SK44094A3

SK44094A3 - Method and composition for determining the immunological activity of bioactive substances

Info

Publication number: SK44094A3
Application number: SK440-94A
Authority: SK
Inventors: Anna Inglot; Zofia Blach-Olszewska
Original assignee: Torf Ets
Priority date: 1991-10-26
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1995-03-08
Also published as: EP0539610A1; GR930300100T1; NO941444D0; DK0609255T3; BG61705B1; HU9401185D0; AU2650992A; WO1993008470A1; US5543300A; CZ100494A3; DE609255T1; JPH07500905A; EP0609255B1; DE69220078D1; GR940300077T1; EP0609255A1; LV12140A; ATE153763T1; HU216863B; ES2061424T3

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka spôsobov a prípravkov na analýzu istých biologicky aktívnych látok a stanovenia ich imunologickej aktivity vzhladom k ich schopnosti vyvolávať tvorbu cytokínov. Cytokíny, ako napr. interferóny (IFNs) a faktory nekrózy nádorov (tumor necrosis factors, TNFs) sú hormónom podobné bielkoviny, ktorú majú významnú úlohu azda vo všetkých imunologických reakciách, ako aj v regulačných dejoch zodpovedajúcich za udržiavanie homeostázy. Tvorba takýchto cytokínov môže byť vyvolaná istými látkami, ktoré a imunomodulačnej aktivite, sú, vďaka užitočné svojej biologickej pri liečbe imunonedostatočnosti a príbuzných chorôb.

Samozrejme existuje zásadná potreba metód na riadnu a rýchlu analýzu imunologickej aktivity takýchto biologicky aktívnych látok. Predmetom tohot vynálezu je poskytnúť takúto metódu.

Spôsob podía vynálezu umožňuje stanoviť či testovaná látka je schopná vyvolať tvorbu rôznych cytokínov a dovoluje rýchlu a účinnú skúšku vlastností istých látok, menovite ich imunologickej aktivity, v každom štádiu produkcie, separácie, čistenia a prípravy výsledných prostriedkov. Vynález tiež poskytuje prostriedky a súpravy vhodné na prevádzanie rečeného spôsobu.

Doterajší stav techniky

Doteraz používané testy na stanovenie imunologickej aktivity sú početné, ale obtiažne sa prevádzajú. Keď sa liečebný prostriedok, ktorý má imunologické účinky, klinicky testuje, jeho imunologická účinnosť sa hodnotí sledovaním početných, dobre známych a analyticky stanoviteíných vlastností imunologických systémov s použitím štandartných metód. Akonáhle je aktivita overená, vynára sa potreba reprezentatívneho jediného testu umožňujúceho rýchle zisťovanie stavu pacienta vzhladom k jeho imunologickej odozve.

V klinických štúdiách môže byť hodnotenie hladín IFN v sére obtiažne, nepresné a zavádzajúce. Interferóny sa často tvoria miestne v rôznych tkaniach, majú krátky čas života, ich pôsobenie je parakrinné (obmedzené na bezprostrednú blízkosť), a pevne sa viažu na bunečné receptory a nosičové proteíny.

Z druhej strany, technologické postupy na výrobu, čistenie a/lebo separáciu imunologický aktívnych látok, ako osobitne extraktov zo surového rašelinného materiálu, sú zvyčajne postupy s viacerými krokmi a tu je vždy potreba zavedenia spoľahlivého a rýchleho testu umožňujúceho dôkladnú kontrolu výroby. Navyše, pretože tieto látky sú často komplexnej povahy, ako je to v prípade extraktov rašelinného materiálu, je dôležité mať podobný test na stanovenie aktivity jednotlivých frakcií takýchto látok. Je taktiež potrebné nájsť testovaciu metódu v mikromerítku, pretože analyzované produkty sú veľmi drahé.

Podstata vynálezu

Následujúce štyri nálezy umožnili riešenie zhora popísaných problémov.

1. Niektoré imunoaktívne extrakty rašelinného materiálu vyvolávajú tvorbu cytokínov, ako sú interferóny a faktory nekrózy, v in vitro kultúrach leukocytov periferálnej krvi, pričom indukcia je závislá na dávke.

2. Interferón-β (a TNF-alfa) sú vytvárané vo významne vyšších množstvách rezistentnými peritoneálnymi bunkami (RPC) BALB/c myší keď sa na ne pôsobí imunoaktívnymi extraktmi rašelinného materiálu v porovnaní so spontánnym uvoľňovaním tých cytokínou v vzorkoch, na ktoré sa nepôsobilo.

3. Niektoré imunoaktívne extrakty rašelinného materiálu vykazujú, keď sú testovaná in vitro ako je spomenuté hore, synergický účinok v kombinácii so známymi imunomodulátormi, ako sú organoselénové zlúčeniny, p-chlórfenylamid kyseliny 3-metyl-5-bezolyamino-izotiazol-4-karboxylovej a indomethacin

- 3 Toto umožňuje použitie o moc menšieho množstva imunologický aktívnych látok na preukázanie ich aktivity.

4. PBL zdravých dobrovoľníkov, na ktorých sa pôsobí TTP (istým produktom odvodeným z rašelinného materiálu) podávaným ústne v dávkach 5 mg/deň, testované na indukciu istých cytokínov, IFN-alfa, IFN-gama a TNF-alfa, strácajú schopnosť odpovede na indukciu cytokínov roztokmi TTP po predĺženom, neprerušenom podávaní TTP ústne a znovuzískajú túto schopnosť po približne dojtýždňovej prestávke.

Spôsob podía tohoto vynálezu zahrnuje kroky pôsobenia na kultúry ľudských leukocytov periferálnej krvi (PBL) lebo na suspenziu rezidentných peritoneálnych buniek (RPC) BALB/c myší roztokom látky, čo má byť testovaná aby sa indukovala tvorba cytokínov a potom stanovenie rečených cytokínov podía štandartných identifikačných metód.

Kultúra leukocytov periferálnej krvi (PBL) používaná podía prvej varianty prevedenia bezprostredného spôsobu je krátkodobá kultúra pripravená z čerstvých leukocytov zdravých íudí s živným médiom vhodným na tkáňovú kultúru. Preferovaná hustota kutúry na použitie je okolo 8 x 10⁶ leukocytov/ml. Roztok, čo má byť testovný je s výhodou používaný v koncentráciách 0.1 - 200 pg/ml. Spôsob je osobitne vhodný na testovanie extraktov rašelinného materiálu. Stanovenie v mikromerítku je možné, keď roztok, čo má byt testovaný, napr. extrakt rašelinného materiálu lebo jeho frakcie, je zmiešaný s imunomodulačným činidlom, ako je nesteroidné protizápíové liečivo, s výhodou látka vybraná zo skupiny zahrnujúcej organoselénové zlúčeniny, ako je ebselen, isté izotiazolové deriváty, ako je p-chlórfenylamid kyseliny 3-metyl-5-bezolyamino-izotiazol-4-karboxylovej a indomethacin, ako aj analógy, homológy a metabolity takýchto látok.

- 4 Príkladmi organoselénových zlúčenín, ktoré môžu byť použité pre tento účel sú zlúčeniny nasledujúcich vzorcov 1 - 3; zlúčenine vzorca 2 (Ebselen) sa dáva prednosť:

(1) Bis-[2- (N-fenylkarboxamido)]-fenyldiselenid

(2) 2-Fenyl-l,2-bezisoselenazol-3(2H)-one (Ebselen PZ 51)

(3) Bis-[2-(N-(2-pyridyl)karboxamido)]-fenyldiselenid

Príkladmi izotiazolových zlúčenín, ktoré môžu byť použité pre horeuvedený účel sú zlúčeniny obecného vzorca I

.4

C__NECOR_? (I) kde R_x je halofenyl, prednostne chlórfenyl, R₂ je fenyl a R₃ je nižší alkyl, prednostne metyl. Halogénový atóm v halofenylovej skupine, chlórfenyl skupine R^ je prednostne v p-polohe fenylového cyklu.

Zlúčeniny horeuvedeného vzorca I, ktorým sa dáva prednosť., sú p-chlórfenylamid kyseliny izotiazol-4-karboxylovej, t.j. p-chlórfenyl, R₂ je fenyl a R₃ kyseliny 3-metyl-5-bezolyaminozlúčenina vzorca I kde R je metyl. Pre stručnosť sa bude na túto zlúčeninu nižšie odkazovať ako na zlúčeninu ITCL. V Polsku je registrovaná obchodná známka VRÁTIZOLIN^R. Syntéza a vlastnosti sú popísané v Árch Immunol. et Ther. Exp. 1973, 21, 891.

Všetky imunomodulačné činidlá na ktoré sa odkazuje vyššie ako na užitočné pre stanovenia v mikromerítku, t.j. organoselénové zlúčeniny, izotiazolové deriváty a indomethacin majú spoločné to, že sú nesteroidné protizápalové zlúčeniny, ktoré inhibujú sytézu prostaglandínov. Amplifikujú výsledky testov s metódu pódia tohoto vynálezu. Z tohoto dôvodu sú osobitne užitočné na mikrostanovenia. Amplifkácia výsledkov môže byť 5- až 20-násobná.

Zo všetkých rôznych nesteroidných protizápalových zlúčenín užitočných na účel amplifikácie sú preferované selénoorganické zlúčeniny (1, 2 a 3) a zlúčenina ITCL, ale osobitne indomethacin.

Bezprostredne vo vynáleze sa používajú rôzne antiséra, ktoré rozpoznávajú jednotlivé indukované cytokíny. Tieto séra sú známe a používajú sa na testovanie a štandartizáciu rôznych cytokínov. Identifikácia cytokínov musí prebehnúť v čase dovŕšenia ich tvorby a pred ich proteolýzou. Medzi rôznymi indukovanými cytokínmi sa niektoré tvoria pomaly a zostávajú stabilné v roztoku, zako napríklad interferón gama, zatialčo iné sa tvoria rýchlo a podliehajú proteolýze, ako napríklad faktor nekrózy nádorov.

Spôsob popísaný vyššie sa dá využiť aj na stanovenie imunologickej odpovede ľudského jedinca na isté imunoaktívne látky za predpokladu, že táto imunologická odozva nie je stimulovaná inými faktormi, ako napríklad vírosovými lebo bakteriálnymi infekciami. Môže byť využitý na sledovanie odozvy na liečivo v jednotlivých pacientoch, na stanovenie optimálnej dávky induktoru terapeutických cytokínov, ako je TTP, ako aj na zostavenie účinného režimu podávania liečiva. Spôsob je založený na určení hyporeaktívneho stavu k indukcii IFN.

Takto sa predkladaný vynález týka spôsobu na stanovenie imunologickej odpovede ľudského jedinca na terapiu používajúcu imunomodulujúcu látku indukujúcu cytokín. Rečený spôsob je charakteristický tým, že na kultúru leukocytov periferálnej krvi (PBL) sa pôsobí v definovaných časových úsekoch roztokom látky podávanej na indukciu tvorby cytokínov, ktoré sú potom stanovované štandartnými metódami (vrátane ELISA stanovení cytokínov), s účelom určiť moment vytvorenia hyporeaktivity k danej látke po jej dlhodobom podávaní a čas znovuzískania schopnosti odpovedať na d'aľšiu dávku po istom období prestávky. Časové úseky sú s výhodou asi 7-14 dní.

V prevedení, ktorému sa dáva prednosť, je horeuvedený spôsob používaný behom terapie používajúcej rašelinový extrakt ako imunomodulujúcu látku indukujúcu cytokín.

Podľa prevedenia vynálezu, ktorému sa dáva osobitná prednosť, je spôsob používaný behom terapie používajúcej TPP ako imunomodulujúcu látku indukujúcu cytokín; rečený TPP je, medzi iným, predmetom PCT prihlášky čís. PCT/EP92/00491, kde rečený TPP, jeho charakteristiky a produkcia sú podrobne popísané.

- 7 S prihladnutím k horeuvedenému sa tento vynález týka tiež TPP, kdekoľvek sa použije, testuje lebo stanovuje spôsobom z tohoto vynálezu.

Predkladaný vynález tiež poskytuje, vo svojej e druhej variante, testovaciu metódu, ktorá je vhodná na rýchle sledovanie technologických postupov imunoaktívnych látok a p. rezidentných peritoneálnych produkcie, čistenia Napríklad, ked sa na buniek (RPC) BALB/c separácie suspenziu myší pôsobí roztokom, čo má byť testovaný, indukuje sa myšací interferon-β ako aj faktor nekrózy nádorov. Oba sa dajú zistiť a kvantitatívne stanoviť podľa štandartných identifikačných metód. Pri tomto spôsobe sa používa suspenzia čerstvých myšacích rezidentných peritoneálnych buniek (RPC) obsahujúca približne 1 x 10⁶buniek/ml. Roztok, čo má byt testovaný, sa pripraví v živnom médiu Eagle, lebo RPMI-1640 s pridaním 10 % fetálneho teľacieho séra. Získané výsledky sa hodnotia proti kalibračnej krivke pripravenej s modelovou látkou. Ako modelová vzorka tej istej imonologicky aktívnej látka sa dá použiť látky, testovanej tradičnou cestou. Opäť: Spôsob je osobitne vhodný na sledovanie procesu získavania extraktov rašeliny ako aj na analýzy ich frakcií.

Bezprostredný v porovnaní s inými jednoduchý a účinný pretože je založený na na druhotných efektoch spôsob je veľmi známymi spôsobmi, priamej indukcii interferónu β misto tvorby protilátok, ako je to v rade konvenčných testov. Doteraz nebolo možné nájsť podobný spôsob kvôli skutočnosti, že imúnny systém myši sa významne odlišuje od ľudského imúnneho sýtemu a testy uznané ako indikatívne pre ako je prítomnosť interferónu vo atď. - nevychádzajú s najlepšími testovacími zvieratámi, t.j. s myšami typu BALB/c.

ľudskú imunologickú odpoveď slezine, lymfatických uzlinách

Teraz sa zistilo, že jasná imunologická odpoveď sa dá získať, ak sa ako biologický materiál na testovanie použijú rezidentné peritoneálne bunky (RPC), pričom sa používa čerstvá suspenzia takýchto buniek. Na každý pokus postačuje zabiť len tri zvieratá. Výsledky sa získajúbehom niekolko hodín. Biologický materiál sa dá aj kultivovať a dá sa ustanoviť zodpovedajúca línia makrofágov.

Spôsob podlá predkladaného vynálezu používa biologický materiál, menovite leukocyty periferálnej krvi (PBL) lebo supenziu myšacích BALB/C rezidentných peritoneálnych buniek (RPC), podlá informácií poskytnutých vyššie. Prítomnosť a koncentrácia každého cytokínu je stanovená metódami na testovanie a štandartizáciu interferónov, známymi z Methods in Enzymology, 1986, zv. 119, časti C: Interferon, editovanej Sidney Pestkom. Stanovenie celého spektra indukovaných cytokínov identifikuje imunologický stav pacienta.

Pre riadne hodnotenie výsledkov je podstatné aby biologický materiál na prevádzanie oboch variánt metódy podlá predkladaného vynálezu bol vybraný z vhodných darcov. V prípade ludských leukocytov, odobrané z jednotlivcov, ktorí vykazujú hyporektivitu (zriedkavé prípady), sa musia vylúčiť z hodnotenia. V prípade suspenzií RPC z BALB/c myší, vzorky odobrané zo zvierat dodatočne stimulovaných (napríklad infikovaných) sa tiež musia vylúčiť z hodnotenia. V prípade suspenzií RPC z BALB/c myší, vzorky sa nesmú odoberať z príliš mladých lebo príliš starých zvierat, pretože v takýchto myšiach existuje na veku závislá nedostatočnosť tvorby cytokínov. Treba vyberať 5-8 týždňov staré, zdravé zvieratá. Vzorky vykazujúce velmi vysokú spontánnu tvorbu cytokínov treba vylúčiť, osobitne ak sa testujú imunoregulačné látky, pretože sa môže stať, že sa nepozoruje potenciácia indukcie cytokínov lebo sa dokonca pozoruje zníženie takejto indukcie.

Prevedenie metódy podlá predkladaného vynálezu, v ktorom sa amplifikácia výsledkov dosahuje pridaním nesteroidnej protizápalovej zlúčeniny (jedna z látok, na ktoré sa odkazuje vyššie, ako je zlúčenina ITCL, lebo organoselénové zlúčeniny 1, 2 a 3, ale s výhodou indomethacin) k roztoku, čo sa má testovať, je test v mikromerítku, osobitne vhodný na stanovenie indukovaných aktivít TNF a IFN. Tento test je hospodárny, rýchly, aplikovateľný na analýzu veľkého počtu vzoriek súčasne a vhodný na štandartizáciu a automatizáciu, prinajmenšom čiastočnú.

Dve varianty spôsobu podľa tohoto vynálezu sa podrobnejšie popisujú pomocou príkladov nižšie:

Príprava roztoku látky, ktorá má byť testovaná:

Látka, ktorá má byť testovaná, napríklad rašelinový extrakt, sa rozpustí v sterilnej redestilovanej vode na koncentráciou 10 mg/ml. Vzorky sa sterilizujú filtráciou cez 0.45 μτη, 600 kPa max Millipore(^R), antibakteriálne filtre. Potom sa pripravia roztoky v úplnom RPMI-1640 médiu obsahujúcom tepelne inaktivované fetálne bovinné sérum (FBS).

A) PBL varianta:

Indukcia cytokínov

Žlté povlaky krvi od zdravých darcov sa dajú získať z oblastného transfúzneho centra. Alternatívne sa môžu izolovať leukocyty periferálnej krvi (PBL) z heparinizovanej žilnej krvi zdravých dobrovolníkov pomocou centrifugácie vo

Ficoll-Hypague(^R) (lebo Histopague^^Rí) hustotnom gradiente (g = 1.077), s následujúcim dvojnásobným premytím buniek. Erytrocyty sa lýzovali pôsobením NH₄C1 podľa Cantella et al. (Cantell, K., Hirvonen, S., Kauppinen, H.L.: Production and Partial Purification of Human Immune Interferon

119. 54, 1988). Používali sa leukocyty od obsahujúce približne 8 x 10⁶ leukocytov/ml v RPMI 1640 médiu doplnenom 10 % fetálneho bovinného séra (FBS), L-glutamínom a antibiotikámi. Všetky šarže FBS boli predom testované. Na PBL kultúry sa používali len nemitogénne FBS. Induktory cytokínov sa pridávali k 200-1000 μΐ objemom kultúr. Kontrolné induktory cytokínov boli fytoheraaglutinín (PHA) (Pharmacia Fine Chemicals, Švédsko lebo Sigma, USA). Indukované kultúry PBL sa inkubovali

Meth. Enzymol. jednoho darcu hodín atmosfére

CO.

37°C vo vzduchu pri uschovávali pri 4°C do týždňa. Supernatanty a centrifugovali. Supernatanty sa a analyzovali na IFN aktivitu najneskôr na satanovenie TNF aktivity je treba uschovávať pri -90°C lebo kvapaľnom dusíku aby sa zabránilo inaktivácii proteolýzou.

Stanovenie interferónu

Konfluentné monovrstvy buniek A549 boli pripravené na mikroplatničkách v Dulbeccom modifikovanom minimálnom esenciálnom médiu (DMEM) s 10 % FBS, L-glutamínom a antibioťikámi (penicilín 100 jednotiek/ml a streptomycín 100 μ9/ιη1) . Vzorky IFN zriedené na platničkách boli pridané k monovrstve buniek a inkubované pri 37°C po 20 hodín v atmosfére 5 % CO₂ vo vzduchu. Bunky boli potom premyté a podrobené pôsobeniu vírusou encefalomyoakarditídy (EMCV). Titer IFN bol definovaný ako riedenie vzorky IFN, ktoré znížilo cytopatogénny účinok vírusu o 50 % po 48 hod inkubácie. Metóda s MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) (Hansen, M.B., Nielsen, S.E. a Berg, K.: Overenie a ďalší vývoj presnej a rýchlej farebnej metódy na meranie pomeru rastu a zabíjania buniek [Re-examination and Further Development of a Precise and Rapid Method for Measuring Celí Growth/Cell Kill]. J. Immunol. Meth. 1989, 119, 203-210) na meranie zabíjania buniek ELISA čítačkou sa používala tiež. Laboratórne štandarty IFN traba zahrnúť do všetkých analýz, napr. rekombinantný ludský IFN-gama (špecifická aktivita 2 x 10⁶jednotiek/mg), prírodný ludský leukocytárny IFN-alfa 3 x 10⁶IU/mg) a IFN-gama (2 x 10⁶ IU/mg).

Stanovenie TNF

Cytotoxická aktivita TNF sa merala v L_2g2 bunkách podlá Flicka a Gifforda (Flick, D.A., Gifford, G.E.: Comparisons of in Vitro Celí Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor. J. Immunol. Meth. 68 , 1667, 1984). Vzorky a roztok aktinomycínu D (5 μς/ιπΐ) boli pridané k monovrstevným kultúram buniek. Po inkubácii pri 37°C po 20 hod boli cytotoxické efekty TNF stanovené bud mikroskopickým prezeraním kultúr alebo použitím MTT metódy. Množstvo spôsobujúce približne 50%-né rozloženie bunečných kultúr bolo definované ako jedna jednotka TNF aktivity. Porovnanie s preparátom TNF-alfa (Genentech Inc., USA) ukázalo, že 1 jednotka vo stanovení zodpovedala 100 - 200 pg/ml TNF.

- Íl Cytokínové neutralizčné stanovenia

Cytokíny produkované PBL, na ktoré sa pôsobilo skúmanými preparátmi,,·' sa môžu identifikovať neutralizčným stanovením špecif ikými- protilátkami (Inglot et al., Organoselenides as potential immunostimulants and inducers of iterferon gamma and other cytokines in human periferal blood leukocytes, Experientia 1990, 46, 308-311). Navyše sa dajú použiť rôzne ELISA súpravy na stanovenie imunoaktivity definovaného cytokínu.

Poznámka

V supernatantoch získaných z kultivovaných lymfoidných buniek sa dajú inými štandartnými metódami nájsť a identifikovať cytokíny iné ako TNF a IFN, napr. interleukíny (IL-1 - 10), GM-CSF, TGF-beta a d.

B) R.PC varianta: Indukcia cytokínov

Myšacie rezidentné peritoneálne bunky (RPC) sa získajú z približne 6 týždňov starých BALB/c myší zabitých éterom, pomocou inekcie 5 ml úplného RPMI-1640 média do peritoneálnej dutiny pri izbovej teplote. Premývacie médium obsahujúce RPC sa zbiera do 50 ml centrifugačných skúmaviek chladených ladom. RPC sa nepremývajú ani necentrifugujú. Bunky sa počítajú v Burkerovom hemocytometre a suspendujú na hustotu 1-1.5 x 10⁶ buniek/ml. Takáto hustota buniek je potrebná na všetky stanovenia merajúce efekty rôznych koncentrácií preparátu (od 0.1 - 500 μg/ml).

Negatívne a pozitívne kontroly sú zahrnuté vo všetkých testoch. Negatívna kontrola meria spontánne uvolnenie TNF lebo IFN bunkami RPC inkubovanými v RPMI-1640 médiu bez induktorov, zatialčo pozitívna kontrola ukazuje lipopolysacharidového induktoru (LPS

1-10 μg/ml). Všetky kultúry sa inkubujú pri 26°C po 20 hod. Potom sa kultúry centrifugujú pri 1000 rpm po 10 min a zoberú sa supernatanty. S použitím automatickej pipety sa supernatanty riedia od 1:20 do 1:256.

efekt štandartného z E. coli 055:85, Sigma

Biotesty cytokínov

Na stanovenie TNF aktivity v supernatantoch z RPCX kultúr sa používajú 20 hod staré monovrstvy kultúr buniek L_g29·

Myšacie bunky L_g2g podobné fibroblastom, 2 x 10⁴ buniek na jamku v 100 μΐ úplného média, sa očkujú na 96-jamkové platničky s plochým dnom a inkubujú pri 37°C po 20 hod aby sa získala monovrstva.

Prenos supernatantov musí byť velmi presný. Inkubácia kultúr ^l929 Pobieha 24 hod pri 37°C v atmosfére 5% C0₂ vo vzduchu.

Hodnotenia

1) Odčítanie cytotoxických účinkov v reverznom mikroskope.

2) MTT test (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazolium bromid, Sigma).

Na meranie zabíjania buniek s kultúrami L_g2g sa pridá 25 μΐ MTT roztoku farbiva s koncentráciou 5 mg/ml do každej jamky mikroplatničky.

Platničky sa 5% CO₂ vo vzduchu.

potom inkubujú hod pri 37°C v atmosfére

Potom sa pridá do každej jamky 100 μΐ roztoku rozpúšťadiel obsahujúceho 45 ml dimetylformamidu, 13.5 g SDS (dodecylsulfátu sodného) a 55 ml destilovanej vody.

Inkubácia prebieha 12 hod pri 37°C v C0₂Výsledky MTT farebného testu sa odčítajú Multiskan 340/CC (Labsystems) s použitím 570 nm referenčná vzorka sa má použiť rekombinantný TNF-alfa inkubátore. v čítačke filtru. Ako

Biotesty interferónu

IFN sa stanovuje pomocou inhibície cytopatických účinkov spusoboavných vírusom myšacej encefalomyokarditídy (EMCV v myšacích L_g2g bunkách, zahrnutý je štandart Mu IFN alfa/beta z National Inštitúte of Health Bethesda, MD, USA). Cytopatický účinok sa pozoruje pod reverzným mikroskopom a taktiež sa meria MTT metódou, ako je popísané nižšie:

MTT metóda podlá Berga et al.

Berg K., Hansen M. B. a Nielsen S. E. (1990): A new sensitive bioassay for precise quantification of interferon activity as measured via the mitochondrial dehydrogenase function in cells (MTT-method) [Nové citlivé biostanovenie na presnú kvantifikáciu interferónovej aktivity prostredníctvom funkcie mitochondriálnej dehydrogenázy v bunkách (MTT-metóda)]. APMIS, 98, 156-162.

MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyl-tetrazolium bromid, Sigma) sa nariedi PBS na koncentráciu 5 mg/ml. Na meranie zabíjania buniek s kultúrami Lg₂g ^sa pridá 25 μΐ MTT roztoku farbiva s s koncentráciou 5 mg/ml do každej jamky mikroplatničiek. Zahrnú sa kontrolné vzorky TNF lebo IFN. Platničky sa potom inkubujú 2 hod pri 37°C v atmosfére 5% C0₂ vo vzduchu. Potom sa pridá do každej jamky 100 μΐ roztoku rozpúšťadiel obsahujúceho 45 ml dimetylformamidu, 13.5 g SDS (dodecylsulfátu sodného) a 55 ml destilovanej vody. Po inkubácii cez noc pri 37°C sa merajú optické denzity pri 570 nm s použitím čítačky mikroplatničiek Štart Fax Awarness Technology Inc. 2100 a extrakčného pufru ako slepej vzorky.

TNF-alfa, IFN-beta a iné cytokíny sa dajú stanovovať aj s použitím komerčných ELISA súprav.

Prostriedok na prevedenie metódy podľa tohoto vynálezu je v podstate charakterizovaný tým, že obsahuje dvakrát spracovanú vodu na tkáňové kultúry, kultivačné médium a séra doplňujúce kultivačné médium ako aj ľudské PBL a myšacie RPC.

Diagnostická súprava (súprava induktorov cytokínov) na použitie v PBL variante podľa tohoto spôsobu (na 10-20 ručných stanovení) môže obsahovať následujúce zložky:

1) Dvakrát spracovanú vodu pre tkáňové kultúry, 100 ml

2) Histopaque(R) lebo Ficoll-Hypaque- 1077, (médium hustotného gradientu), 100 ml

3) Médium RPMI-1640, 2 x 100 ml (s bikarbonátom sodným a L-glutamínom, sterilizované filtráciou, testované na endotoxíny)

4) Fetálne bovinné sérum, 20 ml, s nízkym obsahom endotoxínov a hemoglobínu

5) Lektín z Phaseolus vulgaris 0.5 mg (fytohemaglutinín - PHA-P)

6) Skúmavky s guľatým dnom a uzáverom, polypropylénové sterilné pre tkáňové kultúry 17 x 100 mm,obsah 14 ml, 25 ks v sáčku

7) Platničky pre tkáňové kultúry s vĺčkom, 2 platničky, 96 jamiek, ploché dno, sterilné.

Reagencie dostupné od Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.,

USA lebo iných firiem.

Takáto PBL súprava sa môže používať, ako tak zvaný vyhľadávací systém druhej fáze, na overenie výsledkov získaných s RPC bunkami alebo niekady ako priamy vyhľadávací systém pre niektoré látky, ktoré môžu byť neaktívne ako imunomodulátory v hlodavcoch, napr. organoselénové zlúčeniny.

1) Dvakrát spracovanú vodu pre tkáňové kultúry, 100 ml

2) Médium RPMI-1640, 2 x 100 ml (s bikarbonátom sodným a L-glutamínom, strilné, filtrované, testované na endotoxíny)

3) Fetálne bovinné sérum, 20 ml, s nízkym obsahom endotoxínov a hemoglobínu

4) Lipopolysacharid (LPS) 0.5 mg, z E. coli 0127:B8

5) Skúmavky s guľatým dnom a uzáverom, sterilné, 25 ks v sáčku, polypropylén, pre tkáňové kultúry, 12 x 75 mm, obsah 6 ml,

7) Platničky pre tkáňové kultúry s vĺčkom, 5 platničiek, 96 jamiek, ploché dno, sterilné.

Reagencie dostupné od Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA lebo iných firiem.

Prostriedok na prevedenie metódy podľa tohoto vynálezu zahrnujúci amplifikáciu výsledkov, ktorého zloženie '· je osobitne vhodné pre mikro-merítko, je v podstate charakterizovaný tým, že obsahuje na jednej strane PBL kultúru lebo RPC suspenziu a na druhej strane nestroídnu protizápaľovú zlúčeninu, s výhodou látku vybranú zo skupiny organoselénových zlúčenín, ako je ebselen, indomethacin a metabolity týchto zlúčenín, nejvýhodnejšie indomethacin.

Príklady . täkiŕfaGf&nKó vynálezu

Následujúce konkrétne Príklady objasňujú predkládaný vynález. Rozumie sa, že neobmedzujú rozsah vynálezu nijakým spôsobom.

Príklad 1:

Jednotlivé roztoky RPC sa získali z 36 samíc 7-8 týždňov starých BALB/c myší zabitých éterom pomocou inekcie 5 ml Eaglovho minimálneho základného média (minimum essential médium, EMEM), doplneného 10 % teplotné inaktivovaného teľacieho séra, do peritoneálnej dutiny. Výmytky z jednotlivých myší obsahovali 1-2 x 10⁶ buniek. Suspenzie buniek z každej myši sa rozdelila na dve vzorky rozdelené do dvoch skúmaviek. Na jednu vzorku sa pôsobilo 100 μς TTP/ml a druhá slúžila ako negatívna kontrola ukazujúca spontánne uvľňovanie cytokínov.

Všetky kultúry boli inkubované pri 26°C po 20 hod a potom boli centrifugované pri 1000 rpm po 10 min. Supernatanty boli odobrané a testované na IFN-beta aktivity v bioteste používajúcom mikrometódu inhibície cytopatických účinkov spôsobovaných EMCV (vírusom encefalomyokartitídy) na myšacie bunky L₂₉₂· ^v každom stanovní bola zahrnutá interná laboratórna štandarta ktorá bola kalibrovaná proti medzinárondnému štandartnému preparátu Mu IFN, G002-904-511, NIH, Bethesda, USA. Cytopatické účinky boli merané MTT metódou podľa Berga et al., APMIS, 98, 156-162. Boli získané následujúce výsledky: Pre kontroly hladina IFN-β bola 1-8 U/ml s priemerom < 2, pre vzorky, na ktoré sa pôsobilo TTP, hladina IFN-β bola 4-127 U/ml, s priemerom 16 U/ml. Výsledky sú graficky prezentované na pripojenom náčrte Obr. 1. (Porovnanie produkcie IFN-β V RPC s pôsobením TTP a bez neho, 1 - hranica nálezu, 2 mediaha, podlá Mediana testu P = 0,0000. Každý bod ukazuje hladinu IFN v RPC izolovaných z jednotlivej myši).

Príklad 2:

Postup ako je popísaný v Príklade 1 bol zopakovaný so skupinou 7 myší ale miesto delenia suspenzií RPC z jednotlivých myší po dvoch vzorkách sa suspenzia delila na štyri vzorky. Vzorky sa dali do štyroch skúmavok (do každej 1 ml). Jedna vzorka bola negatívna kontrola, a na ostatné tri sa μg TTP/ml aby sa určila koncentračná uvolňovanie IFN-β. Po inkubácii 20 hod pri centrifugované. V zobratých supernatantoch bol IFN-β satnovený ako je popísané v Príklade 1. Získané výsledky sú prezentované v pripojenom náčrte Obr. 2 (Závislosť produkcie IFN na koncentrácii TTP). Každá krivka patrí k výsledkom pozorovaným s RPC suspenziou odvodenou z jedinej myši.

pôsobilo 100, 10 a závislosť TTP na 26°C boli skúmavky

Príklad 3:

Postupovalo sa ako je popísané v Príklade 1 až na to, že sa stanovoval TNF-alfa miesto IFN-β.

Supernatanty RPC kultúr, s pôsobením lebo bez pôsobenia 100 μg TTP/ml, boli testované na TNF aktivitu v bioteste. Myšacie bunky L_g2g podobné fibroblastom (4 x 10⁴ buniek na jamku v 100 μΐ úplného EMEM) sa očkujú na 96-jamkové platničky s plochým dnom (Falcon, Lynbro, Flow) a inkubujú 4 hod pri 37°C v atmosfére 5% CO₂ vo vzduchu. Vzorky sa riedia v EMEM s aktinomycínom D (konečná koncentrácia 2,4 μΙ/ml) v ďalšej platničke. Potom sa odstráni kultivačné médium nad monovrstvami buniek Lg_2g ^a pripravené riedenia sa prenesú k tejto kultúre s použitím viac kanálovej pipety. Po inkubácii 20 hod pri 37°C sa kultúry testujú na zabíjanie buniek MTT metódou ako je popísané vyššie. Boli získané následujúce výsledky: Pre negatívne kontroly hladina TNF-alfa bola v rozmedzí 1-256 U/ml s priemerom 8 U/ml, a pre vzorky, na ktoré sa pôsobilo TTP, hladina TNF-alfa bola tiež 2-256 U/ml, ale priemer bol 64 U/ml. Získané výsledky sú ukázané na pripojenom náčrte Obr. 1. (Porovnanie produkcie TNF-afa v RPC s pôsobením TTP a bez neho, 1 - hranica nálezu, 2 - mediana, podľa Mediana testu P = 0,0030. Každý bod ukazuje hladinu TNF v RPC izolovaných z jednotlivej myši).

Príklad 4:

Postupovalo sa ako je popísané v Príklade 2 až na to, že miesto IFN-β sa stanovoval TNF-alfa, v podstate ako je popísané v Príklade 3 horevyššie.

Získané výsledky sú ukázané na pripojenom náčrte Obr. 4 (Závislosť produkcie TNF na koncentrácii TTP).

Príklad 5:

A: Biologický materiál. Viac ako 115 krvných povlakov od jednotlivých zdravých darcov krvi, získaných z wroclawského Oblastného transfúzneho centra, sa použilo na testovanie Charakterizácia darcov je uvedená v Tabulke 1, tu nižšie.

Tabulka 1: Charakterizácia darcov krvi použitej ako zdroj PBL

Vek (rokov)	Počet	Muži	Ženy	Darcovstvo
násobné	jediné
21-30	24	22	2	24	-
31-40	45	44	1	44	-
41-59	46	44	2	40	6
Celkovo	115	110	5	109	6
%	100	96	4	95	5

18’ Väčšina z nich boli mladí muži, ktorí darovali krv mnoho razy. Významné odchýlky v odpovediach PBL od individuálnych darcov boli pozorované a sú uvedené v Tabulke 2, nižšie.

Ako' vyplývá z Tabuíky 2, 10-30 % PBL kultúr môže neodpovedať na 100 ug TTP dávku, zatialčo len 7 % nemôže byť stimulovaných 10 ^g/ml dávkou PHA a 20 % neodpovedalo na 10 μg/ml dávku % neodpovedalo na tú istú dávku produkciou sú podstatné pre správny výber biologického produkciou IFN a TNF. Tieto dáta materiálu. Neodpovedajúce kutúry PBL sa zisťujú hodnotením negatívnych kontrol (bez pôsobenia, cytokínov) a pozitívnych kontrol (s induktorov, ako PHA lebo LPS).

spontánne uvoľňovanie pôsobením štandartných

Tabuľka 2: IFN a TNF odpoveď PBL od jednotlivých darcov krvi po

Induktor	stimulácii buď rôznymi várkami TTP lebo štandartnými
induktormi Dávka (p.g/ml)	Počet testovaných PBL	Počet odpovedajúcich
IFN	í (%)	TNF	(%)
TTP 010391	100	19	13	(68)	13	(68)
	30	13	6	(46)	9	(69)
	10	15	14	(93)	13	(87)
TTP 020391	100	14	10	(71)	11	(79)
	30	12	8	(67)	8	(67)
	10	10	5	(50)	5	(50)
TTP 101091	100	26	21	(81)	20	(77)
	30	20	9	(45)	8	(40)
	10	24	14	(58)	15	(63)
TTP 010991	100	5	5	(100)	4	(80)
	30	4	2	(50)	0	(0)
	10	5	2	(40)	3	(60)
TTP 021091	100	5	4	(80)	4	(80)
	30	4	3	(75)	4	(100)
	10	5	3	(60)	3	(60)
TTP 111191	100	5	3	(60)	4	(80)
	30	2	2	(50)	4	(75)
	10	5	4	(80)	2	(40)
TTP (8x)	100	29	19	(66)	10	(34)
	30	24	14	(58)	11	(46)
	10	21	16	(76)	2	(10)
PHA	10	69	64	(93)	54	(78)
LPS	10	41	33	(80)	21	(51)
žiadny	-	69	36	(52)	20	(29)

Tabuľka 3: Indukcia IFN lebo TNF rôznymi várkami 100 μ/ml rašelinového extraktu v medzinárodných jednotkách aktivity

	IFN / jednotiek/ml	TNF /	jednotiek/ml
Séria čís.	Počet stano- vení	Rozsah	Mediana	Počet stano- vení	Čas 24 hod Rozsah	s star Medi- ana	lovenia 6 dní Rozsah	Medi- ána
Kont- rola bez iduk- torov	333	<10- 100	10	41	9-750	27	9-80	9
31090	3	5- 30	30	3	ND	ND	9-80	80
291290	21	10- 3000	100	14	ND	ND	9-750	40
010391	23	10- 2000	60	17	ND	ND	9-160	9
020391	19	10- 1000	30	32	9-750	200	9-250	27

Upravené média boli pred testovním skladované pri 4°C

Boli použité ľudské leukocyty periferálnej krvi od zdravých darcov (8 x 10⁶ buniek/ml)

B. Vykonané experimenty

Vzorky extraktov rašeliny brané z rôznych produkčných várok, číslované ako je ukázané v Tabuľke 3, boli testované s použitím PBL testu ako je popísané vyššie. V pokusoch boli kvalitatívne určené iterferón (IFN) a faktor nekrózy nádorov (TNF), ako aj stanovené horeuvedeným štandartným postupom; bola stanovená ich aktivita vyjadrená v medzinárodných jednotkách aktivity. Experimenty boli opakované v počtoch uvedených v Tabuľke 3. Rozsah výsledkov a mediány šú tiež uvedené.

Pre ilustráciu, podobný test bol vykonaný so štandartným rašelinovým preparátom. Pri koncentrácii 30 ug/ml bola aktivita interferónu v rozmedzí 30 - 300 medzinárodných jednotiek aktivity, kým pri koncentrácii 100 ug/ml bola 300 - 1000 medzinárodných jednotiek aktivity.

Stredné koncentrácie vykazovali lineárny vzťah medzi dávkou a odpoveďou.

Imunoaktívne rašelinové extrakty testované v horeuvedenom Príklade sú produkty popísané v PCT prihláške čís. PCT/EP92/00491.

Z dát Tabuľky 3 je jasné, že pre PBL kultúry sú pozitívne a negatívne kontroly podstatné pri hodnotení výsledkov.

Ďaľšie pokusy ukazujú, že ked sa neuvažujú PBL kultúry, ktoré nedávajú odpovede a keď sa vykoná štatistické hodnotenie veľkého počtu pokusov, nemôže byť pochýb o tom, že testy podľa vynálezu slúžia svojmu účelu.

Behom vyše dvoch rokov to bolo vyše 20 rôznych várok TTP, vrátane 10 komerčných várok liečiva, ktorých aktivity boli stanovené v biologických testoch, 2) várky odmietnuté výrobcom pre nezodpovedajúcu biologickú aktivitu stanovenú v myšiach, čo bola pod určeným extrakty pripravované uvedené v Tabuľke 4 štandartom a 3) laboratórne rašelinové v malom merítku. Získané výsledky sú tu nižšie vo forme stredných hladín indukovaných IFN a TNF (s vypčítanou štandartnou odchýlkou - SD a so štatistickou významnosťou.

Tabulka 4: Vliv rôznych várok TTP na tvorbu IFN a TNF ľudskými PBL

Induktor Dávka IFN TNF ^g/ml) Log₁₀ jednotiek/ml (± SD)

TTP	010391	100 30 10	1.41 0.96 1.81	+ + +	1.07^b 1.07 0.58^c	1.26 1.25 1.45	+ + +	0.91^c 0.88^b 0.63^c
TTP	020391	100	1.23	+	0.81^a	1.35	+	0.75^c
		30	1.12	+	0.90	1.14	+	0.83^b
		10	0.75	+	0.76	0.86	+	0.90
TTP	101091	100	1.70	+	0.91^c	1.38	+	0.81^c
		30	0.99	+	1.12	0.62	+	0.80
		10	1.22	±	1.07^a	0.94	+	0.76^b
TTP	010991	100	2.24	+	0.30^c	1.35	+	0.73^b
		30	1.00	+	1.00	1	3.0
		10	0.56	+	0.68	0.88	+	0.73
TTP	021091	100	1.72	+	0.87^b	1.49	+	0.84^b
		30	1.39	+	0.81	1.79	+	0.20^c
		10	1.11	+	0.91	1.01	+	0.84
TTP	111191	100	1.36	+	1.12	1.18	+	0.62^b
		30	1.00	+	1.00	1.21	+	0.71^a
		10	1.56	+	0.86^a	0.54	+	0.66
TTP	(8x)	100	1.04	+	0.82^a	0.63	+	0.91
		30	1.88	+	0.81	0.75	+	0.84
		10	1.10	+	0.70^b	0.13	+	0.40^a
PHA		10	2.08	+	0.79^c	1.67	+	0.99^c
LPS		10	1.36	+	0.80^c	'0.97	+	1.01^b
žiadny	-	0.64	+	0.63	0.42	+	0.67

Stredné hodnoty boli počítané zo všetkých výsledkov titrácií IFN lebo TNF. Čo bolo bez odpovede sa považuje za 0.

^a_c Odlišné od Nič (spontánna tvorba cytokínov) pri ^a p < 0.05, ^b p < 0.01 lebo ^c p < 0.001.

Mediánové hodnoty zodpovedajúce výsledkom prezentovaným v Tabulke 4 sú ukázané v Tabulke 5, kým vybrané dáta sú prezentované v grafickej forme v Obr. 5 a 6, ukazujúcich vliv rôznych várok TTP na produkciu IFN resp. TNF.

Tabuľka 5: Vliv rôznych várok TTP na tvorbu IFN a TNF ľudskými PBL

Induktor	Dávka ^g/ml)	IFN	jednotiek/ml	TNF
TTP 010391	100	30		27
	30	<10		27
	10	100		27
TTP 020391	100	30		50
	30	30		34
	10	<10		<9
TTP 101091	100	100		34
	30	<10		<9
	10	45		18
TTP 010991	100	300		27
	30	<10		<9
	10	<10		18
TTP 021091	100	100		27
	30	60		80
	10	60		27
TTP 111191	100	100		18
	30	<10		40
	10	100		<9
TTP (8x)	100	20		<9
	30	10		<9
	10	20		<9
PHA	10	200		80
LPS	10	30		27
žiadny	-	10		<9

Mediánové hodnoty boli počítané zo všetkých výsledkov titrácií IFN lebo TNF.

Identifikácia indukovaných cytokínov sa prevádzala pomocou neutralizácie IFN a TNF indukovaných TTP.

Horeuvedené výsledky sú vysvetlené pomocou Obr. 5 resp. 6.

Vliv rôznych várok TTP na tvorbu IFN a TNF ľudskými PBL (Obr. 5). Použilo sa sedem rôznych várok TTP. Každý bod grafu označuje PBL jednotlivého zdravého darcu' krvi. IFN aktvita označuje antivírusové jednotky. · Tieňovaná oblasť, ukazuje hranicu nesignifikantných dát. Vodorovné čiary ukazujú stredné hodnoty. Indukcia IFN pri 30 a 100 μg/ml TTP je štatisticky významná (p < 0.05) .

Vliv rôznych várok TTP na tvorbu IFN a TNF ľudskými PBL (Obr. 5). TNF aktvita je vyjádrená v cytotoxických jednotkách pre myšacie bunky ^L292* Odpoveď na 30, 100 a 200 μ9/πι1 TTP je signifikantná (p < 0.05) (Obr. 6.).

V pokusoch boli použité potentné polyklonálne antiséra, menovite proti prírodnému IFN-alfa, lýmfoblastoidnému (Namalwa) IFN-alfa a prírodnému IFN-gama, na neutralizáciu intivírusovej aktivity v supernatantoch PBL kultôr, na ktoré sa pôsobilo 20 hod tromi rozdielnymi várkami TTP. Výsledky, ako sú ukázané v priloženej kresbe Obr. 7 (Výsledky neutralizácie interferónov polyklonálnymi anti-interferónovými sérami) ukazujú, že podiely typov IFN alfa a gama vytváraných PBL jednotlivých darcov krvi sa závažne líšia. Zdá sa, že obraz uvoľňovaných interferónov PBL každého darcu je individuálnou charakteristikou tohoto darcu.

Neutralizačné testy vykonané s potentným králičím anti-TNF-alfa sérom (Genzyme Inc.) ukázali, že indukovaný TNF je hlavne TNF typu alfa. Toto bolo overené výsledkami podobnej neutralizácie vykonanej s králičím anti-TNF-β sérom (Genzyme Inc.), ktoré neneutralizovalo TTP indukovanú TNF aktivitu.

Obr. 7 ukazuje výsledky neutralizácie interferónov polyklonálnymi anti-interferónovými sérami. Na média z PBL kultúr inkubovaných s TTP (použili sa 3 rôzne várky TTP a 7 rôznych PBL), ktoré obsahovali IFN, sa pôsobilo vyznačenými anti-IFN sérami: 1 - bez pôsobenia; 2 - s pôsobením anti-HuIFN-alfa; 3 - s pôsobením anti-HuIFN-Ly; 4 - s pôsobením anti-HuIFN-gama.

Príklad 6:

Postup popísaný v Príklade 5 bol vykonaný s účelom ukázať amplifikačný účinok prítomnosti amplifikátora, ako indomethacín, podlá predkládaného vynálezu.

Každá kultúra PBL bola rozdelená na niekolko vzoriek. Jedna z nich bola negatívna kontrola ukazujúca spontánne uvoľňovanie cytokínov, ďalšia bola pozitívna kontrola, na ktorú sa pôsobilo štandartným potentným induktorom cytokínu s povahou uvedenou nižšie, a na zvyšné vzorky sa pôsobilo 1 - 100 μg/ml TTP, várky čís. 010391 lebo 020391, ako aj TTP I a TTP II, ktoré sa objavujú v Tabuľke 6b resp. 6c, a 5 μg/ml indomethacinu plus TTP z rovankých várok (Tabuľka 6a) lebo ináč 10 lebo 20 μg/ml organoselénových zlúčenín (1), (2) lebo (3) ako sú definované vyššie plus TTP z rovnakých várok. V supernatantoch inkubovaných kultúr boli stanovené IFN a TNF.

Získané výsledky sú ukázané v Tabuľkách 6a, 6b a 6c nižšie.

Tabuľka 6a:

Efekt amplifikácie cytokinínovej indukcie v prítomnosti indomethacinu

Pokus	Induktor	Indomethacin	Koncentrácie úg/ml	Cytokíny (jedn./ml)
IFN	TNF
l.^a)	TTP 010391	—	100	300	750
		-	10	30	250
		-	1	20	80
		+	100 + 5	1000	2200
	- -	+	10 + 5	200	750
		+	1 + 5	<10	250
	LPS	-	10	200	500
	žiadny	-	-	<10	9
	žiadny	+	5	20	27
2.^b)	TTP 020391	—	100	600	50
		-	40	20	9
		-	20	10	9
		-	10	<10	<9
		+	100 + 5	600	80
		+	40 + 5	100	27
		+	20 + 5	100	9
			10 + 5	30	9
	PHA	-	5	20	80
	PHA	+	5 + 5	2000	80
	žiadny	-	-	60	<9
	žiadny	+	5	10	<9

PBL boli pripravované z čerstvej heparinizovanej krvi separčnou technikou s Ficoll-Hypaque. PBL kultúry obsahovali 7 x 10⁶ buniek/ml.

PBL boli pripravované zo žltých krvných povlakov z Oblastného transfúzneho centra. Bunky boli spracované podľa metódy Cantella et al. (Meth. Enzymol. 1981, 78, 29-38). PBL kultúry obsahovali 8 x 10⁶ buniek/ml.

Tabuľka 6b:

Efekt amplifikácie cytokinínovej indukcie v prítomnosti zlúčeniny ITCL

Pokus	Induktor	Zlúčenina ITCL	Koncentrácie μσ/πιΐ	Cytokíny (jedn./ml)
IFN	TNF
1.	TTP 010391	—	100	100	18
	TTP 010391	-	30	100	9
	TTP 010391	+	100 + 10	3000	80
	TTP 010391	+	30 + 10	300	80
	PHA	-	10	3000	250
	žiadny	-	-	10	<9
	žiadny	+	10	<10	<9
2 .	TTP I	—	100	3000	28
	TTP I	-	30	30	<9
	TTP I	+	100 + 10	3000	80
	TTP I	+	30 + 10	300	250
	PHA		10	100	9
	žiadny	-	-	10	<9
	žiadny	+	10	10	<9

Tabuľka 6c:

Efekt amplifikácie cytokinínovej indukcie v prítomnosti organoselénových zlúčenín

Pokus	Induktor	Organoselénové	Koncentrácie	Cytokíny	(jedn./ml)
		zlúčenina	μg/ml		IFN	TNF
1.	TTP	—	10		100	<9
	TTP	-	5		10	<9
	TTP	Zlúč.(1)	10 +	20	300	27
	TTP	Zlúč.(1)	5 +	20	100	27
	TTP	Zlúč.(2)	10 +	20	300	50
	TTP	Zlúč.(2)	5 +	20	100	9
	PHA	-	10		100	<9
	žiadny	Zlúč.(1)	20		200	9
	žiadny	Zlúč.(2)	20		100	27
	žiadny	—	—		10	<9
2.	TTP II	—	50		10	<9
	TTP II	-	5		10	<9
	TTP II	Zlúč.(3)	50 +	10	30	27
	TTP II	Zlúč.(3)	10 +	10	30	27
	PHA	-	-		30	<9
	žiadny	Zlúč.(3)	10		10	<9
	žiadny	—	—		10	<9

PBL kultúry obsahovali 8 x 10⁶ buniek/ml. TTP je rašelinový extrakt pripravovaný v malom merítku. Pomerne nízka TNF odpoveď je pravdepodobne dôsledok skutočnosti, že žlté krvné povlaky boli skladované 20 hod pri 4°C pred prípravou kultúr. Organoselénové zlúčeniny sú induktormi cytokínov tak ako TTP.

Príklad 7:

Diagnostický test odrážajúci účinok podávania TTP orálne v denných dávkach 5 mg vo forme komerčne dostupných tabliet na odpoveď PBL kultúr in vitro ku dodatočnej dávke TTP pri indukcii cytokínov sa vykonával podľa jednotlivostí uvedených nižšie:

Test sa vykonal so štyrmi zdravými ženskými dobrovolníčkami, vek 43-58, ktoré darovávali týždenne 20 ml žilnej krvi branej z v. ulnaris pred, v priebehu a po podávaní TTP v denných dávkach 5 mg v tabletách. Použili sa dva režimy podávania.

Dve z dobrovolníčiek (označované ďalej ako B.K. a J.Z.J.) boli podrobené pôsobeniu TTP spočívajúcemu z troch sedemdňových cyklov: Liek sa podával per os., jedna 5 mg tableta denne po jeden týždeň so sedemdňovou prestávkou následovanou sedemdňovým obdobím orálneho podávania TTP. Celková dávka bola 21 tabliet. Druhé dve dobrovolníčky (označované ďalej ako A.D.T. a W.F) boli podrobené pôsobeniu TTP jednou 5 mg tabletou denne podávanou per os súvisle po tri týždne. Celková dávka bola tiež 21 tabliet. Po dvoch týždňoch prerušenia sa pôsobenie opakovalo.

Použité 5 mg tablety boli štandartný komerčný produkt Farmaceutickej fabriky TORF CORPORATION, Wroclaw, Polsko. Každá tableta obsahovala 5 mg TTP, 43 mg laktózy a 2 mg MYVATEX. Na indukciu cytokínov v PBL kultúrach in vitro sa používal práškový TTP ako čistá substancia vo forme zásobného roztoku obsahujúceho 20 mg TTP/ml v redistilovanej vode prostej pyrogénov a skladovaného pri 4°C.

Vzorky krvi odobranej od dobrovolníčiek boli heparinizované roztokom Heparin POLFA bez konzrvačných látok v konečnej koncentrácii 10 jednotiek/ml a spracované ako je popísané skôr aby sa pripravila in vitro kultúra PBL, na ktorú sa potom pôsobilo induktormi cytokínov PHA, LPS a TTP spôsobom popísaným v predchádzajúcich príkladoch. 200 μg kultúry boli použitých na každé stanovenie. Supernatanty boli skladované pri 4°C a testované na IFN aktivitu behom jednoho týždňa respektíve skladované pri - 20°C a testované na TNF aby sa zabránilo samovolnej proteôlýze.

IFN a TNF boli testované rovnakým spôsobom ako je popísané vyššie. Získané výsledky sú uvedené v pripojených grafoch Obr. 8-13 (Odpoved PBL kultúr rôznych pacientov na IFN induktory a na TNF induktory behom orálneho podávania TTP).

Ako je vidieť z dát uvedených v Obr. 8a 9, ktoré ukazujú IFN odpovede prvej skupiny dobrovolníkov behom cyklu podávania, odpovede sa znížili a vrátili k pôvodnej hodnote po dvoch týždňoch prestávky. Naproti tomu TNF odpovede ukázané v Obr. 10 a 11 sa zvyšovali behom podávania a vrátili sa k normálnej hladine po dvoch týždňoch prestávky.

A.D.I., osvedčuj ú, dosiahne po troch

Dáta uvedené v Obr. 12 a 13, ktoré ukazujú odpovede na indukciu cytokínov pri inom spôsobe podávania dobrovolníčke že hyporeaktívny stav k IFN indukcii sa týždňoch súvislého podávania TTP orálne.

Hyporeaktívny stav, prejavujúci sa stratou schopnosti PBL kultúr odpovedať na indukciu IFN roztokmi TTP vymizne po dvoch týždňoch prestávky. Naproti tomu behom troch týždňov podávania TTP sa nevyvinula hyporeaktivita k indukcii TNF (Obr. 12).

Horeuvedené výsledky ukazujú, že optimálna dávka imunomodulátoru ako cytokínového induktoru môže byť určená induviduálne pre každého liečeného pacienta pomocou jednoduchého PBL testu podía predkladaného vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob stanovenia imunologickej aktivity biologicky aktívnych, cytokiníny indukujúcich imunomodulátorových látok vyznačujúci sa tým, že na neaktivované kultúry ludských leukocytov periferálnej krvi (PBL) - s výhodou pripravených v živnom médiu vhodnom pre tkáňové kultúry kde hustota PBL kultúry na priame použitie ja približne 8 x 10⁶leukocytov/ml - lebo na suspenziu rezidentných peritoneálnych buniek (RPC) BALB/c myší sa pôsobí roztokom látky, čo má byť testovaná aby sa indukovala - v priebehu istej inkubačnej periódy

- tvorba cytokínov, ktoré sú potom stanovované podía štandartných identifikačných metód.
2. Spôsob stanovenia imunologickej aktivity biologicky aktívnych, cytokiníny indukujúcich imunomodulátorových látok vyznačujúci sa tým, že na neaktivované kultúry ludských leukocytov periferálnej krvi (PBL) lebo na suspenziu rezidentných peritoneálnych buniek (RPC) BALB/c myší sa pôsobí roztokom látky, čo má byť testovaná aby sa indukovala

- v priebehu istej inkubačnej periódy - tvorba cytokínov, ktoré sú potom stanovované podía štandartných identifikačných metód s predpokladom, že v prípade varianty ludských PBL kultúr sú tieto kultúry pripravované v živnom médiu vhodnom pre tkáňové kultúry a hustota PBL kultúry na priame použitie ja približne 8 x 10⁶ leukocytov/ml.
3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používa kultúra ľudských (PBL) v ktorej sa indukuje tvorba rôznych Cytokínov, kde potom každý z indukovaných cytokínov.·' je kvalitatívne určený a kvantitatívne stanovený s použitím súboru rôznych, s výhou známych, sér, ktoré rozpoznávajú jednotlivé cytokíny.

3. Spôsob podľa nárokov 1 lebo 2, vyznačujúci sa tým, že roztok, čo má byť testovaný, sa používa v koncentrácii 0.1 - 200 ug/ml.
4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že každý cytokín, osobitne faktor nekrózy nádorov (TNF), je identifikovaný dostatočne rýchlo, s výhodou hned po inkubácii, aby sa predošlo proteolýze.
5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov s RPC suspenziou vyznačujúcou sa tým, že obsahuje asi 1 - 2 x 10⁶ buniek/ml.
6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že roztok, čo má byť testovaný, sa pripravuje v živnom médiu Eagle lebo RPMI-1640 s pridaním 10 % teľacieho fetálneho séra.
7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z vyznačujúci sa tým, hodnotia proti kalibračnej krivke, pozitívnych a negatívnych kontrol.
8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z vyznačujúci sa tým, extrakt, ako je TTP, lebo jeho frakcie predchádzajúcich nárokov, že získané výsledky sa s výhodou so zahrnutím predchádzajúcich nárokov že sa testuje rašelinový
9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že sa dosahuje amplifikácia výsledkov primiešaním nesteroídnej protizápaíovej zlúčeniny do testovaného roztoku, s výhodou zlúčeniny ITCL a organoselénových zlúčenín (1-3), a najvýhodnejšie indomethacinu.
10. Spôsob na stanovenie imunologickej odpovede ludského indivídua na liečbu používajúcu cytokiníny indukujúce imunomodulátoroyé látky, vyznačujúci sa tým, že na .kultúry leukocytov periferálnej krvi (PBL) ludského indivídua, liečeného takouto imunomodulátorovou látkou, sa pôsobí v určitých časových úsekoch, s výhodou okolo 7 a 14 dní, roztokom podávanej látky, aby sa indukovala tvorba cytokínov, ktoré sa potom stanovujú štandartnými metódami, aby sa určil čas, v ktorom sa vývine hyporeaktivita k tejto látke po dlhšom podávaní tejto látky a čas znovuzískania schopnosti odpovedať na ďalšiu dávku látky po istej perióde prerušenia.
11. Spôsob podlá nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa aplikuje v priebehu liečby používajúcej rašelinový extrakt, osobitne TTP, ako cytokíny indukujúcu imunomodulátorovú látku.
12. Použitie TTP v spôsobe nárokovanom v ktoromkoľvek z predchádzajúcich nárokov.
13. Prípravok na vykonávanie spôsobu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12, vyznačujúci satým, že obsahuje na jednej strane kultúru PBL lebo suspenziu RPC a na druhej strane nesteroídnu protizápaľovú zlúčeninu, s výhodou indomethacin.