl N-Boc-6-alaninát

V atmosféře inertního plynu se do roztoku 1,25 g (6,60 mmol) Boc-O-Ala-OH v 15 ml dichlormetanu se přidá 510μ1 DIC. Reakční směs se 30 minut míchá, a pak se přemístí do nádoby obsahující roztzok 1,16 g (3,00 mmol) cholesterolu a 367 mg (3,00 mmol) DMAP v 15 ml dichlormetanu. Reakční směs se 2 hodiny míchá, vlije se do vodného roztoku hydrogensíranu draselného a po oddělení podílů ř

se vodný podíl extrahuje chloroformem. Sloučené organické podíly se promyjí vodným roztokem hydrogensíranu draselného a vodou a suší se nad síranem hořečnatým. Po filtraci a odpařování se surový produkt čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého pří eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 99:1 za vzniku 1,63 g bílé pevné látky výsledné sloučeniny s výtěžkem 97%..

Struktura se ověří ^LH (500 MHz).

¹ ' '1 část b: hydrochlorid cholesteryl-ů-alaninátu

V 5 ml 1M roztoku kyseliny chlorovodíkové v 1,4-dioxanu se při teplotě místnosti 4 hodiny míchá 279 mg (0,500 »· «·«·

- 227 mmol) výsledného produktu Části a). Reakční směs se zahustí za vzniku kvantitativního výtěžku hydrochloridu cholesteryl-B-alanínátu. Struktura se ověří ^XH (500 MHz) a hmotovou spektrometrií MALDI: M+Na nalezeno 482, vypočteno 481.

část c: biotin-PEG_340ů-ft-Alanin-cholesterol

I

Do roztoku 15 mg (0,03 mmol) cholesteryl-ň-alanínát-hydrochloridu ve 3 ml směsi chloroformu a vodného metanolu v poměru 2,6:1 se přidá 42 μΐ (0,30 mmol) trietylaminu. Reakční směs se 10‘minut míchá při teplotě místnosti a po kapkách se přidá roztok 100 mg (0,03 mmol) biotin-PEG_340D-NHS v 1 ml 1,4-dioxanu. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se směs dosucha odpaří a zbytek se čistí rychlou chromatografií za vzniku 102 mg bílých krystalů s výtěžkem 89%. Struktura produktu se ověří MALDI-hmotovou spektrometrií a NMR.

část d: choiesteryl-4-[4-[bis(2-chloretyl)amino] fenyl]butanoát

Do roztoku 669 mg (2,20 mmol) chlorambucilu v 15 ml bezvodého dichlormetanu se přidá 170 μΐ (1,10 mmol)

DIC. Reakční směs se míchá 0,5 hodiny při teplotě místnosti, a pak se přidá do roztoku 387 mg (1,00 mmol) cholesterolu a 122 mg (1,00 mmol) DMAP v 10 ml dichlormetanu. Reakční směs se přes noc míchá a vlije ·*·· ·· 44 «

«44 4 » 4 4 • 4 • 4 4 4

4 > 4 • 44 « · • 4 ♦ 4 · • 444 44

- 228 se na 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného. Podíly se oddělí a organický podíl se promyje nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se filtruje a zahustí. Produkt se čistí chromatografíí na koloně oxidu křemičitého při eluci chloroformem za vzniku 560 mg bezbarvého oleje s výtěžkem 83%. Produkt se analyzuje hmotovou spektrometrií MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 634. Struktura se ověří ^rH (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR.

část e: plynem plněné mikrobublinky

Do zkumavky obsahující 5 mg‘DSPS, 0,5 mg produktu části c) a 0,5 mg výsledného produktu části d) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, a pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo dětekovatelné množství výsledných sloučenin částí c) ad). Začlenění výsledných sloučenin c) a d) do mikrobublinek se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté

J, zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzuje se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix) ·* ·»·» • ♦ 9 • · • · • ♦ · • ••Φ ΦΦ

- 229 • V α· • · · • · ··* • · · · * φ • * · ♦ ·· ·· ΦΦ ► * · · *·· οι • · ««

- vrchol M+H odpovídá struktuře produktů částí c) ad).

t

Příklad 60

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím derivát bestatinu pro diagnostické a terapeutické účely část a: lipopeptid obsahující derivát bestatinu

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Emoc v množství řádu 0,125 mmol) odpovídajích aminokyselin a kyseliny palmítové. Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Přidáním eteru vznikne sraženina surového materiálu, která se čistí preparativní kapalinovou chromatografií při eluci * gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 12 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = ···· ··

- 230 ·· ···· ·· ·· I»·· .··.

·· · ··· 1 ί 1 ϊ * · .···· * · · · * * - — I * Α * * * * *

I · * « ·* ♦ ·

49· 944 ·

• · ·

ftftftft ·· ftft « · · · ftftft · ftft · » ftft I ftft ftft

0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min, detekce v UV 214 nm - doba retence produktu =25 minut).

MALDI hmotová spektrometrie(ACH matrix): vypočteno M+H 1315, nalezeno 1314.

část b: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím derivát bestatinu pro diagnostické a terapeutické účely.

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C.a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledné sloučeniny části a). Začlenění výsledného produktu části a) se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix)

- vrchol M+H při 1320 (vypočteno 1314) odpovídá struktuře produktu části a).

• « • ·

- ais.’-,.· část c: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 61

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím derivát chlorambucilu pro diagnostické a terapeutické účely.

část a: lipopeptíd obsahující derivát chlorambucilu

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol, odpovídajích aminokyselin a kyseliny palmitové. Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Při DIC preaktivaci se chlorambucil váže na Lys postranní řetězec jako symetrický anhydrid. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin z postranního- řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT, 5% etyl-metylsulfidu a 5%· vody.

Podíl 10 mg surového materiálu se čistí preparativní kapalinovou chromatografií při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% * * ♦ »·· • · . · * * « «· »· ·* ··

«· ·· > · · ) · 0 0 · • 0 *«

0· · *·*·

- 23*Γ-·· vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 30 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20. minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychl-ost průtoku 1 ml/min, detekce v UV 214 nm - doba retence •produktu = 26,5 minut).

MALDI hmotová spektrometrie(ACH matrix): vypočteno M+H 1295, nalezeno 1294.

část b: plynem·plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem obsahujícím derivát chlorambucilu pro diagnostické a terapeutické účely.

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části a) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se '5 minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí’. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném michadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledné sloučeniny části a). Začlenění výsledného produktu části a) se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 pl míkrobublinek se přenese do • fc ···· ·* *· · fcfc ·· fc fcfcfc fcfcfc· • · · fcfcfc· · fcfc ·

čisté zkumavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix): vypočteno M+H 1294, nalezeno M+H 1300, M+Na vypočteno 1317, nalezeno 1324.

část c: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 62

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopetidem obsahujícím atenolol a lipofilický derivát kaptoprilu pro terapeutické a diagnostické účely.' i

část a: chráněný atenolový derivát vhodný k vazebné reakci na pevné fázi

1. metyl-4-[(2,3-epoxy}propoxy]fenylacetát ¹ Ί*

Reakční směs 4,98 g (0,030· mol) metyl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 μΐ (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85°C. Reakční směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý «» φφ «φ φφ fl fl φ φ flflflfl φ · flflflfl φ φφ φ φ φ φ · φ φ φ • «φ φφ «φ φφ

- 236 zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako.bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ^lH (300 MHz) a' ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

2. metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetát

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyi-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetátu, ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) vody. Reakční směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze.

Struktura se ověří analýzou \H a ¹³C NMR.

3. hydrochlorid 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny

Při teplotě 100°C· se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny * · · ft •ftft· ·· · ftft ·· • ··«< ftftftft • * ftft·· · ·· · • •«•ftft · · • ft ·♦ ·♦ ftft ftft

- 237 chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se. Spektrum ^XH a ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268 .

4., . N-Boc-4-[2-hydroxy-3-.[ (1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyl-etyl)amino]propoxy] fenyloctové ve 2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol) hydrogenuhličitanů sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1. Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2 mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografíí na tenké vrstvě na koloně

Joxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyldikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší Se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí chromatografíí na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu á kyseliny octové v poměru 85:10:5. Roztok se zahustí, vytvořený zbytek se zpracuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%.

• fc fcfcfcfc « · ♦ fc • · «fcfc· ·»····· * · ···· fcfc ·· fcfc fcfc fcfc

- 238 Struktura se ověří analýzou ³H a ¹³C NMR.

část b: lipopeptid s navázaným atenololem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol, aminokyselin, kyseliny pálmitové a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidu-z pryskyřice a ochranných skupin z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Přidáním eteru vznikne sraženina surového materiálu, která se čistí preparativní kapalinovou chromatografii při eluci gradientem rozpouštědel od 70 do 100% B během 60 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu) při rychlosti průtoku 10 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 38 mg čistého produktu.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min, detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 25 minut).

MALDI hmotová spektrometrie(ACH matrix): vypočteno M+H 1257, nalezeno 1258.

část c: N-[ (Ξ)-3-hexadecylthio-2-metylpropionyl]prolin • · ···· • ·

« · · fcfc · • fc · · fcfc ·· • · · fcfcfc fcfcfc* * · fcfcfc·· fcfcfcfc • fcfcfc fc · ·« «fcfc fcfcfc fcfcfcfc··· · · fcfcfc* fcfc fcfc fc* ·· fcfc

- 240 Do roztoku 176 mg (0,500 mmol) 1-jodhexadekanu, 120 mg (0,550 mmol) kaptoprilu a 165 μΐ (1,10 mmol) DBU v 5 ml tetrahydrofuranu se přidá 188 μΐ (1,10 mmol) DIEA. Reakční směs se 2 hodiny zahřívá na teplotu 70°C, a pak se zahustí. Vytvořený zbytek se vlije na vodu nasycenou hydrogensíranem draselným a organický podíl se extrahuje chloroformem. Organický podíl se promyje vodou a suší se nad síranem hořečnatým. Surový produkt se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Produkt se lyofilizuje za vzniku 105 mg špinavě bílé pevné látky s výtěžkem 48%. Struktura Se ověří ^:H (500 MHz) a ¹³C (125 MHz) NMR. Hmotová spektrometrie MALDI: m/z vypočteno a nalezeno 440.

část d: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopetidem obsahujícím atenolol a lipofilickým derivátem kaptoprilu pro terapeutické a diagnostické účely !

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS, 0,5 mg výsledného produktu části b) a 0,5 mg výsledného produktu části c) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu- a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 8Q°C a zchladí. Prostor nad reakční směsi se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou.vodou. Hmotovou «φ «φφφ

- ···· φφ

- 241 ► · · « • Φ φφ spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledných sloučenin částí b) a o). Začlenění výsledného produktu částí b) a c) se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 pl mikrobublinek se přenese do čisté zkumavky obsahující přibližně 100 pl 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou spektrometrií MALDI (ACH matrix)

- vrchol M+H odpovídá struktuře produktů částí b) a c).

část e: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 63

Plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a cholesterolovým derivátem atenololupro diagnostické a terapeutické použití část a: metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetát

Reakční směs 4,98 g (0,030 mol) metýl-4-hydroxyfenylacetátu, 23,5 ml (0,30 mol) epichlorhydrinu a 121 pl (1,5 mmol) pyridinu se 2 hodiny míchá při teplotě 85°C. Reakční směs zchladí a přebytek epichlorhydrinu se odstraní destilací na rotačním odpařovači. Vzniklý • 0 • 0 00 «·,0 00 00 000 000 • 00 0000 0 0 0000 00 00 00 00 00

- 242 zbytek se zpracuje etylacetátem, promyje se nasyceným roztokem chloridu sodného a suší se nad síranem sodným. Roztok se filtruje a zahustí. Vytvořený tmavý zbytek se čistí chromatografii na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí hexanu a etylacetátu v poměru 7:3 za vzniku 2,25 g jako bezbarvého oleje s výtěžkem 34%.

Spektra ³H (300 MHz) a ¹³C NMR (75 MHz) odpovídala struktuře sloučeniny.

část b: metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino] propoxy]fenylacetát

Při teplotě místnosti se přes noc míchá směs 2,00 g (9,00 mmol) metyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]fenylacetátu, ' 23 ml (0,27 mol) isopropylaminu a 1,35 ml (74,7 mmol) vody. Reakční směs se v rotačním odpařovači zahustí, zbytek jako olej se rozpustí v chloroformu a suší se nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním se získá kvantitativní výtěžek žlutého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následující syntéze.' Struktura se ověří analýzou ^XH a ¹³C NMR.

část c: hydrochlorid' 4-[2-hydroxy-3- [(1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctové kyseliny

Při teplotě 100°C se 4 hodiny míchá roztok 563 mg (2,00 mmol) metyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy ] fenylacetátu v 15 ml 6M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí v rotačním odpařovači a zbytek se zpracuje vodou a lyofilizuje se. Spektrum ³H a »1 ·Μ* ·· 44 44 »4

4» 4 444 4444 · 4 4 · 4 4 4 4 4 · • 4 4 · 44 44 444 444 • 044444 4 4

4444 44 44 44 44 44

- 243 ¹³C NMR bylo v souladu se strukturou. Hmotová spektrometrie MALDI: vypočteno a nalezeno M+H 268.

část d: N-Boc-4-‘[2-hydroxy-3-[ (1-metyletyl) amino]propoxy]fenyloctová kyselina

Roztok 2,0 mmol hydrochloridu kyseliny 4-[2-hydroxy-3[(1-metyl-etyl)amino]propoxy]fenyloctové ve -2 ml vody se přidá do roztoku 0,60 g (7,2 mmol) hydrogenuhličitanu sodného v 15 ml směsi vody a dioxanu v poměru 2:1 Následně se přidá roztok 0,48 g (2,2'mmol) di-terc.butyl-dikarbonátu v 5 ml dioxanu. Reakce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě na koloně oxidu křemiči tého při elucí směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Di-terc.butyl-dikarbonát se přidává do ukončení reakce. Reakční směs se vlije vodu nasycenou hydrogensíranem.draselným a organický materiál se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, suší se nad síranem sodným a filtruje se za vzniku 0,6 g surového produktu. Tento produkt se čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 85:10:5. Roztok se zahustí a vytvořený zbytek se zpracuje ledovou,kyselinou octovou a lyofilizuje se. Vznikne 415 mg bílé pevné látky s výtěžkem 56%. Struktura se ověří analýzou ^ΤΗ a ¹³C NMR.

část e: cholesteryl N-Boc-B-alaninát »· tototo· ·· »· to· to · · · • · « to · · * — 24*4··-*»·

V atmosféře inertního plynu se do roztoku 1,25 g (6,60 mmol) Βοο-β-Ala-OH v 15 ml dichlormetanu se přidá 510μ1 DIC. Reakční směs se 30 minut míchá, a pak se přemístí do nádoby obsahující roztzok 1,16 g (3,00 mmol) cholesterolu a 367 mg (3,00 mmol) DMAP v 15 ml dichlormetanu. Reakční směs se 2 hodiny míchá, vlije se do vodného roztoku hydrogensíranu draselného a po oddělení podílů se vodný podíl extrahuje chloroformem. Sloučené organické podíly se promyjí vodným roztokem hydrogensíranu draselného a vodou a suší se nad síranem hořečnatým. Po filtraci a odpařování se surový produkt čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého při eluci směsí chloroformu a metanolu v poměru 99:1 za vzniku 1,63 g bílé pevné látky výsledné sloučeniny s výtěžkem 97%. Struktura se ověří ^ΣΗ (500 MHz).

část f: hydrochlorid cholesteryl-ů-alaninátu

V 5 ml ÍM roztoku kyseliny chlorovodíkové v 1,4-dioxanu se při teplotě místností 4 hodiny míchá 279 mg (0,500 mmol) výsledného produktu části a). Reakční směs se zahustí za vzniku kvantitativního výtěžku hydrochloridu cholesteryl-Ů-alaninátu. Struktura se ověří ^ΧΗ (500 MHz) a hmotovou spektrometrií MALDI: M+Na nalezeno 482, vypočteno 481.

část g: cholesteryl N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl) amino]propoxy]fenylacetyl-ň-alaninát

4444 ·* 44 ·· 44 * * · · 4 4 44·· • 4 4 4 ··· · 4 4 4

4 4 4 4 4 44 4*4 «44

4 4 · 4 4 4 4

4*44 44 44 4« *4 44

- 245 Do roztoku 55 mg (0,15 mmol) 4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenyloctové kyseliny a 74 mg (0,15 mmol) cholesteryl Ν-Βοο-β-alaninátu v 5 ml DMF se přidá 26 ml (0,15 mmol) DIEA. Přidá se 23 mg (0,15 mmol) HOBt a 29 mg (0,15 mmol) ve vodě rozpustného karbodiimidu. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti a vlije se na 25 ml vody, která obsahuje 2,5 g uhličitanu sodného a 4,0 g chloridu sodného. Vytvořená sraženina se extrahuje chloroformem. Organický podíl se promyje vodou a suší se nad síranem hořečnatým. Po filtraci a zahuštění se 132 mg surového produktu čistí chromatografií na koloně oxidu křemičitého pří eluci směsí chloroformu, metanolu a kyseliny octové v poměru 95:4:1. Podíly se zahustí, zpracují se v ledové kyselině octové a lyofilizují se. Vznikne 83 mg žlutobílé pevné látky. Struktura se ověří NMR.

část h: cholesteryl-4-[2-hydroxy-3-[(1-metyletyl)amino]propoxy]fenylacetyl-B-alaninát trifluoracetát

Do roztoku 40 mg (0,05 mmol) cholesteryl-4-[2-hydroxy-3- [ (1-metyletyl) amino] propoxy] fenylacetyl-B-alaninátu ve 4 ml bezvodého dichlormetanu se přidají 2 ml kyseliny trifluoroctové. Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti, a pak se zahustí. Produkt se lyofilizuje ze směsi acetnítrilu a vody za vzniku žlutobílého materiálu v kvantitativního výtěžku. Produkt se ověří hmotovou spektrometrií MALDI: M+H vypočteno a

4444

44 ·· 44 • ♦ · 4 » · 4 » fl 4 • * · · ··· 4 4 4 4 • · » · · · 4 4 444444 · · 4 4 4 4 4 · • 444 44 «4 44 44 44

- 246 nalezeno 708.

část i: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a cholesterolovým derivátem atenololu pro diagnostické a terapeutické použití

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného produktu části h) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakčni směs se 5 minut působí ultrazvukem, pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí. Prostor nad reakčni směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát promyjí deionizovanou vodou. Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledné sloučeniny části b). Začlenění výsledného produktu části h) se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií.

část j: zkouška in vitro

Mikrobublinky se pozorují zkouškou in vitro, popsanou v příkladě 21. Dojde k postupnému shlukování mikrobublinek vázaných na buňky.

Příklad 64

Víceúčelové plynem plněné mikrobublinky potahované transferinem a avidinem pro cílené ultrazvukové • ·» ·

4· ··

- 247 · ·

4444 ··

4 44

4 44 zobrazení

Příklad popisuje přípravu mikrobublinek obsahujících vektory pro cílené ultrazvukové vyšetření a k terapeutickým účelům.

část a: lipidová molekula s navázaným thiolem:. dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys.OH

Lipidová struktura se připraví na automatickém syntezátoru peptidů ABI 433A za použití pryskyřice Fmoc-Cys(Trt)Wang v množství řádu 0,25 mmol a předem vyrobených zásobníků aminokyselin s obsahem 1 mmol. Všechny aminokyseliny a kyselina palmitová se před vazebnou reakcí aktivují za použití HBTU. Současné odstraňování peptidů z pryskyřice a postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody za vzniku 250 mg surového produktu. Preparativní HPLC se čistí 40 mg podíl tohoto surového materiálu při eluci gradientem rozpouštědel od 90 do 100% B během 50 minut (A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové a B = metanol) při rychlosti průtoku 9 ml/min. Po lyofilizaci vznikne 24 mg čistého produktu.

'Analytická HPLC: gradient 70-100% Β (B = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,01% vodný roztok kyseliny trifluoroctové: detekce v UV 214 nm doba retence produktu = 23 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H 1096,

NH,

O

- 249

9 · · · · 9 · · * • · · * · · • 9 9 9999

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 nalezeno 1099.

část b: mikrobublinky plněné plynem tvořené DSPS dopovaným lipidovou strukturou obsahující thiol

Do čisté zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného lipopeptidu vyrobeného v části a) se přidá 0,8 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4%-glycerolu ve vodě. Reakční směs se současně 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C. Ještě horký se filtruje přes 4.0 mikron filtr. Vzorek se zchladí na teplotu místnosti a prostor nad reakční směsí se naplní perfluorbutanem. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle a přes noc se uloží na výkyvnou třepačku. Vytvořené mikrobublinky se několikrát promyjí deionizovanou vodou a začlenění thiolové skupiny se analyzuje Ellmanovým činidlem·.

Část c: modifikace transferinu a avidinu pomocí fluorescein-NHS a sulfo-SMPB

Do směsi 2 mg lidského transferinu (Holo) a 2 mg avídinu v 1 ml PBS se přidá 0,5 ml roztoku DMSO obsahujícího 1 mg sulfo-SMPB a 0,5 mg fluorescein-NHSReakční ^;směs se 45 minut*míchá při teplotě místnosti, a pak -se nechá pro- jít přes kolonu Sephadex 200 při elucí PBS. Proteinový podíl se sebere a skladuje se pří teplotě 4 oc.

část d: konjugace mikrobublinek s modifikovanými transferinem a avidinem

4

- 250 · 44· 4 ·» ·« • · * · 4 · » 4 4444 « 4 4·*«· • 4 · · 4 · ♦ • •4« 44 44 44

Do mikrobublinek obsahujících thiol (část b) se přidá 1 ml modifikovaného proteinového roztoku transferinu a avidinu proteinu popsaného v části c). Hodnota pH se upraví na 9 a.konjugace probíhá 2 hodiny při teplotě místnosti. Po důkladném promytí deionizovanou vodou se mikrobublinky analyzují na počítači Coulter Counter (81% mezí 1 a 7 mikrony) a fluorescenční mikroskopií (vysoce fluoreskující mikrobublinky).

Příklad 65

Přenos genu plynem plněnými mikrobublinkami

Příklad ja zaměřen na přípravu cílených mikrobublinek pro genový přenos.

část a: plynem plněné mikrobublinky tvořené DSPS a lipopeptidem potahovaným poly-L-lysinem

Do dvou zkumavek obsahujících 4,5 mg DSPS a 0,5 mg výsledného lipopeptidu příkladu 41 se přidá 0,8 ml 4% roztoku propylenglykol-glycerolu ve vodě. Roztoky se zahřívají 5 minut na teplotu 80°C, protřepávají se, zchladí se na teplotu místnosti a prostor nad' disperzí se naplní perfluorbutanem. Uzavřená zkumavka se 45 sekund protřepává v ponorném míchadle při frekvenci

4450 kmitů za minutu, a pak se na 5 minut umístí na výkyvnou třepačku. Po 5 minutách centrifugace rychlostí • φ φφφφ ··

- 251 * · ·· φ ·

2000 otáček za minutu se infranatant odstraní a objem se doplní destilovanou vodou. Promývací procedura se znovu opakuje. Ve 2 ml vody se rozpustí 20,6 mg hydrobromidu poly-L-lysinu, a pak se 0,4 ml podíl roztoku zpracuje 2 ml vody. Do 1,2 ml ředěného polylysiriového roztoku se přidá 0,12 ml suspenze mikrobublinek tvořených DSPS a.lipopeptidem.. Po inkubaci se přebytek polylysinu odstraní důkladným . promýváním vodou.

část b: přenos genetického materiálu do buněk

V kultivačních nádobách s 6 prohlubněmi se pěstují endoteliálníbuňky ECV 304 za vzniku jedné souvislé vrstvy buněk. Připraví se směs pro přenos genetickíého materiálu obsahující 5 pg DNA (zeleně fluoreskující proteinový vektor fi CLONTECH) a 50 pl suspenze mikrobublinek vyrobené v části a) v živném prostředí RPMI v množství do 250 pl celkového objemu. Reakční směs se nechá 15 minut stát při teplotě místnosti, a pak se přidá 1 ml kompletního živného prostředí RPMI. Živné prostředí se odstraní z kultivačních misek a k buňkám se přidá směs DNA a mikrobublinek. Buňky se inkubují, v inkubátoru buněčných kultur při teplotě 37°C.

část c·: působení ultrazvukem.

Po 15 minutách inkubace se na vybrané prohlubně působilo 30 vteřin kontinuálním ultrazvukovým vlněním s

4 ··»» « 4 • 4 · ·

- 252 • 4 4 4 • 4 4 * *4 4

4*44444 4 4

44·« 44 4 · 44 44 ·· frekvencí 1 MHz (0,5 W/cm²) .

část d: inkubace a vyhodnocení

Buňky se dále přibližně 4,5 hodiny inkubují v inkubátoru pro buněčné kultury při teplotě 37°C. Živné prostředí obsahující směs DNA a mikrobublinek se odstraní odsátím a 'přidají se 2 ml živného prostředí RPMI. Buňky se nejprve 40-70 hodin inkubují, živné prostředí se z větší části odstraní a buňky se sledují fluorescenční mikroskopií. Výsledky se porovnávají s výsledky kontrolních zkoušek, při kterých se do buněk přidá DNA nebo směs DNA a polylysinu.

Příklad 66

Mikrobublinky způsobující vznášení endoteliálních-· buněk, specifická vazba mikrobublinek vektory k enďoteliálním buňkám

Příklad popisuje, jak podle současného vynálezu lze mikrobublinky použít k oddělení buněk, na které jsou mikrobublinky cílené. V kultivační misce Nunc (chutney 153732) se na živném prostředí RPMI 1640, do kterého se přidá 200 mM L-glutaminu, směs 10000 U/ml penicilinu a 10000 pg/ml streptomycinu- a 10% fetálního hovězího séra, se kultivuje lidská endoteliální buněčná linie ECV 304 odvozená z .normální pupeční šňůry (ATCC · · • · · ·

- 253 » · to 4 toto toto

CRL-1998). Buňky se kultivují s následnou trypsinací v poměru od 1:5 do 1:7 k dosažení souvislé vrstvy. Do každé sady pěti centrifugačních zkumavek se přidají 2 miliony buněk trypsinované souvislé vrstvy buněk. Následně se připraví kontrolní mikrobublinky a mikrobublinky navázané k endoteliálním buňkám podle příkladu 21 a příkladu 38, když do každé zkumavky se ..přidá 2, 4, 6, 8 nebo 10 milion bublinek. Po 5 minutách centrifugace rychlostí 400.g se buňky na dně zkumavek sledují počítačem Coulter Counter. Čtyři nebo více mikrobublinek navázaných na buňku způsobilo přemístění buňky k hladině tekutiny v centrifugační zkumavce. Výsledné mikrobublinky přikladu 38 způsobily vznášení všech buněk, zatímco mikrobublinky příkladu 21 způsobily vznášení buněk jen z 50%.

Příklad 67

Plynem plněné mikrobublinky distearoyl-fosfatidylserinu obsahující lipopeptíd obsahující vektorem s afinitou k endotelinovým receptorům pro cílené ultrazvukové vyšetření.

to část a: 4 '- [ (3,4-dímetyl-5-isoxazolylj sulfamoyl] sukcinanílinová kyselina

Do rbztoku'267 mg (1,00 mmol) sulfisoxazolu v 10 ml DMF se přidá 1,00 g (10,0 mmol) anhydridu kyseliny »**· ·» · Β ·· 00 • · · 000 0 · · « 0 0 0 000« 0 00 0 0 000 00 0· 000 000 0000000 0 0 0000 00 00 00 0· 00

- 254 sukcinové a 122 mg (1,00 mmol) 4-dimetylaminopyridinu. Reakční směs se 2 hodiny míchá při teplotě 80°C, a pak se zahustí. Vytvořený zbytek se zpracuje 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje se etylacetátem. Vodný roztok se okyselí zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a organický podíl se extrahuje etylacetátem. Organický podíl se dále promyje zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, zpracuje se na aktivním uhlí a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se filtruje a zahustí za vzniku 280 mg bílé pevné látky s výtěžkem 76%. Struktura sloučeniny se ověří (300 MHz) a ¹³C(75 MHz) spektroskopií. Hmotová spektrometrie MALDI (ACH matrix):vypočteno a nalezeno - vrchol H+Na při m/z 390 a vrchol M+K při m/z 406.

část b: lipopeptid s navázaným sulfisoxazolem

Sloučenina shora uvedené struktury se připraví za použití manuálního přístroje k probublávání dusíkem, pryskyřice Rink Amide MBHA chráněné Fmoc v množství řádu 0,125 mmol, odpovídajících aminokyselin, palmitové kyseliny a výsledné sloučeniny části a). Vazebná reakce se provede podle standartních TBTU/HOBt/DIEA postupů. Současné odstraňování peptidu z pryskyřice a ochranných skupin 'z postranního řetězce se provádí 2 hodiny ve směsi kyseliny trifluoroctové obsahující 5% EDT a 5% vody. Surový materiál se zpracuje eterem.

Analytická HPLC: gradient 70-100% B během 20 minut (B =

• · * ·

- 256 • » » fc fc · > fcfc 1 ·« fcfc

0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetnitrilu, A = 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové, rychlost průtoku 1 ml/min: detekce v UV 214 nm - doba retence produktu = 27 minut).

MALDI hmotová spektrometrie: vypočteno M+H při m/z 1356, nalezeno 1359.

část c: plynem plněné mikrobublinky tvořené výslednou sloučeninou části b)

Do zkumavky obsahující 4,5 mg DSPS a 0/5 mg výsledného produktu části b) se přidá 1,0 ml roztoku 1,4% propylenglykolu a 2,4% glycerolu. Na reakční směs se 5 minut působí ultrazvukem, ‘ pak se 5 minut protřepává a zahřívá k 80°C a zchladí. Prostor nad reakční směsí se naplní plynem perfluorbutanu. Zkumavka se 45 vteřin protřepává v ponorném míchadle, načež se vytvořené mikrobublinky několikrát důkladně promyjí deionizovanou vodou'.' Hmotovou spektrometrií MALDI se v konečném promývacím roztoku neprokázalo detekovatelné množství výsledné sloučeniny části b). Začlenění výsledného lipopetidu části b) obsahující isoxazol se potvrdí MALDI hmotovou spektrometrií následovně: přibližně 50 μΐ mikrobublinek se přenese do čisté zku- mavky obsahující přibližně 100 μΐ 90% roztoku metanolu. Na směs se 30 vteřin působí ultrazvukem a analyzují se hmotovou'spektrometrii MALDI (ACH matrix): nalezeno - vrchol M+H při m/z 1359 odpovídající výslednému lipopeptidu části b).

Zastupuje:

9« « * · 4 · • 4 9 9

4 9 4

19»·

- 257 • * * 444 9 9 9

I 9 9 1 «· 44

Claims (34)

1. Diagnostický, a/nebo léčebný prostředek s možností zacílení, vyznačující se tím, že je tvořen suspenzí vodné nosné kapaliny a reportéru, tvořeného mikrobublinkami, vyplněnými plynem a stabilizovanými vrstvou filmotvorného smáčedla, přičemž prostředek dále obsahuje nejméně jeden vektor.

2. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje vzduch, dusík, kyslík, oxid uhličitý, vodík, inertní plyn, fluorid sírový, hexafluorid selenu, uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností, keton, ester, halogenovaný'uhlovodík s nízkou molekulovou hmotností nebo směs uvedených látek,

3. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje perfluorovaný keton,, perfluorovaný ether nebo perfluorovaný uhlovodík.

4. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako plyn obsahuje fluorid sírový nebo perfluorpropan, perfluorbutan nebo i

perfluorpentan.

5. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 4, vyznačuj ící sě tím., že jako filmotvorné smácedlo obsahuje nepolymerní a nepolyme-rizovatelný materiál smáčedla pro tvorbu stěn bublinek, polymerní smácedlo nebo fosfolipid.

r

6. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 5,vyznačující se tím, že nejméně 75 % '· · · ·

F fcfc ·

I · · · ♦ ··· « · ► · * ·

- 258 ·· »» filmotvorného smáčedla je tvořeno molekulami fosfolipidů, nesoucími náboj.

7. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 6,vyznačující se tím, že alespoň 75 % filmotvorného smáčedla je tvořeno jedním nebo větším počtem fosfolipidů se skupiny fosfatidylseriny, fosfatidylglyceroly, fosfatidylinositoly, fosfatidové kyseliny -a kardiolipiny.

8. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 7,vyznačující se tím; že nejméně 80 % fosfolipidů je tvořeno fosfatidylseriny.

9. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 8,vyznačující se tím, že filmotvorné smáČedlo je tvořeno lipopeptidem.

10. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 9,vyznačující se tím, že. se vektor volí ze skupiny protilátky, molekuly, schopné přilnout k buňkám, receptory pro molekuly, schopné přilnout k buňkám, cytokiny, růstové faktory, pěptidové hormony a jejich části, látky nepeptidové povahy sagonistickým něbo antagonis tickým účinkem a biologicky neúčinné látky pro vazbu na recep tory pro molekulu, schopné přilnout k buňkám, cytokiny, růstové faktory a pěptidové hormony, oligonukleotidy a modifikované oligonukleotidy, účinné látky, schopné se vázat na DNA, substráty a inhibitory proteázy, molekuly, vytvořené, z kombinačních bank a malé biologicky účinné molekuly.

11. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 10,vyznačuj ící se tím, že vektor nebo vektory mají afinitu pro cílové struktury a dostávají se s nimi do interakce, avšak nejsou na tyto cílové struktury pevně vázány.

• · ·· • «44 ·* 44 ······· ft ·

444 ·· 44 44 ·· ' 4·

259

12. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 11,vyznačující se tím, že vektor nebo vektory se volí z vazných látek pro bílkoviny, schopné adheze na buňky a z bílkovin, které mají odpovídající vazné řetězce na endothelovém buněčném povrchu.

13. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 12, v y z na č-u j í c í se tím, že vektor nebo vektory jsou uloženy tak, že nejsou přímo vystaveny cílové struktuře.

14. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek.podle nároku 1 až 13,vyznačující se tím, že vektor nebo vektory jsou vázány nebo spojeny s reporterern pomocí interakcí avidin-biotin a/nebo streptavidin-biotin.

'4;

15. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 14,vyznačující se tím, že vektor nebo vektory mohou být s reporterern spojeny nebo na něj vázány kovalentním nebo nekovalentním způsobem.

16. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že vektor je spojen s reporterern nebo je na něj vázán pomocí interakce elektrostatických nábojů.

17. Diagnostický a/riebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 16,vyznačující se tím, že dále obsahuje skupiny, které jsou radioaktivní nebo účinné jako kontrastní látky pro rtg-zobrazování, jako sondy pro zobrazování světlem nebo jako spinové značení.

18. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle některého z nároků 1 až 17,vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje léčivo.

Φ φ «φφφ φ φ 4 « Φ 4 * ·Φ φφ «φφφ φφ φ · φ · φ φφφφ *«

- 260 ι.

19.. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že jako léčivo obsahuje antineoplastickou látku, krevní produkt, látku, modifikující biologickou odpověď, antifungální· látku, hormon nebo jeho analog, vitamin, enzym, antialergickou látku, inhibitor tkáňových faktorů, inhibitor krevních destiček, inhibitor cílové koagulační bílkoviny, inhibitor tvorby fibrinu, promotor fibrínolýzy, antiangiogenní látku, látku pro ovlivnění oběhového systému, potenciátor metabolismu, antituberkulotickou nebo protivirovou látku,, vasodilatační látku, antibiotikum, protizánětlivé látky, látky s účinkem proti prvokům, antirheumatické látky, narkotika, opiáty, srdeční glykosidy, blokátory nervosvalového přenosu, sedativa, místní anestetika, celková.anestetika nebo genetický materiál.

20· Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 18 nebo Í9, vyznačující se tím, že léčivo je kovalentne vázáno nebo spojeno s reportérem pomocí disulfidových skupin.

21. Diagnostický a/nebo léčebný prostředek podle nároku 18‘nebo 19, vyznačující se tím, že obsahuje lipofilní nebo lipofilnějderivatizované léčivo, vázané na reportér pomocí hydrofobních interakcí.

22. . Kombinovaný prostředek, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje

i) první složku, tvořenou předem zacíleným vektorem s afinitou pro zvolenou cílovou strukturu a ii) druhou složku, tvořenou prostředkem podle některého z nároků 1 až '21, přičemž tento prostředek obsahuje vektor s afinitou pro předběžně zacílený vektor.

261

23. Kombinovaný prostředek podle nároku 22, v y 2 n a Sující se tím, ze jako předem zacílený vektor obsahuje monoklonální protilátku.

2.4 .Kombinovaný prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje

i) první složku, kterou je prostředek podle některého z nároků 1 až 21 a ř

ii) druhou složku, tvořenou látkou, schopnou odštěpit nebo uvolnit uvedený prostředek z jeho cílové struktury.

25. Kombinovaný prostředek, vyznačující se t í m , že obsahuje

i) první složku, tvořenou prostředkem podle nároku 20 a ii) druhou složku, obsahující redukční činidlo, schopné ·, reduktivně štěpit disulfidové skupiny nebo spojit léčivo a reportér v první složce.

26. Způsob výroby diagnostického a/nebo léčebného prostředku s možností zacílení podle nároku 1, vyznačující se tím, že se spojí nebo naváže nejméně jeden vektor ná reportér, tvořený, mikrobublinkami, vyplněnými plynem a stabilizovanými vrstvou smáčedla, vytvářejí— čího film nebo· se vytvoří mikrobublinky reportéru, naplněné plynem, při použití filmotvorného smáčedla s nejméně jedním, navázaným vektorem.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačuj íc í tím, že na reportér je rovněž navázáno léčivo.

• φ · ♦ φ * • Φ φ* φφ φφ • Φ · φφφ φφφφ φ φ φ φ φ φφ «φφφ φ φφφ φφ φφ φφφ φφφ • φ φ φ φ φ φ · φ

ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ ·· ΦΦ Μ

- 262 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se t í m , že se sloučenina s léčebným účinkem, obsahující thiolové skupiny naváže na vrstvu, smáčedla s obsahem thiolových skupin, stabilizujícího mikrobublinky reportéru, vyplněné plynem reakcí za oxidativních podmínek za vzniku disulfióových skupin.

. 291 Použití diagnostického a/nebo' léčebného prostředku podle některého z nároků 1 až 21 jako zacíleného kontrastního prostředku pro. zobrazování ultrazvukem.

30. Způsob vytvoření zlepšených obrazů lidského nebo živočišného organismu, vyznačující se tím, že se podává diagnostický prostředek podle některého z nároků 1 až 21 a vytvoří se obraz alespoň části .organismu pomocí ultrazvuku, magnetické rezonance, rtg-záření, radiograficky nebo pomocí světla.

31. Způsob podle nároku 30,vyznačující se t í m , že se

i) nejprve podá vektor pro předběžné zacílení s afinitou pro zvolenou cílovou strukturu, načež se ii) podá prostředek podle některého z nároků 1 až 21 s .obsahem vektoru s afinitou pro předběžně zacílený vektor.

32. Způsob podle nároku 31, vyznačuj í c í se t í m , že se jako vektor pro předběžné zacílení užije monoklonální protilátka.

33. Způsob podle nároku 30„vyznačuj ící s e t í m, že se ' fl

i) podá prostředek podle některého z nároků 1 až 21 a toto ·*·· «· • «•to ·,· to

263 ii) podá se látka, schopná uvolnit tento prostředek z jeho cílové struktury nebo jej na této struktuře nahradit.

34. Způsob podle některého z nároků 30 až 33, v y z n a Č u j í c í se t í m, že se užije prostředek, který dále obsahuje léčivo.

35. Způsob podle nároku 34,vyznačuj ící se t í m , že se léčivo kovalentně spojí nebo váže na reportér přes disulfidové skupiny a pak se podává prostředek, obsahující redukční činidlo, schopné reduktivně štěpit disulfidové skupiny.

v

36. Způsob sledování in .vitro nebo zacílení in vitro. při použití prostředku podle některého z nároků 1 až 21, vyzná, čující- se tím, že se buňky, u nichž do- chází k expresi cílové struktury pevně umístí v průtokové 'komoře a komorou se nechá procházet suspenze uvedeného proT » středku v nosné kapalině, načež se. sleduje vazba prostředku na buněčný materiál.

I

37. Způsob'podle nároku' 36, vyznačující se t í m , že se rychlost průtoku nosné kapaliny řídí tak, aby byla napodobena rychlost střihu in vivo.