CZ100494A3

CZ100494A3 - Process and composition for determining immunobiological activity of biologically active cytokin-inducing immunomodulator substances

Info

Publication number: CZ100494A3
Application number: CZ941004A
Authority: CZ
Inventors: Anna Inglot; Zofia Blach-Olszewska
Original assignee: Torf Ets
Priority date: 1991-10-26
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1994-11-16
Also published as: EP0539610A1; GR930300100T1; NO941444D0; DK0609255T3; BG61705B1; HU9401185D0; AU2650992A; WO1993008470A1; US5543300A; DE609255T1; JPH07500905A; EP0609255B1; DE69220078D1; GR940300077T1; EP0609255A1; SK44094A3; LV12140A; ATE153763T1; HU216863B; ES2061424T3

Description

Předkládaný vynález se týká způsobuj a~komprrz±T?er pcu- zkoušení určitých: bioaktivních. substancí a stanovení jejich?· imunologické aktivity s ohledem?; nu jejich schopnost indukovat produkci cytokinů^ÚCytokiny, jako interferony (ZFTT) a tumor nekrosis faktory (TEN) jsou hormonům podobné proteiny, které hrají důležitou úlohu prakticky ve všech imunologických reakcích, jakož i v regulačních, procesech odpovědných? za udržování homeostásy. Produkce takových cytokinů může? být indukována určitými substancemi, které jsou podle své bioaktivní a imunomodulační aktivity, využitelné' v terapií imunodeficiencí a chorob, které se jich týkají.

Dosavadní stav techniky

Existuje pochopitelně základní potřeba metod pro správné a snadné zkoušení imunologické aktivity takových bioaktivních substancí. Objektem předkládaného vynálezu je poskytnutí takové metody.

Metoda podle vynálezu dovoluje určit, zda testovaná substance je schopná indukovat produkci různých cytokinů a dovoluji? rychlé a efektivní ověření vlastností jistých substancí, zejména jejich imunologickou aktivitu, v každém stupni produkce, separace, purifikace a formulace do finálních kompozic. Předkládaný vynález také' poskytuje kompozice a kity vhodné pro provedení zmíněných metod.

Testů, dosud užívaných pro určení imunologické aktivity je řada, ale jsou obtížně proveditelné. Když je

-2klinicky testována nová terapeutická kompozice, mající imunologický efekt, je^jejl imunologická efektivnost, hodnocena monitorováním množství dobře známých a analyticky určitelných vlastností: imunologických systémů a využitím: standardních metod* Jakmile je aktivita prokázána, vystoupí potřeba jednoho reprezentativního- testu;, schopného rychlého ověření atavu pacienta ve smyslu; jeho nebo její.' imunologické odpovědi.

V klinických studiích· může být stanoveni IFIí v séru obtížné, nepřesné a vedoucí k chybě. Interferon.y jsou často produkovány lokálně v různých tkáních, mají krátkou životností, jejich akce je paralelní (v jejich bezpros třeď“ním okolí) a jsou silně vázány na buněčné receptory a proteinové nosiče*

Na druhé straně terapeutické procesy pro zpracování, purifikaci a/nebo separaci imunologicky aktivních; substancí jako jsou zejména extrakty ze siuroyéccašeliny jsou obvykle mnohostupňové procesy a je zde vždy potřeba vytvořeni spolehlivého.· a rychlého testu, schopného průběžné kontroly produkce. Navíc., protože substance jsou často komplexní povahy jako v případě rašelinových extraktů·, je důležitá: mít stejný test pro určeni aktivity individuálních frakcí takových substancí. Je také nezbytné objevit mikro-testovací metodu,, protože testované produkty jsou velmi nákladné.

Následující čtyři základní zjištění umožňuji vyřešit výše popsané problémy:

. Některé imunoaktivní rašelinové extrakty indukují produkci cytokinů, jako jsou interferony a tumor-nekrotizující faktory, v in vitro kulturách periferních krevních leukocytů, kdy indukce je závislá na dávce;.

-a2. Interferon-^b ( a TNF-d.) je produkován! ve významně vyšším množství BALB/c myšími rezident peritoneélnímí buňkamífRPC), jsou-li ošetřeny imunoaktivními rašelinovými extrakty ve srovnání se spontánním uvolněním těchto cytokinů v neošetřených vzorcích.

3. úi_né rašelinové extrakty, jsou-li testovány in vitro, jak je uvedeno výše, vykazují synergistický účinek v kombinaci, se známými imunomodulátory, jako jsou sloučeniny organoselemr, p-chlorfenylamid kyseliny 3-methyl5-benzoylamino-isothiazol-4-karboxylové a indomethacln. To umožňuje¹ použití' mnohem menších množství imunologicky aktivní substance, pro prokázání jejich aktivity.

4. PBL zdravých dobrovolníků ošetřených TTP (určitý produkt získaný z rašeliny) podávaným orálně v dávce 5 mg/den, testovaných na indukci určitých cytokinů,

IFN’- a TNF-c< , ztratily schopnost odpovídat na indukci cytokiny s TTP roztokem po prodlouženém^ nepřerušovaném podání TTP orálně a znovu získaly .tuha schopnost po přibližně 2 týdnech vynechání.

Podstata vynálezu

Metoda podle předloženého vynálezu zahrnuje stupně stupně ošetření lidských periferálních krevních leukocytů (PBL) kulturou nebo suspenzí BALB/c myších rezidentních peritoneálních buněk (RPC), roztokem testované substance za účelem indukce produkce cytokinů a potom stanovení uvedených cytokinů standardními identifikačními metodami.

Kultura leukocytů periferní krve (PBL) použitá podle první varianty nebo prbvedení .rychlé.metody je krátkodobá kultura připravená z čerstvých leukocytů zdravých lidí se živným mediem, vhodným pro tkáňovou kulturu.

-4Preferovaná hustota kultury připravené pro použitf je asi 8 x IQ^ leukocytů/ml. Roztok se pro testování výhodně používá' v koncentraci 0,1 až 200 /Ug/ml. Metoda je zejména vhodná pro: testování rašelinových extraktů.

hiikrostanovenf je možné,jestliže roztok, který je testován, např- rašelinový extrakt nebo jeho frakce, je smísen s imunomodulačním činidlem·, jako je nesteroidní protizánětlivé léčivo, výhodně substance, zvolená ze skupiny, zahrnující organoselenové sloučeniny, jako je ebselen, některé isothiazolové deriváty jako je p-chlorfenylamid kyseliny 3-methyl-5-benzoylaminoisothiazol-4karboxylové a indomethacin, jakož i analogy, homology a meetabolity takových substancí.

Příklady organosélenových: sloučenin, které mohou být použity pro tento účel· jsou sloučeniny následujících! vzorců 1 až 3, preferována je sloučenina vzorce 2 (Ebselen) :

) bis-/2-(N^-fenylkarboxamiďb)/-fenyldiselenid

3) bis3-/2-(N-(2-pyridyl)karboxamido)/-fenyldiselenid

Příklady isothiazolových derivátů, které mohou být použity pro výše uvedený účel jsou sloučeniny obecného vzorce I

CH-Cff- CONHR.

|l H

G-- NHCOR_? (I) kde R₁ je halogenfenyl, výhodně chlorfenyl, R₂ je fenyl a R-j j_e nižší alkyl, výhodně methyl* Atom halogenu. v halogenfenylové skupině, chiorfenylové skupině R, je vý hodně v p-poloze fenylového kruhu.

-6Výhodnou sloučeninou výše uvedeného vzorce I je p-chlorfenylamid kyseliny 3-methyl-5^_benzoylamino-isothiazol-4-karboxylové, t j . sloučenina vzorce I, kde 3^ je p-chlorfenyl, je fenyl a je methyl* Pro zkrácení bude tato sloučenina dále označována jako sloučenina ΙΤΟΊΛ.. Tato existuje pod ochrannou známkou 7RATIZ0LIN^Rmv Polsku. Tejí syntéza a vlastnosti jsou popsány v Arch. Immunol. at Ther.Exp.1973, 21, 891.

Všechna imunomodulační činidla uvedená výše jako použitelná pro mikrostanovení, tj. organoseleniové sloučeniny, isothiazolové deriváty a indomethacin, mají společné to, že jsou to nesteroidní protizánětlivé látky, které inhibují syntézu prostaglandinů. Posilují výsledky testů v metodě podle předloženého vynálezu. Z tohoto hladiska jsou zvláště vhodná pro mikrostanovení. Zesílení výsledků může být 5 až 20násobné.

Ze všech, různých; nesteroidních protizánětlivých sloučenin vhodných: prn účely zesílení, jsou preferovány selenoorganické sloučeniny (£,2 a 3) a sloučenina ITGL, ale zejména indomethacin.

Předložený vynález; využívá různá antisera, která rozpoznávají individuálně indukované cytokiny. Tato séra jsou známá a používaná pro testování a standardizaci různých cytokinů. Identifikace indukovaných cytokinů by měla být provedena v momentě dovršení formace cytokinů a před jejich proteolýzou. Mezi různými indukovanými cytokiny jsou některé vytvořeny pomalu a zústávájí stabilní v roztoku, jako například interferon^, zatímco ostatní jsou tvořeny rychle a jsou náchylné k proteolýze, jako například tumor? nekrosis faktory.

-7Metoda, jak je popsána výěe, může být použita také pro stanovení imunologické odezvy lidského individua na určitou imunoaktivní substanci, s podmínkou, že taková imunologická odpověá není stimulována jinými faktory, jako například virovými nebo bakteriálními infekcemi. Může být aplikována pro sledování lékové odezvy u jednotlivých pacientů, pro stanovení optimální dávky terapeutického induktoru cytokinu, jaká je TTP, jakož i pro stanovení účinného schéma podávání léčiva. Metoda je založena na hodnocení hyporeaktivního stavu k IFN indukci.

Předložený vynález se také týká metody pro stanovení imunologické odezvy lidského individua k terapii používající cytokinin indukující imunomodulátorovou substanci. Uvedená metoda je charakterizována tím, že kultura leukocytů periferní krve (PEL) lidských individuí, ošetřená takovou imunomodulátorovoui substancí, je ošetřována w definovaných; časových intervalech¹ roztokem substance podávané za účelem: indukce produkce cytokiniŮ, které' pak jsou stanoveny standardními metodami (zahrnujícími ELISA testy cytokinů), za účelem¹ stanovení momentu, vývoje hyporeaktiviťy k substanci po prodlouženém podávání substance' a momentu znovuobjevení schopnosti odpovídat na další dávku substance po určité periodě vynechání. Oasové intervaly jsou výhodně asi 7 až 14 dnů.

Ve výhodném provedení je výše uvedená metoda aplikována v průběhu terapie, využívající rašelinové extrakty jako cytokin indukující imunomodulátorovou substanci.

Podle zvláště výhodného provedení vynálezu je tato metoda aplikována v průběhu terapie používající TTP jako substanci imunomodulátorovou, indukující cytokin a TIP je, inter alia, subjektem PCT přihlášky č. PCT/EP92/00491,

-8kde je TTP, jeho charakteristiky a jeho produkce popsána podrobněji.

Z výše uvedeného hlediska se tento vynález také týká TTP, kdykoliv je použit, testován nebo stanovém podle metod předloženého vynálezu.

Předložený vynález také poskytuje, ve své druhé variantě, testovací metodu, která je vhodná pro rychlé monitorování technologických procesů pro výrobu, čištění dělení a podobně imunoaktivních substancí. Například, je-li suspenze BALB/c;· myších rezidentních, peritoneálnícfr buněk (RPC) ošetřena roztokem, který je testován, jsou indukovány myší interfaron- jakož i tumor nekrosis faktor.

Oba mohou být detegovány a kvalitativně stanoveny podle standardních identifikačních metod. V této metodě se použije suspenze čerstvých myších rezidentních: peritoneálních buněk (RPC), obsahující přibližně 1 x 10^ buněk/ml. Testovaný roztok se připraví v živném mediu Eagle nebo RPMT-1640 s přídavkem 10% fetálního telecího séra. Získané výsledky se hodnotí.' proti kalibrační křivce připravená- s modelovou? substancí, ^ako modelová substance může být použití, vzorek téže imunologicky aktivní substance testovaná· tradičním způsobem. Opět je metoda zvláště vhodné pro monitorování procesu? pra. získání rašelinových extraktů jakož i pro analýzu: jejich frakcí.

Předložená metoda je velmi jednoduchá a účinná ve srovnání s jinými známými metodami, protože je založena na přímé indukci interferonu/3 místo - jako v případě mnoha konvenčních testů - na sekundárním’, účinku tvorby protilátek. Νθηί možná nalézt jakoukoliv podobnou metodu? díky tomu·, že se imunosystém myši významně odlišuje od lidského imunosystému?a testy považovaných za indikativní pro

-9lidskou imunologickou odezvu - jako je přítomnost interferonů ve tkáníck sleziny nebo lymfonodech atd. - a tedy se nepracuje s nejlepšími laboratorními zkušebními zvířaty, tj. s myší BALB/c typu.

Nyní bylo nalezenu, že čistá imunologická pdezva BALB/c myši může být získána, jestliže rezidentní peritoneální buňky (RPC) jsou zvoleny jako biologický materiál pro testování' a použije se čertsvá suspenze takových buněk.

Pro takový test je dostačující usmrcení tří zvířat. Výsled⁷ky se získají během několika hodin.. Biologický materiál může být také kultivován' a určena odpovídající linie makrofágů.

Způsob podle předloženého vynálezu využívá biologický materiál, zejména kulturu leukocytů periferní krve (PBL) nebo suspenzí BALB/cs myších rezidentních peritoneálních buněk (RFC), podle výše uvedené informace. Přítomnost a koncentrace každého cytokinu je stanovena metodami pro testování a standardizaci interferonů známých z Methods ino Enzymology, 1986, vol.119, část C:“Interferon, vydáno Sudney Pestka. Stahovení celého spektra cytokinů, které jsou indukovány, identifikuji imunologický stav pacienta.

Pro správné vyhodnocení výsledků je podstatné, že biologický materiál pro provedení- obou variant metody podle vynálezu je vybrán od správných dárců. V případě lidských leukocytů, vzorky odebrány od individuí', která vykazují hyporeaktivitu (vzácný stav), tj'. nízká hladina imunologické odezvy, by měly bý vyloučeny z hodnocení. V případě BALB/c myší RPC suspenze, vzorky odebrané od dále stimulovaných zvířat (například infikovaných) by měly být

c.

-10také vyloučeny z hodnocení'. V případě BALB/c myči RPC suspenzí, by vzorky neměly být odebírány od příliš mladých nebo příliš starých zvířat, protože existuje na stáří závislá nedostatečnost produkce cytokinů u těchto myší.

““šly by být vybrána zdravá zvířata stará 5 až 8 týdnů. Vzorky, vykazující velmi vysokou spontánní produkci cytokinů by měly být eliminovány, zejména když jsou testovány imunoregulátorové substance, pc když·, nebyla pozorována žádná poterrciace indukce cytokinur nebo někdy i redukce takové indukce.

Provedení metody podle předloženého vynálezu’, kde se zesílení výsledků dosáhne přimíšením nesteroidního protizánětlivého léčiva (jedné ze substancí uvedených, výše, jako je sloučenina ITCL nebo selenoorganická sloučenina 1,2 a 3j ale výhodně indomethacin) k testovanému roztoku, je mikrotest zvláště vhodný pro stanovení indukované TNP a LFN aktivity. Test je ekonomický, rychlý, použitelný.pro stanovení velkého počtw vzorků současně a vhodný pro standardizaci a alespoň částečně, automatizaci.

Podrobněji jsou dále popsány dvě varianty metody podle předloženého vynálezu dále v příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příprava roztoku testované substance·

Testovaná substance, např. rašelinový extrakt, se rozpustí ve sterilní dvakrát destilované vodě v koncentraci 10 mg/ml. Vzorky se sterilizují filtrací přes 0,45 /um,

600 kPa max Millipore^R, antibakteriální filtry. Dáléíser roztoky vyrobí v kompletním; RPMI-1 640 mediu, obsahujícím teplem inaktivované fetální hovězí sérum (FBS).

-1 ΙΑ) PBL-varianta:

Indukce cytokinu

Sražené leukocyty z krve zdravých dárců mohou být^získány z regionálních transfuzních center. Alternativně, leukocyty periferní krve (PBL) mohou být izolovány z heparinizované venozní krv.e zdravých dobrovolníků Ficoll-Hypaque (nebo Histopaque ) denzitním gradientem (g = 1,077) odstředění, s následující dvojnásobným promytím buněk. Erytrocyty byly lyžovány NH^Cl ošetřením podle čantella a spoKCantell K., Hirvoneni S., Kauppiner IT.L.: Production and' Partial Purificationi of Human Imrnune Interferon.Meth. Enzymol.119, 54, 1988). Byly použity leukocyty od jediného dárce, obsahující přibližně 8 x 10^ leukocytů/ml v RPMI 1640· mediu, doplněném 10 % fetálního hovězího sera (FSS), L-glutaminem· a antibiotiky. Všechny podíly FBS byly předem testovány. Byly použity pouze nemitogenní F5S' pro PBL kultury. Induktory cytokinu? byly přidány k 200 až 1000 /ul objemů kultur. Induktory cytokinu byly fytohematoaglutinin (PHA) (Pharmacia Fine Chemicals, Švédsko nebo Sigma, USA). Indukované kultury PBL byly inkubovány v atmosféře 5 % CO? ve vzduchu při 37 °C po 20 hodím a odstředěny. Supernatanty byly uchovávány při 4 Ca slednvána IFfF aktivita během jednoho týdne. Supernatanty pro stanovení TNP aktivity byly uchovávány při -90 °C nebcc v kapalném dusíku pro zabránění inaktivace proteolýzou.

Zkouška interferonu

Splývající monovrstvy A549 buněk byly připraveny v mikroplotnách v Dulbecco-modifikovaném Minimum Essential Medium

-124 (DMEM) s 10% FBS, L-glutaminem· a antibiotiky (penicilín 100 jednotek/ml a streptomycin 100 /ug/ml. IFN'vzorky zředěné v plotnách byly přidány k buněčné monovrstvě a inkubovány při 37 °C 20 h v 5% CO₂ ve vzduchu?. Buňky pak byly promyty a imunologicky zkoušeny s virem encefalomyocarditis (EMCV). Titr lfN byl definován jako, ředění IFN vzorkuj které redukuje virový oytopatogenní efekt z 50 % po 48 hodinách inkubace. MTT' (3-/4,5-dfimethylthiazol-2-yl/2,5>-difenyltetrazoliumbromid ) metoda (Hansen M.B*., Nielsen S.E a Berg K.: Re-examination. and Further Development of Preeise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Growth/ Cell Kill. «I, Immunol.Meth. 1 989, 119, 203 až 210), pro měření usmrcení buněk v ELISA Scaneru byla také použita. Laboratorní standardy IFN byly zahrnuty do všech zkoušek např. rekombinantní lidský IFN-Cp (specifická aktivita 2 x 10^ jednotek/mg), přirozený lidský leukocytový IFN )3x10 Itl/ml) a IFN- (2x10 ⁶ iU/ml).

TNF zkouška

Cytotoxická aktivita TNF byla měřena v ^929 buňkách podle Flicka a Gifforda (Fllck D.A., Gifford G.E.: Comparison'. of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor, <1.Immunol.Mth.68, 1667, 1984). Vzorky a roztok aktinomycinu D (5* /ug/ml) byly přidány k monovrstvým kulturám buněk. Po inkubaci při 37 °G po 20 hodin, byly stanoveny cytotoxická účinky TNF byly stanoveny buč při mikroskopickém hodnocení kultur nebo použitím? MTT' metody. Množství, působící přibližně 50% destrukci buněčné kultury bylo definováno jako jedna jednotka TNF aktivity. Porovnání s TNF~y (Genentěch lne., USA) ukazuje, že 1 jednotka ve zkouš ce je rovna 100 až 200 pg/ml TNF.

-13Zkouška neutralizace cytokinu

Cytokiny produkované PBL ošetřenými zkoušenými přípravky mohou být identifikovány neutralizační studií? se specifickými protilátkami (Inglot a spol., Organoselenides as potential immunostímulants and inducers of interferon gamma and other cytokines in human. peripheral bloodř leukocytes, Experientia 1990, 46/ 308-311)· Dále mohou být aplikovány různé ELISA kity pro stanoveni imunoaktivity definovaného cytokinu·Poznámka i

V supernatantech získaných z kultivovaných lymfoidních buněk ROhOVt být nalezeny jiné cytokiny než TNF nebo IFNT a identifikovány jinými standardními metodami, např- interleukiny (IL-1-10), G7-CSF, TGF-/3 atd.

B) RPC varianta: indukce cytokinu;

Myší rezidentní peritoneální buňky (RPCj se získají z přibližně 6 týdnů starých. BALB/c myší usmrcených- etherem, injektováním 5 ml kompletního RPMI 1640 media do peritoneální dutiny při teplotě místnosti. Promývací mediuat, obsahující RPG se shromáždí do ledem chlazených 50 mL odstředivkových zkumavek» RPG se ani nepromývá ani neodstře áuje. Buňky se spočtou v Bůrkerově hemocytometru; a suspendují na hustotu; 1-1,5x10^ buněk/ml- Taková buněčná hustota je vyžadována pře. všechna měřeni účinků různých, koncentrací přípravku (od 0,1 do 500 /Ug/ml). Ve všech testech jsou zahrnuty negativní a pozitivní kontroly. Negativní kontrola měří spontánní uvolněni TNF nebo IFN

-14RPC inkubovaného ss kompletním RPMI-1640 mediem bez: induktorčř, zatímco pozitivní kontrola okazuje účinek standardního lipopolysacharidového induktorir (LPS z E.coll 055:85 Sigma 1-IQ /Ug/ml). Všechny kultury se inkubují při 26 °C 20 h. Potom se kultury odstřeďují při 1000 ot/min 10 min a supernatanty se shromáždí. Za použití automatické pipety se suspernatanty zředí 1:2 až 1:256.

Siozkouáka cytokinů

Pro stanovení TNF aktivity v supernatantech z RPC kultur byly použity 20 h staré monovrstvy L^g buněk.

* 4

Myší fibroblastům: podobné buňky, 2 x 10 buněk na jamku v 100 yul kompletního media, se naočkují do 96-jamkových ploten s plochým dnem a inkubují se 20 h při 37 °C za účelem získání monovrstvy.

Transfer supernatantů musí být velmi přesný. Inkubace 1^529 kultur se provádí po 24 hodin: při 37 C v atmosféře 5% CO2 ve vzduchu.

Hodnocení:

) Cfcení cytotoxických účinků pod reverzním mikroskopem.

2) MTT test (3-(/4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl) tetrazolium-bromiď, Sigma).

Pro měření usmrcení buněk ^2^ buněčnými kulturami se do každé jamky mikroplotny přidá 25 yul .řřoztoku; MTT barviva.

Dále se plotny inkubují-' po 2 h při 37 V' atmosféře 5% CO2 ve vzduchir.

-15Potom se do každé jamky přidá 100 /ul roztoku rozpouštědla, obsahujícího. 45 ml dimethylf ormamidu·, 13,5 g SDS: (dodecylsulfát sodný) a 55 ml destilované vody. _v

Inkubace se provádí 12 h při 37 °C v CO2 inkubátoru. Výsledky MTT barevného testu jsou odečteny v Multiskan 340/CG čtecím zařízení (Labs.ystem) za použití 570 nm filtru. Jako referenční látka byl použit. TNP-cZ .

Interferonová biozkouška

HřlT je sledován inhibicí cytopatického efektu vyvolaného: myším encefalomyocarditis virem (EMCV < myší' ^29 buňce, referenční Mu IFNí ^:A/, standarď od National Institute of Health Bethesda, MD, USA byl použit). Cytopatický efekt je pozorován; pod reverzním mikroskopem a také je měřen MTT metodou jak je popsáno dále:

MTT metoda podle Berga a spol.:

Berg K. , Hansen M.B. a Nielsen S.E. (199O):A new sensitive bioassay for precise quantification of interferon activity as measured via the mitochondrial dehydrogenase function in cells (MTT-method). APMIS, 98, 156—162.

MTT (3/4,5-dimethyT-thIazol-2-yl/2,5-difenyl-tetrazoliumbromiď, Sigma) se zředí v PBS na koncentraci 5 mg/ml. Pro měřenf buněk, usmrcených kulturami se pričEď 25 /nl roztoku barviva MTT v koncentraci 5 mg/ml <£o každé jamky mfkroploten. Kontrolní referenční vzorek TNP nebo· LETT se také zpracuje. Potom se plotny inkuhujf 2 h při 37 °G v atmosféře 5% CC>2 ve vzduchu;. Potom, se do každé jamky přidá 100 /ul roztoku, obsahujícího 45 ml.dimethylformamidu

t.. -1613,5 g SDS (dodecylsulfát sodnýů a 55 ml destilované vody.

Po inkubaci při. 37 ^σΟ přes noc se změří optické hustoty při 570 nm za použití mikroplotnového odečítače Start Fax Awarness Technology lne. 2100 za použiti extrakčního pufru jak® slepého pokusu. Jak TNF- , lFN-/^a jiné cytokiny, mohou také být zkoušeny za použití komerčních- ELISA kitů.

Kompozice pro provedení metody podle předloženého vynálezui je v podstatě charakterizována tím, že obsahuje dvakrát zpracovanou vodu pro tkáňovou kulturu, kultivační medium a sera kompletující kultivační medium jakož i lidský PBL ne-bo myší RPC.

Diagnostický kit (kit induktoru cytokinů) pro použiti v PBL variantě předložené metody (pro 10-20 manuálních stanovení) může obsahovat následující:

1) dvakrát zpracovanou vadu pro tkáňové kultury , 100 ml

2) Histopaque^ nebo Ficali-Hypaque^ - 1Q77 (medium hustotního gradientu-), 100 ml

3) RPMI-1640-medium, 2 x 100 ml ( s hydrofeenuhličitanem sodným a L-glutaminem, sterilně filtrované, testované endotoxinem)

4) fetální hovězí sérum (FBS), 20 ml, nízký obsah endotoxinu a hemoglobinu

5) lektin z Phaseolus vulgaris 0,5- mg (fytohemaglutinin-PHA-P)

6) zkumavky s kulatým dnem· s uzávěrem, polypropylen sterilní pro tkáňové kultury 17 x 100 mm, kapacita 14 ml, 25 na vak:

7) plotny pro tkáňové kultury s víčky, 1 plotny, 96' jamek, ploché dno, sterilní

-17Reagencie dostupné oď: Sigma Chemical Co., St.Louis, &io., USA nebo jiné firmy.

^afcový PBL kit může být použit pro tak zvanou druhou fázi screeningového systému, pru ověření výsledků získaných s RPC buňkami nebo současně jako přímý screeningový systém pro některá substance, které mohou být inaktivní jaká imunomodulátory u hlodavců, např. organoseleniové sloučeniny.

Diagnostický kit (kit induktoru cytokinu) pro použití v? RPC variantě předložené metody (pro 10 až 20 manuálních stanovení)_r může obsahovat následující!

1) dvakrát zpracovanou vodu pro tkáňovou kulturu, 100 mi

2) RPMI-1640-medium, 2x100 ml, (s h.ydrogenuhličitanem sodným a L-gl vitaminem), sterilní, filtrovaný, testovaný na endotoxtn)

3) fetální hovězí sérum (FBS), 20 ml nízký obsah eadotnxinu a hemoglobinu

4) liposacharid (LPS) 0,5 mg, z E.coli 0127:38

5) zkumavky s kulatým dnem s víčky, sterilní 23 na vak, polypropylen^ pro tkáňovou kulturu, 12 x 75· mm, & ml objem plotny pro tkáňovou kulturu s víčky, 5 ploten, 96 jamek, ploché dno, sterilní.

“eagencie: jsou dostupné oď Sigma Chemical. Co. St.Louis,

MO., USA nebo jiných firem.

Kompozice pro provedeni' metody podle předloženého vynálezu· zahrnující amplifikaci výsledků, která je zvláště vhodná pru mikrotesty, je v podstatě charakterizována obsahem?, jednak PBL kultury nebo RPC- suspenze a jednak nesteroidního protizánětlivého léčiva, výhodně subatance,

-18vybrané ze skupiny organoseleniových sloučenin jako je ebselea, indomethacim nebo sloučenina ITCL a derivátů_ranalogů, homologů a metabolitů těchto sloučenin, nejvýhodhěji jí je indomethacin.

Následující specifické příklady ilustrují předložený vynález:, ^yto příklady nejsou v žádném případě pro vynález omezující.

Příklad 1

Jednotlivé roztoky RPC se získají ze 36 samic 7-8 týdnů starých BALB/c myší· usmrcených etherem, injektováním der peritoneální dutiny 5 ml Eagle-ova minimálního esenciálního media (EMEM), doplněného 10% teplem inaktivovaného telecího, séra. Promývací roztoky z jednotlivých myší obsahují 1-2 χ 10^ buněk/ml. Suspenze buněk z každé myši se rozdělí na dva vzorky rozdělené do dvou zkumavek. Jeden vzorek se zpracuje se 100 yugrTTP/ml a druhý slouží jako negativní kontrola, vykazující spontánní uvolnění cytokinů.

Všechny kultury se inkubují při 26 °0 20 h a potom se odstředí při 1000 ot/min po 10 min. Supernatanty se shro máždí a zkouší na LFN-/3 aktivity v biozkoušce za použití mikrometody inhibice cytopatického efektu vyvolaného EMCV (endefaLomyokarditis virus) v myších buňkách. V každé zkoušce je? použit vnitřní laboratorní standard⁵, který byl kalibrován proti mezinárodnímu referenčnímu přípravku Mu IFN, σθ02-904-5Ί 1 , NIH, Bethesda, USA. Gytopatický efekt byl měřen MTT metodou podle Berga a spol., APMIS, 98, 156162. Získané výsledky jsou následující: pro kontroly IFIThladina byla 1-8 U/ml, průměrně pod'2, pro vzorky zpracovaná ss TTP, IFN- hladina byla 4-127 U/ml, průměr 16 U/ml.

-19Výsledky jsou graficky znázorněny na připojeném obr.. 1 (Porovnání IFKT- produkce RPC ošetřeného s TTP a neošetřenéhcr. 1-hranice detekce, 2-Medíána.Podle Mediana testu P=O,QQQG. Každý bod ukazuje hladinu IFN v RPC izolovaném z individuální myši).

Příklad 2

Opakuje se postup z příkladu 1 se skupinou 7 myší, avšak místa? rozdělení každé individuální myší RPC suspenze na dva vzorky, byla pouze³ jedna suspenze rozdělena na čtyři vzorky. Vzorky byly rozděleny do 4 zkumavek. (1 ml v každé). Jeden ze vzorků byla negativní kontrola a zbylé tři byly ošetřeny 100, 10 a 1 /Ug TTP/ml pro stanovení TTP dávkové závislosti uvolnění' IFN- /3 . Po inkubaci kultur po 24 fr> při 26 °C byly zkumavky odstředěny. Ve shromážděných? supernatantech byl stanoven ΙΠΤ-/3 jak je popsáno v příkladu 1 . Získané výsledky jsou uvedeny na připojeném obr. 2. (Závislost IFTT produkce na TTP koncentraci). Každá křivka se vztahuje v výsledkům pozorovaným ^s® suspeszí RPC získanou s jedinou myší.

Příklad i

Postupuje se jako v příkladu? 1 s tím rozdílem,, že TNF- (A. se stanoví místa IFN- fl .

Supernatanty z RPC kultur, neošetřené a ošetřené s 100 /Ug TTP/mí se zkoušejí na TNF aktivitu? v biozkoušce?. Myším fIbrcrblastům: podobná buňky (4 x 1Q^ buněk na jamku ve 100 /ul kompletního FMEM) se naočkují' na 96-jamkové plotny s plochým dnenr (Falcon, Linbro, Flow) a inkubují se 4 h pří 37 ^σ0 v atmosféře 5% 0θ£ ve vzduchu. Vzorky se zředí' v EMEM s aktinomycinem D (konečná koncentrace.

2,4 /Ug/ml) v další plotně. Potom se kultivační medium nad

-20— ^929 buněčnou monovrstvou odstraní a připravená zředěni se přenesou k této kultuře za použití multikanálkové pipety.

Po inkubaci 20 h při 37 °C se kultury zkoušejí na< usmrcení buněk: MTT metodou jak je dříve popsáno. Získané výsledky/ byly následující: pro negativní kontroly TNF-t/ hladina byla. v rozsahu 1-256 U/ml, průměr 8 U/ml, a pro vzorky ošetřené s TTP byla hladina TNF-0< 2-256’ také, ale? průměr byl 64 U/ml, Získané výsledky jsou uvedeny na připojeném obr.3·(Porovnáni produkce TNF-Λ RPG ošetřenými TTP a neošetřenými.

1-hranice detekce, 2-mediana. Podle Mediana tes tu: P=0,0030 · Každý bctd ukazuje hladinu TNF v RPG izolovaném z individuální myši).

Příklad 4

Postupuje se podle postupu z příkladu 2 s tím, že se místo stanoví TNF-v podstatě jak je popsáno výše v příkladu 3·

Získané výsledky jsou uvedeny na připojeném obr. 4 (závislosti TNF produkce na TTP koncentraci).

Přiklaď 5

A.Biologický materiál. Více než 115 sražených leukocytů od individuálních- dobrovolných zdravých dárců krve, získaných z Wroclav Regional Transfúsion Center, bylo použito prazkoušku. Charakteristiky dárců, jsou uvedeny v tabulce 1.

-21bulka 1

Charakteristiky dárců krve použité jako zdroj PBL,

Věk počet (roky)	muži	ženy	dárcovství
násobné	jediné
21-30	24	22	2	24	-
31 -4Q	45	44	1	45	-
41-59	46	44	2'	40	6
celketm	115	1 10	5	109	6
%	100	96	4	95	5

Převládali mládi muži, kteří darovali krev vícekrát. Významné změny v odezvě PBL od jednotlivých dárců byly pozorovány a jsou uvedeny v tabulce 2 dále·.

<lak je zřejmé z tabulky 2, 10-30 % PBL kultury nemůže odpovídat na 1 00 ^ug/ml TTP dávku, zatímeo pouze· 7 % nemůže být stimulováno 10 ^ug/ml PHA dávkou, a 20. % nebude odpovídat na 1Q /ug/ml LPS dávku produkcí IFK a 50 % nebode odpovídat na stejnou dávku LPS produkcí TNF. Tatc data jsou podstatná pro vhodný výběr? biologického materiálu. Neodpovídající PBL kultury jsou detegovány hodnocením hegativní (neošetřené, spontnánně cytokin uvolňující) a pozitivní (ošetřené standardním induktorem jako je PHA nebo LPS) kontroly.

-22Tabulka 2·. IFN a TNF odezva FBL individuálních dárců krve po stimulaci buá různými šaržemi TTP nebo standardními induktory

Induktor	dávka (jig-/ml)	č.PBL testov

TTP 010391	100	19
	30	13
	10	' 15
TTP 02Q391	100	14
	30	12
	10	10
TTP 101091	100	26
	30	20
	' 10	24
TTP 010991	1Q0	5
	30	4
	10	5
TTP 021091	100	5
	30	4
	10	- 5
TTP 111191	100	5
	30	4
	10	5
TTP (8xJ	100	•29
	30	24
	10	21
PHA	10	69
LPS	10	41
žádný	-	69

č. IFN (%) ·	odezva na; • TNF (%)

13 (63)	13 (68)
6 (46)	9 (69)
14 (93)	13 (87)
10 (71)	11 (79)
8 (67)	8 (67)
5 (50)	5 (50)
21 (81)	20 (77)
9 (45)	8 (40)
14 (58)	15 (63)
5 (100)	4 (80)
2 (50)	0 (0)
2 (40)	3 (60)
4 (80)	4 (.80)
3 (75)	4 (100)
3 (60)	3 (60)
3 (60)	4 (80)
2 (50)	3 (75)
4 (80)	2 (40)
19 (66)	10 (34)
14 (58)	11 (46)
16 (76)	2 (10)
64 (93)	54 (78)
33 (80)	21 (51)
36 (52)	20 (29)

-23Tabulka 3r Indukce IFN nebo TNE různými šaržemi ΓΌΟ ^u/ml rašelinového extraktu v mezinárodních jednotkách aktivity tpj / jedn./ml

TNF / jedn.-/¹¹¹^Serxa ·δ._Γ počet' zkouš >]f průrozsafc průměr ek počet pokusů doba pokusu 24h rozsah prurn..

^dn:£rozsah iprům _ kontrole bez indukt.

333

31090

291290

010391

020391 <10100

530

103000

102000

101000

100

9-750

ND

9-750'

ND

200

9-80

9-750

9-160

9-250

Kondicionovaná media byla uchovávána při 4 °G před zkouškou.

-24Byly použity leukocyty lidské periferní krve od zdravých dárců krve? (8 x 10^ buněk/ml). '

3. Provedeni pokusů

Byly testovány? vzorky extraktů rašeliny odebrané z různých: výrobních vsádek a číslované' jak je uvedeno v tabulce 3 za použiti PBL testu jak je popsán výše. 7 těchto pokusech: byly kvantitativně stanoveny interferon (IFN) a tumor necrosis faktor“ (TNF) a podle výše uvedeného standardního postupu; jejich aktivity, vyjádřeno v Mezinárodních jednotkách aktivity, byly stanoveny·. Pokusy byly opakovány a počet opakování je uveden v tabulce 3» Rozsahy výsledků a průměry jsou zde rovněž uvedeny*

Pro ilustrační účely byl proveden podobný test. se standardizovanými přípravky rašelinovými. V koncentraci 30 /Ug/ml byla interferonová aktivita v? rozmezí' 30 až 300 mezinárodních jednotek aktivity, zatímco v koncentraci 100 /Ug/ml byla 300 až 1000 mezinárodních jednotek aktivity.

Koncentrace meziproduktu, ukazují lineární vztah mezi dávkou a odezvou.

Imunoaktivní rašelinové extrakty testované' ve? výše uvedeném příkladu· jsou popsány v PCT přihlášce č.

PCT/EP92(00491.

Z. údajů uvedených v tabulce 3 je zřejmé, že V7 PBL kulturách je negativní' a pozitivní kontrola podstatná pro hodnocení výsledků.

-25Další pokusy ukazují, že když neodpovídající PBL kultury nejsou vzaty v úvahu; a provede se statistické hodnocení velkého počtu výsledků, účinnost testů podle vynálezu nemůže být zpochybněna.

Během dvou let byla stanovena biologická účinnost cytokin indukujících látek na více než 20 různých vsázdkách TTP, zahrnujících 10 standardních komerčních šarží léčiva, Z) šaržích odmítnutých výrobcem pro neodpovídající biologickou aktivitu stanovenou na myši, která byla po stanoveným standardem?: a 3) laboratorních rašelinových extraktů připravených v malém měřítku. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 ve formě průměrných hladin? IFlí a TNF iadukovaných (s vypočtenými standardními odchylkami -SD a statistickou významností).

-26Tabulka 4: Účinky různých šarží TTP na IFN a TNF produkc lidskými PBL

Induktor dávka •(pg/ml)

IFN

Log, o . “^edn’/ml (± SD)

TTP	010391	100 30 10
TTP	020391	100 30 10
TTP	101091	100 ’ 30
		10
TTP	010991	100 3Q
		10
TTP	Ό21091	100
		³⁰ 10
TTP	111191	100 30
		10
TTP	(8x)	100
		30 10
PHA		10
LPS		10
Ž^dný	-

1.41	+.	1. 07^b
0.96		1.07
1 .81		0.58^c
1.23	+ .	0.81^a
1 .12	+_	0.90
0.75	+,	0.76
1 .70	+	0.91^c
0.99		1 -¹²
1.22	+	1 .07^a
2.24	.+	0.30°
1 .00	+	1 .00
0.56	i	0.68
1 .72	+	0.87^b
í. 39	+	0.81
1 .11	+	0.91
'1 .36	+	1 .12
1.00	+	1.00
1.56	±	0.86^a
1.04	+	0.82^a
0.88 .	i	0.81
1.10	+	0.70^b
2.08	+	0.79^c
1 .36	+_	0.80^G
0.64	+	0.63

1.26	_+	0.91^c
1.25	+	0.88^b
1.45	+	0.63^c
1 .35	+_	0.75^c
1 .14	+	Q.83^b
0.86	+_	0.90
1 .38	+	0.81^c
0.62-	+	0.80
0.94'	+_	0.76^b
T.35	+ 0.0	0.73^b
0.88	· +.	0.73
1.49	'· +_.	0.84^b
•1 .79	+	0.20^G
1 -01	.+	0.84
1.18		0.62^b
1 .21	+	0.71^a
0.54	+	0.66
0.63.	+	0.91
0.75		0.84
0.13	+	0.40^a
1.67-	_+	0.99^c
0.97	+.	1 .01^b
.0.42	+	0.67

-21Průměrné hodnotyz byly vypočteny ze všech výsledků IFN a TNP titracf. Neodpovídající bylý označeny jaká 0.

^a-<ERozdíl od 'žádný’* (spontánní produkce cytokinu) při ^a p Q,05_r ^bp 0,01 nebo 0,001.

Průměrné hodnoty, odpovídající výsledkům uvedeným v tabulce 4 jsou uvedeny v další tabulce 5, zatímco vybraná data jsou uvedena v grafické forma? na obn. 5 ^a 5, ukazujících účinky různých šarží TTP' aa IFN a TNF produkci.

Tabulka 5: Účinek různých šarží TTP na IFN a TNP produkc lidskými PBL

Induktor	dávka , _zug7ml_	......jed=/ul ¹	TNP
TTP 010391	100	30	27
	30	' <10	27
	10	100	27
TTP Q20391	100	30	50
	30	30	34
	10	<10	<9
TTP 101Q91	.. 100	100	34
	30	<10	<9
	10	45	18
TTP Q10991	100	300	27
	30	<10	<9
	10	<10	18
TTP 021091	100	100	27
	30	60	80
	10	60	27
TTP 11.1191	100	1Q0	18
	30	<10	40
	10	100	<9
TTP (8x)	100	20*	<9
	30	10	<9
	10	20	<9
ΡΞΑ	10	200	80
EPS	10	30	27
žádný	—	io ;	<9

- /í-29Průměrné hodnoty jsou vypočteny ze všech výsledků, získaných v ti tracích' IFN nebo TNF.

Identifikace indukovaných cytokinů byla provedena pomocí neutralizace IFK a TNF indukovaných TTP.

Výše uvedené výsledky pokusů jsou znázorněny na obr.

a 6.

Účinky různých šarží TTP na IFN produkci lidskými PBL (obr.5). Bylo použito sedm různých šarží TTP. Každý bod na grafu představuje PBL individuálního dárce krve.

IFN⁷ aktivita se týká antivirových jednotek. Označená plocha představuje hramici nevýznamných údajů. Horizontální čáry znamenají průměrné hodnoty, Indukce IFN 30 a 100 /ug/ml TTP je statisticky významná (při p < 0,05).

Účinky různých šarží TTP na TNF produkci lidskými PBL. TNF aktivita je vyjádřena v cytotoxických jednotkách, pro myší L^^ buňky. Odezva na 30, 100 a 200 /Ug/ml TTP je významná (při p <. 0,05) (obr.6).

V pokusech byla použita, potentní polyklonální antlséra, jmenovitě: anti-přirozerrý IFN-cA, , anti.l.yrnfoblasstoidní (Namalwa) IFN-a anti-prirozený IFN-pro neutralizaci antivirové aktivity v supernatantectia PBL kultur ošetřených po 20 hodin třemi různými šaržemi TTP. Výsledky, jak je zřejmé z připojeného obr.7 (výsledky neutralizace? IFN polyklonálním anti-IFN sérem) indikují, že části IFN typů a produkovaných; PBL z individuální krve dárců se významně měnf. Tím je potvrzeno, že způsob uvolňování IFN¹ c,;·. každého dárce PBL je individuální charakteristikou dárce.

-30Neutralizační zkoušky provedené s potentním polyklonálním králičím anti-TNF-o< séirern (Genzyme Inc,) ukazují, že TNF indukovaný TTP je hlavně TNF typu: ci . Toto bylo potvrzena výsledky podobných neutralizací' provedených s králičím polyklonálníoi! anti-TNF-/?) sérem (Genzyme? Inc.), které neposkytlo neutralizaci TTP indukované TNF aktivity.

Obr.7 představuje výsledky neutralizace IFN polyklonálnímianti-IFN séry. IFN obsahující media zz PBL kulturr inkubovaná' s TTP (tři různé šarže? TTP a sedm různých PBL bylo použito) byl$t zpracována s uvedeným anti-IFN séremc. 1 - N^ošetřené přípravky, 2- ošetřené anti-HuIFN- ,

3-rOšetřené anti-HulFN-Ly, 4-ošetřenď anti-HuIFN-φ .

Příklad 6

Postupuje se podle příkladu: 5 za účelem prokázání amplifikačního efektu: přítomnosti amplifikétorru,indomethacinu, podle předloženého vynálezu.

Každá PBL kultura byla rozdělena na několik vzorků. Jeden z nich byla negativní kontrola, ukazující spontánní uvolnění cytokinů,. druhý byl pozitivní kontrola ošetřená standardně potentním induktorem cytokinů dále uvedeného charakteru a zbylé vzorky byly ošetřeny 1-100 /Ug/ml TTP, šarže č. 010391 nebo 020391, jakož.i TTP I a TTP II, které jsou uvedeny v tabulce 6b a 6<r- a 5 /Ug/ml indomethacinti + TTP ze stejných šarží (tabulka 6a) netra· 10 yug/ml sloučeniny ITCL + TTP ze stejných šarží (tabulka 6b), nebo i 10 nebo 20 /Ug/ml selenoorganických sloučenin Ί ),2) nebo 3?) jak jsou uvedeny výše + TTP ze stejných šarží. V supernatantecfr: inkubovaných kultur byly stanoveny IFN a TNF.

Získané výsledky jsou uvedeny v tabulkách 6a, b a c.· dále

-3ΓTabulka 6a;

účinek amplifikace indukce cytokinů za přitomnost-i indomethacinu

-32a) PBL byly připraveny z čertvé heparinizované krve separační technikou Ficoll-Hypaauee. PBL kultury obsahují 7x 10⁶ buněk/ml,

b) PBL byly připraveny ze sražených leukocytů získaných z Oblasthího trasfuzních steřdinka. Buňky byly zpracovány podle Cantella-a a spol. metody (Meth.Enzymol. 1981, 78, 29-38).

δ

PBL kultury obsahují 8x10 buněk/ml.

Tabulka 6b

Účinek amplifikace indukce cytokinu za přítomnosti sloučeniny ITCL

Př. induktor	slouč. ITCL	koncen- trace	cytokiny XFN	( jedru/ml) TNF
. 1. TTP 010391	—	100	10O	18
TTP 010891	-	30	100	9
TTP 010391	+	100+10	3000	80
TTP 010391	+	30+10	300	80
PHA	—	10	3000	250
žádný	—	— .	10	<9
žádný	+	10	<10	<9
2. ttp i		ίσα	3000 '	27
TTP I	-	3Q	³⁰	<9
TTP X	+	100+10,	300Q	250
TTP X		30+10	300	9
PHA	-	10	100	18
žádný	-	-	10	<9
žádný	+	10 ·	10	. <9

-33.Tabulka 6c

Účinek amplifikace indukce cytokinu za přítomnosti 'seleno organických sloučenin

i-· 1 . 1	' se;leno-orga-	končen-	cytokíny·	(jedn./ml)
ýPř. induktor niOcé slouč.	tra?e	IFN	TNF
		. pg/ml	•
1. ' TTPs	—	10	100	<9
TTPs	-	5	10	<9
TTPs	slouň, (1)	10+20	300	27
TTPS	slouč. (1)	5+20	100	27
TTPs	slouč. (2)	10+20	- 300	50
TTPS	slouč. (2>	5+20	100	9
PHA	-	10	100	<9
žádný	slouč.A )	20	200	9
žádný	slouč. (2)	20	100	27
žádný	—		10	<9
TTP II	—	50	10	<9
TTP· II	“f ·	5	10	<9
TTP II	slouč.(3)	50+10	30	27
TTP II	slouč.(3)	10+10	30	27
PHA	-	-	30	<9 -
žádný	slouč.)	10	10	<9
žádný	/	—	10	<9

PBL kultury obsahují 8x1 0^ buněk/ml. TTP je raáelinový přípravek produkovaný v malém měřítku. Relativně nízká TNF odezva je pravděpodobně způsobena Skutečností, že sražené leukocyty byly uchovávány 20 hodin při 4 °G před přípravou kultur. Selenoorganické sloučeniny jsou induktory cyťokinů stejně jaká TTP'.

-34Příklad 7

Diagnostický tesť odrážející účinek podání TTP orálně v denní dávce? 5^; mg ve formě komerčně dostupných tablet na PBL in vitro kulturovou odezvu na další dávku TTP indukc cytokinů, byl proveďen? podle dále uvedených pravidel:

Test byl proveden se 4 ženami-dobrovolnicemi, ve věku 43-58' let, kterým bylcr odebírání 20 ml venosní krve? z v.ulnaris před, během a po podání TTP v denní dávce? 5 mg v tabletách. Byly provedeny dva různé režimy podání.

Dvě z dobrovolnic; (označené dále jako B'.K. a J.2.J.) byly podrobeny ošetření' s TTP, skládajícímu se? ze tří sedmidenních cyklů: léčivo bylo podáváno per os, jedna 5mg tableta denruč po jeden týden se sedmi dny vysazení po sedmidenní' periodě' orálního podání TTF. Celková dávka byla 21 tablet. Drhým dvěma dobrovolnicím· (označeným dále jakc A.D.I a W.F.) bylo denně podáváno: 5 mg TTP v tabletě kontinuálně po tři týdny. Celková dávka také byla 21 tablet.

Po dvou týdnech vysazení bylo ošetření opakována.

Použité 5mg tablety byly standardním komerčním produktem firmy TORF CORPORATION Pharmaceutical Factor.y, Wroclaw, Polsko. Každá tableta obsahuje 5 mg TTP, 43 mf laktozy a 2 mg MYVATEXu. Píro indukci cytokinů v PBL v in vitro kulturách byl použit práškovaný TTP jako čistá substance ve formě zásobního? roztoku, obsahujícího 20 mg TTP/ml pyrogenů prosté redestilované vody^ skladovaného při. 4 °C.

-35Krevní vzorky odebrané dobrovolnicím byly heparinizovány ffeparinemPalfa-roztokem pez chránících látek na konečnou koncentraci. 10 jednotek/ml a ošetřeny jak je popsáno dříve pro připravuj PBL in vitro kultury,která pak byla ošetřena induktor.y cytokinů PHA, LPS a TTP způsobem popsaným v předcházejících příkladeclt. 200 /Ug kultury? byly použity v každém ošetření. Supernatant.y byly uchovávány při 4 ^aG a zkoušeny na IFN v jednom týdnu a uchovávány při -20 °G a zkoušeny na TNF pro vyloučení inaktivace způsobená spontánní proteolýzou.

IFTF a TNF byly zkoušeny spejným způsobem jak je popsáno výše. Získané výsledky jsou; uvedeny na souvisejících obrázcích 8-13 (odezva PBL kultur různých pacientů k IFN induktorům- a TNF induktorům během orálního podávání TTP).

Z. údajů na obr.8 a 9 je zřejmé:·, (žyto obr. představují IFN odezvu; první skupiny dobrovolnic během cyklo podávání, odezzzvu pokleslou: a navrácenou na počáteční hodnotíc po dvou týdnech vysazení. Naopak, TFN odezva uvedená na obr.10 a 11 se zvyšuje? po podání TTP a havrací k normálu: po dvou týdnech vysazení.

Údaje uvedené na obr.12 a 13 zobrazují odezvu: na indukci cytokinů: při jiném způsobu podání dobrovolnici A.D.I. ověřují, že hyporeaktivní stav k IFN inďukci je dosažen po 3 týdnech kontinuálního podávání TTP orálně. Hyporeaktivní stavz představený jako ztráta schopnosti PBL kultur odpovídat na indukci IFN TTP roztokem se objevuje po dvou týdnech vysazení. Naopak, během tří týdnů podávání TTP se nevyvinula haporeaktivita k TNF indukci (obr.12).

Výše uvedené výsledku ukazují, že optimální dávka imunomodulátoru, který je induktorem cytokimu; může být stanovena individuálně pro každého pacienta ošetřeného jedním PBL testem podle předloženého vynálezu.

Claims

1 . Způsob stanovení' imunologické aktivity bioaktivních,

c.ytokin indukujících imunomodulátorových substancí, vyznačující se tím·, že se? kultura lidských leukocytů z periferní krve (PBL) nebo suspenze BALB/c myších rezidentních peritoneálních buněk (RPG) ošetří roztokem testované substance za účelem indukce produkce c.ytokinů, které se pak stanoví standardními identifikačními metodami.

2. Způsob podle nároku ,1,. vyznačující se t í m, že se použije kultura lidských PBL,kde je indukována produkce cytokinů a potom se každý z indukovaných cytokinů stanoví kvalitativně a kvantitativně za použití setů různých- výhodně známých- sér, která rozeznávají individuální cytokiny.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že lidská PBL kultura se připraví s živným v

mediem vhodným pro tkáňovou kulturu a že hustota odečítané PBL kultury je přibližně 8 x 10^' leukocytů/ml

4-. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v y z n ačující se t. í my se testovaný roztok? použije v koncentraci Q„1 až 200 /Ug/ml.

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že' každý cytokin je identifikován rychle pro zabránění? proteolýzy cytokinu.

6» Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se t í m, že se použije PBL kultura nebo RPC suspenze a

-37bioaktivní substance indukující produkci interferonů a tumor necrosis faktorů.

7. Způsob podle nároku 6-, vyznačující se t i m, že RPC suspenze obsahuje asi 1 až 2 x 10 buněk/ml.

8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se t í m/ že testovaný roztok se připraví v živném mediu Eagle nebo RPMI-1640 s přídavkem 10 % fetálního telecího séra.

9. Způsob podle kteréhokoliv; z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že získané výsledky jsou vyhodnoceny proti kalibrační křivce.

10. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že? jsou testovány rašelinové extrakty jako je TTP.

11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, 8,9 nebo 10, vyznačující se tím, že v případě PBL varianty se dosáhne amplifikace výsledků přimíšením k testovanému roztoku· nesteroidniho, protizánětlivého léčiva, výhodně sloučeniny ITCL a selenoorganických sloučenin vzorců 1 až 3 a nejvýhodněji indooethacinu.

12. Způsob stanovení imunologické odezvy lidského individua k terapii používající imunomodulátorovou substanci, indukující cytokin, vyznačující se tím, žes kultura leukocytů periferní krve (PBL) lidského individua, ošetřená takovou imunomodulátorou substanci, se ošetří v definovaných časových intervalech roztokem podávané substance, za účelem· indukce produkce c.ytokinů, které jsou

-38pak stanoveny standardními metodami, za účelem stanovení momentu vývoje? hyporeaktivity k substanci po prodlouženém podání substance a momentu; navrácení’ schopnosti odpovídat na další dávku substance po určité periodě vysazení.

13> Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m, že časové intervaly jsou asi 7, až 14 dnů*

14. Způsob podle nároku 12 nebo 13, v y z n a č u j í c í se t í nr, že se aplikuje v průběhu terapie používající rašelinový extrakt jako imunomodulátorovou substanci, indukující cytokin*

15* Způsob podle nároku 12,13 nebo 14, vy z n a č uj í c í se t í m, že je aplikován v průběhu? terapie, využívající TTP jako imunomodulátorovou substanci indukující cytokin.

16. TTP, kdykoliv použitý, testovaný nebo stanovený způsoby nárokovanými v kterémkoliv z nároků 1 až 15·

17· Kompozice pro provedení metody podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, v y z n a č u j í c í se t í m, že jednak obsahuje PBL kulturu nebo RFC suspenzi a jednak nesteroidní protizánětlivé léčivu, výhodně indomethacin.