CZ141293A3

CZ141293A3 - Interleukin - 10 for treating tumors, a pharmaceutical preparation containing thereof, its use and preparation process

Info

Publication number: CZ141293A3
Application number: CS931412A
Authority: CZ
Inventors: Paulo J M Vieira; Kevin W Moore
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1991-01-16
Filing date: 1992-01-15
Publication date: 1994-01-19
Also published as: DE69201128T2; GR3015510T3; HUT69962A; HK192196A; HU218598B; JPH06504785A; JP3260368B2; NO310444B1; EP0567576A1; DK0567576T3; ATE116550T1; HU9302066D0; KR100207766B1; DE69201128D1; NO932570L; AU1261792A; NO932570D0; FI933193A0; SK279556B6; CA2100553A1

Description

Tento vynález se týká způsobů a prostředků léčení neoplasmů nebo rakovin u lidí a zvláště použití prostředků s interleukinem-10 (IL-10) pro léčení rakovin.

Dosavadní stav techniky

Imunologické přístupy k terapii rakovin jsou založeny na představě, že rakovinné buňky se nějakým způsobem vyhýbají obranám těla proti nahodilým nebo cizím buňkám a molekulám a že tyto obrany mohou být teraputicky stimulovány pro opětovné získání ztracené půdy, např. strany 623 až 648 v Kleinovi Immunology (Wiley-Interscience, New York, 1962.). Nedávná pozorování, že některé imunní efektory mohou řídit nebo nepřímo inhibovat růst nádorů, vedla k obnovení zájmu o tento přístup k terapii rakoviny: např. Herberman: Concepts Immunopathol. 1., 96 až 132 (1985) (přirozené killer buňky odolávají růstu nádorových buněk), Rosenberg a spol.: Ann. Rev. Immunol. 4., 681 až 709 (1988) (klinické použití killer buněk (zabiječe) aktivovaných IL-2 pro léčení rakoviny), Ralph a spol.: J. Exp. Med. 167, 712 až 717 (1988) (tumoricidní aktivita makrofágů stimulovaných lymfokiny), Tepper a spol.: Cell 57, 503 až 512 (1989) (IL-4 má protinádorovou aktivitu), M. Cohen Lymphokines and Tumor Immunity”, str. 237 až 253 ,v S. Cohen (red.) Lymphokines and the Immune Response (CRC Press, Boča Raton, 1990.) apod.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká použití interleukinu-10 (IL-10) pro snižování a/nebo zabránění růstu nádorů. Tento vynález zahrnuje také farmaceutické prostředky, které obsahují interleukin-10. Interleukin-10 podle vynálezu se s výhodou vybere ze skupiny, která sestává z maturovaných polypeptidů s otevřenými čtecími oblastmi, které jsou definovány sekvencemi aminokyselin uvede2 nými v sekvenci identifikační číslo 1 a 2 (všechny sekvence identifikačních čísel jsou uvedeny bezprostředně před body patentových nároků), v nichž jsou k označení L-aminokyselin použity standardní třípísměnové zkratky, při čemž se začíná od N-konce. Na tyto dvě formy IL-10 se někdy odkazuje jako na lidský IL-10 (hIL-10 nebo inhibiční faktor syntézy lidského cytokinu) a na virový IL-10 (vIL-10 nebo BCRF1): např. Moore a spol.: Science 248. 1230 až 1234 (1990), Vieira a spol.: Science 88., 1172 až 1176 (1991), Fiorentino a spol.: J. Exp. Med. 170, 2081 až 2095 (1985), Hsu a spol.: Science 250. 830 až 832 (1990). Výhodněji se maturovaný IL-40 používaný ve způsobu podle tohoto vynálezu vybere ze skupiny sestávající z maturovaných polypeptidů s otevřenými čtecími oblastmi, které jsou definovány aminokyselinovými sekvencemi v sekvencích identifikační číslo 3 a 4 zde uvedených.

V následující části budou stručně popsány připojené výkresy.

Obrázek 1 je diagram znázorňující savčí expresní vektor pcD(SRa).

Obrázek 2 je diagram znázorňující bakteriální expresní vektor TRP-C11.

Obrázek 3 ukazuje plasmid pGSRG, který nese otevřenou čtecí oblast (ORF) myšího IL-10, virového IL-10 nebo lidského IL-10 vloženého do jeho Xho restrikčního místa. Ukazuje také sekvenci RBS-ATG-polylinkerových oblastí konečné konstrukce (nazvané TAC-RBS).

Tento vynález se týká způsobu používání IL-10 pro prevenci a/nebo snižování postupu rakovin. Tento vynález zahrnuje také farmaceutické prostředky obsahující IL-10 pro použití podle tohoto způsobu. IL-10 pro použití podle tohoto vynálezu se vybere ze skupiny maturovaných polypeptidů kódovaných otevřenými čtecími fázemi definovanými cDNA inserty pH5C, pH15C a pBCRFl (SR<%), které jsou uloženy v Americké sbírce typů kultur (American Type Culture Collection; ATCC), Rockville, Maryland, pod čísly 68 191, 68 192 a 68 193.

Pro přípravu polypeptidů podle tohoto vynálezu se používají rozmanité jednobuněčné a vícebuněčné expresní systémy, tj. kombinace hostitel - expresní vektor. Mezi možné typy hostitelských buněk patří, ale nejsou na ně omezeny, bakteriální buňky, kvasinky, hmyzí buňky, savčí buňky apod. Existuje mnoho přehledných souhrnných prací, které jsou dobrými průvodci pro výběry a/nebo modifikace specifických expresních systémů, např. aby byly jmenovány alespoň některé; de Boer a Shepard; Strategies for Optimizing Gene Expression in Escherichia coli, str. 205 až 247 v Kroon (red.) Genes; Structure and Expression (John Wiley and Sons, New York, 1983), přehledný článek několika E. coli expresních systémů; Kucherlapati a spol.: Critical Reviews in Biochemistry 16(4), 349 až 379 (1984) a Banerji a spol.; Genetic Engineering 5, 19 až 31 (1983) podávají přehled způsobů transfekce a transformování savčích buněk; Reznikoff a Góki (red.) Maximizing Gene Expression” (Butherworths, Boston, 1986) podávají přehled vybraných způsobů exprese genů v E. coli. kvasinkách a v savčích buňkách a Thilly Mammalian Cell Technology” (Buterworths, Boston, 1986) uvádí přehled savčích expresních systémů. Podobně je dostupno mnoho přehledných souhrnných článků, které popisují techniky a podmínky pro navázání a/nebo manipulaci specifických cONAs a expresi kontrolních sekvencí při tvorbě a/nebo modifikování expresních vektorů vhodných pro použití podle tohoto vynálezu, např. Sambrook a spol. (viz shora).

E.coli expresní systém je popsán Riggsem v USA patentu č. 4 431 739, který je zde zahrnut jako odkaz. Zvláště užitečným prokarytickým promotorem pro vysokou expresi v E. coli je tac promotor, popsaný de Boerem v USA patentu č. 4 551 433, který je zde zahrnut jako odkaz. Jsou dostupné také sekreční expresní vektory pro E.coli hostitele. Zvláště užitečné jsou plŇ-III-ompA vektory popsané Ghrayebem a spol.; EMBO J. 3., 2437 až 2442 (1984), v nichž cDNA, která má být transkribována, je napojena na část E.coli OmpA genu kódujícího signální peptid ompA proteinu, který dále způsobuje, že maturovaný protein je sekretován do periplasmového prostoru bakterie. USA patenty č. 4 336

336 a 4 338 397 popisují také sekreci expresních vektorů pro prokaryoty. Také tyto citace jsou zde zahnruty jako odkazy.

Vhodnými hostiteli pro prokaryotické expresní vektory jsou četné kmeny bakterií včetně kmenů E, coli. jako je například W3110 (ATCC č. 27 325), JA221, C600, ED767, DHl, LE392, HB101, X1776 (ATCC č. 31 244), X2282, RRl (ATCC č. 31 343), MRC1, kmeny Bacillus substilis a jiné enterobakterie, jako je například Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescens a různé druhy Pseudomonas. Obecné způsoby pro odvození bakteriálních kmenů, jako je E, coli K12 X1776, použitelných pro expresi eukaryotických proteinů, jsou popsány Curtisem III v USA patentu č. 4 190 495. Tento patent je zde také zahrnut jako odkaz.

U prokaryotických a eukaroytických mikrogranismů se pro přípravu proteinů podle tohoto vynálezu používají také expresní systémy obsahující buňky odozené od vícebuněčných organismů. Zvláště zajímavé jsou savčí expresní systémy, protože jejich posttranslační opracování pravděpodobněji produkuje biologicky aktivní savčí proteiny. Jako vektory pro savčí hostitele bylo použito několik DNA nádorových virů. Zvláště důležité jsou četné vektory, které obsahují SV40 replikační, transkripční a/nebo translační kontrolní sekvence kondenzované s bakteriálními replikačními kontrolními sekvencemi, např. pod vektory vyvinuté Okayamou a Bergen, které jsou popsány v Mol. Cell. Biol. 2/ 161 až 170 (1982) a Mol. Cell. Biol. 3, 280 až 289 (1983) a zlepšené Takefou a spol.í Mol. Cell. Biol. 2/ 466 až 472 (1988). Také tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkaz. Mezi další na SV40 založené savčí expresní vektory patří ty, které byly popsány Kaufmanem a Sharpem v Mol. Cell. Biol. 2, 1304 až 1319 (1982) a Clarkem a spol. v USA patentu č. 4 675 285, obě tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Výhodnými hostiteli shora uvedených vektorů jsou opičí buňky. Tyto vektory obsahující sekvence SV40 počátku replikace a neporušený A gen se mohou replikovat autonomně v opičích buňkách (aby se získaly vysoké počty kopií a/nebo stabilnější počet kopií než u neautonomně replikujích plasmidů). Navíc vektory obsahující sekvence SV40 počátku re5 plikace bez neporušeného A genu se mohou replikovat autonomně v opičích buňkách COS7 ve vysokém počtu kopií (ale nestabilně), jak je to popsáno Gluzmanem: Cell. 23, 175 až 182 (1981). Tyto buňky jsou dostupné od ATCC (pod číslem CRL 1651). Shora uvedené vektory založené na SV40 jsou schopny transformovat také jiné savčí buňky, jako jsou například myší L buňky, integrací do DNA hostitelské buňky.

Pro přípravu polypeptidů podle vynálezu se mohou používat také vícebuněčné organismy, například hmyzích larev, Maeda a spol.: Nátuře 315. 592 až 594 (1985) a Ann. Rev. Entomol. 351 až 372 (1989), a transgenních živočichů, Jaenisch: Science 240, 1468 až 1474 (1988).

I. Testování interleukinu-10: IL-10 vykazují některé biologické účinky, které by mohly být základem pro testy a jednotky. IL-10 mají vlastnost inhibovat syntézu alespoň jednoho cytokinu ve skupině sestávající z IFN-_T, lymfotoxinu, IL-2, IL-3 a GM-CSF v populaci T pomocných buněk indukovaných tak, aby syntetizoval jeden nebo více těchto cytokinů vystavením působení buněk se syngenním antigenem (APCs) a antigenu. U této aktivity se APCs nechají zpracovat tak, že nejsou schopny replikovat, ale jejich antigen-opracovávající systém zůstává funkční. Toho se vhodně dosáhne ozářením APCs, např. asi 1500 až 3000 R (záření r nebo X) před tím, než se smíchají s T buňkami.

Inhibice cytokinů se může testovat také primární nebo výhodněji sekundární MLR (mixed-lymphocyte reaction; reakce smíchaných lymfocytů)). V tomto případě není potřeba používat syngenních APCs. MLR jsou dobře známy odborníkům, např. Bradley, str. 162 až 166 v Mishell a spol. (red.): Selected Methods in Cellular Immunology (Freeman, San Francisco, 1980) a Battisto a spol.: Meth. in Enzymol. 150. 83 až 91 (1987). Ve stručnosti - smíchají se dvě populace allogenních lymfoidních buněk, jedna populace se před smícháním zpracuje tak, aby se zabránilo proliferaci, např. ozářením. Populace buněk se s výhodou připraví v koncentraci asi 2.10⁶ buněk na ml v doplněném mediu, např.

RPMI 1640 s 10 % plodového telecího sera. Pro test jak kontrol tak testovaných kultur se smíchá 0,5 ml každé populace. U sekundární MLR se buňky, které zbývají po sedmi dnech v primární MLR, restimulují čerstvě připravenými ozářenými stimulátorovými buňkami. Vzorek, o kterém se předpokládá, že obsahuje IL-10, se může přidat k testovaným kulturám v době smíchání a jak kontroly tak testované kutlury se testují na produkci cytokinu v době 1 až 3 dny po smíchání.

Testy na IL-10 se získanými populacemi T buněk a/nebo APC populacemi používají způsoby, které jsou dobře známy odborníkům a které jsou plně popsány DiSabatem a spol. (red.).: Meth. in Enzymol. 108 (1984). APCs pro výhodný IL-10 jsou periferní krevní monocyty. Tyto monocyty se získávají standardními způsoby, např. způsobem popsaným Boyumem: Meth. in Enzymol. 108. 88 až 102 (1984), Máge: Meth. in Enzymol. 108. 118 až 132 (1984), Litvín a spol.: Meth. in Enzymol. 108. 298 až 302 (1984), Stevenson: Meth. in Enzymol. 108. 242 až 249 (1989) a Romain a spol.: Meth. in Enzymol. 108. 148 až 153 (1984), které jsou zde zahrnuty jako odkazy. V IL-10 testech se s výhodou používají pomocné T buňky, které se získávají nejdříve oddělením lymfocytů z periferní krve a potom vybráním,, např. panning nebo průtokovou cytometrií, pomocných buněk pomocí komerčně dostupných anti-CD4 protilátek, např. OKT4 popsaných v USA patentu č. 4 381 295 a dostupných od Ortho Pharmaceutical Corp. Potřebné způsoby jsou plné popsány Boyumem ve Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2JL, (Suppl. 97), 77 (1968), v Meth. in Enzymol. 108 (shora uvedená citace) a Bramem a spol.: Meth. in Enzymol. 121, 737 až 747 (1986). Obvykle se PBLs získávají z čerstvé krve odstřečfováním Ficoll-Hypaque hustotním gradientem.

V testu se mohou používat rozmanité antigeny, např. KLH (Keyhole limpet hemocyanin), drůbeží r-globulin nebo podobné. Výhodněji, místo antigenu, jsou pomocné T buňky v testu stimulovány anti-CD3 monoklonální protilátkou, např. OKT3 popsanou v USA patentu č. 4 361 549.

Koncentrace cytokinu v kontrolních a testovaných vzorcích se měří standardními biologickými a/nebo imunochemickými testy. Konstrukce imunochemických testů pro specifické cytokiny jsou dobře známy odborníkům, jestliže je dostupný vyčištěný cytokin, např. Campbell Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterodam, 1984), Tijssen: Practise and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterodam, 1985) a USA patent číslo 4 486 530 jsou příklady rozsáhlé literatury o tomto předmětu. Komerčně dostupné od Goenzyme Corp. (Boston, Ma.) jsou ELISA sestavy pro .lidský IL-2, lidský IL-3 a lidský GM-CSF a ELISA sestava pro lidský IFN-r komerčně dostupný od Endogen, lne. (Boston, Ma.) . Polyklonální protilátky specifické pro lidský lymfotoxin, které jsou dostupné od Goenzyme Corp., se mohou používat v radioimunoanalýze lidského lymfotoxinu, např. Chard: An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques” (Elsevier, Amsterodam, 1982).

Pro stanovení IL-10 aktivity se mohou použít také shora uvedené biologické analýzy citokinů. Biologická analýza lidského lymfotoxinu je popsána Aggarwalem; Meth. in Enzymol. 116, 441 až 447 (1985) a Matthewsem a spol.: str. 221 až 225 Clemensem a spol.(red.) Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1987). Lidský IL-2 a GM-CSF se mohou analyzovat na faktoru závislými buněčnými liniemi CTLL-2 a KG-1, které jsou dostupné od ATCC pod čísly TIB 214 a CCL 246. Lidský IL-3 se může analyzovat svojí schopností stimulovat tvorbu rozmanitých heptatopoietických kolonií v kulturách měkkého agaru, např. jak popsal Metcalf: The Hemopoietic Colony Stimulating Factors (Elsevier, Amsterodam, 1984). INF-r lze kvantifikovat antivirovými analýzami, např. Maeger, str. 129 až 147 v Clemensen a spol. (red.) (shora uvedená citace ).

Produkce cytokinu se může zjišťovat mRNA analýzou. Cytokinové mRNA se mohou měřit cytoplasmovou tečkovací hybridižací jak popsali White a spol.: J. Biol. Chem. 257, 8569 až 8572 (1982) a Gillespie a spol.: USA patent č. 4 483 920. Také tyto citace jsou zde zahrnuty jako odkazy. Mezi další možné přístupy patří blotování tečkováním s využitím vyčištěné RNA, např. kapitola 6 v Hames a spol. (red.); Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1985).

V některých případech se vzorky, které se mají testovat na IL-10 aktivitu, musí předem zpracovat tak, aby se odstranily cyitokiny, které mohou interferovat s testem. Například IL-2 zvyšuji produkci IFN-T v některých buňkách. Podle toho, jaké pomocné T buňky se v testu používají, se IL-2 odstraňuje ze vzorku, který je testován. Takové odstranění se vhodně provádí tak, že se vzorek nechá projít standardní kolonou s anti-cytokinovou aktivitou.

Z důvodů vhodnosti se jednotky IL-10 aktivity definují v pojmech schopnosti IL-10 zvětšit proliferaci MC/9 buněk indukovanou IL-4, které jsou popsány v USA patentu č. 4 559 310 a které jsou dostupný od ATCC pod číslem CRL 8306. 1 jednotka/ml je definována jako taková koncentrace IL-10, která poskytuje 50 % maxima stimulace MC/9 proliferace nad hladinou IL-4 v následujícím testu: Připraví se dvojí nebo trojí zředění IL-4 a IL-10 v 50 μΐ media na jamku na standardní mikrotitrovací desce; medium obsahuje RPMI 1640, 10 % plodového telecího sera, 50μΜ 2-merkaptoethanol, 2mM glutamin, penicilin (100 jednotek na litr) a streptomycin (100 /<g/l). Přidá se IL-4, 25 ^1/jamku 1600 jednotek/ml (konečných 400 jednotek/ml) zředěných mediem a inkubuje se přes noc, např. 20 až 24 hodin. Přidá se ³H-thymidin (např. 50 mikroCi/ml v mediu) při hodnotě 0,5 až 1,0 /ťCi/jamku a opět se buňky inkubují přes noc, potom se buňky isolují a změří se obsažená radioaktivita.

II. Čištění a farmaceutické prostředky: Jestliže k expresi polypeptidů podle tohoto vynálezu dochází v rozpustné formě, například jako sekretovaný produkt transformovaných kvasinek nebo savčích buněk, mohou se tyto polypeptidy vyčistit standardními způsoby známými odborníkům, včetně stupňů srážení síranem amonným, chromatografie na ionexu, gelové filtrace, elek9 troforesy, afinitní chromatografie a/nebo podobných, např. Enzyme Purification and Related Techniques, Methods in Enzymology 22, 233 až 577 (1977) a Scopes R.: Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982) poskytují návody pro tato čištění. Podobně jestliže se polypeptidy podle tohoto vynálezu získávají expresí v nerozpustné formě, například jako agregáty, inkluzní tělesa nebo podobně, mohou se vyčistit standardními postupy známými odborníkům, mezi něž patří oddělení inkluzních tělísek z rozbitých buněk odstřečfováním, solubilizací inkluzních těles chaotropními činidly a redukujícími činidly, zředěním solubilizované směsi a snížením koncentrace chaotropního činidla a redukujícího činidla tak, že polypeptid zaujme biologicky aktivní konformaci. Poslední postupy jsou uvedeny v následujících citacích, které jsou zde zahrnuty jako odkazy: Winkler a spol.: Biochemistry 25m 4041 až 4045 (1986), Winkler a spol.: Biotechnology 3, 992 až 998 (1985), Koths a spol.: USA patent č. 4 569 790 a Evropské patentové přihlášky číslo 86306917.5 a 86306353.3.

Pojem efektivní množství tak, jak je zde používán, znamená množství postačující pro snížení nebo zabránění růstu nádoru. Efektivní množství pro příslušného pacienta se může měnit podle závislosti na takových faktorech, jako je stav a typ nádorového onemocnění, které se má léčit, celkový zdravotní stav pacienta, způsob podávání, prudkost vedlejších účinků apod. Obvykle se IL-10 podává jako faramceutický prostředek obsahující efektivní množství IL-10 a farmaceutický nosič. Farmaceutický nosič může znamenat jakoukoliv slučitelnou, netoxickou látku, která je vhodná pro dodávání prostředků podle tohoto vynálezu pacientovi. Obecně jsou prostředky užitečné proparenterálni podávání takových léčiv dobře známy, např. Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydání (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). Prostředky podle tohoto vynálezu se mohou do těla pacienta zavádět také implantovatelným nebo injektovatelným systémem pro dodávání léčiva: např. Urquhart a spol.: Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24, 199 až 236 (1984), Lewis a spol.: Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals (Plenům

Press, New York, 1981), USA patent δ. 3 773 919, USA patent č. 3 270 960 a podobné.

Jestliže se podává parenterálně, pak se IL-10 připraví (formuluje) jako jednotková dávková injektovatelná forma (roztok, suspenze, emulze) společně s farmaceutickým nosičem. Mezi příklady takových nosičů patří normální solný roztok, Ringerův roztok, roztok dextrosy a Hankův roztok. Mohou se používat také nevodné nosiče, jako jsou například netuhnoucí oleje a ethyl-oleát. Výhodným nosičem je 5% roztok dextrosy v solném roztoku (roztoku chloridu sodného ve vodě). Nosič může obsahovat menší množství přísad, jako jsou například látky, které zvyšují isotoničnost roztoku a chemickou stabilitu, například pufry a ochranná činidla. IL-10 se s výhodou připravuje ve formě prostředku ve vyčištěné formě, která v podstatě neobsahuje agregáty a další proteiny v koncentraci od asi 5 do asi 20 /ig/ml. IL-10 se s výhodou podává kontinuální infuzí tak, že jeho množství se pohybuje v rozmezí asi 50 až 800 ftq podávaných denně (tj. asi 1 až 16 ^g/kg/den). Denní infuzní rychlost se může měnit podle sledování vedlejších účinků a podle počtu červených krvinek.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady slouží pro ilustraci tohoto vynálezu. Zvolené vektory a zvolení hostitelé, koncentrace reakčních činidel, teploty a hodnoty dalších.proměnných jsou pouze příklady aplikací podle tohoto vynálezu a nejsou považovány jako omezení tohoto vynálezu.

Příklad 1

Exprese lidského CSIF v bakteriálním hostiteli

Z řady chemicky syntetizovaných fragmentů dvouvláknové DNA se sestaví syntetický lidský CSIF gen. Vytvoří se tak expresní vektor označený TAC-RBS-hCSIF. Klonování a exprese se provádí ve standardním bakteriálním systému, například E.coli K-12 kmenu JM101, JM103 nebo podobných, popsaných Vierou a Messingem: Gene JJ?, 259 až 268 (1982). Štěpení restrikčními endonukleasami a reakce s ligasami se provádí podle standardních postupů, například Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manuál (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).

Alkalický způsob (Maniatis a spol., shora uvedená citace) se používá pro přípravu plasmidů v malém měřítku. Pro přípravy ve velkém měřítku se používá modifikace alkalického způsobu, podle něhož se pro vysrážení nukleových kyselin z vyčeřeného lyzátu použije stejný objem isopropanolu. Vysrážení studeným 2,5M octanem amonným se používá pro odstranění RNA před odstřečřováním rovnovážnou hustotou chloridu česného a detekcí ethidiumbromidem.

Při hybridizaci na filtru se pro přenesení kolonií, které se pak lysují a fixují reakcí (vždy po dobu dvou minut) s 0,5M NaOH, 1,5M NaCl a potom s 1M Tris.HCl, pH 8,0, 1,5M NaCl a následujícím zahřátím na 80 °C (30 minut), se používají kolečka filtru Whatman 540. Hybridizace se provádí v 6 x SSPE, 20% formamidu, 0,1% dodecylsulfátu sodném (SDS), 100 mg/ml E. coli tRNA, 100 mg/ml barviva Coomassie Brilliant Blue G-250 Bio-Rad) při 42 °C po dobu 6 hodin s použitím ^2p__znag_ený_ci₁ (kinasovaných) syntetických DNAs (20 x SSPE se připraví rozpuštěním 174 g NaCl, 27,6 g Na^POg^^O a 7,4 g ethylendiaminotetraoctové kyseliny v 800 ml vody. pH se upraví hydroxidem sodným na 7,4, objem se upraví na 1 litr a vzorek se steriluje v autoklávu). Filtry se promyjí dvakrát (15 minut, teplota místnosti) 1 x SSPE, 0,1% SDS. Po autoradiografii (Fuji RX film) se positivní kolonie umístí na filtry seřazením vyrostlých kolonií modře vybarvených. DNA se sekvenuje dideoxymetodou, Sanger a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 74., 5463 (1977). Templáty pro dideoxy-reakce jsou bud jednovláknové DNA příslušných oblastí reklonované do vektorů M13mp (např. Messing a spol.: Nucleic Acids Res. 5?, 309 (1981) nebo dvouvláknová DNA připravená minialkalickým způsobem a denaturovaná 0,2M hydroxidem sodným (5 minut, teplota místnosti) a vysrážená z 0,2M hydroxidu sodného a 1,43M octanu amonného přidáním dvou objemů ethanolu. DNA se může syntetizovat fosforamiditovou chemií syntetizátorem Applied Biosystems 380A Synthesizer; syntéza, odstranění chránících skupin, štěpení a vyčištění (7M močovinová PAGE, eluce, chromatograf ie na DEAE-celulose) se provádí tak, jak je to popsáno v příručce pro syntetizátor 380A.

Doplňková vlákna syntetických DNA, které se mají klonovat (každé 400 ng), se smíchají a fosforylují polynukleotidkinasou v reakci o objemu 50 ml. Tato DNA se ligu je v objemu 50 ml za teploty místnosti 4 až 12 hodin s 1 mg vektorové DNA rozštěpené příslušným restrikčním enzymem. Podmínky pro fosforylaci, štěpení restrikčními enzymy, polymerasové reakce a ligaci jsou popsány v literatuře (Maniatis a spol.: shora uvedená citace). Spočtou se kolonie na lacZ+ (jestliže je to žádáno) vysetím na L agar doplněný o ampicilin, isopropyl-l-thiobeta-D-galaktosid (IPTG) (0,4mM) a5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosid (x-gal) (40 mg/ml).

Vektor TAC-RBS se zkonstruuje doplněním DNA polymerasou jediného Bam HI místa tacP-nesoucího plasmidu pDR540 (Pharmacia). Ten se potom liguje s nefosforylovanými oligonukleotidy (Pharmacia), které tvoří dvojvláknový fragment kódující souhlasné ribosomové vazebné místo, jak je to uvedeno v sekvenci identifikační číslo 5, a označí se RBS. Po ligaci se směs fosforyluje a religuje s Sstl linkerem ATGAGCTCAT. Tento komplex se pak rozštěpí působením Sstl a EcoRI. Elektroforesou na polyakrylamidovém gelu (PAGE) se isoluje fragment o 173 párech nukleotidů (pn). Tento fragment se klonuje do pUC19 (Pharmacia) rozštěpeného působením EcoRI a Sstl (jak shora popsáno). Sekvence RBS-ATG-polylinkerových oblastí konečné konstrukce (nazvaná TAC-RBS) je uvedena na obrázku 3.

Tento syntetický IL-10 gen se vestaví do plasmidu pUC19 v osmi stupních. V každém stupni inserty bez delecí a/nebo insercí se mohou detegovat po klonování zachováním lacZ(a) genu pUC19 v oblasti s ATG start kodonem vloženým ve stupni 1. Klony, které obsahují deleční a/nebo inserční změny, se mohou odfiltrovat vyhodnocením modrých kolonií na L-ampicilinových deskách obsahujících x-gal a IPTG. V každém stupni se sekvence insertů mohou snadno potvrdit použitím universálního sekvenačního primeru při přípravách plasmidové DNA v malém měřítku, např. dostupných od Boehringer Mannheim.

Ve stupni 1 se vektor TAC-RBS rozštěpí působením Sstl, nechá se zreagovat ss T4 DNA polymerasou (jejíž 3'-exonukleasová aktivita štěpí 3'-přečnívající vlákna Sstl štěpů za vzniku fragmentů se zarovnanými konci) a po deaktivaci T4 DNA polymerasy, se nechá zreagovat s EcoRI. Vznikne tak fragment o 173 párech nukleotidů obsahující TAC-RBS oblast, který má zarovnaný konec na ATG start kodonu a EcoRI rozštěpení na opačném konci. Nakonec se isoluje fragment TAC-RBS o 173 párech nukleotidů.

Ve stupni 2 se isolovaný TAC-RBS fragment ze stupně 1 smíchá s plasmidem pUC19 rozštěpeným působením EcoRI a KpnI a syntetický fragment 1A/B uvedený v níže uvedené sekvenci identifikační číslo 6 má zarovnané konce na konci proti směru vlákna a posunuté konce odpovídající štěpu KpnI na svém konci po směru vlákna. Tento KpnI konec je přilehlý k místu BstEII a po směru vlákna místa BstEII. Tyto fragmenty se ligují. Vytvoří se pUC19 stupně 2.

Ve stupni 3 se syntetický fragment 2A/B uvedený v sekvenci identifikační číslo 7 a 3A/B uvedený v sekvenci identifikační číslo 8 smíchá s plasmidem pUC19 ze stupně 2 rozštěpeným působením BstEII a Smál (po amplifikaci a vyčištění) a liguje se za vzniku plasmidu pUC19 stupně 3. Povšimněte si, že konec po směru vlákna fragmentu 3A/B obsahuje další nukleotidy, které tvoří Smál zarovnaný konec. Tyto další nukleotidy jsou štěpeny ve stupni 4. Také fragmenty 2A/B a 3A/B mají doplňkové jednovláknové konce o 9 zbytcích, které se anelují po smíchání a zanechávají tak BstEII štěp 2A/B proti směru vlákna a zarovnaný konec 3A/B po směru vlákna pro ligování na pUC19.

Ve stupni 4 se pUC19 ze stupně 3 roštěpí působením AflII a Xbal, amplifikuje, vyčistí, znovu vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 4A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 9 a liguje za vzniku pUC19 ze stupně 4.

Ve stupni 5 se pUC19 ze stupně 4 rozštěpí působením Xbal a Sáli, amplifikuje a vyčistí, smíchá se se syntetickým fragmentem 5A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 10 a liguje se za vzniku pUC190 ze stupně 5. Povšimněte si, že Sáli posunutý konec fragmentu 5A/B se odstraní štěpením působením Hpal ve stupni 6.

Ve stupni 6 se pUC19 ze stupně 5 rozštěpí působením Hpal a Pstl, amplifikuje, vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 6A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 11 a liguje za vzniku pUC19 ze stupně 6.

Ve stupni 7 se pUC19 ze stupně 6 rozštěpí působením Clal a Sphl, amplifikuje, vyčistí, smíchá se syntetickým fragmentem 7A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 12 a liguje za vzni-ku pUC19 ze stupně 7.

Ve stupni 8 se pUC19 ze stupně 7 rozštěpí působením Mlul a HindlII, amplifikuje, vyčistí, smíchá se syntetickými fragmenty 8A/B uvedený v sekvenci identifikační číslo 13 a 9A/B uvedeným v sekvenci identifikační číslo 14 a liguje za vzniku konečné konstrukce, která se pak vloží do E, coli K-12 kmen JM101, např. dostupný od ATCC pod číslem 33 876, standardními způsoby. Po kultivaci se protein extrahuje z buněk JM101. Zředění extraktů se testují na biologickou aktivitu.

Příklad 2

Exprese vIL-10 v opičích buňkách COS 7

Gen, který kóduje otevřenou čtecí oblast pro vIL-10, se amplifikuje polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s použitím primerů, které umožňují pozdější vložení amplifikovaného fragmentu do vektoru pcD(SRa) rozštěpeného působením EcoRI (obrázek 1). Kódující vlákno vloženého fragmentu je uvedeno v sekvenci identifikační číslo 15.

Klony, které nesou insert v příslušné orientaci, se identifikují expresí vIL-10 a/nebo elektroforetickou sestavou restrikčních štěpů. Jeden takový vektor, nesoucí gen vIL-10, se označí pBCRFl(SRa). Tento vektor byl uložen v ATCC pod číslem 68 193. pBCRFl(SRa) se amplifikuje v E. coli MC1061, isoluje se standardními způsoby a použije se pro transfekci opičích buněk COS 7 následujícím způsobem: Jeden den před transfekci se přibližně 1,5.10® opičích buněk COS 7 vyseje na jednotlivé lOOmm misky v Eaglově mediu modifikovaném podle Dulbecca (DME), které obsahuje 5 % plodového telecího sera (FCS) a 2 mM glutaminu. Pro provedení transfekce se buňky COS 7 odstraní z misek inkubací s trypsinem, promyjí se dvakrát DME bez sera a suspendují se na množství 10? buněk/ml v DME bez sera. O,75ml podíl se smíchá s 20 /íg DNA a přenese se do sterilní 0,4cm elektroporační kyvety. Po 10 minutách se na buňky působí pulsem 200 voltů, 960 μΡ v jednotce BioRad Gene Pulser. Po dalších deseti minutách se buňky odstraní z kyvety a přidají se ke 20 ml DME obsahujícího 5 % FCS, 2 mM glutaminu, penicilín, streptomycin a gentamycin. Tato směs se rozdělí na stejné díly do čtyř lOOmm misek pro tkáňové kultury. Po 12 až 24 hodinách při 37 °C s 5 % oxidu uhličitého se medium nahradí podobným mediem, které obsahuje pouze 1 % FCS a v inkubaci se pokračuje dalších 72 hodin při 37 ’C s 5 % CO2· Potom se medium isoluje a testuje se na schopnost inhibovat syntézu IFN-T.

Desetimililitrové podíly čerstvě isolovaných PBL (asi 2.10® buněk/ml) se inkubují při 37 °C s PHA (100 ng/ml) v mediu, které sestává z i) 90 % DME doplněného 5 % FCS a 2 mM glutaminu a ii) 10 % supernatantu z buněk COS 7 předem zpracovaných s pBCRFl(SRa). Po 24 hodinách se buňky a supernatanty isolují a testují se na přítomnost buď IFN-T mRNA nebo IFN-T proteinu. Kontroly byly připraveny stejným způsobem až na to, že % supernatantu z kultury COS 7 bylo předem transfektováno s plasmidem nesoucím nepříbuzný cDNA insert. vIL-10-zpracované vzorky vykazovaly asi 50% inhibici syntézy IFN-r vzhledem ke kontrole.

Příklad 3

Exprese vIL-10 v Esherichia coli

Gen, který kóduje maturovaný vIL-10 uvedený v sekvenci identifikační číslo 4, může být expresován v E. coli.

cDNA insert pBCRFl(SRa) se reklonuje do plasmidu M13, kde se změní dvojitou místně řízenou mutagenesí: Nejdříve se vytvoří místo Clal na 5’-konci kódující oblasti pro maturovaný vIL-10 polypeptid a potom se vytvoří místo BamHI na 3'-konci kódující oblasti pro maturovaný vIL-10 polypeptid. Mutovaná sekvence se pak ihned vloží do dále popsaného TRPCÍ 1 expresního vektoru.

Vektor TRPC11 se zkonstruuje ligací syntetického souhlasného RBS fragmentu s Clal linkery (ATGCAT) a klonováním výsledných fragmentů do pMTllhc (který byl předem modifikován tak, aby obsahoval místo Clal) roštěpeného působením Clal. pMTllhc je malý (2 300 párů nukleotidů) AMP^R, TET^R derivát plasmidu pBR322 o vysokém počtu kopií, který nese EcoRI-HindlII polylinkerovou oblast plasmidu rfVX (^TVX je popsán Maniatisem a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Tento plasmid byl modifikován tak, aby obsahoval místo Clal štěpením pMTllhc působením EcoRI a BamHI, doplněním výsledných přečnívajících konců a ligací s Clal linkerem (CATCGATG). Obnoví se tak místa EcoRI a BamHI a místo Smál se nahradí místem Clal. Jeden transformant z konstrukce TRPC11 měl tandem RBS sekvence obklopený místy Clal. Jedno z Clal míst a část druhé kopie RBS sekvence se odstraní rozštěpením tohoto plamidu působením Pstl, zpracováním s nukleasou Bal31, štěpením působením EcoRI a reakcí s T4 DNA polymerasou v přítomnosti všech čtyř deoxynukleotidtrifosfátů. Výsledné fragmenty o 30 až 40 párech nukleotidů byly isolovány PAGE a klonovány do pUCl2 rozštěpeného působením Smál. E. coli trpP-nesoucí EcoRI fragment o 248 párech nukleotidů odvozený od pKCIOl (popsaný Nicholsem a spol. v Methods in Enzymology 101, str. 155 (Academie Press, N.Y. 1983) se pak klonuje do místa EcoRI. Doplní se tak konstrukce TRPCll, která je ilustrována na obrázku 2. TRPC11 se použije jako vektor pro vIL-10 nejdříve rozštěpením působením Clal a BamHI, vyčištěním a potom smícháním ve standardním ligačním roztoku s Clal-BamHI fragmentem Ml3 obsahujícím sekvenci nukleotidů kódující maturovaný BCRFl. TRPCll, kerý obsahuje insert, označený jako TRPC11-BCRF1, se množí v E. coli K12 kmen JM101, např. dostupném z ATCC pod číslem 33 876.

Příklad 4

Potlačení nádorů u myší účinkem IL-120

Vliv IL-10 na růst nádorů byl testován v testu podobném tomu, který popsal Tepper a spol.: Cell 57, 503 až 512 (1989). Stručně - tento test, jak je zde používán, zahrnuje oddělené injekční podání dvou skupin buněk syngenní nádorové buněčné linie myším; jedna skupina je stabilně transfektována plasmidem expresu jícím IL-10, druhá skupina znamená netransfektovanou kontrolu. Potom se srovná výskyt tvorby nádorů u myší, kterým byly injekčně podány buňky těchto dvou skupin.

Ve všech pokusech byly myším BALB/σ injekčně podány bud transfektované nebo netransfekované NS1 myelomové nádorové buňky, které jsou dostupné z ATCC pod číslem TIB 18. Buňky NS1 byly transfektovány elektroporací plasmidem pGSRG (ilustrovaným na obrázku 3) nesoucím otevřenou čtecí oblast (ORF) myšího IL-10, virového IL-10 nebo lidského IL-10 vloženou do restrikčního místa Xho I. pGSRG obsahuje markér pro stanovení stabilně transfektovaných buněk NS1 a je derivátem pSVDtfi popsaným Schneem a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 84, 6904 až 6908 (1987). IL-10 inserty pro pGSRG se získávají následujícím postupem. PCR primery obsahující sekvence EcoRI linkeru se připraví pro každý z plasmidů pH5C, pBCRFl a pcD(SRa)-F115 tak, aby se ORF příslušných cDNA insertů mohly amplifikovat. Amplifikované ORF se reklonují do pcD(SRa) vektorů rozštěpených působením EcoRI a odděleně se expresují tak, aby se vybraly vektory, které obsahují ORF se správnou orientací. A konečně se Xhol fragmenty plasmidů pcD(SRa) reklonují do příslušných pGSRG plasmidů rozštěpených působením Xhol.

Buňky NS1 se transfektují plamidem pGSRG následujícím způsobem. Buňky (2 až 3.10®) z polokonfluentní 10Omni Petriho misky se odstředují, promyjí se jednou 10 ml sterilního fosforečnanem pufrovaného sterilního solného roztoku (PBS), odstředují a resuspendují v 0,5 ml PBS. V 1 ml PBS se suspenduje 20 až 100 μς plasmidové DNA. Buňky se smíchají s DNA, umístí se do kyvety v ledu a elektricky se na ní působí šoky v zařízení Bio-Rad Gene Pulser nastaveném na kapacitu 960 mikrofaradů a 200 až 300 Voltů. Po deseti minutách v ledu se buňky vysejí na standardní mikrotitrovací desku s 96 jamkami v objemu 100 μΐ. Po 48 až 78 hodinách se do každé jamky přidá 100 μΐ selekčního media s mykofenolovou kyselinou (0,5 /xg/ml mykofenolové kyseliny, 100 μς na ml xanthinu, 15 /íg/ml hypoxanthinu, 12 až 15 % plodového telecího sera, 600 /4g/ral glutaminu v DME High glukose).

V prvním pokusu se intraperitoneální injekcí 4, 3, 4 a 5 myším podá 5.10® netransformovaných buněk (kontrola), pGSRG-mlLlO-transformovaných buněk, pGSRG-vIL10-transformovaných buněk a pGSRG-hILlO-transformovaných buněk. Po čtyřech týdnech se třem ze čtyř kontrolních myší vyvinuly viditelné nádory. U žádné z pokusných myší se nevyvinuly nádory během 4 týdnů.

V druhém pokusu se intraperitoneální injekcí 16 myším podá 5.10® netransformovaných buněk a 15 myším se intraperitoneálně podá 5.10® pGSRG-mILlO-transformovaných buněk. Po dvou týdnech se osmi kontrolním myším znovu inkekčně podá 5.10® netransformovaných buněk a 7 z 15 myší 5.10® pGSGR-mIL 10-transformovaných buněk. Po čtyřech týdnech od původních injekcí se myši zkoumají na přítomnost vývoje nádorů. U 16 ze 16 kontrolní myší byly vyvinuty viditelné nádory. U žádné z pokusných myší se nevyvinuly žádné známky nádorů.

Popisy předcházejících uspořádání podle vynálezu jsou zde popsány pro účely ilustrace a popisu. Nejsou zamýšleny jako vyčerpávající nebo jako omezující tento vynález na přesné zde popsané formy. Je zřejmé, že vedle shora uvedeného popisu existuje mnoho modifikací a variací. Tato uspořádání byla vybrána a popsána, aby nejlépe vysvětlila principy tohoto vynálezu a tím umožnila jiným zručným odborníkům co nejlépe využít vynález v různých uspořádáních a s různými modifikacemi podle toho, jak je toho potřeba. Rozsah vynálezu je definován připojenými body patentových nároků.

Žadatelé uložili kultury E.coli MC1061 nesoucí pH5C, pH15C a pBCRF(SRcx) v Americké sbírce typů kultur (American Type Culture Collection), Rockville, Md., USA (ATCC) pod čísly 68 191, 68 192 a 68 193. Tato uložení byla provedena za podmínek stanovených ATCC dohodou o ukládání kultur pro patentové účely, podle které se zajišťuje, že uložení budou dostupná USA úřadu pro patenty a ochranné známky podle 35 USC 122 a 37 CFR 1.14 a budou veřejně dostupná po vydání USA patentu, což vyžaduje, aby tato uložení byla uchovávána. Dostupnost uloženého kmene není konstruována jako license k praktickému využívání vynálezu v rozporu s právy garantovanými autoritou jakékoliv vlády v souladu s jejími patentovými zákony.

V následující části tohoto spisu je uveden seznam sekvencí.

Sekvence identifikační Číslo: 1

Typ sekvence: aminokyselinová

Délka sekvence: 178 zbytků aminokyselin

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Původní zdroj (organismus): člověk

Vlastnosti: lidský IL-10 (lidský inhibiční faktor syntézy cytokinu, lidský CSIF)

Met His Ser Ser Ala

Leu Leu Cys

Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly

5

10

15

Val

Arg

Ala

Ser

Pro

Gly

Gin

Gly

Thr

Gin

Ser

Glu

Asn

Ser

Cys

20

25

30

Thr

His

Phe

Pro

Gly

Asn

Leu

Pro

Asn

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

35

40

45

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

Thr

Phe

Gin

Met

Lys

Asp

Gin

50

55

60

Leu

Asp

Asn

Leu

Lys

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

65

70

75

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyt

80

85

90

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Asp

Ile

95

100

105

Lys

Ala

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

110

115

120

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

125

130

135

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Val

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

140

145

150

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

155

160

165

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr.

Met

Lys

Ile

Arg

Asn

170

175

Sekvence identifikační číslo: 2 Typ sekvence: aminokyselinová Délka sekvence: 170 zbytků aminokyselin Druh vlákna: jednovláknová Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Vlastnosti: virový IL-10 (BCRF1)

Met

Glu Arg Arg

Leu 5

Val Val Thr Leu Gin Cys Leu Val Leu Leu

10

15

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Cys

Gly

Thr

Asp

Gin

Cys

Asp

Asn

Phe

20

25

30

Pro

Gin

Met

Leu

Arg

Asp

Leu

Arg

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Val

Lys

35

40

45

Thr

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Glu

Val

Asp

Asn

Leu

Lys

50

55

60

Glu

Ser

Leu

Glu

Asp

Phe

Lys

Gly

Tyr

Leu

Gly

Cys

Gin

Ala

65

70

75

Leu

Ser

Glu

Met

Ile

Gin

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Met

Pro

Gin

80

85

90

Ala

Glu

Asn

Gin

Asp

Pro

Glu

Ala

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

95

100

105

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

110

115

120

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

125

130

135

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

140

145

150

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

155

160

165

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

170

Sekvence identifikační číslo: 3

Typ sekvence: aminokyselinová

Délka sekvence: 160 zbytků aminokyselin

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: protein

Původní zdroj (organismus): člověk

Vlastnosti: maturovaný lidský IL-10 (maturovaný lidský CSIF)

Ser Pro Gly Gin Gly Thr Gin Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe 5 10 15

Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe

	20	25	30
Ser Arg	Val Lys Thr Phe Phe Gin Met	Lys	Asp Gin Leu Asp Asn
	35	40	45
Leu Leu	Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu	Asp	Phe Lys Gly Tyr Leu
	50	55	60
Gly Cys	Gin Ala Leu Ser Glu Met Ile	Gin	Phe Tyr Leu Glu Glu
	65	70	75
Val Met	Pro Gin Ala Glu Asn Gin Asp	Pro	Asp Ile Lys Ala His
	80	85	90
Val Asn	Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys	Thr	Leu Arg Leu Arg Leu
	95	100	105
Arg Arg	Cys His Arg Phe Leu Pro Cys	Glu	Asn Lys Ser Lys Ala
	110	115	120
Val Glu	Gin Val Lys Asn Ala Phe Asn	Lys	Leu Gin Glu Lys Gly
	125	130	135
Ile Tyr	Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp	Ile	Phe Ile Asn Tyr Ile
	140	145	150
Glu Ala	Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg	Asn
	155	160
Sekvence identifikační číslo: 4
Typ sekvence: aminokyselinová
Délka sekvence: 147 zbytků aminokyselin
Druh vlákna: jednovláknová
Topologie: lineární
Typ molekuly: protein
Vlastnosti: virový IL-10 (BCRF1)
Thr Asp	Gin Cys Asp Asn Phe Pro Gin	Met	Leu Arg Asp Leu Arg
	5	10	15
Asp Ala	Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe	Phe	Gin Thr Lys Asp Glu
	20	25	30
Val Asp	Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser	Leu	Leu Glu Asp Phe Lys
	35	40	45
Gly Tyr	Leu Gly Cys Gin Ala Leu Ser	Glu	Met Ile Gin Phe Tyr
	50	55	60
Leu Glu	Glu Val Met Pro Gin Ala Glu	Asn	Gin Asp Pro Glu Ala

65

70

75

Lys

Asp

His

Val

Asn

Ser

Leu

Gly

Glu

Asn

Leu

Lys

Thr

Leu

Arg

80

85

90

Leu

Arg

Leu

Arg

Cys

His

Arg

Phe

Leu

Pro

Cys

Glu

Asn

Lys

95

100

105

Ser

Lys

Ala

Val

Glu

Gin

Ile

Lys

Asn

Ala

Phe

Asn

Lys

Leu

Gin

110

115

120

Glu

Lys

Gly

Ile

Tyr

Lys

Ala

Met

Ser

Glu

Phe

Asp

Ile

Phe

Ile

125

130

135

Asn

Tyr

Ile

Glu

Ala

Tyr

Met

Thr

Ile

Lys

Ala

Arg

140

145

Sekvence identifikační číslo: 5

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 15 nukleotidů

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická (komerční, Pharmacia)

Vlastnosti: dvojvláknový fragment kódující souhlasné ribosomové vazebné místo

GTAAGGAGGT TTAAC

Sekvence identifikační číslo: 6

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 56 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem se 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Charakteristika: malá písmena znamenají, že nukleotid se liší od nukleotidu přírodní sekvence ve stejném místě

Vlastnosti: fragment 1A/B syntetického CSIF genu

AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCCCAGG 50 TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAGGGTCC tAACCggtac 60 aTTGGc

Sekvence identifikační číslo: 7

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 48 párů nukleotidů s přečnívajícími konci s 5 a 9 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 2A/B syntetického CSIF genu

GtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGAGTG 50 GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTCTCAC

AAGACTTTCT TT 62

TTC

Sekvence identifikační číslo: 8

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 35 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem s 9 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 3A/B syntetického CSIF genu

C AAATGAAGGA TCAGCTGGAC AACTTGTTcT tAAG 35

TGAAAGAAAG TTTACTTCCT AGTCGACCTG TTGAACAAgA aTTC

Sekvence identifikační číslo: 9

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 69 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem se 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 4A/B syntetického CSIF genu

GAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC 50 CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGAACAG

TGAGATGATC CAGTTTTAt 69

ACTCTACTAG GTCAAAATaG AtC

Sekvence identifikační číslo: 10

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 61 párů nukleotidů s přečnívajícím koncem se 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 5A/B syntetického CSIF genu

CTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCAAGGC 50

GAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGTTCCG

GCATGTtAAC g CGTACAaTTG cagct

Sekvence identifikační číslo: 11

Typ sekvence: nukleotid

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 6A/B syntetického CSIF genu

AACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGCGCTG 50

TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCCGCGAC

TCATCGATct gca 63

AGTAGCTAg

Sekvence identifikační číslo: 12

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence:

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 7A/B syntetického CSIF genu

CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA 50

TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACTTCTT cGCgTgcatg gCGcAc

Sekvence identifikační číslo: 13

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 45 párů nukleotidů s přečnívajícími konci se 4 a 9 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 8A/B syntetického CSIF genu

CGCGTTTATT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATGAGTG 50 AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTACTCA

AGTTTGAC 58

Sekvence identifikační číslo: 14

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 51 párů nukleotidů s přečnívajícími konci s 9 a 4 nukleotidy

Druh vlákna: dvouvláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Bezprostřední experimentální zdroj: syntetická

Vlastnosti: fragment 9A/B syntetického CSIF genu

A TCTTCATCAA CTACATAGAA GCCTACATGA CAATGAAGAT 50

CTCAAACTGT AGAAGTAGTT GATGTATCTT CGGATGTACT GTTACTTCTA

ACGAAACTGA 60

TGCTTTGACT tcga

Sekvence identifikační číslo: 15

Typ sekvence: nukleotid

Délka sekvence: 499 nukleotidů

Druh vlákna: jednovláknová

Topologie: lineární

Typ molekuly: DNA

Vlastnosti: kóduje virový IL-10

AATTC ATG GAG CGA AGG TTA GTG GTC ACT CTG CAG TGC CTG GTG 44

CTG

CTT

TAC

CTG

GCA

CCT

GAG

TGT

GGA

GGT

ACA

GAC

CAA

TGT

86

GAC

AAT

TTT

CCC

CAA

ATG

TTG

AGG

GAC

CTA

AGA

GAT

GCC

TTC

128

AGT

CGT

GTT

AAA

ACC

TTT

TTC

CAG

ACA

AAG

GAC

GAG

GTA

GAT

170

AAC

CTT

TTG

CTC

AAG

GAG

TCT

CTG

CTA

GAG

GAC

TTT

AAG

GGC

212

TAC

CTT

GGA

TGC

CAG

GCC

CTG

TCA

GAA

ATG

ATC

CAA

TTC

TAC

254

CTG

GAG

GAA

GTC

ATG

CCA

CAG

GCT

GAA

AAC

CAG

GAC

CCG

GAG

296

GCT

AAG

GAC

CAT

GTC

AAT

TCT

TTG

GGT

GGA

AAT

CTA

AAG

ACC

338

CTA

CGG

CTC

CGC

CTG

CGC

AGG

TGC

CAC

AGG

TTC

CTG

CCG

TGT

380

GAG

AAC

AAG

AGT

AAA

GCT

GTG

GAA

CAG

ATA

AAA

AAT

GCC

TTT

422

AAC

AAG

CTG

CAG

GAA

AAA

GGA

ATT

TAC

AAA

GCC

ATG

AGT

GAA

464

TTT

GAC

ATT

TTT

ATT

AAC

TAC

ATA

GAA

GCA

TAC

ATG

ACA

ATT

506

AAA

GCC

AGG

TGA

G

519

Claims

PATENTOVÉ

1.Interleukin-10 pro léčeni nádorů.
2.Použití interleukinu-10 pro výrobu léčiva pro léčení nádorů u pacienta.
3.Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje efektivní množství interleukinu-10 spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem.
4. Farmaceut i cký vyznačuj ící kontinuální iníuzi.

prostředek se tím, podle že je ve nároku f ormé vhodné

3, pro
5.Farmaceutický prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že interleukin-10 je vybrán ze skupiny, která sestává z virového interleukinu-10 a lidského interleukinu-10.
6.Způsob výroby farmaceutického prostředku, vyznačující se tím, že se efektivní množství interleukinu-10 smíchá s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.