CZ124999A3 - Farmaceutický prostředek pro léčení virových infekcí a rakoviny - Google Patents

Description

Léčba HIV a zhoubných nádorů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu inhibice růstu virů, zvláště HIV, rakoviny a nádorů u lidí a teplokrevných živočichů, zahrnuje podávání herbicidních a fungicidních látek. Velikost nádoru se zmenšuje, zpomaluje se růst zhoubného nádoru a tlumí se replikace virů. Tato léčba je účinná zvláště, když virus nebo zhoubný nádor je důsledkem mutované buňky, tzn. živočišná buňka, která je mutovaná včleněním genetického materiálu z rostlin, hub a plísní.

Dosavadní stav techniky

HIV a jiné virové infekce patří mezi hlavní příčiny úmrtí. HIV je onemocnění, u kterého replikující se virus napadá imunitní systém organismu. HIV virus nelze jednoduše zničit, ani když dobře funguje mechanismus, který brání replikaci viru v hostitelských buňkách. Herpes simplex patří mezi další virové infekce, které lze léčit jen velmi obtížně. Způsob léčby těchto onemocnění a jiných virových infekcí je vysoce žádoucí.

Překvapivě bylo zjištěno, že fungicidy, herbicidy, inhibitory plísní a jejich deriváty mohou tlumit replikaci virů. Fungicidy a herbicidy se mohou používat ve spojení s jiným druhem léčby, jako např. AZT, 3TC nebo inhibitory proteáz pro léčbu HIV. Tato léčba HIV je významně účinná při léčbě chronicky infikovaných buněk a buněk, které nejeví známky vývoje rezistence na léčbu. Například bylo prokázáno, že thiabendazol a chlorpropham rychle snižují úroveň virové produkce v buněčné populaci chronicky infikované HIV-1 a antivirový účinek přetrvává po následné expozici (až jeden rok). Dále tato významná v podstatě kompletní suprese virové produkce u chronicky infikovaných buněk přetrvává až 80 dní po té, kdy je lék odstraněn a tento „vakcinační“ účinek je na té úrovni, jako by byly obě látky přítomny. Tento účinek není dosud v literatuře o HIV léčbách popsán. Tato redukce virové produkce se vyskytuje v koncentracích, které jsou netoxické pro hostitelské buňky a které nemají žádný efekt na syntézu buněčné DNA, RNA a bílkoviny. Dále chronicky infikované buňky léčené dlouhou dobu thiabendazolem

* 9 • ·	• 9	• 9 • •	99	99 9 9 • 9	99 9 9
• 9	• •	9 9	9 9
• ·	•	•	•	9	9	9
• 9	99		« 9		• 9	• 9	99

a chlorprophanem nebyly superinfikovány HIV. Dále je pro tyto látky významná neschopnost indukce rezistentního kmenu po jednoročním pokusu. Naproti tomu inhibitory proteázy indukují rezistentní kmeny během týdnů a všechny RT inhibitory indukují rezistentní kmeny během jednoho až dvou měsíců.

Zhoubné nádory patří mezi hlavní příčiny úmrtí u živočichů i u lidí. Není známa přesná příčina zhoubných nádorů, ale mnoho vědců popisuje výskyt jednotlivých typů nádorů v souvislosti s různými aktivitami jako např. kouření, expozice kancerogenům. Nicméně je známo, že nádorové buňky jsou buňky abnormální, které mohou určitou dobu dřímat a následně rapidně růst. Mnoho nádorových buněk se považuje za nesmrtelné, protože neodumírají jako normální živočišné a lidské buňky, ale pokračují v samovolném množení.

Je zřejmé, že bude průlomem vývoj látek s jedinečnou specificitou, které budou směrovány proti nádorovým buňkám. Jinak je žádoucí, aby látky, které mají cytotoxický efekt na nádorové buňky, vykazovaly pouze mírný účinek na normální buňky.

Je známo, že rostlinné a živočišné buňky mohou být geneticky pozměněny vložením genetického materiálu z odlišného buněčného druhu. Tyto geneticky pozměněné buňky mají DNA nebo část genů nebo genetického materiálu jedné buňky včleněné do nové buňky. Tyto nové buňky vykazují známky obou buněk, ale již nejsou identifikovány jako zcela rostlinné nebo živočišné buňky. Takto pozměněné nebo abnormální zvířecí buňky mohou být rychle rostoucí a neodpovídají jako normální buňky regulačním mechanismům.

Organismus má různé mechanismy k odfiltrování a eliminaci plísní, hub a pylových látek. Pokud jsou požívány, zažívací systém je může vylučovat nebo detoxikovat v rozumném množství. Nos, plíce a pokožka obsahují aktivní mechanismy pro filtraci cizích látek. Nicméně vždycky budou rostliny, houby a plísně, které proniknou přes obranné mechanismy organismu a dostanou se do krevního řečiště, lymfatického systému nebo proniknou přes plíce a kožní membrány. Tyto látky mohou pronikat do živočišných buněk a měnit je. Pozměněné buňky mohou být tvořeny spojením rostlinných buněk s živočišnými buňkami, vytvořených kombinací pylu se živočišnou buňkou. Pyl se může vstřebat při dýchání neboť plicní tkáň a jiné buňky nosu, úst a krku jsou v trvalém kontaktu s rostlinnými látkami. Jiné buňky mohou být vytvořeny spojení látek z hub a plísní s genetickým materiálem živočišných buněk stejným způsobem.

to toto • to • ···	··	·· • <· to	»· • to to ·	to· • •
• •	• •
• · 9	to -	•	• i	•
to*	to ·		• ·	• to	··

Abnormální nebo pozměněné buňky, které obsahují genetický materiál jak rostlinných a živočišných buněk, nebo hub a živočišných buněk patří v životním prostředí mezi alterované buňky. Organismus je normálně odmítne tím, že vytvoří protilátky, ale pokud buňky vykazují charakteristiky jak živočišných tak i rostlinných buněk, nebo hub, včetně plísní, protilátky nemusí fungovat stejným způsobem. To umožňuje buňkám růst vzhledem k jejich abnormalitě, který se nazývá „rakovinný“ nebo nádorový růst, a zahrnuje též tzv. „tekuté nádory“ jako např. leukémie.

Viry mají také schopnost napadat buňky a množit se v buněčné hmotě. Tyto nové buňky se liší od těch dvou původních. Viry samy mutují a mění se na základě vzájemného působení s houbami, plísněmi a rostlinným materiálem, zvláště pylem.

Tyto viry mohou být také zničeny nebo jejich replikace utlumena léčbou fungicidy, inhibitory plísní a herbicidy. Je zajímavé, že některé z těchto látek mají i protihlřstový účinek.

Je zajímavé, že 15% zhoubných nádorů je způsobeno viry. Pokud se z hlediska geografického podíváme na přítomnost hub, zvláště těch, které se nacházejí v travinách a používání herbicidů a fungicidů ke kontrole růstu nebo proliferace těchto látek, byla zjištěna korelace s výskytem zhoubných nádorů v těchto lokalitách. Čím více byl tlumen růst hub a rostlin za použití herbicidů a fungicidů, tím méně se vyskytovalo zhoubných nádorů na daném území.

Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu léčby HIV, kde je potlačena produkce viru. Tento způsob zahrnuje podávání bezpečného a účinného množství herbicidu nebo fungicidu samostatně nebo v kombinaci s jinými HIV léky, jako např. AZT nebo 3TC.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí antivirové léčby, která zahrnuje podávání bezpečného a účinného množství látky tlumící virový růst, která má i schopnost zničit viry, zvláště pak alterované a pozměněné buňky. Těmito látkami jsou herbicidy, které dokážou zničit rostlinné buňky a fungicidy, které jsou účinné proti houbám, včetně plísní. Tyto látky se podávají také ve spojení s násobitelem, jako je protizánětlivý lék, nebo vitamíny, včetně antioxidačních vitamínů.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí protinádorové léčby, která zahrnuje podávání bezpečného a účinného množství látky k útlumu nádoru, která má schopnost zničit buňky nádorové, zvláště buňky změněné. Těmito látkami jsou herbicidy, které dokážou zničit rostlinné buňky a fungicidy , které jsou účinné proti houbám, včetně ·· «ο « • · · · ··· • · · • » ·· ·· a · • ··· • · * · • · ·

plísní. Tyto látky se podávají s chemoterapeutickou látkou buď současně nebo následně a/nebo ve spojení s násobitelem.

Tyto a další předměty budou zřejmé z následujícího podrobného popisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Nárokem je způsob léčby HIV a jiných virových infekcí a zhoubných nádorů u savců a zvláště u teplokrevných živočichů. Způsob zahrnuje podávání bezpečného a účinného množství herbicidu nebo fungicidu nebo jejich derivátů, které významně zmenšují nádorovou hmotu nebo tlumí replikaci virů a nádorových buněk. Herbicidní látka a její deriváty jsou účinné k léčbě zhoubných nádorů nebo virů, které jsou geneticky změněné živočišné buňky vzniklé spojením rostlinné buňky s buňkou živočišnou. Fungicidní látky a jejich deriváty jsou účinné, když zhoubný nádor nebo virus je živočišnou buňkou, která obsahuje genetický materiál odvozený od hub nebo plísní.

Tyto složky se používají k inhibici růstu zhoubných a jiných nádorů u člověka nebo živočichů. Podává se účinné množství buď ústy , konečníkem, lokálně nebo parenterálně, nitrožilně nebo injekčně přímo do nádoru. V této směsi se také používají násobitelé. Směs se používá ve spojení s dalšími druhy léčby souběžně nebo následně.

Podrobný popis vynálezu

A. Definice:

Pod pojmem „složka v tomto dokumentu se rozumí různé komponenty, které mohou být spojeny do farmaceutické látky tohoto vynálezu. Podle toho, pojem skládající se zahrnuje pojmy „v podstatě se sestávající“ a „sestávající se“.

V tomto dokumentu použité výrazy „mutovaná buňka“ a „buňka změněná životním prostředím“ znamenají živočišnou buňku, která je geneticky pozměněná spojením genetického materiálu, tzn. zlomky DNA nebo RNA, z rostlinných buněk nebo mykotických buněk s genetickým materiálem živočišných buněk za vzniku nové

geneticky modifikované buňky, která není ani rostlinná ani mykotická ani živočišná, ale která je životaschopným parazitem, který přetrvává v hostitelské buňce. Takováto buňka pokud roste a množí se, stává se v hostitelském živočichu zhoubnou buňkou.

V tomto dokumentu použité výrazy „farmaceuticky přijatelná látka znamená látku, která je vhodná pro použití u člověka a/nebo u živočicha bez zbytečných vedlejších účinků (jako např. jedovatost, podráždění, alergická odpověď) s přijatelným poměrem prospěch / riziko.

V tomto dokumentu použitý výraz „bezpečná a účinná dávka“ se týká množství látky, které je vhodné k dosažené terapeutické odpovědi bez zbytečných vedlejších účinků (jako např. jedovatost, podráždění, alergická odpověď) s přijatelným poměrem prospěch / riziko, pokud se používá způsobem tohoto vynálezu. Pojem „bezpečná a účinná dávka“ se mění v závislosti na faktorech konkrétních podmínek léčby, fyzické kondice pacienta, druh léčeného savce, na době léčby, druhu souběžné léčby (pokud je nějaká), a přesné struktuře látek a jejich derivátů.

V tomto dokumentu použitý výraz „farmaceutické přídatné soli“ znamenají sůl herbicidních nebo fungicidních látek a jejich derivátů s organickou nebo anorganickou kyselinou. Mezi oblíbené přídatné soli kyselin patří chloridy, bromidy, sulfáty, nitráty, fosfáty, sulfonáty, formiáty, tartaráty, maleáty, maláty, citráty, benzoáty, salicyláty, askorbáty apod.

V tomto dokumentu použitý výraz „derivát“ znamená chemicky modifikovaný derivát fungicidní nebo herbicidní látky, která je více rozpustná nebo snadněji metabolizovatelná, ale nemá výrazně změněný herbicidní či fungicidní účinek. Např. přidáním hydroxylové skupiny nebo jiné hydrofilní skupiny se zlepší rozpustnost a vstřebávaní v těle a ve většině případů se tím významně neovlivní funkčnost látky. Odborník snadno tyto látky určí.

V tomto dokumentu použitý výraz „farmaceutický nosič“ je farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo, suspendující látka nebo vehikulum, včetně liposomů k dopravě protinádorové látky do živočicha nebo člověka. Nosič může být tekutý nebo tuhý a jeho výběr závisí na zamýšleném způsobu podávání.

V tomto dokumentu použitý výraz „zhoubný nádor“ zahrnuje všechny zhoubné nádory a novotvary u savců, včetně nádorů a leukémie.

V tomto dokumentu použitý výraz „chemoterapeutická látka“ zahrnuje látky působící na DNA, antimetabolity, látky působící na tubulín, hormonální látky a jiné, jako např.: asparagináza nebo hydroxymočovina.

V tomto dokumentu použitý výraz „viry“ zahrnuje viry, které jsou příčinou onemocnění (virových infekcí) u člověka a jiných teplokrevných živočichů jako je HIV virus, herpes, virus chřipky a rinoviry.

V tomto dokumentu použitý výraz „násobitel“ jsou látky jako triprolidin a jeho cisizomer a prokodazol, které se používají v kombinaci s chemoterapeutickou látkou a herbicidními nebo fungicidními látkami.

V tomto dokumentu použitý výraz „významně změnšuje“ znamená významné zmenšení nádorové hmoty. Obvykle je to pod 50% původní hmoty, ale především zmenšení hmoty na nedetekovatelnou velikost.

V tomto dokumentu použitý výraz „fungicidy“ znamená látky, které jsou účinné v inhibici růstu hub nebo hubení hub. Plísňové inhibitory jsou zahrnuté v pojmu „fungicidy“, vzhledem k tomu, že plísně patří mezi houby.

V tomto dokumentu použitý výraz „herbicidy“ znamená látky, které jsou účinné v inhibici růstu rostlin nebo ty, které ničí rostlinné buňky.

B. Fungicidy

Používá se libovolný počet fungicidů a jejich derivátů a farmaceuticky přijatelných solí. Konkrétní fungicid se vybírá z hlediska jak bezpečnosti tak i účinnosti pro prevenci růstu hub. Dává se přednost širšímu spektru fungicidů. Některé účinné fungicidy jsou zobrazeny dále.

1. Benzimidazolové látky

Benzimidazolové deriváty jsou známy pro svou protihoubovou aktivitu. Překvapivě bylo zjištěno, že tyto látky mohou způsobit apoptózu buněčné linie zhoubného nádoru. Apoptóza je specifické odumření buňky, která se liší od nekrózy. Většina nádorových buněk mohou žít neurčitě dlouho. O nádorových buňkách se hovoří jako o nesmrtelných buněčných liniích.Proto schopnost vyvolat apoptózu je velmi důležitá.

Látky obecného vzorce I mají následující strukturu:

kde Xje vodík, halogen, alkyl o méně než 7 atomech uhlíku nebo alkoxy skupina o méně než 7 atomech uhlíku, n je pozitivní celé číslo menší než 4, Y je vodík, chlor, nitro, metyl nebo etyl skupina, a R je vodík, CONHR3 a R3 je alkyl o méně než 7 atomech uhlíku, s výhodou butyl nebo isobutyl nebo alkylová skupina s 1 až 8 atomy uhlíku, a R₂ je NHCOORt.kd® Ri J^e alifatický uhlovodík o méně než 7 atomech uhlíku a s výhodou alkylová skupina o méně než 7 atomech uhlíku.

S výhodou je sloučenina obecného vzorce II:

Kde R je vodík, CONHR3 a R₃ je alkyl o méně než 7 atomech uhlíku, s výhodou butyl nebo isobutyl nebo alkyl o 1 až 8 atomech uhlíku nebo netoxické farmaceuticky přijatelné přídatné soli jak organických tak anorganických kyselin.

Nejvýhodnějšími sloučeninami jsou methyl-(butylkarbamoyl)-2benzimidazolkarbamát a 2-methoxykarbonylaminobenzimidazol a sloučeniny, kde Y je chlór a Xje vodík. Tyto sloučeniny se připravují způsobem popsaným v U.S. patentu 3,738,995 Adams a kol. 12. června 1973.

2. Thiabenzimidazolové sloučeniny

Bylo zjištěno, že thiabendazol je zvlášť účinný v léčbě chronické HIV, kde je prokázána suprese virové produkce, aniž by se vyvinula rezistence buněk.

Sloučeniny obecného vzorce III:

Kde X je vodík, halogen, alkylová skupina o méně než 7 atomech uhlíku nebo alkoxy skupina o méně než 7 atomech uhlíku, n je pozitivní celé číslo menší než 4, Y je vodík, chlór, nitro, methyl nebo ethyl skupina, a R je vodík, CONHR₃ kde R₃ je alkylová skupina o méně než 7 atomech uhlíku, s výhodou butyl nebo isobutyl nebo alkylová skupina obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a R₂ je thiazolyl. S výhodou je přípravek obecného vzorce IV:

(IV),

Kde R je vodík a R₂ je 4-thiazolyl nebo netoxické farmaceuticky přijatelné přídatné soli jak organických tak anorganických kyselin. Nejvhodnějšími sloučeninami jsou 2-(4thiazolyl)benzimidazol. Thiabendazol je také protihlístová látka.

Thiazolylové deriváty se připravují způsobem, který popsal Brown a kol., J. Am. Chem. Soc., 83, 1764 (1961) a Grenda a kol., J. Org. Che., 30, 259 (1965).

3. Substituované benzimidazolové deriváty

Více rozpustné benzimidazolové sloučeniny jsou užitečné v tomto vynálezu. Zatímco tyto sloučeniny nejsou známy pro herbicidní nebo fungicidní použití, věří se v účinky proti HIV, zhoubným nádorům a jiným virovým infekcím. Tyto deriváty jsou látky obecného vzorce V:

• · · ··· » · · · ·«·· · · · ♦ · · ·· · ······· · · ·· · ·· · · · · · · ··

(V),

Kde R je vybrán ze skupiny skládající se z vodíku, karboxyl (~CO₂H), hydroxyl, amino nebo esterů (-CO₂R'), kde R' je vybrán ze skupiny skládající se z alkoxy, haloalkyl, alkenyl a cykloalkyl, kde alkylové skupiny mají 1 až 8 atomů uhlíku nebo CH₃CH₂(OCH₂CH₂)_n— nebo CH₃CH₂CH₂(OCH₂CH₂CH₂)_n— nebo (CH₃)₂CH— a sloučenina obecného vzorce VI:

a (OCH(CH₃)CH₂)_n—, kde n je 1 až 3. Alkylové skupiny jsou s výhodou nerozvětvené řetězce. Halogen je s výhodou substituovaný na koncovém uhlíku a halogenem je chlór. S výhodou jsou cykloalkylové skupiny ty, které mají 3 až 6 atomů uhlíku. Cykloalkylové skupiny také zahrnují ty, které jsou substituovány na alkylovém řetězci,

2-cyklopropylethyl, cyklopropylmethyl, 2-cyklopropyl propyl nebo 2-cyklopropylpropyl nebo cyklohexylmethyl. Upřednostňovány jsou sloučeniny obecných vzorců VII až XI:

• · · · · · · · • · · · · · · · · · · ·

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

4. 1H-1,2,4-triazolové deriváty

H-1,2,4-triazolové deriváty jsou známy pro svou fungicidní aktivitu. Jsou to systémové látky používané k prevenci a k hubení plísní. Jsou to sloučeniny obecného vzorce XII:

Η Φ · ·· · · · · • ΦΦΦ ΦΦΦ· ··· · · · · · · · · · ······ · · • Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ·· ] Η , / \ ι Ο Ο ι ν^ζ

CHj—C —Ar (XII), kde Z je alkylen vybraný ze skupiny skládající se z CH₂-CH₂-, CH2-CH2-CH2-CH(CH₃)-CH(CH₃)- a -CH₂-CH(alkyl), kde zmíněný alkyl obsahuje 1 až 10 atomů uhlíku a Ar je člen vybraný ze skupiny skládající se z fenylu, substituovaný fenylu, thienylu, halothienylu, naftylu, a fluorenylu, kde „substituovaný fenyl“ znamená že na fenylovém radikálu je 1 až 3 substituenty vybrané nezávisle na skupině skládající se z halogenu, nižšího alkylu, nižší polyalkoxy skupiny, kyano a nitro skupiny. Terapeuticky účinné soli přídatných kyselin dříve zmíněných sloučenin (I) jsou také zahrnuty v rámci tohoto vynálezu.

Jak je použito v již zmíněné definici Z, pojem „alkyl“ zahrnuje nerozvětvené a rozvětvené řetězce uhlovodíkových radikálů, které obsahují 1 až 10 atomů uhlíku, jako např. methyl, ethyl, 1-methylethyl, propyl, 1,1-dimethylethyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, oktyl, decyl apod. V tomto dokumentu pojem „nižší alkyly“ znamená nerozvětvené a rozvětvené nasycené uhlovodíky s 1 až 6 atomy uhlíku, jako např.: methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1,1-dimethylethyl, pentyl, hexyl, a jim podobné alkyly. Pojem „halo“ znamená obecně atomy halogenu o atomové hmotnosti menší než 127, tzn. fluór, chlór, bróm a jód.

Zde se používají také jejich farmaceuticky přijatelné soli jak organických tak i anorganických kyselin.

Upřednostňované deriváty obsahují:

-[2-(2,4-dichlorfenyl)-1,3-dioxolan-2-yl methyl]-1 H-1,2,4-triazol;

-[2-(2,4-dichlorfenyl)-4-methyl-1,3-dioxolan-2-yl methyl]-1 H-1,2,4-triazol,

-[2-(2,4-dichlorfenyl)-4-ethyl-1,3-dioxolan-2~yl methyl]-1 H-1,2,4-triazol,

-[2-(2,4-dichlorfenyl)-4-propyl-1,3-dioxolan-2-yl methyl]-1 H-1,2,4-triazol,

-[2-(2,4-dichlorfenyl)-4-pentyl-1,3-dioxolan-2-yl metyl]-1 H-1,2,4-triazol, a terapeuticky účinné přídatné soli jejich kyselin.

• · · • · • · · ·	• •		• •	• · • • ♦ ·	• · • · • ·	·* • · • ·
• · ·	•		•	• ·	•	•
• · · ·		♦ ·		• ·	• ·	• ·

Tyto sloučeniny se připravují způsobem popsaným v U.S. patentu 4,079,062 Van Reet a kol., 14. března 1999.

5. Deriváty 1,3-bis-triazolyl-2-propanolu

Deriváty 1,3-bis-triazolyl-2-propanolu jsou známy pro svou fungicidní aktivitu. Jsou to systémové látky používané k prevenci a k hubení plísní. Jsou to sloučeniny obecného vzorce XIII:

OH

Kde R¹ je případně substituovaný alkyl, cykloalkyl (např.: cyklopentyl nebo cyklohexyl), aryl nebo halogenaryl (např.: fenyl nebo 2,4-dichlorfenyl) nebo aralkyl (např.: benzyl); a jejich soli a komplexy kovů a étery nebo estery, nebo netoxické farmaceuticky přijatelné přídatné soli kyselin jak organických, tak i anorganických. Zde se používají zvláště takové bis-triazolové deriváty jako 2-(2,4-dichlorfenyl)-1,3-bis(1H-1,2,4-triazol-1-yl) propan-2-ol a tomu odpovídající 2- a 4- chlorfenylové analogy a 2,4-diflorfenylové analogy. S výhodou je složení

2-(2,4-dichlorfenyl)-1,3-bis(1 H-1,2,4-triazol-1 -yl)propan-2-ol a jejich farmaceuticky přijatelné přídatné soli kyselin jak organických, tak i anorganických.

Sloučeniny se připravují způsobem popsaným v U.S. patentu 4,404,216 Richardson 13. září 1983 a v British Patent Application č. 2,078.719A vydané 13. ledna 1982 a v European patent application č. 44,605 vydané 27. ledna 1982 (oba pro Imperiál Chemical Industries, Ltd.)

6. Grizeofulvin

Grizeofulvin je látka obecného vzorce XIV:

ch₃o

» « ·· ·· tt 9 9

9 9 9 9 9 ·9

99 9 9 99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 99

Připravuje se způsobem popsaném v U.S. patentu 30169,328 Hockenhull (1962) a U.S. patentu 3,069,328 Dorey a kol. (1962).

C. Herbicidy:

Používá se libovolný počet herbicidů a jejich derivátů a farmaceuticky přijatelných solí. Upřednostňovány jsou herbicidy, které jsou popsány níže:

1. N-chlorfenylkarbamáty a N-chlorfenylthiokarbamáty N-chlorfenylkarbamáty a N-chlorfenylthiokarbamáty jsou známy pro svou herbicidní aktivitu. Jsou to systémové látky používané k prevenci a k hubení určitých rostlin a plevelů. Systémové herbicidy se liší od ostatních herbicidů schopností být vstřebán rostlinou a prostupovat jí. Tato systémová schopnost není nezbytným požadavkem pro sloučeniny tohoto vynálezu.

Chlorpropham, isopropyl N-(3-chlorfenyl)karbamát se jeví jako zvlášť účinný v léčbě HIV.

Jsou to sloučeniny obecného vzorce XV:

C n

kde n je 1 až 3, X je kyslík nebo síra a R se vybírá ze skupiny skládající se z vodíku, nižšího alkylu, nižšího alkenylu, cyklohexylu, fenalkylu 1 až 8 atomů uhlíku a farmaceuticky přijatelné soli těchto sloučenin.

Výhodné jsou ty sloučeniny, kde R je alkyl s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou izopropyl a X je kyslík, n je 1 a skupina chlóru je na 3. pozici fenylové skupiny. N-3-chlorfenylkarbamát je používán nejvýhodněji.

Tyto sloučeniny se připravují způsobem popisovaným v U.S. patentu 2,695,225 Witman (1954) a U.S. patentu 2,734,911 Strain (1956).

• ·· ·· ftft ·· ·* • · · ♦ ♦ ♦ t · · · • ··· · · »·· · · · · ·«····· * « ft·· ftft ftft ♦· ·♦ ··

2. N-fosfonoglyciny

Deriváty N-fosfonoglycinů jsou známé pro svou herbicidní aktivitu. Jsou to systémové látky používané k prevenci a k hubení určitých rostlin a plevelů.

Jsou to sloučeniny obecného vzorce XVI:

O R O ί! I II

X-C-CHo-N-CH₂ -p-ΟΥ (XVI), oz kde X je vybrán ze skupiny skládající se z hydroxy skupiny, thioyl skupiny, alkoxy skupiny, nebo chloroxy skupiny až do počtu 12 atomů uhlíku: nižší alkenoxy, cyklohexyloxy, morfolino, pyrrolidinyl, piperidino, a NHR'; Y a Z jsou nezávisle vybrány z vodíku a nižšího alkylu, Rje vybrán ze skupiny skládající se z vodíku, formylu, acetylu, benzoylu, nitrobenzoylu a chlorovaného benzoylu, R' je vybrán ze skupiny skládající se z vodíku, nižšího alkylu a nižšího alkenylu, cyklohexylu, fenalkylu až do počtu 8 atomů uhlíku, fenylu, chlorovaného fenylu a anisylu, a určité soli těchto sloučenin, které se vybírají ze skupiny skládající se ze skupiny kovů I a II s atomovým číslem do 30, hydrochloridu, pyridinu, amoniaku, nižších alifatických aminouhlovodíků, nižších aminoalkanolů a anilinu.

S největší výhodou se jedná o sloučeniny obecného vzorce XVII:

O CHj o

HO - C · CH₂ N · ^CH2 - Ρ'(°^H)2 ^<XVII)'

S výhodou se používají nižší soli alkylaminu, zvláště soli isopropylaminu.

Tyto sloučeniny se připravují způsobem popisovaným v U.S. patentu 3,794,758 Franz 10. prosince 1974.

Farmaceutický přípravek pro léčbu u savců, a zvláště u teplokrevných živočichů a u člověka, se skládá z farmaceutického nosiče a účinného množství protinádorové látky vybrané ze skupiny, která se skládá ze směsi (1) derivátů N-fosfonoglycinu a (2) N-chlorfenylkarbamátů nebo jsou zde též použitelné N-chlorfenylthiokarbamáty.

4 · • · · • · 4 · · ·4 • · 4 · 4 4 • · · 444 44 • 4 44 • 4 4 · • · I 4 * 4

44

C. Léky HIV

HIV se léčí pomocí dvou obecných tříd léků, inhibitory reverzní transkriptázy a inhibitory proteázy. AZT a 3TC se široce používají k léčbě akutní HIV infekce. Herbicidní a fungicidni látky a jejich deriváty se používají v kombinaci s AZT nebo 3TC k léčbě akutní HIV infekce. Neinterferují s aktivitou AZT.

V rámci tohoto vynálezu se k léčbě používají i další HIV a antivirové látky v kombinacích. Patří mezi ně inhibitory reverzní transkriptázy a inhibitory proteáz. Léky se používají buď současně nebo se podávají následně s fungicidními nebo herbicidními látkami a jejich deriváty.

D. Chemoterapeutické látky

Fungicidy a herbicidy se mohou podávat s chemoterapeutickými látkami. Podávají se buď postupně, chemoterapeutické látka se používá ke zmenšení nádoru potom následuje léčba herbicidem, fungicidem nebo jejich deriváty, nebo se tyto dva druhy látek podávají současně.

Chemoterapeutické látky patří obecně do skupin látek vzájemně působících na DNA, antimetabolitů, látek vzájemně působících na tubulín, hormonálních látek a skupinu ostatních jako je aspargináza nebo hydroxyurea. Každá z těchto skupin chemoterapeutických látek se dál dělí podle typu aktivity nebo podle sloučeniny. Chemoterapeutické látky , které se používají sekvenčním způsobem v kombinaci s herbicidními nebo fungicidními látkami zahrnují primárně látky ze skupiny látek vzájemně působících na DNA, antimetabolitů a látek vzájemně působících na tubulín. Detailní popis chemoterapeutických látek a jejich způsob podávání viz Dorr a kol. Cancer Chemotherapy Handbook, 2^nd edition, str. 15 až 34, Appleton & Lange (Connecticut, 1994), obsaženo v odkazech.

Aby došlo k redukci nádorové hmoty nebo zastavení růstu nádorových buněk musí chemoterapeutické látka zabránit buněčné replikaci, ale mít schopnost vlastní buňku uchránit. Takovéto látky, které patří mezi primárně působící na DNA jako např. cisplatina a látky působící na tubulín.

Mezi látky působící na DNA patří alkylační činidla, jako např. cisplatina, cyklofosfamid, altretamin, látky působící zlomy v DNA, jako např. bleomycin, inhibitory vmezeřené topoizomerázy II, jako např. etopozid a tenipozid, a plikamycin.

Alkylující látky vytváří kovalentní vazby s buněčnou DNA, RNA a proteinovými molekulami a nižšími aminokyselinami, glutathionem a podobnými chemickými sloučeninami. Obecně tyto alkylující látky reagují s nukleofilní částicí v buněčné hmotě, jako jsou amino skupiny, karboxy skupiny, fosfát, sulfohydrilová skupiny v nukleových kyselinách, bílkovinách, aminokyselinách nebo glutathionu. Mechanismus a úloha těchto alkylujících látek v léčbě zhoubných onemocnění není doposud dobře objasněn. Mezi typické alkylující látky patří:

Dusíkaté yperity, jako např. chlorambucil, cyklofosfamid, izofosfamid, mechloretamin, melfalan a uráčil yperit;

aziridiny jako např. thiotepa;

estery methansulfonové kyseliny, jako např. busulfan;

nitrózomočoviny, jako např. karmustin, lomustin a streptozocin;

platinové komplexy, jako např.cisplatina a karboplatina;

bioreduktivní alkylační látky, jako např. mitomycin, prokarbazin, dakarbazin a altretamin;

látky požkozující DNA řetězce zahrnují bleomycin; inhibitory DNA topoizomerázy II zahrnují následující látky:

látky s interkalačním účinkem, jako např. amsakrin.daktinomycin, daunorubicin, doxorubicin, idarubicin a mitoxantron;

látky s neinterkalačním účinkem, jako např. etopozid a tenipozid.

Látky vážící se na DNA, jako např. plikamycin,

Antimetabolity interferují s tvorbou nukleových kyselin jedním nebo dvěma hlavními mechanismy. Některé z léků blokují tvorbu deoxyribonukleosidových trifosfátů, které jsou bezprostředními prekursory pro DNA syntézu a tím tlumí replikaci DNA. Některé sloučeniny jsou dostatečně podobné purinům a pyrimidinům, že je mohou nahrazovat při tvorbě nukleotidů. Tyto obdobné látky je potom mohou nahradit v DNA a RNA místo jejich normálních protějšků. Zde použité antimetabolity zahrnují:

antagonisty kyseliny listové, jako např. metotrexát a trimetrexát ······* · · ··· ·· ·· ·♦ ·9 ·· antagonisty pyrimidinu, jako např. fluorouracil, fluorodeoxyuridin, CB3717, azacytidin, cytarabin a floxuridin antagonisty purinu zahrnují merkaptopurin, 6-thioguanin, fludarabin, pentostatin, modifikované analogy cukrů zahrnují cyktrabin, fludarabin, inhibitory ribonukleotidové reduktázy zahrnují hydroxymočovinu.

Látky působící na tubulín se váží na specifická místa tubulínu, bílkoviny, která polymerací vytváří buněčné mikrotubuly. Mikrotubuly jsou kritické strukturální buněčné jednotky. Když se působící látka naváže na protein, buňka nemůže vytvořit mikrotubuly Látky působící na tubulín zahrnují vinkristin, vinblastin, jak alkaloidy tak i paklitaxel.

Nadledvinkové kortikosteroidy jsou odvozeny od nadledvinkového kortizolu nebo hydrokortizonu. Používají se pro jejich protizánětlivé účinky stejně tak jako schopnost zastavit mitotické dělení a zastavení syntézy DNA. Tyto sloučeniny zahrnují prednison, dexamethazon, metylprednisolon a prednisolon.

Hydroxymočovina primárně působí prostřednictvím inhibice enzymu ribonukleotid reduktázy.

Asparagenáza je enzym, který přeměňuje asparagin na nefunkční aspartovou kyselinu a tím blokuje syntézu bílkovin v nádoru.

Hormonální látky a luteinizační hormony se obvykle nepoužívají k významnému zmenšení nádorové hmoty. Nicméně , mohou se používat ve spojení s chemoterapeutickými látkami nebo herbicidními nebo fungicidními látkami nebo jejich deriváty.

Látky blokující hormony jsou také užitečné v léčbě zhoubných nádorů. Používají se u hormonálně ovlivnitelných nádorů a jsou obvykle získávány z přírodních zdrojů. Zahrnují:

estrogeny, konjugované estrogeny a ethinylestradiol a diethylstilbestrol, chlorotrianisen, idenestrol;

progestiny jako např. hydroxyprogesteron kaproát, medroxyprogesteron a megestrol;

androgeny jako např. testosteron, testosteron propionát, fluoxymesteron, methyltestosteron;

• · ·

-in φφ φφ φφ φφ φφφ φφφφ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ «φφφ φ · φφ «« φφ φφ

Antagonisté hormonů uvolňujících luteinizační hormon nebo uvolňujících gonadotropiny se používají primárně k léčbě zhoubných nádorů prostaty. Zahrnují leuprolid acetát a goserelin acetát. Tyto látky zabraňují syntéze steroidů ve varlatech.

Antihormonální látky zahrnují: antiestrogenní látky, jako např. tamoxifen, antiandrogenní látky, jako např. flutamid; a antiadrenální látky, jako např. mitotan a aminoglutethimid.

E. Potenciátory „Potenciátory“ mohou být jakékoliv látky, které zlepšují a zvyšují účinnost farmaceutických látek a/nebo působí na imunitní systém. Jedním takovým potenciátorem je triprolidin a jeho cis-izomer, které se používají v kombinaci s chemoterapeutickými látkami a fungicidy nebo herbicidy. Triprolidin je popsán v U.S. patentu 5,114,95, 1 (1992). Další potenciátor je prokodazol, 1H-benzimidazol-2propanová kyselina, [3-(2-benzimidazol)propionová kyselina, 2-(2-karboxyethyl) benzimidazol; propazol). Prokodazol je nespecificky účinná imunoprotektivní látka proti virovým a bakteriálním infekcím a může být použit ve sloučeninách zde nárokovaných.

Potenciátory mohou zlepšit účinnost herbicidních a fungicidních sloučenin a mohou se použít v bezpečném a účinném množství. Tyto kombinace se mohou podat pacientovi nebo zvířeti ústy, konečníkem, místně nebo parenterální cestou.

Antioxidační vitamíny jako např. kyselina askorbová, beta-karoten, vitamin A a vitamin E se mohou podávat se sloučeninami tohoto vynálezu.

F. Dávkování

Jakákoliv vhodná dávka může být podána dle způsobu tohoto vynálezu.Typ látek a nosičů a množství se liší v závislosti na druhu teplokrevného živočicha nebo člověka, tělesné hmotnosti a viru či zhoubném nádoru, který se léčí. Rozsah a poměr používaných fungicidních nebo herbicidních látek a jejich derivátů a/nebo chemoterapeutických látek závisí na typu látky a druhu léčeného zhoubného onemocnění. Obecně je pro herbicidní nebo fungicidní látky a jejich deriváty vhodná dávka od 2 miligramů (mg) na kilogram (kg) tělesné hmotnosti až po 4000 mg na kg tělesné hmotnosti. Mohou se také použít i vyšší dávky až do 6000 mg na kg. S výhodou ··· * ·«« · · »·· · · · · «·««··· · ♦ ··· ·· »· ·· ·· ·· se používají i fungicidní nebo herbicidní látky v dávkách od 15 mg až do 3000 mg/kg tělesné hmotnosti. Pro chemoterapeutické látky jsou vhodné nižší dávky, tzn. od 0,01 mg/kg tělesné hmotnosti až do 400 mg/kg tělesné hmotnosti. Dávky jsou obecně pro člověka nižší než dávky pro malé teplokrevné savce, jako jsou myši. Dávková jednotka se skládá buď z jednoduché látky nebo její směsi s dalšími látkami, které tlumí zhoubné nádory.

Jakákoliv vhodná dávka může být podána dle způsobu tohoto vynálezu k léčbě HIV infekce. Typ látek a nosičů a množství se liší v závislosti na druhu teplokrevného živočicha nebo člověka, tělesné hmotnosti. Rozmezí a poměr používaných fungicidních nebo herbicidních látek a jejich derivátů a látek k léčbě HIV infekce závisí na typu látky. Obecně je pro herbicidní nebo fungicidní látky a jejich deriváty vhodná dávka od 0,2 miligramů (mg) na kilogram (kg) tělesné hmotnosti až po 4000 mg na kg tělesné hmotnosti. Mohou se také použít i vyšší dávky až do 6000 mg na kg. S výhodou se používají i fungicidní nebo herbicidní látky v dávkách od 20 mg/kg až do 3000 mg/kg tělesné hmotnosti. Dávky jsou obecně pro člověka nižší než dávky pro malé teplokrevné savce, jako jsou myši. Dávková jednotka se skládá bud z jednoduché látky nebo její směsi s dalšími látkami pro léčbu HIV infekce.

G. Lékové formy

Herbicidy nebo fungicidy a jejich deriváty se obvykle smíchají s farmaceuticky přijatelným nosičem. Tento nosič může být tuhý nebo tekutý nebo ve formě liposomálních částic a forma se obecně vybírá na základě způsobu podávání jednotlivého léku. Aktivní látka se podává ve formě tablety nebo kapsle, liposomu, nebo ve formě prášku nebo v tekuté formě. Příkladem vhodných tuhých nosičů jsou laktóza, sacharóza, želatina a agar. Kapsle nebo tablety se snadno vyrábí a snadno se polykají nebo žvýkají, mezi další tuhé formy patří granule nebo volně sypané prášky. Tablety mohou obsahovat vhodná pojivá, mazací oleje, ředidla, rozmělňující látky, barviva, příchutě, ztekucovadla a rozvolňovadla. Příkladem vhodných tekutých lékových forem jsou vodné roztoky nebo suspenze, farmaceuticky přijatelné tuky a oleje, alkoholy a další organická rozpouštědla, včetně esterů, emulzí, sirupů nebo elixírů, suspenzí, roztoků a/nebo suspenzí z nešumivých granulí a šumivé preparáty z šumivých granulí.

• toto • to • to · ·	• •	• ·	·«	·· • · • ·	• to to · to ·
to •	• •	• ♦
« · to	•		•	•	to	•	•
·· ·«		to·			··	• to	··

Takovéto tekuté lékové formy mohou obsahovat např. vhodná rozpouštědla, konzervační přípravky, emulgátory, suspendující látky, ředidla, sladidla, zahušťovadla a rozvolňovadla. Lékové formy k podávání ústy obsahují volitelně příchutě a barviva. Parenterální a nitrožilní formy také obsahují minerály a jiné látky tak, aby byly slučitelné s vybraným druhem injekce nebo cílovým systémem.

Specifické příklady farmaceuticky přijatelných nosičů a masťových základů tohoto vynálezu, které se používají k výrobě lékových forem pro podávání ústy, jsou popsány v U.S. patentu č. 3,903,297 Robert 2. září 1975. Pracovní postupy a sloučeniny pro výrobu lékových forem použité v tomto vynálezu jsou popsány v následujících odkazech: 7 Modem Pharmaceutics, kapitola 9 a 10 (Bankéř & Rhodes, Editors, 1979), Lieberman a kol., Pharmaceutical Dosage Foprms: Tablets (1981), a Ansel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Formě 2^nd Edition (1976).

H. Způsob léčby

Způsobem léčby může být jakýkoli vhodný způsob, který je účinný v léčbě jednotlivých virových onemocnění, zhoubných a nezhoubných nádorů. Léčba může být prováděna ústy, konečníkem, místně, parenterálně nebo nitrožilním podáním apod. Způsob podávání účinného množství je různý a závisí na druhu léčeného nádorového nebo virového onemocnění. Má se za to, že parenterální léčba nitrožilním, podkožním nebo nitrosvalovým podáváním herbicidních nebo fungicidních látek, je vytvářena pomocí vhodného nosiče. Přídatné protivirové látky se mohou používat společně s herbicidem nebo fungicidem stejně jako mohou být při léčbě kombinovány i přídatné protinádorové látky. Rozpouštědla se používají k usnadnění nanášení nebo podávání látek u teplokrevných živočichů.

Herbicidní nebo fungicidní látky, které se používají k léčbě virových infekcí, se podávají v dávkách po dobu 7 až 21 dnů nebo i déle k utlumení růstu nebo usmrcení viru. V případě chronických infekcí se mohou tyto látky podávat delší časové období až několik let.

K léčbě akutních virových infekcí nebo HIV infekce se používá fungicidní látka podávaná po léčbě AZT nebo v kombinaci s jinou HIV léčbou. Tyto léky se podávají v postupném režimu, kde se nejprve HIV virus v těle oslabí a následně podaná • *« «· ·· ·· ·» • > · »«· ««♦· ···· · ···» · ♦· · «··♦»·· · ► ··« ·< »» ·· ·» ·· herbicidní nebo fungicidní látka zabraňuje jeho dalšímu pomnožování. Léčba pomocí AZT může pokračovat během léčby herbicidní nebo fungicidní látkou. Pokud se onemocnění nachází v časnějších stádiích, herbicidní nebo fungicidní látka se podává, aby bránila pomnožování nebo růstu viru a tím zpomalovala rozvoj onemocnění.

S výhodou se při léčbě zhoubných onemocnění podává nejprve herbicidní nebo fungicidní látka, aby došlo k významnému zmenšení velikosti nádorové hmoty. Toto trvá 3 až 14 dní. Zmenšení nádoru nebo hladiny nádorových buněk dosahuje 50% původní velikosti. Radiační léčba se používá v kombinaci s léčbou herbicidními nebo fungicidními látkami.

Jakmile dojde ke zmenšení nádoru, podává se herbicidní nebo fungicidní látka. Vzhledem k tomu, že se jedná o relativně bezpečné látky, mohou se podávat 14 až 365 dní tak, aby se zachovala účinnost zmenšování znovu narůstajícího zhoubného bujení.

Následující příklady jsou ilustrační a nemají limitovat tento vynález.

Benomyl je methyl-1 -(butylkarbamoyl)-2-benzimidazolkarbamát Karbendazim je methyl-2-benzimidazolkarbamát

Thiabendazol je 2-(4-thiazolyl)-1H-benzimidazol.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zkoušení HIV

Studie replikace HIV viru

Chorpropham a thiabendazol se zkoušely u chronicky nakažených virem HIV. Tyto buněčné populace obsahují včleněné kopie HIV genomu a tím produkují HIV v relativně vysokých hladinách (CEM-SK1, U937-SK1 a H9-SK1 z Frederick Research Center, Maryland) nebojsou skrytě infikovány a produkují virus jenom po stimulaci estery kyseliny forbolové, tumor nekrosis faktorem nebo IL 6 (U1 a ACH2). Produkce viru byla snížena u všech testovaných buněčných linií a látky nestimulovaly virovou produkci u skrytě infikovaných buněk. Bylo zaznamenáno snížení virové produkce kvantitativně pomocí aktivity reverzní transkriptázy, supernatantu p24 stejně jako nitrobuněčné p24,

t toto • · * tototo	«to	toto to ···	• to • « • ·	• · • to • ·
• •	• »
• · ·	•	•	* ·	•	to
• to ·>	• to		··	• ·	··

která určuje, že látka tlumí produkci viru ve stadiu replikace přednostně před tvorbou nitrobuněčných bílkovin.

Kvantifikace nakažlivosti virionů produkovaných nakaženými buňkami dokazuje snížený počet infekčních virionů souběžně se snížením v supernatantu RT nebo p24. Tím se prokazuje, že látky snižují množství produkovaného viru, ale nikoliv kvalitu virionů. Snížení virové produkce u chronicky infikovaných buněk bylo zjištěno u koncentrací, které jsou netoxické pro cílové buňky. Thiabendazol tlumí virovou produkci v koncentracích vyšších než 1 až 10 μρ/ιπΙ zatímco chlorpropham tlumí virovou produkci v koncentracích vyšších než 0,25 pg/ ml.

Toxicita pro chronicky infikované buňky byla obdobná, jako byla zjištěna u neinfikovaných buněk. Zhodnocení působení chlorprophamu a thiabendazolu na chronicky infikované buňky bylo provedeno hodnocením začleněním thymidinu (DNA), uridinu (RNA) a leucinu (bílkoviny) do buněčných makromolekul. Inhibice syntézy buněčných makromolekul souběžně s toxicitou dvou látek nebyla prokázána, jak se předpokládalo, při nižších netoxických koncentracích, ale byla zjištěna inhibice virové produkce u chronicky infikovaných buněk.

Po 28 denní léčbě chronicky infikovaných buněk pomocí těchto látek, toxicita látek na cílové buňky se jeví obdobná jak u infikovaných tak u neinfikovaných buněk. Látky neusmrcují přednostně buňky nakažené HIV virem. Snížení hladiny virové produkce bylo stabilní bylo zjištěno u koncentrací vyšších než 10 pg/ml pro thiabendazol a vyšší než 1 pg/ml pro chlorpropham.

Tyto výsledky nasvědčují, že chlorpropham a thiabendazol dokážou rychle snížit hladinu virové produkce buněčných populací chronicky infikovaných HIV-1 a antivirový účinek se zachovává s prodloužením působením látky.

Toto snížení virové produkce se vyskytuje v koncentracích, které jsou netoxické pro hostitelskou buňku a které nemají účinek na syntézu buněčné DNA, RNA a bílkovin.

Studie virové rezistence

Buňky chronicky infikované HIV virem kultivovány za přítomnosti thiabendazolu v koncentraci 1 μρ/ηιΙ po dobu prvního měsíce, 5 μρ/kg po dobu druhého měsíce, 10 pg/ml po dobu 3. měsíce, 20 a 40 pg/ml po dobu 4. měsíce a 80 pg/ml po dobu pátého až šestého měsíce. Chlorpropham byl použit v koncentracích 1, 2, 4, 8 a 16 pg/ml po ·« * * · ··· • * • · • · ···

• · ·· 0· • ·· ·· ·· dobu každého ze šesti měsíců. Na konci každého měsíce byly buňky hodnoceny z hlediska virové produkce v porovnání s buňkami chronicky infikovanými, které nebyly léčeny těmito látkami. Pro každý ze šesti měsíců pokusné léčby nebyla zjištěna změna antivirového účinu látek a jejich toxicita zůstala stejná. U látek přetrvávala aktivita proti viru HIV a nevyvinula se rychle rezistence cestou selekce rezistentních virů nebo přizpůsobením se buněk na prevenci toxicity vyvolanou látkami. Virová produkce zůstává naprosto potlačena na kulturách léčených thiabendazolem v koncentracích 40 a 80 pg/ml a chlorprophamem v koncentracích 8 a 16 pg/ml.

Znovuobjevení se virové produkce u chronicky infikovaných buněk dříve léčených

Chronicky infikované buňky byly léčeny látkou po delší období, následně byla látka z nich vymyta buňky dále kultivovány, aby určilo, zda-li a kdy dojde k virové produkci.

V těchto testech byly použity kultury, u kterých došlo k úplné eliminaci virové produkce. Tyto kultury zahrnovaly chronicky infikované buňky kultivované za přítomnosti 20, 40, a 80 pg/ml thiabendazolu a 4, 8, a 16 pg/ml chlorprophamu. Během 4 dnů byla obnovena virová produkce v případě, že byly použity nižší koncentrace obou látek (20 pg/ml a 4 pg/ml). Virová produkce byla obnovena při koncentraci 40 pg/ml thiabendazolu 12. den a při koncentraci 8 pg/ml chlorprophamu 54. den. U vyšších koncentrací byla pozorována produkce virů přibližně 70. den.

Nakažlivost buněk léčených chlorprophamem a thiabendazolem

Z buněk, které byly předléčeny chlorprophamem a thiabendazolem po delší časové období, byla vymyta látka a tyto buňky byly použity jako buňky cílové. Tyto buňky byly rozděleny do 3 populací a označeny jako skupina 1, 2 nebo 3. Skupina 1 byla léčena látkou po dobu 24 hodin (ve stejné koncentraci, která byla použita v prodloužené léčebné fázi), dále byla látka vymyta a buňky byly kultivovány za přítomnosti infekčního viru a čerstvé látky. Skupina 2 byla předléčena po dobu 24 hodin, dále byla látka vymyta a buňky byly kultivovány pouze za přítomnosti infekčního viru. Skupina 3 byla kultivována jak v předléčebné fázi tak v infekční fázi pouze v čerstvém médiu (bez viru či látky). Virová produkce u buněčných populací byla identická bez

ohledu na kultivační podmínky. Tyto výsledky dokazují, že chronicky infikované buňky léčené po delší období nebyly superinfikovány HIV.

Doplňkové studie chronické HIV infekce

Buňky U1 chronicky infikované virem HIV-1 byly získány z buněk promonocytární linie U937 akutně infikovaných virem HIV-1. Buňky ACH-2 chronicky infikované virem HIV-1 byly získány z T-buněčně linie A3.01 akutně infikovaných virem HIV-1.

Tyto buňky byly kultivovány v médiu a esteru kyseliny forbolové, PMA. PMA způsobuje, že se buňky (jak U1, tak i ACH-2) aktivují, ale nedělí, ale způsobuje také, že se buňky U-1 diferencují. To vede k tomu, že se sníží počet buněk v kulturách léčených pomocí PMA, ve srovnání s kulturami v médiu nebo kulturami samotnými. Měří se životaschopnost buněk po té, co byly léčeny zbývajícími látkami.

Obě buněčné linie následně produkují malé množství HIV-1. Buněčné linie ACH-2 mají tendenci produkovat více HIV-1 než buňky U1, jak je prokázáno testem p-24 ELISA. Pokud jsou obě buněčné linie kultivovány za přítomnosti PMA, dochází ke zvýšení množství tvorby HIV-1, měřeného pomocí p-24 antigenu metodou ELISA.

Navíc se měří počet buněk, které produkují HIV-1 pozitivní mRNA na jedno mikroskopické pole. Porovnání se provádí tak, že stejný počet buněk se nechá ulpět na skleněném podložním sklíčku pro jednotlivé koncentrace léků (10 χ 10⁶ buněk/ml).

Tyto buňky byly léčeny testovacími vzorky. Thiabendazol v koncentraci 60 pg/ml potlačil replikaci u HIV monocytů o 74 % a replikace HIV u T-buněk se zvýšila o 26 %. Pozitivní kontrolou bylo AZT, které potlačilo replikaci u HIV monocytů o 98 % při koncentraci 1 pg/ml a replikaci HIV u T-buněk potlačilo o 60 %. Terapeutický index (TI), poměr toxické dávky léku k účinné dávce léku pro thiabendazol je 2,8 oproti 12 500 pro AZT.

Model akutní HIV infekce

U modelu akutní HIV infekce in vitro, griseovulvin utlumil virovou replikaci o 98 % při koncentraci 10 pg/ml s terapeutickým indexem 5,3. AZT, známý HIV lék, také utlumil

virovou replikaci o 98 % při koncentraci 1 pg/ml s terapeutickým indexem 12 500. Terapeutický index je poměr toxické dávky léku k účinné dávce léku.

Příklad 2

Testy buněk nádorů tlustého střeva, prsu a plic

Následující testy buněčných kultur byly provedeny k ověření toxicity herbicidních nebo fungicidních látek na lidských buňkách nádorů tlustého střeva, prsu a plic. Životaschopnost buněk byla posuzována zmenšením nádoru za použití MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid). Test MTT je znám pro měření životaschopnosti buněk.

Buňky nádorů tlustého střeva (HT29 z American Type Culture Collection (ATCC) a buňky nádorů prsu (MXI z buněčných linií ATCC) byly kultivovány v Eaglově minimálním základním médiu s 10% fetálním hovězím sérem.

Nádorové buňky byly pasážovány a naočkovány do kultivačních lahví v požadovaných buněčných hustotách. Kultivační médium se slilo a buněčný povlak se omyl dvakrát pomocí fosfátového pufru (PBS). Buňky byly štěpeny trypsinem a rozděleny před naočkováním do kultivačních lahví Pokud není určeno jinak kultury byly inkubovány při teplotě 37 ± 1 °C ve zvlhčeném ovzduší s 5 ± 1 % kysličníku uhličitého. Kultury se nechaly inkubovat do té doby až splývaly z 50 až 80 %.

Buněčné kultury byly neúplně nakultivovány pokud zcela nesplývaly. Medium bylo odsáto z láhve a buněčné povlaky byly dvakrát propláchnuty pomocí PBS. Následně se přidal roztok trypsinu do každé láhve tak, aby pokryl povlaky buněk. Roztok trypsinu se odstranil po 30 až 60 sekundách a láhve se nechaly inkubovat při teplotě místnosti po dobu dvou až šesti minut. Jakmile se 90 % buněk uvolnilo, přidalo se růstové medium. Buňky se potom odstranily rozetřením a přenesly se do sterilní centrifugační zkumavky. Byla určena koncentrace buněk v suspenzi, provedlo se vhodné naředění tak, aby se dosáhlo hustoty 5000 buněk/ml. Buňky se neúplně nakultivovaly do požadovaných jamek 96-jamkových ploten biotestů. (200 mikrolitrů buněčné suspenze na 1 jamku). PBS se přidal do všech zbývajících jamek k zajištění vlhkosti. Plotny se potom před zahájením zkoušené léčby nechaly inkubovat přes noc.

Každá dávka testované látky byla zkoušena na kultuře ve čtyřech jamkách se 100 mikrolitry každého ředění. Do těch jamek, které byly určeny jako rozpouštědlové kontroly, se přidávalo dalších 100 mikrolitrů methanolové kontroly, k negativním kontrolám se přidávalo dalších 100 mikrolitrů léčebného média. Do zbývajících jamek, které nebyly léčeny testovanou látkou ani médiem, se přidával PBS. Plotny se nechaly po té inkubovat po dobu 5 dní.

Na konci 5. inkubačního dne byla každá skupina se shodnou dávkou vyšetřena mikroskopicky k posouzení toxicity. Roztok MTT o koncentraci 0,5 mg/ml se připravil v léčebném médiu a roztok se filtroval přes filtr 0,45 mikrometrů tak, aby se odstranily nerozpuštěné krystaly. Médium se slilo z jamek ploten. Ihned poté se do každé jamky kromě dvou neléčených slepých jamek přidalo 2000 mikrolitrů filtrovaného roztoku MTT. Do dvou slepých jamek se přidalo 200 mikrolitrů léčebného média. Plotny se vrátily zpět do inkubátoru na 3 hodiny. Po inkubaci se slilo médium MTT z jamek, které jej obsahovaly. Přebytečné médium se přidalo do každé jamky a plotny se nechaly protřepávat po dobu 2 hodin při teplotě místnosti.

Absorbance při vlnové délce 550 nm (OD₅₅₀) byla měřena snímačem VMax od firmy Molecular Devices (Menlo Park, CA).

Byla spočítána průměrná absorbance ODssojamek s rozpouštědlovými kontrolami, všech jamek s roztokem testované látky i všech slepých jamek a pozitivních kontrol. Průměr absorbance OD₅₅₀ slepých jamek byl odečten od průměru jamek s rozpouštědlovými kontrolami a od jamek s roztokem testované látky tak, aby byl získán příslušný průměr OD550· % kontroly = korigovaný průměr OD₅₅o roztoku testované látky x 100 korigovaný průměr OD550 rozpouštědlové kontroly

Křivky citlivosti dávky byly zhotoveny jako semi-logaritmické grafy s % kontroly na lineární ose a koncentrací testované látky na logaritmické ose. EC50 byl odečten z grafu pro každou testovanou látku.

Pro testované látky podávané v methanolu byly zhotoveny samostatné citlivosti pro úpravu dat s methanolem.

Adriamycin byl použit jako pozitivní kontrola. Ve všech případech byl více jak o jeden až dva řády více toxický než kterákoliv z testovaných látek. Adriamycin je jednou ze silnějších látek v současnosti používanou a s významnými vedlejšími účinky. Vrcholové plasmatické koncentrace jiných, zcela účinných chemoterapeutických látek jsou 10 až 50 krát vyšší než u adriamycinu.

EC50znamená koncentraci, při které je polovina buněk usmrcena.

Následující tabulky ukazují výsledky těchto testů pro jednotlivé fungicidy a herbicidy. Je také stanoven účinek těchto látek na normální zdravé buňky.

Tabulka č. 1

Testovaná látka

Výsledek EC-50 (ppm)

	HT29	HT29	MXI	MXI	A549	A549
adriamycin	0,03	0,006	0,02	0,001	0,03	0,009
benomyl	0,742	0,747	1,42	2,42	0,980	1,02
karbendazim	0,621	0,662	0,829	0,856	0,856	0,836

U normálních zdravých buněk byly získány následující výsledky.

Tabulka č. 2

Testovaná látka benomyl karbendazim adriamycin buňky průdušek 0,728 0,682

0,320 0,506

0,015 0,0020

EC-50 buňky rohovky 3,26 2,4

0,752 0,822

0,0035 0,0093

fibroblasty
3,24	2,81
1,52	1,42
0,065	0,10

V popisované studii byly použity buňky nádorů plic (A-549), buňky nádorů prsu (MCF-7), a buňky nádorů střev (HT-29). Thiabendazol, systémový fungicid, tyto buňky účinně usmrtil. Tabulka č. 3 shrnuje výsledky.

··· · · · · · · · ···· · · · · · · · · · • · ··· ·· ·· ··· ··· ·····»· · · ····· ·· ·· ·♦ ··

Tabulka č. 3

Koncentrace (ppm)	A-549	Optická hustota MCF-7	HT-29
0-kontrola	0,600	0,245	0,398
173	0,007	0,007	0,005
35	0,411	0,025	0,011
17,3	0,851	0,258	0,204
3,46	1,12	0,466	0,713
0,87	1,32	0,507	0,852

Výsledky testů s chlorprophamem jsou uvedeny v tabulkách č. 4 a č. 5

Tabulka č. 4
Testovaná látka		Výsledek EC-50 (ppm nebo mikrogram / ml)
	HT29	HT29	MXI	MXI	A549	A549
adriamycin	0,003	0,006	0,02	0,001	0,03	0,009
chlorpropham	13,3	11,4	91,8	108	12,6	92,5

Následující výsledky jsou uvedeny pro normální zdravé buňky.

Tabulka č. 5
Testovaná látka	buňky průdušek	EC-50 buňky rohovky	fibroblasty
chlorpropham	0,002	>15,2	3,9	13,0	>152 64,2
adriamycin	0,015	0,0020	0,0035	0,0093	0,065 0,10

Výsledky testů s glyfosfátem jsou uvedeny v tabulkách č. 6 a 7

999 9999

999 9 9999 9 · 9 9

Výsledek EC-50 (ppm)

999999 9 9 • 9 99 9· 99 «9

Tabulka č. 6

Testovaná látka adriamycin glyfosfát

HT29	HT29	MXI	MXI	A549	A549
0,003	0,006	0,02	0,001	0,03	0,009
5,41	3,73	36,5	14,6	25,9	22,3

Následující výsledky jsou uvedeny pro normální zdravé buňky.

Tabulka č. 7

Testovaná látka	buňky průdušek	EC-50
buňky rohovky	fibroblasty
glyfosfát	1,59	3,54	3,09	3,21	86,1 35,8
adriamycin	0,015	0,0020	0,0035	0,0093	0,065 0,10

Byla testována také směs chlorprophamu a glyfosfátu. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách č. 8 a č. 9

Tabulka č. 8

Testovaná látka	HT29	Výsledek HT29
adriamycin	0,003	0,006
chlorpropham	13,3	11,4
glyfosfát	5,41	3,73
směs 1:1*	1,96	1,61

* směs chlorprophamu a glyfosfátu®

EC-50 (ppm)

MXI	MXI	A549	A549
0,02	0,001	0,03	0,009
91,8	108	12,6	92,5
36,5	14,6	25,9	22,3
9,70	8,78	10,8	10,1

Následující výsledky jsou uvedeny pro normální zdravé buňky

Tabulka č. 9
Testovaná látka	buňky průdušek
chlorpropham	0,002	>15,2
glyfosfát	1,59	3,54
směs 1:1*	0,001	0,497
adriamycin	0,015	0,0020

* směs chlorprophamu a glyfosfátu® * směs chlorprophamu a glyfosfátu®

• •	• · · · · · · · ··· · · ··· · ·· ·
• · · · · · ·	• • ·
• · · · ·	• · · ·
EC-50 buňky rohovky	fibroblasty
3,9	13,0	>152	64,2
3,09	3,21	86,1	35,8
0,242	0,286	129	5,95
0,0035	0,0093	0,065	0,10

V tabulce č. 10 jsou uvedeny výsledky testu s propikonazolem

Tabulka č. 10

Testovaná látka	Výsledek EC-50 (ppm)
HT29	MXI	A549
adriamycin	0,00639	0,00078	0,00373
propikonazol	0,0331	0,0284	0,113

Studie leukémie

Myši jsou vybrány randomizovaně a rozděleny do skupin podle léčby. Pět skupin je nakaženo leukémií. Těmto nemocným zvířatům je aplikovaná dávka po dobu pěti dnů, další dny je vynechána, dále je podávána pět dní a další tři dny je vynechána, dále je podávána pět dní a další dva dny vynechána. Toto nepravidelné střídání podávání dávky a vynechávání dávky není sice ideálním režimem, ale výsledky ukazují pozitivní výhodu pro karbendazim^(TM). Jedna skupina myší byla léčena cytoxanem^(TM), 2-[bis(2chlorethyl)-amino-1-oxo-2-aza-5-oxofosforidin, kontrolní skupině byl podáván kanolový olej a třetí skupina byla léčena různými hladinami karbendazimu^(TM), methyl(butylkarbamoyl)-2-benzimidazol karbamát. Byla také použita kontrolní skupina bez léčby. Karbendazim^(TM) byl podáván ve třech různých dávkách 4000 mg/kg, 2500 mg/kg

Ml 4 4 4 4 4 · 4 • ♦•4 4 4 4 4 4 4 44 4 • 4 4 4 4 4 4 · 4 • 4444 44 44 · · · · a 1000 mg/kg. Cytoxan^(TM) byl podáván v dávce 125 mg/kg. Po 8 dnech ztratila skupina myší bez léčby jednu myš, po 10 dnech uhynulo 8 myší a 11. den bylo všech 10 myší uhynulých. Myši ve skupině s cytoxanem^(TM) přežily více než 21 dní. Ve skupině s vyššími dávkami karbendazimu^(TM) uhynula jedna myš14. den, po dvou uhynulo 15., 16. a 17. den a po jedné 20., 21. a 22. den. Průměrný počet dni pro tuto skupinu byl 17,3. Ve skupině se středními dávkami 2 uhynuly 14. den, 4 uhynuly 15. den, 1 uhynula 16. den, 2 uhynuly 19. den a jedna 21. den. Průměrný počet dní pro tuto skupinu byl 16,50. Ve skupině s nejnižšími dávkami uhynulo po dvou myších 12., 13., 14. a 15. den a 1 uhynula 16. a 17. den. Průměrný počet dní pro tuto skupinu byl 14,1.

U myšího modelu in vivo pro leukémii, P388, karbendazol prodloužil dobu přežívání myší v porovnání s kontrolní skupinou o 129 % při dávce 1000 mg/kg, o 148 % při dávce 2000 mg/kg a o 189 % při dávce 4000 mg/kg.

Model zhoubného nádoru u myši

Karbendazim zpomalil růst nádoru u myšího modelu pro zhoubný nádor prsu, plic a střeva. Zhoubné nádory prsu MXI naočkovány podkožně pod kůži myší byly léčeny karbendazimem v dávce 500 mg/kg. Růst nádoru se zpomalil o 42 %. Karbendazim zpomalil nádorový růst u nádoru plic A549 naočkovaného podkožně pod kůži myší o 57 % ve stejné dávce. U hromadného vyšetření myší s podkožně naočkovanými nádory HT29 pod kůži myší se zpomalil nádorový růst o 54 % při dávce 2500 mg/kg karbendazimu.

Cytoxan, který byl podáván zvířatům u myšího modelu pro zhoubný nádor prsu, zmenšil významně nádorovou hmotu. Karbendazim se podával myším v dávkách 4000, 5000 a 6000 mg/kg tělesné hmotnosti do jednotlivých nohou. Nádor dále zmenšoval svoji velikost a jeho opakovaný růst byl omezen dokonce i po 180 dnech léčby karbendazimem. Růst byl závislý na dávce. U kontrolní skupiny léčené cytoxanem došlo k opakovanému růstu po 100 dnech, a po stimulaci estrogenem došlo po 115. dni k rychlému růstu. Dokonce i po estrogenní stimulaci u zvířat léčených karbendazimem nedošlo k významné změně nádorové hmoty. Po 130 dnech byl myším, které byly dříve léčeny cytoxanem, podáván karbendazim (v dávce 4000, 5000 a 6000 mg/kg tělesné

9 9 · 9 9 · 9 · · • · ·· 9 · ·«· 9 · · *

9 9 9 9 9 9 9 ·

9 99 99 99 99 99 hmotnosti). Nádor dále zmenšoval svoji velikost a jeho opakovaný růst byl omezen dokonce i po 180 dnech.

U myšího modelu in vivo pro leukémii (P388) bylo prokázáno, že griseovulvin prodloužil dobu přežití v poměru ke kontrolní skupině o 156 % při dávce 4000 mg/kg, o 188 % při dávce 5000 mg/kg a o 218 % při dávce 6000 mg/kg.

Model melanomu u myši

U myšího modelu in vivo pro melanom, B16, prodloužil karbendazim dobu přežívání oproti kontrolní skupině o 131 % při dávce 1000 mg/kg, o 163 % při dávce 2000 mg/kg a o 187 % při dávce 4000 mg/kg.

Pokud byl karbendazim kombinován s navelbinem od 0,5 mg/kg až po 2,0 mg/kg, byla účinná dávka karbendazimu nižší pro myší model melanomu in vivo.

Dávka karbendazimu (mg/kg)	Dávka navelbinu (mg/kg)	% prodloužení doby přežívání v porovnání se skupinou neléčených myší
4000	0,5	255
4000	1,0	298
4000	2,0	268
2000	0,5	259
2000	1,0	265
2000	2,0	287
1000	0,5	207
1000	1,0	233
1000	2,0	245
—	0,5	190
—	1,0	245
—	2,0	265

• »« ·* ·· *·

9 9 9 9 · 9 9 9·

9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 ·

99999 99 99 99 99

U myšího modelu in vivo pro melanom (B16) prodloužil griseovulvin dobu přežívání oproti kontrolní neléčené skupině o 165 % při dávce 4000 mg/kg, o 179 % při dávce 5000 mg/kg a o 201 % při dávce 6000 mg/kg. Cytoxan při dávce 300 mg/kg prodloužil dobu přežívání o 192 %.

Příklad 3

Hodnocení antivirového účinku u lidského viru chřipky

Samice myši CD (z chovných laboratoří Charles River Breeding, Portage, Ml) byly přijaty k použití ve věku 5 až 7 dní. Myši byly ve věku 6 až 9 týdnů a vážily přibližně 20 až 28 gramů v období na počátku testu. U všech myší, které byly použity v této studii, se nelišil věk o více než 10 dní. Myši byly umístěny do klecí s podestýlkou po 6. Myši byly krmeny potravou pro hlodavce 5002 (PMI, St. Luis Missouri) podle libosti.

Myši byly vystaveny lidskému viru chřipky, řetězec AT2/Taiwan/1/164/. Organismus byl skladován při teplotě -70 °C. Před infekčním kontaktem byly lahvičky se zmraženým obsahem rozmraženy a naředěný do přiměřené koncentrace pomocí pufrovaného fyziologického roztoku. Myši byly anestezovány halotanem a dávka viru o objemu 50 mikrolitrů byla podána nosem.

Testované látky byly podávány v koncentracích a objemu, jak je uvedeno níže. Během 1. až 14. dne deset myší z každé skupiny dostávalo testované látky výplachem úst. Kontrolní zvířata s fyziologickým roztokem (10) dostávala srovnatelný objem fyziologického roztoku v porovnání s myšmi, kterým byla podávaná testovaná látka. Dávkování testované látky bylo prováděno ve 24 hodinových intervalech. Ve dni 0 přibližně 4 hodiny po druhé dávce testované látky nebo fyziologického roztoku, byly všechny myši vystaveny nosem infekční dávce viru vypočtené tak, aby byla zajištěna 90% úmrtnost. Zvířata byla denně pozorována z hlediska nemocnosti a úmrtnosti po dobu 21 dní po vystavení infekční dávce.

·· ·· ·· • · · · · · · • ♦ · testovaná látka flukonazol flukonazol fyziologický roztok amantadin ··· ·· dávka (mg/kg)

350

700 • · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 % úmrtnost 0

30%

100%

0%

Při dávce 175 mg/kg propikonazolu přežilo 40 % myší v porovnání s kontrolní skupinou s fyziologickým roztokem, kde nepřežila žádná. Při dávce 350 mg/kg propikonazolu přežilo 57 % myší.

Příklad 4

Hodnocení antivirového účinku u rhinoviru

V hromadné studii pro rhinovirus, typ A-1, buněčné linie WI-38, byl propikonazol účinný v dávce 32 μg/ml. Pozitivní kontrolou byla A-36683 firmy Abbott, (S,S)-1,2-bis(5 methoxy-2-benzimidazolyl)-1,2-ethandiol. U skupiny A-36683 byl terapeutický index 1000 až 3200. Propikonazol měl terapeutický index 1 až 3. (Viz Schleicher a kol., Applied Microbiology, 23, No. 1, 113 až 116 (1972).

V hromadné studii pro rhinovirus, typ A-1, buněčné linie WI-38, byl griseovulvin účinný v dávce 100 pg/ml. Pozitivní kontrolou byla A-36683 firmy Abbott, (S,S)-1,2bis(5-methoxy-2-benzimidazolyl)-1,2-ethandiol. U skupiny A-36683 byl terapeutický index 1000 až 3200. Griseovulvin měl terapeutický index 1 až 2. (Viz Schleicher a kol., Applied Microbiology, 23, No. 1, 113 až 116 (1972).

Příklad 5

Test tvorby lidské nádorové kolonie in vitro

Solidní nádory, které byly u pacientů odstraněny byly rozdrceny do 2 až 5 mm fragmentů a ihned vloženy do McCoy média 5A s 10% teplem inaktivovaným sérem novorozeného telete a s 1 % penicilinem/streptomycinem. Během 4 hodin byly tyto

			99	99	99	99
• ·		9	9	9	9 9	• ·
• ·	··	9	9	999	• ·	• ·
• ·	•	•	9	9 9	•	•
• ·	99		99	99	99	9 9

solidní nádory mechanicky rozděleny pomocí nůžek, dále propasírovány přes nerezavějící ocelové sítko č. 100, skrze jehlu č. 25 a potom promyty McCoy médiem jak je popsáno výše. Nitrobřišní, pohrudniční a osrdečníková tekutina a kostní dřeň byly získány standardními postupy. Tekutiny nebo dřeň se umístila do sterilních nádobek, které obsahovaly 10 jednotek heparinu bez konzervačních látek najeden ml maligní tekutiny nebo dřeně. Po centrifugací při 150G po dobu 10 minut byly buňky vyjmuty a promyty McCoy médiem s 10% teplem inaktivovaným telecím sérem. Životaschopnost buněčné suspenze byla určována hemocytometrem s trypanovou modří.

Buňky byly klonovány a suspendovány v 0,3% agaru, obohaceném CMRL 1066, doplněným 15% teplem inaktivovaným koňským sérem, penicilinem (100 jednotek/ml), streptomycinem (2 mg/ml), glutaminem (2 mmol), inzulínem (3 jednotky/ml), asparaginem (0,6 mg/ml) a HEPES pufrem (2 mmol). Pro nepřetržitý expoziční test se přidává každá látka do výše uvedené směsi. Buňky se umístí do 35 mm Petriho misek mezi dvě vrstvy agaru, aby se zabránilo růstu fibroblastů. Tři plotny se připravují pro každý experimentální bod. Plotny se umístí do inkubátoru 37°C a vyndají se 14. den, který se počítá pro každý počet kolonií na každé plotně. Počet kolonií (definovaných jako 50 buněk) vytvořených na třech plotnách léčených látkami je porovnáván s počtem kolonií vytvořených na třech kontrolních plotnách. Stanoví se procento kolonií, které přežívají při určité koncentraci dané látky. Tři plotny jako pozitivní kontroly se používají k určení stupně přežívání. Jako pozitivní kontrola se používá orthovanadičnan sodný v koncentraci 200 pg/ml. Test se vyhodnocuje, pokud je přítomno méně než 30 % kolonií na plotnách s pozitivními kontrolami v porovnání s kontrolními neléčenými plotnami.

Při pokusu s jednoduchou dávkou byl propikonazol při koncentraci 0,5 a 5,0 pg/ml neúčinný (0/1) proti nádorům. Při koncentraci 50,0 pg/ml při pokusu kontinuální expozice byl propikonazol účinný proti nádorům tlustého střeva, plic (nemalobuněčného), melanomu a zhoubným nádorům vaječníků. U 6 z 8 bylo < 50% přežívání.

Při pokusu s jednoduchou dávkou byl griseovulvin při koncentraci 0,5 a 5,0 pg/ml neúčinný (0/1) proti nádorům. Při koncentraci 50,0 pg/ml při pokusu kontinuální expozice byl griseovulvin účinný proti nádorům tlustého střeva, plic (nemalobuněčného), a zhoubným nádorům vaječníků. U 5 z 6 bylo < 50% přežívání.

• 9 9 9 99 9* 99 • 9 9 · 9 9 9 · ♦ ♦· · 9 9 9 · · ·· 9

9 9 9 9 9 · 9

99 99 99 99 99

Při pokusu s jednoduchou dávkou byl flukonazol při koncentraci 0,5 a 5,0 gg/ml neúčinný (0/3 resp. 0/13) proti nádorům. Při koncentraci 50,0 pg/ml při pokusu kontinuální expozice byl flukonazol účinný proti nádorům plic (nemalobuněčného), a zvláště zhoubným nádorům vaječníků. U 4 z 13 bylo < 50% přežívání.

*» ·· ·· ·· toto »·· ··· 9 9 9 9

9 99 9 9 999 9 9 9 9

999 99 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 99 99 99 99

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutický přípravek pro léčbu virových infekcí u teplokrevných savců vyznačující se tím, že obsahuje 700 mg až 6000 mg látky vybrané ze skupiny, která se skládá z herbicidů, fungicidů, derivátů herbicidů, derivátů fungicidů a jejich směsí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že virová infekce je způsobena virem, který obsahuje genetický materiál z rostlin, hub a plísní.
3. 3. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že virovou infekcí je HIV infekce.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle nároku 3 vyznačující se tím, že se do sloučeniny přidává antivirová látka, s výhodou inhibitor transkriptázy nebo inhibitor proteázy.
5. 5. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, 2, 3 nebo 4 vyznačující se tím, že obsahuje 3000 až 6000 mg zmíněného herbicidu nebo fungicidu.
6. 6. Farmaceutický přípravek podle nároku 5 vyznačující se tím, že se připravuje v tekuté formě vybrané ze skupiny, která obsahuje vodné roztoky, alkoholové roztoky, emulze, suspenze a suspenze vytvořené z nešumivých a šumivých přípravků a suspenzí ve farmaceuticky přijatelných tucích nebo olejích.
7. 7. Farmaceutický přípravek podle nároku 3, 4 nebo 5 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému farmaceutickému přípravku přidává HIV lék.
8. 8. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému farmaceutickému přípravku přidává potenciátor.
9. 9. Farmaceutický přípravek pro léčbu zhoubných nádorů vyznačující se tím, že obsahuje 700 mg až 6000 mg látky vybrané ze skupiny, která se skládá z herbicidů, fungicidů, derivátů herbicidů, derivátů fungicidů a nebo jejich farmaceuticky přijatelné přídatné soli organických nebo anorganických kyselin s farmaceuticky přijatelným nosičem.
10. 10. Farmaceutický přípravek podle nároku 9 vyznačující se tím, že nádorově buňky obsahují genetický materiál z rostlin, hub a plísní.

    • ·· 00 ·* 00 00

    00 0 · · 0 · 0 · 0

    0 0#· · · · · 0 · 00 0

    0 0 000 00 00 000 000 000 0000 0 0 000 00 00 00 00 00
11. 11. Farmaceutický přípravek podle nároku 9 nebo 10 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému farmaceutickému přípravku přidává potenciátor.
12. 12. Farmaceutický přípravek podle nároku 10 nebo 11 vyznačující se tím, že obsahuje 3000 až 6000 mg zmíněného herbicidu nebo fungicidu nebo derivátu fungicidu, nebo derivátu herbicidu.
13. 13. Farmaceutický přípravek podle nároku 12 vyznačující se tím, že ke zmíněnému herbicidu nebo fungicidu se přidává chemoterapeutická látka.
14. 14. Farmaceutický přípravek podle nároku 13 vyznačující se tím, že zmíněná chemoterapeutická látka je vybrána ze skupiny skládající se z látek působících na DNA, antimetabolitú nebo látek působících na tubulín, s výhodou asparaginasa, hydroxymočovina, cisplatina, cyklofosfamid, altretamin, bleomycin, daktinomycin, doxorubicin, etopozid, tenipozid a plikamycin, metotrexát, fluorouracil, fluorodeoxyuridin, CB3717, azacytidin, cytarabin, floxuridin, merkaptopurin, 6-thioguanin, pentostatin, cyktrabin a fludarabin.
15. 15. Farmaceutický přípravek podle nároku 14 vyznačující se tím, že zmíněná chemoterapeutická látka je ve formě liposomálních částic.
16. 16. Farmaceutický přípravek podle 9,10,11,12,13,14 nebo 15 vyznačující se tím, že se použije 0,5 mg až 400 mg chemoterapeutické látky.
17. 17. Farmaceutický přípravek podle nároku 13,14,15 nebo 16 vyznačující se tím, že zmíněný herbicid nebo fungicid je v tekuté formě vybrané ze skupiny, která obsahuje vodné roztoky, alkoholové roztoky, emulze, suspenze a suspenze vytvořené z nešumivých a šumivých přípravků a suspenzí ve farmaceuticky přijatelných tucích nebo olejích.
18. 18. Způsob přípravy farmaceutické látky pro léčbu virových infekcí u teplokrevných savců vyznačující se tím, že se smíchá bezpečné a účinné množství látky vybrané ze skupiny skládající se z herbicidů, fungicidů, derivátů herbicidů, derivátů fungicidů, jejich farmaceuticky přijatelné přídatné soli organických nebo anorganických kyselin a jejich směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem.
19. 19. Způsob přípravy podle nároku 1 vyznačující se tím, že zmíněná látka se připravuje k léčbě virové infekce způsobené virem, který obsahuje genetický materiál z rostlin, hub a plísní.

    • ·· ·* • to ·· • » • • • • • • to • ··· • • • • • · • i · • · · « • • ·· • 9 • · • · • • • ·
20. 20. Způsob přípravy podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že zmíněnou virovou infekcí je HIV infekce.
21. 21. Způsob přípravy podle nároku 3 vyznačující se tím, že se do sloučeniny přidává antivirová látka, s výhodou inhibitor transkriptázy nebo inhibitor proteázy.
22. 22. Způsob přípravy podle nároku 1, 2, 3 nebo 4 vyznačující se tím, že se kjejí přípravě používá 3000 až 6000 mg zmíněného herbicidu nebo fungicidu.
23. 23. Způsob přípravy podle nároku 5 vyznačující se tím, že směs se připravuje v tekuté formě vybrané ze skupiny, která obsahuje vodné roztoky, alkoholové roztoky, emulze, suspenze a suspenze vytvořené z nešumivých a šumivých přípravků a suspenzí ve farmaceuticky přijatelných tucích nebo olejích.
24. 24. Způsob přípravy podle nároku 3, 4 nebo 5 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému herbicidu nebo fungicidu přidává HIV lék.
25. 25. Způsob přípravy podle nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému farmaceutickému přípravku přidává potenciátor.
26. 26. Způsob přípravy farmaceutické látky pro léčbu zhoubných nádorů vyznačující se tím, že se přidá bezpečné a účinné množství herbicidu, fungicidu, derivátu herbicidu, derivátu fungicidu, nebo jejich farmaceuticky přijatelné přídatné soli organických nebo anorganických kyselin s farmaceuticky přijatelným nosičem.
27. 27. Způsob přípravy podle nároku 9 vyznačující se tím, že zmíněný farmaceutický přípravek se připravuje k léčbě zhoubného nádoru, který obsahuje genetický materiál z rostlin, hub nebo plísní.
28. 28. Způsob přípravy podle nároku 9 nebo 10 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému farmaceutickému přípravku přidává potenciátor.
29. 29. Způsob přípravy podle nároku 11 vyznačující se tím, že se přidává 2 mg až 4000 mg zmíněného herbicidu nebo fungicidu nebo derivátu fungicidu nebo derivátu herbicidu.
30. 30. Způsob přípravy podle nároku 11 vyznačující se tím, že se ke zmíněnému herbicidu nebo fungicidu přidá chemoterapeutické látka.
31. 31. Způsob přípravy podle nároku 13 vyznačující se tím, že zmíněná chemoterapeutické látka je vybrána ze skupiny skládající se z látek působících na DNA, antimetabolitů nebo látek působících na tubulín, s výhodou asparagináza, hydroxymočovina, cisplatina, cyklofosfamid, altretamin, bleomycin, daktinomycin,

    ♦ ·· ·« ·· • » * · » · • ♦ • • • • ··· « · 4 · · • • • • • · · • » • · C « Φ · · · «» « · «· • ·

    doxorubicin, etopozid, tenipozid a plikamycin, metotrexát, fluorouracil, fluorodeoxyuridin, CB3717, azacytidin, cytarabin, floxuridin, merkaptopurin, 6-thioguanin, pentostatin, cyktrabin a fludarabin.
32. 32. Způsob přípravy podle nároku 14 vyznačující se tím, že zmíněná chemoterapeutická látka je ve formě liposomálních částic.
33. 33. Způsob přípravy podle nároku 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 vyznačující se tím, že se přidá 150 až 4000 mg zmíněného herbicidu nebo fungicidu a používá se 0,5 mg až 400 mg chemoterapeutické látky.
34. 34. Způsob přípravy podle nároku 13, 14, 15 nebo 16 vyznačující se tím, že zmíněný herbicid nebo fungicid se připravuje v tekuté formě vybrané ze skupiny, která obsahuje vodné roztoky, alkoholové roztoky, emulze, suspenze a suspenze vytvořené z nešumivých a šumivých přípravků a suspenzí ve farmaceuticky přijatelných tucích nebo olejích.