PL170592B1

PL170592B1 - Method of determining cytokin inducing activity of immunologically active substances and composition therefor

Info

Publication number: PL170592B1
Application number: PL92303417A
Authority: PL
Inventors: Anna Inglot; Zofia Blach-Olszewska
Original assignee: Torf Ets
Priority date: 1991-10-26
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1997-01-31
Also published as: EP0539610A1; GR930300100T1; NO941444D0; DK0609255T3; BG61705B1; HU9401185D0; AU2650992A; WO1993008470A1; US5543300A; CZ100494A3; DE609255T1; JPH07500905A; EP0609255B1; DE69220078D1; GR940300077T1; EP0609255A1; SK44094A3; LV12140A; ATE153763T1; HU216863B

Abstract

1. Sposób okreslania aktywnosci substancji immunologicznie czynnych w zakresie indukcji cytokin, w którym przygotowuje sie hodowle tkankowa, poddaje sie te hodowle dzialaniu roztworu badanej im m unom odula cyjnej substancji aby spowodowac indukcje produkcji cytokin, a nastepnie oznacza sie znanymi metodami wytworzone cytokiny, znam ienny tym, ze stosuje sie hodowle tkankowa zawierajaca ludzkie leukocyty krwi obwodowej PBL, pobrane od dawców meprzejawiajacych hyporeaktywnosci w odniesieniu do indukcji IFN, która przygotowuje sie stosujac m em itogenna pozywke dla hodowli tkankowych, korzystnie RPMI 1640 uzupelniona 10% uprzednio zbadanej memitogennej bydlecej surowicy plodowej. L-glutam ina i antybiotykami, i której gestosc - w postaci gotowej do uzycia wynosi okolo 8 x 106 leukocytów/ml lub tez stosuje sie hodowle tkankowa zawierajaca rezydentne komórki otrzewnowe RPC pobrane z 5-8 tygodniowych, zdrowych "dziewiczych" myszy BALB/C, mestymulowanych immunologicznie ani nieprzejawiajacych wysokiej spontanicznej produkcji cytokin, której gestosc - w postaci gotowej do uzycia wynosi okolo 1-2 x 10 kom órek/m l. a sposród wytworzonych cytokin oznaczaniem obejmuje sie co najmniej oznaczenie stezenia interferonu (IFN) i/lu b czynnika nekrozy nowotworów TNF 6. Kompozycja do prowadzenia sposobu oznaczania aktywnosci substancji immunologicznie czynnych, w zakresie zdolnosci do indukow ania cytolan, który to sposób obejmuje przygotowanie hodowli ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), poddanie tej hodowli dzialaniu badanej substancji immunologicznie czynnej by spowodowac produkcje cytokin, a nastepm e oznaczenie wyindukowanej produkcji cytokin znanymi metodami, znam ienna tym, ze stanowi ja kompozycja otrzym ana z nastepujacych skladników stanowiacych zestaw do prowadzenia oznaczania 1) dwukrotnie oczyszczana woda do kultur tkankowych, 2) pozywka z gradientem gestosci korzystnie Histopaaue® lub Flcoll-Hypaque®-1077. 3) pozywka RPMI-1640 z kwasnym weglanem sodu i L-glutamina, przefiltrowana w w arunkach sterylnosci i poddana testom n a endotoksyny, 4) bydleca surowica plodowa (FBS) o niskiej zawartosci endotoksyn i hemoglobiny, 5) Lektyna (fltohemaglutynma, PHA). PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu określania aktywności substancji immunologicznie czynnych w zakresie indukcji cytokin oraz kompozycji do określania aktywności substancji immunologicznie czynnych w zakresie indukcji cytokin.

Dotychczas badanie aktywności substancji immunologicznie czynnych oparte było na testach in vivo prowadzonych na zwierzętach doświadczalnych, w których badaną substancję podawano wyselekcjonowanym zwierzętom i po oznaczonym okresie czasu oceniano stan ich systemu immunologicznego. Taki znany sposób ma kilka wad. Przede wszystkim jest długotrwały, a więc nie może być wykorzystany do kontroli międzyoperacyjnej procesu wytwarzania substancji immunologicznie czynnych. Ponadto, hodowla i selekcja zwierząt doświadczalnych nastręcza również szereg praktycznych trudności w zakresie zapewnienia wymaganej ilości zwierząt doświadczalnych w określonym czasie, kiedy konieczne jest wykonanie oznaczeń. Intensywny rozwój wykorzystania zwierząt doświadczalnych hamowany jest przez ugrupowania działające na rzecz ochrony zwierząt i postuluje się szerokie odejście od testów in vivo na zwierzętach doświadczalnych. Co najważniejsze jednak, szereg cennych substancji immunologicznie aktywnych nie wykazuje żadnej aktywności w badaniach prowadzonych na zwierzętach z uwagi na odmienności systemów immunologicznych.

Cytokiny, takie jak interferony (IFN) i czynniki nekrozy nowotworów (TNF) są białkami hormonopodobnymi, które odrywają ważną rolę w praktycznie wszystkich reakcjach immunologicznych, jak również w procesach regulacyjnych odpowiedzialnych za utrzymanie homeostazy, wytwarzanie takich cytokin może być indukowane przez niektóre substancje, które ze względu na swoją czynność immunologiczną są użyteczne w leczeniu niedoboru odpornościowego i chorób pokrewnych.

Z licznych publikacji, m.in z europejskich opisów patentowych nr 0227335, nr 0238851 czy zgłoszenia WO-A-87/05400 znane są metody diagnostyczne oparte na analizie próbek krwi lub wyodrębnionych z niej komórek takich jak leukocyty, pobranych od ludzi lub zwierząt, pod kątem obecności spontanicznej lub indukowanej określonych cytokin. Metody te służą odpowiednio do stwierdzenia występowania stanu chorobowego, odpowiedzi na pobudzenie czynnikiem immunonoczynnym lub reakcji systemu pacjenta na określony antygen.

Testy dotychczas stosowane w przemyśle farmaceutycznym do określania aktywności immunologicznej są liczne, ale trudne do przeprowadzenia. Przy badaniu klinicznym nowej kompozycji leczniczej mającej działanie immunologiczne jej efektywność immunologiczną

170 592 określa się poprzez monitorowanie za pomocą standardowych metod licznych, dobrze znanych i oznaczalnych analitycznie cech układów immunologicznych.

W fazie badań klinicznych oznaczanie poziomów IFN w osoczu może być trudne, u/wtnuor^ono uz rriioicAAAiia u, »» j¹ l »» uizjliiiv rr uliujow v* U w ··-»·» λ «%··» .-¾ z-»T rr-»·· r«»-»« ·»-*-» T > 1 »-» Tr, Ια^ΤΑΓΑΠΛ i CO p-\ nieprecyzyjne i mylne. intenetouj są b różnych tkankach, mają krótki czas życia, ich działanie jest parakrynne (tylko w bezpośredniej bliskości) i są one silnie związane z receptorami komórkowymi oraz białkami nośnikowymi.

Z drugiej strony procesy technologiczne wytwarzania, oczyszczania i/lub separacji substancji aktywnych immunologicznie takich jak w szczególności ekstrakty z torfu są zwykle procesami wieloetapowymi i zawsze istnieje potrzeba przeprowadzania wiarygodnego i szybkiego testu umożliwiającego dokładną kontrolę produkcji. Ponadto, ponieważ substancje mają często złożoną naturę, jak to jest w przypadku ekstraktów z torfu, ważne jest posiadanie podobnego testu do określania aktywności poszczególnych frakcj i takich substancj i. Jest również niezbędne znalezienie metody badania w mikroskali, ponieważ analizowane produkty są bardzo drogie.

Istnieje oczywiście znaczne zapotrzebowanie na sposoby prawidłowego i łatwego oznaczania aktywności substancji immunologicznie czynnych. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie takiego sposobu, jak również kompozycji i zestawów nadających się do realizacji tego sposobu.

Sposób według wynalazku umożliwia określenie, czy badana substancja jest zdolna do indukowania produkcji różnych cytokin i pozwala na szybkie i efektywne sprawdzenie właściwości niektórych substancji, mianowicie ich aktywności immunologicznej na każdym z technologicznych etapów wytwarzania, separacji, oczyszczania i formułowania kompozycji finalnych.

Rozwiązanie opisanych powyżej problemów umożliwiły poniższe trzy główne odkrycia:

1. Niektóre aktywne immunologicznie ekstrakty z torfu indukują in vitro produkcję cytokin, takich jak interferony i czynniki nekrozy nowotworów w hodowlach leukocytów krwi obwodowej, a indukcja jest zależna od dawki.

2. Interferon-β (i TNF-α) jest produkowany przez rezydentne komórki otrzewnowe (RPC) myszy BALB/c traktowane aktywnymi immunologicznie ekstraktami z torfu w znacznie wyższych ilościach w porównaniu z ilościami tych cytokin uwalnianych spontanicznie przez RPC w próbkach nie traktowanych.

3. Niektóre ekstrakty z torfu testowane in vitro w sposób opisany powyżej wykazują efekt synergistyczny w połączeniu ze znanymi immunomodulatorami, takimi jak związki selenoorganiczne: p-chlorofenyloamid kwasu 3-metylo-5-benzoiloamino-izotiazolo-4-karboksylowego i indometacyna. Umożliwia to używanie w testach dużo mniejszych ilości badanych substancji aktywnych immunologicznie, w celu wykazania ich aktywności.

Sposób określania aktywności substancji immunologicznie czynnych w zakresie indukcji cytokin, w którym przygotowuje się hodowlę tkankową, poddaje się tę hodowlę działaniu roztworu badanej immunomodulacyjnej substancji aby spowodować indukcję produkcji cytokin, a następnie oznacza się znanymi metodami wytworzone cytokiny, według wynalazku polega na tym, że stosuje się hodowlę tkankową zawierającą ludzkie leukocyty krwi obwodowej (PBL), pobrane od dawców nieprzejawiających hyporeaktywności w odniesieniu do indukcji IFN, którą przygotowuje się stosując niemitogenną pożywkę dla hodowli tkankowych, korzystnie RPMI 1640 uzupełnioną 10% uprzednio zbadanej niemitogennej bydlęcej surowicy płodowej, L-glutaminą i antybiotykami, i której gęstość - w postaci gotowej do użycia wynosi około 8 x 10⁶leukocytów/ml lub tez stosuje się hodowlę tkankową zawierającą rezydentne komórki otrzewnowe (RPC) pobrane z 5-8 tygodniowych, zdrowych dziewiczych myszy BALB/c, niestymulowanych immunologicznie ani nieprzejawiających wysokiej spontanicznej produkcji cytokin, której gęstość - w postaci gotowej do użycia wynosi około 1-2 x 1θ6 komórek/ml, a spośród wytworzonych cytokin oznaczaniem obejmuje się co najmniej oznaczenie stężenia interferonu (IFN) i/lub czynnika nekrozy nowotworów (TNF).

Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się roztwór testowanej substancji o stężeniu 0,1 - 200 pg/ml.

170 592

Korzystnie, produkcję cytokin ocenia się w porównaniu z pozytywnym i genatywnym oznaczeniem kontrolnym.

Korzystnie, roztwór badanej substancji immunomodulującej uzupełnia się przed wprowadzeniem go do wskazanej hodowli tkankowej dodatkiem amplifikatora indukcji cytokin w postaci syntetycznego niepeptydowego środka immunomodulacyjnego, korzystnie wybranego z grupy składającej się z leków niesteroidalnych przeciwzapalnych oraz hamujących syntezę prostaglandyny, związków selenoorganicznych, pochodnych izotiazolu oraz ich analogów, homologów i metabolitów, najkorzystniej wybranego z grupy obejmującej związek ITCL, związki selenoorganiczne: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2-benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 oraz indometacynę, w ilości co najmniej od 1 do 20 gg/ml.

Korzystnie, w powyższym sposobie przygotowuje się roztwór zawierający ekstrakt torfowy, otrzymany z surowca torfowego przez wyekstrahowanie substancji biologicznie czynnych wodnym roztworem ługu, a następnie - po oddzieleniu części stałych, przetworzenie hydrolizatu na drodze zakwaszenia, oddzielenia wytrąconych osadów i ponownej alkalizacji z usunięciem wytrąconych części stałych oraz ponownego zakwaszenia z wyodrębnieniem klarownego roztworu ciał czynnych z torfu, przetwarzany dalej na drodze zatężania, ekstrahowania roztworem etanolowo-wodnym, dalszego odbalastowania roztworu oraz ponownego zagęszczenia i oczyszczenia z substancji toksycznych na drodze ekstrakcji eterowej i ostatecznie: odsolenia i zagęszczenia fazy wodnej do zawartości około 10%c suchej masy, a następnie przeprowadzenia w postać stałą, a zwłaszcza ekstrakt z torfu o popielności 8-30%, stopniu rozkładu 30-70% i pH 3,5-7,0 lub frakcję takiego ekstraktu wyodrębnioną dowolną techniką, jako wskazaną substancję immunologicznie czynną i następnie działaniu tego roztworu poddaje się wybraną hodowlę komórkową.

Kompozycją do prowadzenia sposobu oznaczania aktywności substancji immunologicznie czynnych, w zakresie zdolności do indukowaniacytokin, który obejmuje przygotowanie hodowli ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), poddanie tej hodowli działaniu badanej substancji immunologicznie czynnej by spowodować produkcję cytokin, a następnie oznaczenie wyindukowanej produkcji cytokin znanymi metodami, zgodnie z wynalazkiem jest kompozycją otrzymaną na bazie hodowli PBL, z następujących składników stanowiących zestaw do prowadzenia oznaczania:

1) dwukrotnie oczyszczana woda do kultur tkankowych,

2) pożywka z gradientem gęstości korzystnie Histopaąue® lub Ficoll-Hypaque® - 1077.

3) pożywka RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowana w warunkach sterylności i poddana testom na endotoksyny,

4) bydlęca surowica płodowa (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

5) Lektyna (fitohemaglutynina, PHA).

Kompozycja taka może być wprowadzana do obrotu wraz z odpowiednim wyposażeniem do realizacji tego sposobu oznaczania.

Korzystnie kompozycję na bazie hodowli PBL do przeprowadzenia 10-20 oznaczeń manualnych stanowi:

1) 100 ml dwukrotnie przerabianej wody do kultur tkankowych,

2) 100 ml pożywki z gradientem gęstości, korzystnie Histopaąue® lub Ficoll-Hypaque®' 10377.

3) 2 x 100 ml pożywki RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowanej w warunkach sterylności i poddanej testom na endotoksyny,

4) 20 ml bydlęcej surowicy płodowej (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

5) 0,5 mg lektyny z Phaseolus vulgaris (fitohemaglutyniny, PHA) oraz

6) ewentualnie 0,5 mg związku ITCL lub 1,0 mg jednego ze związków selenoorganicznych: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 lub 0,5 mg indometacyny.

Kompozycja taka może być wprowadzana do obrotu w postaci zestawu wraz z okrągłodennymi, propylenowymi jałowymi rurkami z zatyczkami do hodowli tkankowych, o wymiarach

170 592 x 100 mm i pojemności 14 ml, w ilości 25 szt/zestaw i 2 jałowymi płytkami do hodowli tkankowych z pokrywami, o 96 wgłębieniach, płaskodennymi.

Kompozycja zaś, do prowadzenia sposobu oznaczania aktywności substancji immunologicznie czynnych w zakresie zdolności do indukowania cytokin, który obejmuje przygotowanie hodowli mysich rezydentnych komórek otrzewnowych (RPC), poddanie tej hodowli działaniu badanej substancji immunologicznie czynnej by spowodować indukcję produkcji cytokin a następnie oznaczenie wyindukowanej produkcji cytokin znanymi metodami, zgodnie z wynalazkiem jest kompozycja otrzymana z następujących składników stanowiących zestaw do prowadzenia oznaczania:

1) dwukrotnie oczyszczana woda do kultur tkankowych,

2) pożywka RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowana w warunkach sterylności i poddana testom na endotoksyny,

3) bydlęca surowica płodowa (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

4) lipopolisacharyd (LPS)

5) ewentualnie syntetyczny niepeptydowy amplifikator, korzystnie wybrany z grupy obejmującej związek ITCL, związek selenoorganiczny: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo4,24tcnzoi/Oselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 i indometacynę.

Kompozycja taka może być wprowadzana do obrotu w postaci zestawu wraz z odpowiednim wyposażeniem do realizowania tego sposobu oznaczania.

Korzystnie kompozycję na bazie hodowli RPC do przeprowadzenia 10-20 oznaczeń manualnych stanowi:

1) 100 ml dwukrotnie oczyszczanej wody do kultur tkankowych,

2) 2 x 100 ml pożywki RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowanej w warunkach sterylności i poddanej testom na endotoksyny,

3) 20 ml bydlęcej surowicy płodowej (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

4) 0,5 mg lipopolisacharydu z E. coli 0128:B8,

5) ewentualnie 0,5 mg ITCL lub 1,0 mg jednego ze związków selenoorganicznych: bis-[2-(N-ffnylokarboksyamido)]-ffnylodiselfnid o wzorze 12-fenylo-1,2-benzoizoselenazol3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselemd o wzorze 3 lub 0,5 mg indometacyny.

Kompozycja taka może być wprowadzana do obrotu w postaci zestawu wraz z okrągłodennymi polipropylenowymi jałowymi rurkami z zatyczkami do hodowli tkankowych, o wymiarach 12 x 75 mm i pojemności 6 ml po 25 szt/torebkę i 2 jałowymi płytkami do hodowli tkankowych z pokrywami, o 96 wgłębieniach, płaskodennymi.

Kompozycja według wynalazku do oznaczeń w mikroskali, dodatkowo zawiera syntetyczny niepeptydowy amplifikator, korzystnie wybrany z grupy obejmującej związek ITCL, związki selenoorganiczne: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1,2-fenylo-1,2-benrolzoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 i indometacynę, korzystnie 0,5 mg ITCL, lub 1 mg jednego z selenoorganicznych związków 1-3 lub 0,5 mg indometacyny, do oznaczeń w mikroskali.

Hodowla ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL) stosowana w pierwszym wariancie wynalazku jest hodowlą krótkotrwałą, przygotowaną ze świeżych leukocytów ludzi zdrowych, na pożywce do prowadzenia hodowli tkankowych.

W sposobie według wynalazku każdą z cytokin, zwłaszcza czynnik nekrozy nowotworów (TNF) identyfikuje się wystarczająco szybko, korzystnie bezpośrednio po inkubacji, aby uniknąć proteolizy cytokiny.

Szczególnie korzystnym związkiem selenoorganicznym, do stosowania zgodnie z wynalazkiem do amplifikacji wyników testu jest związek o wzorze 2 2-fenylo-1,2-benzoiroselenazol-3(2H)-on to znaczy ebselen PZ 51.

Przykładami pochodnych izotiazolu, które mogą być stosowane do powyższego celu są związki o wzorze ogólnym I, w którym R1 oznacza chlorowcofenyl, korzystnie chlorofenyl,

170 592

R.2 oznacza fenyl a R3 oznacza niższy alkil, korzystnie metyl. Atom chlorowca w grupie chlorowcofenylowej, grupie chlorofenylowej R1 znajduje się korzystnie w pozycji -para, pierścienia fenylowego.

Korzystnym związkiem o powyższym wzorze T jest p-chlorofenyloamid kwasu 3-metylo5-benzoiloamino-izotiazolo-4-karboskylowego, to jest związek o wzorze I, w którym R1 oznacza p-chlorofenyl, R 2 oznacza fenyl a R 3 oznacza metyl. Związek ten będzie poniżej określany w skrócie jako związek ITLC. Dla związku tego istnieje w Polsce rejestracja znaku towarowego VRATTZOLIN. Jego synteza i właściwości są opisane w Arch. Immunol. et Ther. Exp. 1973, 21, 891.

Wspólną cechą środków immunomodulujących opisanych powyżej, to jest organicznych związków selenu, pochodnych izotiazolu i indometacyny, które są użyteczne w oznaczeniach sposobem według wynalazku w mikroskali, jest to, że są one niesterydowymi lekami przeciwzapalnymi, hamującymi syntezę prostaglandyn. Amplifikują one wyniki testów prowadzonych sposobem według wynalazku. Z tego powodu są one szczególnie użyteczne do mikrooznaczeń. Amplikacja wyników może być 5-20 krotna.

W sposobie według wynalazku, do identyfikacji oraz ilościowego oznaczania cytokin stosuje się różne antysurowice, rozpoznające indywidualne indukowane cytokiny. Surowice te są znane i stosowane do testowania i standaryzacji różnych cytokin. Identyfikacja indukowanych cytokin powinna mieć miejsce w momencie zakończenia tworzenia cytokin i przed ich proteolizą. Spośród wielu różnych indukowanych cytokin niektóre tworzą się wolno i pozostają trwałe w roztworze, jak na przykład interferon-, podczas gdy inne tworzą się natychmiast i są podatne na proteolizę, jak na przykład czynniki nekrozy nowotworów.

Przedmiotem równoległego zgłoszenia jest sposób określania odpowiedzi immunologicznej człowieka na niektóre substancje aktywne immunologicznie pod warunkiem, że taka odpowiedź immunologiczna nie jest stymulowana przez infekcje wirusowe lub bakteryjne. Sposób ów może być stosowany do monitorowania odpowiedzi na lek u poszczególnych pacjentów, do ustalania optymalnej dawki induktora cytokiny terapeutycznej, takiego jak PTT, jak również do ustalania efektywnego schematu podawania leku. W sposobie tym indukcję produkcji cytokin bada się w hodowlach PBL pobranych od pacjentów poddawanych terapii immunologicznej.

Obecny wynalazek w wariancie opartym na wykorzystaniu hodowli mysich RPC zapewnia sposób nadający się do szybkiego monitorowania procesów technologicznych takich jak wytwarzanie, oczyszczanie, separacja lub tym podobnych, substancji aktywnych immunologicznie. Gdy zawiesinę rezydentnych komórek otrzewnowych (RPC) myszy BALB/c traktuje się roztworem testowym, indukowany jest mysi interferon-β jak również mysi czynnik nekrozy nowotworów. Obie te cytokiny mogą być wykryte i ilościowo oznaczone według standardowych metod. W sposobie według wynalazku stosuje się zawiesiny świeżych rezydentnych otrzewnowych komórek (RPC) myszy, zawierającą około 1 x 10⁶ komórek/ml. Testowany roztwór przygotowuje się w pożywce Eagle lub RPMI-1640 z dodatkiem 1^%o cielęcej surowicy płodowej. Otrzymane wyniki ocenia się stosując krzywą kalibracyjną przygotowaną przy użyciu substancji modelowej.

Jako substancję modelową można użyć próbkę tej samej substancji aktywnej immunologicznie, testowanej w sposób tradycyjny. Sposóbjest szczególnie odpowiedni do monitorowania procesu otrzymywania ekstraktów z torfu, jak również do analizowania ich frakcji.

Sposób według wynalazku oparty na wykorzystaniu hodowli RPC jest bardzo prosty i efektywny w porównaniu z innymi znanymi sposobami, ponieważ jest on oparty na bezpośredniej indukcji interferonu-β, a nie na wtórnym efekcie tworzenia przeciwciał, jak w przypadku licznych znanych testów. Dotychczas nie było możliwe znalezienie jakiegokolwiek podobnego sposobu z powodu faktu, że system immunologiczny myszy znacznie różni się od ludzkiego systemu immunologicznego i testy uznawane jako wskaźnikowe dla ludzkiego układu immunologicznego, takie jak obecność interferonów w tkankach śledziony lub węzłach limfatycznych, etc.. nie działają na najlepszych laboratoryjnych zwierzętach badawczych, to jest na myszach BALB/c.

170 592

Obecnie stwierdzono, że wyraźną odpowiedź immunologiczną u myszy BALB/c można uzyskać, gdy jako materiał biologiczny do testowania wybierze się rezydentne komórki otrzewnowe (RPC), stosując świeże zawiesiny takich komórek. Dla każdego testu wystarczające jest poświęcenie dokładnie trzech zwierząt. Wyniki uzyskuje się w ciągu kilku godzin. Materiał biologiczny może być również hodowany i ustalona odpowiednia linia makrofagów.

Sposób według wynalazku obejmuje stosowanie materiału biologicznego, mianowicie hodowli leukocytów krwi obwodowej (PBL) lub zawiesiny rezydentnych komórek otrzewnowych (RPC) myszy BALB/c, zgodnie z informacją podaną powyżej. Obecność i stężenie każdej z cytokin określa się metodami testowania i standaryzacji interferonów, znanymi z Methods in Enzymology, 1986, vol. 119, część C: Interferon, wydane przez Sidney Pestka. Określenie całego spektrum indukowanych cytokin identyfikuje stan immunologiczny pacjenta.

Dla właściwej oceny wyników znaczenie podstawowe, ma, aby materiał biologiczny do prowadzenia obu wariantów sposobu według wynalazku pobrany był od prawidłowych dawców. W przypadku leukocytów ludzkich próbki pobrane od osobników wykazujących hypo-reaktywność (rzadkie przypadki), to jest niski poziom odpowiedzi immunologicznej powinny być wykluczone. W przypadku zawiesiny RPC myszy BALB/c próbki pobrane z dodatkowo stymulowanych zwierząt (na przykład zwierząt zainfekowanych) również powinny zostać wykluczone z oceny. W przypadku zawiesin RPC myszy BALB/c, próbki nie powinny być pobierane od zwierząt zbyt młodych lub zbyt starych, ponieważ u takich myszy istnieje zależny od wieku upośledzenie produkcji cytokin. Powinny być wybrane zdrowe, 5-8 tygodniowe zwierzęta. Próbki wykazujące bardzo wysoką spontaniczną produkcję cytokin powinny być wyeliminowane, zwłaszcza gdy testowane są substancje immunoregulujące, ponieważ nie można wtedy zaobserwować wzmagania indukcji cytokin lub w niektórych przypadkach można zaobserwować nawet zmniejszenie indukcji.

Ta postać sposobu według wynalazku, w której amplifikację wyników uzyskuje się przez zmieszanie testowanego roztworu z niesterydowym lekiem przeciwzapalnym (jedna z substancji opisanych powyżej, taka jak związek ITLC lub organiczny związek selenu 1, 2 i 3, korzystnie indometacyna) jest testem w mikroskali, zwłaszcza nadającym się do określania aktywności indukowanego TNF i IFN. Test ten jest ekonomiczny, szybki i nadający się do oznaczania dużej liczby próbek jednocześnie oraz nadający się do standaryzacji i co najmniej częściowej automatyzacji.

Oba warianty sposobu według wynalazku są opisane bardziej szczegółowo poniżej.

Otrzymywanie roztworu testowanej substancji: Testowaną substancję, na przykład ekstrakt z torfu, rozpuszcza się w jałowej, dwukrotnie destylowanej wodzie w stężeniu 10 mg/ml. Próbki sterylizuje się przez filtrację poprzez filtry przeciwbakteryjne Millipore® 0,45 pm’ max. 600 kPa. Następnie roztwory uzupełnia się kompletną pożywką RPMI-1640, zawierającą inaktywowaną termicznie bydlęcą surowicę płodową (FBS).

A) Wariant PBL:

Indukcja cytokin

Kożuszki z krwi pobranej od zdrowych dawców mogą być uzyskane z regionalnych stacji krwiodawstwa. Alternatywnie leukocyty krwi obwodowej (PBL) można wyizolować z heparynowej krwi żylnej zdrowych ochotników przez wirowanie w gradiencie Ficoll-Hypaque® (lub Histopaque®) (g = 1,077), a następnie dwukrotne przemycie komórek. Leukocyty lizuje się przez działanie NH4CI według Cantella et al. (Cantell, K.,Hirvonen, S., Kauppinen. H.L.:Production and Partial Purification of Human Immune Interferon. Meth. Enzymol. 119, 54, 1988). Stosowano leukocyty od jednego dawcy, zawierające około 8 x 10⁶ leukocytów/ml w pożywce RPMI-1640, suplementowanej 10% bydlęcej surowicy płodowej (FBS), L-glutaminą i antybiotykami. Wszystkie partie FBS uprzednio badano. Do hodowli PBL stosowano tylko niemitogenne FBS. Do 200-1000 pl objętości hodowli dodawano induktory cytokin. Referencyjnymi induktorami cytokin były fitohemaglutynina (PHA) (Pharmacia Fine Chemicals, Szwecja lub Sigma, USA). Indukowane hodowle PBL inkubowano przez 20 godzin w atmosferze powietrza z 5% CO 2 w 37°C i wirowano. Supernatanty przechowywano w 4°C 1 oznaczano aktywność IFN w ciągu 1 tygodnia. Supernatanty do oznaczania aktywności TNF muszą być przechowywane w -90°C w ciągłym azocie w celu uniknięcia inaktywacji spowodowanej proteolizą.

170 592

Oznaczanie interferonu

Zlane monowarstwy komórek A549 przygotowano na mikropłytkach w minimalnej pożywce podstawowej zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) z 10% FBS, L-glutaminą i antybiotykami (penicylina 100 jednostek/ml i streptomycyna 100 ng/ml). Próbki IFN rozcieńczano na płytkach i dodawano do monowarstwy komórek i inkubowano w 37°C przez 20 godzin w atmosferze powietrza z 5% CO 2. Następnie komórki przemywano i poddawano prowokacji wirusem zapalenie mięśnia sercowego (EMCV). Miano IFN zdefiniowano jako rozcieńczenie próbki IFN powodujące zmniejszenie efektu cytopatogenicznego wirusa o 50% po 48 godzinach inkubacji. Do pomiaru zabijania komórek w skanerze ELISA stosowano również metodę MTT (bromek 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolium) (Hansen, M.B., Nielsen. S.E. i Berg, K.: Re-examination and further Development of a Precise and Rapid Dye method for Measuring Cell Growth/Cell Kill, J. Immunol. Meth. 1989, 119, 203-210). We wszystkich oznaczeniach musiały być stosowane wzorce laboratoryjne IFN, to jest rekombinacyjny ludzki IFN-γ (aktywność właściwa 2 x 10⁶ jednostek/mg), naturalny ludzki leukocytowy IFN-α (3 x 106 IU/ml) i IFN -γ (2 x 106 IU/ml).

Oznaczanie TNF

Aktywność cytostatyczną TNF mierzono w hodowlach komórek L929 według Flicka i Gifforda (Flick, D.A., Gifford, G.E.: Comparison of in vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor, J. Immunol Meth 68, 1667, 1984). Do monowarstwowych hodowli komórkowych dodawano próbki i roztwór aktynomycyny D (5 ng/ml). Po inkubacji przez 20 godzin w 37°C oznaczano efekty cytotoksyczne TNF albo przez badanie mikroskopowe hodowli albo stosując metodą MTT. Ilość powodującą destrukcję około 50% hodowli komórkowej definiowano jako jedną jednostkę aktywności TNF. Porównanie z preparatem TNF-α (Genentech Inc., USA) wykazało, że 1 jednostka w tych oznaczeniach była równoważona 100-200 pg/ml TNF.

Oznaczanie cytokin technikami neutralizacji

Cytokiny wytwarzane przez PBL traktowane preparatami badanymi, mogą być zidentyfikowane technikami neutralizacji swoistych przeciwciał (Inglot et al., Organoselenides as potential immunostimulants and inducers of interferon gamma and other cytokines in human peripheral blood leukocytes, Experientia 1990, 46, 308-311). Ponadto do oznaczania aktywności immunologicznej określonych cytokin mogą być stosowane różne zestawy ELISA.

Komentarz

W supernatantach otrzymywanych w sposobie według wynalazku z hodowli komórek limfoidalnych można stwierdzić i oznaczyć - za pomocą innych standardowych metod, obecność cytokin innych niż TNF i IFN, na przykład Interleukin (IL-1-10), GM-CsF, TGF-β, etc.

B) Wariant RPC:

Indukcja cytokin

Rezydentne komórki otrzewnowe myszy (RPC) uzyskiwano od około 6-tygodniowych myszy BALB/c zabitych eterem, przez wstrzyknięcie do jamy otrzewnowej, w temperaturze pokojowej, 5 ml kompletnej pożywki RPMI-1640. Pożywkę wymywającą zawierającą RPC zbierano do chłodzonych lodem 50 ml probówek do wirowania. RPC nie przemywano ani nic wirowano. Komórki zliczano w hemocytometrzeBurkera i sporządzono ich zawiesiny o gęstości 1-1,5 x 106 komórek/ml. Taka gęstość komórek jest wymagana dla przeprowadzenia oznaczeń wpływu badanego preparatu w różnych stężeniach: od 0,1 do 500 ng/ml. Każde oznaczenie prowadzono równolegle z oznaczeniem kontrolnym negatywnym i pozytywnym. Kontrolne oznaczenie negatywne polega na pomiarze stężenia TNF lub IFN uwalnianego spontanicznie w hodowlach RPC inkubowanych w kompletnej pożywce RPMI-1640 bez induktorów, natomiast kontrolne oznaczenie pozytywne polega na analogicznych pomiarach stężenia wskazanych cytokin w takich samych hodowlach, pod wpływem standardowego induktora lipopolisacharydowego - LPS z E.coli 055:85, Sigma w stężeniu 1-10 ng/ml. Wszystkie hodowle inkubowano w 26°C przez 20 godzin. Następnie hodowle wirowano przy 1000 obrotów na minutę przez 10 minut i zbierano supematanty. Za pomocą pipety supernatanty rozcieńczono w stosunku od 1:2 do 1:256.

170 592

Biooznaczanie cytokin

Do określania aktywności TNF w supernatantach z hodowli RPC stosowano 20 godzinne monowarstwowe hodowle komórek L929.

^kr^»lr,^z-\ VnroArVi T mvc7ir w nJocLirn p i o» siilUO^^VUVL' Hw IV \JlU6L-\.T A-o2.ł IUJ&UJ V r uu ł »ł y ^.d lhV J VU £>-»k Vi'-cVh2 Pj 2 «.łO-lS-i li!

dnem w ilości 2 x 10⁴ komórek na dołek w 100 gl kompletnej pożywki i inkubowano przez 20 godzin w 37°C w celu otrzymania monowarstwy. Przenoszenie supernatantów musi być bardzo dokładne. Inkubację hodowli L929 z dodatkiem supernatantów prowadzi się przez 24 godziny w 37°C w atmosferze powietrza z dodatkiem 5% CO 2.

Oznaczenia

1) Odczyt efektów cytostatycznych z mikroskopu odwróconego

2) Test MTT (bromek 3-[4,5-dimetylo-tiazol-2-ilo]-2,5-difenylotetrazolium, Sigma).

W celu zmierzenia ile komórek uległo zabiciu w hodowlach komórek L 929 inkubowanych jak wyżej z supernatantami z hodowli RPC, do każdego dołka mikropłytki dodawano 25 gl roztworu barwnika MTT w stężeniu 5 mg/ml. Następnie płytki inkubowano przez 2 godziny w 37°C w atmosferze powietrza z 5% CO 2. Następnie do każdego dołka dodawano 100 gl roztworu zawierającego 45 ml dimetyloformamidu, 13,5 SDS (dodecylosulfonian sodu) i 55 ml wody destylowanej. Ponowną inkubację prowadzono przez 12 godzin w 37°C w inkubatorze z CO2. Wyniki testów barwnych MTT odczytywano za pomocą czytnika Multiscan 3430/CC (Labsystem), stosując filtr 570 nm. Jako odnośnik stosowano rekombinacyjny TNF-α.

Biooznaczanie interferonu

Interferon oznaczano na podstawie hamowania efektu cytopatycznego powodowanego przez mysiego wirusa zapalenia mięśnia sercowego (EMCV) w komórkach mysich L929, stosując jako odnośnik mysi IFN α/β - wzorze z Narodowego Instyutuu Zdrowia z Bethesda , MD , USA . Efekt cytopatyczny obserwowano w mikroskopie odwróconym i również metodą MTT w sposób opisany poniżej.

Metoda MTT według Berg et al.

Berg, K., Hansen, M.B., i Nielsen, S.E. (1990): A new sensitive bioassay for precise ąuantification of interferon activity as measured via the mitochondrial dehydrogenase function in cell (MTT-method). APMIS, 98, 156-162.

MTT (bromek 3-[4,5-Timetylo-tiazol-2-ilo]-2,5-Tifenylotetrazolium, Sigma) rozcieńczono w PBS To stężenia 5 mg/ml. Dla zmierzenia ile komórek uległo zabiciu w hodowlach komórek L929, do każdego dołka mikropłytek dodawano 25 gl roztworu barwnika MTT w stężeniu 5 mg/ml. Dołączano kontrolną próbkę referencyjną TNF lub IFN. Następnie płytki inkubowano przez 2 godziny w 37°C w atmosferze powietrza z 5% CO2. Następnie do każdego dołka dodawano 100 gl roztworu zawierającego 45 ml dimetyloformamidu, 13,5 g SDS (dodecylosulfonian sodu) i 55 ml wody destylowanej. Po całonocnej inkubacji w 37°C w mierzono gęstości optyczne przy 570nm, stosując czytnik mikropłytek Start Fax Awareness Technology Inc. 2100. Jako ślepą próbę stosowano bufor ekstrakcyjny.

Zarówno TNF-α jak i IFN-β oraz inne cytokiny mogą być również oznaczane przy użyciu handlowych zestawów ELISA.

Kompozycje według wynalazku do prowadzenia obu wariantów sposobu według wynalazku charakteryzują się przede wszystkim tym, że zawierają dwukrotnie oczyszczoną wodę do hodowli tkankowych, pożywkę To hodowli i surowicę uzupełniającą pożywkę, jak również ludzkie PBL lub mysie RPC.

Reagenty w zestawach do sporządzania kompozycji według wynalazku pochodzą z Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA lub z innych firm.

Zestaw oparty na hodowlach PBL może być stosowany jako tak zwany system skriningowy drugiej fazy dla potwierdzania wyników otrzymanych w testach opartych na wykorzystaniu komórek RPC lub niekiedy jako bezpośredni system skriningowy do niektórych substancji, które mogą być nieaktywne jako immunomodulatory u gryzoni, na przykład do związków selenoorganicznych.

Kompozycja do prowadzenia sposobu według wynalazku z amplifikacją wyników, to jest kompozycja do testów w mikroskali, charakteryzuje się przede wszystkim tym, że zawiera z jednej strony hodowlę PBL lub zawiesinę RPC, a z drugiej strony niesterydowy lek przeciwza12

170 592 palny, korzystnie substancję wybraną z grupy organicznych związków selenu, takich jak ebselen, indometacyna lub związek ItCl oraz pochodne, analogi, homologi i metabolity tych związków, najkorzystniej indometacynę.

Poniższe szczegółowe przykłady ilustrują bliżej wynalazek. Przykładów tych nie należy interpretować jako ograniczenia wynalazku w jakikolwiek sposób.

Przykład T. Poszczególne roztwory RPC uzyskano od 36 7-8 tygodniowych myszy BALB/c płci żeńskiej zabitych eterem, przez wstrzyknięcie do jamy otrzewnowej 5 ml mininalnej pożywki podstawowej Eagle (EMEM) suplementowanej 10% inaktywowanej termicznie surowicy cielęcej. Przemywki od jednej myszy zawierały 1-2 x 10⁶ komórek/ml. Zawiesiny komórek od każdej myszy podzielono na dwie próbki i rozdzielono j do dwóch probówek. Na jedną próbkę działano 100 pg PTT/ml, a druga służyła jako kontrola negatywna wykazująca spontaniczne uwalnianie cytokin.

• Wszystkie hodowle inkubowano w 26°C przez 20 godzin, a następnie wirowano je przez 10 minut przy 1000 obrotów na minutę. Supernatanty zbierano i oznaczano w nich aktywność INF-β stosując metodę hamowania efektu cytopatycznego powodowanego przez EMCV (wirusa zapalenia mięśnia sercowego) w mysich komórkach L929. Przy każdym oznaczeniu stosowano wewnętrzny wzorzec laboratoryjny, który kalibrowano wobec międzynarodowego preparatu odniesienia mysiego INF, Goo2-904-511 NIH, Bethesda, USA. Efekt cytopatyczny mierzono za pomocą metody MTT według Berg et al, APMIS, 98, 156-162. Otrzymano następujące wyniki: dla kontroli: poziom INF-β wyniósł 1-8 U/ml, średnio < 2 U/ml, dlapróbek traktowanych pTt poziom INF-β wyniósł 4-127 U/ml, średnio 16 U/ml. Wyniki przedstawiono graficznie na załączonym rysunku fig. 1 (porównanie produkcji IFN-p przez RPC traktowane i nietraktowane PTT. 1 - granica detekcji, 2 - średnia. Zgodnie z testem średniej P=0,0000. Każdy punkt pokazuje poziom IFN w RPC wyizolowanych od pojedynczych myszy).

Przykład II. Procedurę opisaną w przykładzie I powtórzono z grupą 7 myszy, jednakże zamiast dzielenia zawiesiny od każdej z poszczególnych myszy na dwie próbki tylko jedną zawiesinę podzielono na cztery próbki. Próbki te rozdzielono do 4 probówek (1 ml w każdej). Jedna z próbek stanowiła kontrolną negatywną, a na pozostałe trzy działano 100, 10, i 1 pg PTT/ml w celu określenia zależności uwalniania IFN-β od dawki PTT. Po inkubacji hodowli przez 24 godziny w 26°C probówki wirowano. W zebranych supernatantach IFN-β oznaczano w sposób opisany w przykładzie I. Otrzymane wyniki przedstawiono na załączonym rysunku fig. 2 (Zależność wytwarzania IFN od stężenia PTT). Każda krzywa dotyczy wyników zaobserwowanych dla zawiesiny RPC od jednej myszy.

Przykład III. Postępowano zgodnie z procedurą z przykładu I, poza tym, że zamiast IFN-β oznaczano TNF-α.

W supernatantach hodowli RPC, nietraktowanych i traktowanych 100 pg PTT/ml oznaczano aktywność TNF za pomocą biooznaczeń. Mysie fibroblasto-podobne komórki L929 (4 x 10⁴komórek na dołek w 1θ0 pl kompletnej EMEM) posiano na 96-dołkowych płaskodennych płytkach (Falcon, Linbro, Flow) i inkubowano przez 4 godziny w 37°C w atmosferze powietrza z 5% CO2. Próbki rozcieńczono EMEM z aktynomycyną D (stężenie końcowe 2,4 pg/ml) na płytce dodatkowej. Następnie pożywkę hodowlaną znad monowarstwy komórek L929 usunięto, a przygotowane rozcieńczenia przeniesiono do tej hodowli stosując pipetę wielokanałową. Po inkubacji przez 20 godzin w 37°C mierzono zabijanie komórek w hodowlach za pomocą metody MTT w sposób opisany powyżej. Otrzymano następujące wyniki: dla kontroli negatywnych poziom TNF-α był zawarty w zakresie 1-256 U/ml, przy średniej 8 U/ml, a dla próbek traktowanych PTT poziom TNF-α wynosił również 2-256 U/ml, ale średnia wyniosła 64 U/ml. Uzyskane wyniki przedstawiono na załączonym rysunku fig. 3 (Porównanie wytwarzania TNF-α przez RPC traktowane i nietraktowane PTT. 1 - granica detekcji, 2 - średnia. Według testu średniej P=0,0030. Każdy z punktów pokazuje poziom TNF w RPC wyizolowanym z pojedyncznej myszy).

Przykład IV. Postępowano zgodnie z procedurą z przykładu II, poza tym, że zamiast IFN-β oznaczano TNF-α jak opisano wyżej w przykładzie III.

Otrzymane wyniki przedstawiono na załączonym rysunku fig. 4 (zależność wytwarzania TNF od stężenia PTT).

170 592

Przykład V. A. Materiał biologiczny. Do oznaczeń użyto ponad 115 kożuszków z krwi pochodzącej od pojedynczych dawców, uzyskanych z Wrocławskiej Stacji Krwiodawstwa. Charakterystyki dawców przedstawiono poniżej w tabeli 1.

Tabela 1

Charakterystyki dawców krwi stosowanej jako źródło PBL

Wiek (lata)	Liczba	Mężczyźni	Kobiety	Dawstwo
Wielokrotne	Jednokrotne
21-30	24	22	2	24	-
31-40	45	44	1	45	-
41-59	45	44	2	40	6
Łącznie	115	110	5	109	6
%	100	96	4	95	5

Większość dawców stanowili młodzi mężczyźni, którzy byli wielokrotnymi dawcami krwi. Zaobserwowano znaczne różnice w odpowiedzi PBL od poszczególnych dawców i przedstawiono je poniżej w tabeli 2.

Tabela 2

Wytwarzanie IFN i TNF w PBL od poszczególnych dawców krwi w odpowiedzi na stymulację różnymi partiami PTT lub standartowymi induktorami

Induktor	Dawka (pg/ml)	Liczba testowanych PBL	Liczba odpowiedzi na
IFN (%)	TNF (%)
1	2	3	4	5
PTT-^10391	100	19	13(68)	13(68)
	30	13	6(46)	9(69)
	10	15	14(93)	13(87)
PTT-020391	100	14	10(71)	11(79)
	30	12	8(67)	8(67)
	10	10	5(50)	5(50)
PTT-101091	100	26	21(81)	20(77)
	30	20	9(45)	8(40)
	10	24	14(58)	15(63)
PTT-010991	100	5	5(100)	4(80)
	30	4	2(50)	0(0)
	10	5	2(40)	3(60)
PTT-021091	100	5	4(80)	4(80)
	30	4	3(75)	4(100)
	10	5	3(60)	3(60)
PTT-111191	100	5	3(60)	4(80)
	30	4	2(50)	3(75)
	10	5	4(80)	2(40)

170 592 ciąg dalszy tabeli2

1	2	3	4	5
PTTC8x)	100	29	19(66)	10(34)
	30	24	14(58)	11(46)
	10	21	16(76)	2(10)
PHA	10	69	64(93)	54(78)
LPS	10	41	33(80)	21(51)
brak	-	69	36(52)	20(29)

Z wyników przedstawionych w tabeli 2 wynika, że 10-30% hodowli PBL nie może odpowiedzieć wytwarzaniem TNF na PTT w dawce 100 pg/ml, podczas gdy tylko 7% nie może być stymulowanych przez PHA w dawce 10 pg/ml, 20% nie odpowiedziało naLPS w dawce 10 pg/ml wytwarzaniem IFN a 50% nie odpowiedziało na LPS w tej samej dawce wytwarzaniem TNF. Dane te mają zasadnicze znaczenie dla prawidłowej selekcji materiału biologicznego. Nieodpowiadaj ące hodowle PBL wykrywane przez ocenę kontroli negatywnych (nietraktowane; spontaniczne uwalnianie cytokin) i pozytywnych (traktowane standartowym induktorem takim jak PHA lub LPS).

Tabela 3

Indukcja IFN lub TNF przez różne partie ekstraktu z torfu o stężeniu 100 pg/ml w międzynarodowych jednostkach aktywności

Numer serii	IEN Fedn /ml)	TNF (jedn /ml)
Liczba prób	Zakres	Średnia	Liczba prób	24 h	6 dni
Zakres	Średnia	Zakres	Średnia
Kontr, bez
mduktorów	333	<10-100	10	41	9-750	27	9-80	9
31090	3	5-30	30	3	n.w.	n w.	9-80	80
291290	21	10-3000	100	14	n.w.	n.w.	9-750	40
010391	23	10-2000	60	17	n.w	n.w.	9-160	9
020391	19	10-1000	30	32	9-750	200	9-250	27

Używano ludzkich leukocytów krwi obwodowej od zdrowych dawców krwi (8 x 10⁶ komórek/ml).

B. Przeprowadzone eksperymenty

Próbki ekstraktu z torfu pobrane z różnych partii produkcyjnych i ponumerowane jak pokazano w tabeli 3 testowano stosując test PBL opisany powyżej. W eksperymentach interferon (IFN) i czynnik nekrozy nowotworów (TNF) oznaczano ilościowo według podanej wyżej standardowej procedury; określano ich aktywności wyrażaną w międzynarodowych jednostkach aktywności. Eksperymenty powtarzano tyle razy jak w podano w tabeli 3. Podano również zakresy wyników i średnie.

Dla celów ilustracyjnych podobny test przeprowadzono ze standaryzowanym preparatem torfowym. Przy stężeniu 30 pg/ml aktywność interferonu zawarta była w zakresie 30-300 międzynarodowych jednostek aktywności, natomiast przy stężeniu 100 pg/ml - zakresie 300 1000 międzynarodowych jednostek aktywności.

Stężenia pośrednie wykazywały liniową zależność między dawką a odpowiedzią.

Aktywne immunologicznie ekstrakty z torfu testowane z powyższym przykładzie są produktami opisanymi w zgłoszeniu nr PCT/EP92/00491.

170 592

Z danych podanych w tabeli 3 wynika jasno, że w hodowlach PBL kontrola pozytywna i negatywna mają zasadnicze znaczenie dla oceny wyników.

Dalsze eksperymenty wykazały, że jeśli nie bierze się pod uwagę hodowli PBL, w których brak jest odpowiedzi i przeprowadza się ocenę statystyczną dużej liczby wyników, skuteczność testów według wynalazku nie może być zakwestionowana.

Przez ponad dwa lata badano aktywność w zakresie indukcji cytokin ponad 20 różnych partii PTT, w tym 10 standaryzowanych partii handlowych leku, którego aktywność oznaczono w testach biologicznych, 2 partii odrzuconych przez producenta z powodu nieodpowiedniej aktywności biologicznej oznaczonej na myszach, będącej poniżej ustalonej normy i 3 laboratoryjnych ekstraktów z torfu przygotowanych na małą skalę. Otrzymane wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 4, w formie średnich indukowanych poziomów IFN i TNF wraz z wyliczonymi odchyleniami standartowymi - SD, przy wskazanej wartości p.

Tabela 4

Wpływ różnych partii PTT na wytwarzanie IFN i TNF przez ludzkie PBL

Induktor	Dawka (pg/ml)	IFN TNF Logio jednostki/ml (±SD)
PTT-010391	100	1,41 ± 1,07b	1,26±0,91c
	30	0,96 ± 1,07	1,25 ± 0,88b
	10	1,81 ±0,58^c	1,45 ± 0,63c
PTT-020391	100	1,23 ± 0,8?	1,35 ± 0,75c
	30	1,12 ±0,90	1,14 ± 0,82b
	10	1,75 ± 0,76b	0,86 ±0),90
PTT-101091	100	1,70± 0,9?	1,38 ± 0,81^c
	30	0,99 ±1,12	0,62 ± 0,80
	10	1,22 ± 1,07a	0,94 ± 0,76b
PT'T-010991	100	2,24 ± 0,30c	1,35 ± 0,73b
	30	1,00+1,00	0,0
	10	0,56 ± 0,68	0,88 ± 0,73 ,
PTT-021091	100	1,72 ±0,87b	1,49 ± 0,84b
	30	1,39 ±0,81	1,79 + 0,20c
	10	1,11 ±0,91	1,01 ±0,84
PTT-111191	100	1,36± 1,12	1,18±0,62b
	30	1,00 ± 1,00	1,21 ± 0,71
	10	1,5^±O,86a	0,54 ±0,66
PTT (8x)	100	1,04±0,82a	0,63 ±0,91
	30	0,88 ±0,81	0,75 ± 0,84
	10	1,100 ± 0,70b	0,13 ± 0,40a
PHA	10	2,08 ± 0,79°	1,67 ± 0,99^c
LPS	10	1,36 ±0,80°	0,97± 1,0?
Brak		0,64 ± 0,63	0,42 ± 0,67

Wartości średnie wyliczono ze wszystkich wyników miareczkowania IFN lub TNF. Brak odpowiedzi traktowano jak 0.

^a’^c/ Różne od braku (spontaniczne wytwarzanie cytokiny) przy ^a/ p<0,05, ^b/ p<0,01 lub ^c/ p<0,001

Wartości średnie odpowiadające wynikom przedstawionym w tabeli 4 podano w następnej tabeli 5, natomiast wybrane dane zaprezentowano w formie graficznej na załączonych rysunkach fig. 5 i 6 pokazujących wpływ różnych partii PTT na wytwarzanie odpowiednio IFN i TNF.

170 592

Tabela 5

Wpływ różnych partu PTT na wytwarzanie IFN i TNF przez ludzkie PBL

Induktor	Dawka ^(pg^/ml)	TFN jednostki/	TNF ml (±SD)
PTT-010391	100	30	27
	30	<10	27
	10	100	27
PTT-020391	100	30	50
	30	30	34
	10	<10	<9
PTT-101091	100	100	34
	30	<10	<9
	10	45	18
PTT-010991	100	300	27
	30	<10	<9
	10	<10	18
PTT-021091	100	100	27
	30	60	80
	10	60	27
PTr-llH91	100	100	18
	30	<10	40
	10	100	<9
PTT (8x)	100	20	<9
	30	10	<9
	10	20	<9
PHA	10	200	80
LPS	10	30	27
Brak	-	10	<9

Wartości średnie wyliczono ze wszystkich wyników miareczkowania IFN lub TNF

Identyfikację indukowanych cytokin prowadzono za pomocą zobojętniania IFN i TNF indukowanych przez PTT

Powyższe wyniki eksperymentów zilustrowano także za pomocą załączonych rysunków, odpowiednio fig. 5 i fig. 6.

Wpływ różnych partii PTT na wytwarzanie IFN przez ludzkie PBL (fig. 5). Użyto siedmiu różnych partii PTT. Każdy punkt wykresu odnosi się do PBL jednego zdrowego dawcy krwi. Aktywność IFN wyrażona jest w jednostkach przeciwwirusowych. Obszar poniżej ciągłej poziomej kreski pokazuje granicę danych nieznaczących. Linie poziome pokazują wartości średnie. Indukcja IFN przez PTT w ilościach 30 i 100 pg/ml jest statystycznie znacząca (przy p<0,05).

Wpływ różnych partii PTT na wytwarzanie TNF przez ludzkie PBL (fig. 6). Aktywność wyrażono w jednostkach cytotoksycznych dla mysich komórek L929. Odpowiedź na PTT w ilościach 30, 100 i 200 pg/ml jest statystycznie znacząca (przy p< 0,05).

W celu neutralizacji aktywności przeciwwirusowej w supamatantach hodowli PBL traktowanych przez 20 godzin PTT z trzech różnych partii, w eksperymentach stosowano silne surowice poliklonalne, mianowicie anty-naturalny IFN-α, anty-limfoblastoidalny (Namlawa) IFN-α i anty-naturalny IFN-γ. Wyniki pokazane są na załączonym rysunku fig. 7 (Wyniki neutralizacji IFN za pomocą poliklonalnych surowic anty-IFN) wskazują, że część IFN typów

170 592 ot i y wytwarzanych przez PBL od pojedynczych dawców krwi znacznie się różni. Zasuregowano, że schemat uwalniania IFN dla każdego z dawców jest cechą indywidualną dawcy.

Próby neutralizacji prowadzone z silną poliklonalną surowicą króliczną anty-TNF (Genzyme Inc ) wykazały, że TNF idukowany przez PTT jest głownie typu ot. Potwierdziły to wyniki podobnych neutralizacji prowadzonych z króliczą surowicą poliklonalną anty-TNF-β (Genzyme Tnc.), która nie neutralizuje indukowanej przez PTT aktywności TNF.

Figura 7 przedstawia wyniki neutralizacji IFN za pomocą poliklonalnych surowic antyIFN. Na pożywki z hodowli PBL mkubowanych z PTT (użyto trzy różne partie PTT i siedem różnych PBL) działano wskazaną surowicą anty-IFN. 1-preparaty nietraktowane, 2 - preparaty traktowane anty-ludzkim IFN-α, 3 - preparaty traktowane anty-ludzkim IFN-Ly, 4 - preparaty traktowane anty-ludzkim EFN-γ.

Przykład VI. Postępowano zgodnie z procedurą z przykładu V w celu wykazania efektu amplifikującego według wynalazku w obecności amplifikatora, to jest indometacyny. Każdą hodowlę PBL dzielono na kilka próbek. Jedna z nich była kontrolą negatywną, wskazującą spontaniczne uwalnianie cytokin, druga była kontrolą pozytywną traktowaną standartowym silnym induktorem cytokin rodzaju wskazanego poniżej, a pozostałe próbki traktowano PTT w ilości 1-100 ng/ml - partie 010391 lub 020391, jak również PTT I i PTT II, które pojawiają się odpowiednio w tabelach 6 b i 6 c oraz indometacyna w ilości 5 ng/ml + PTT z tych samych partii (tabela 6 a) lub związkiem ITCL w ilości 10 ng/ml + PTT z tych samych partii (tabela 6b) lub zdefiniowanymi powyżej związkami selenoorganicznymi (1), (2) lub (3) w ilościach 10 lub 20 ng/ml + PTT z tych samych partii. W supematantach z inkubowanych hodowli oznaczano IFN i TNF. Otrzymane wyniki przedstawiono poniżej w tabelach 6 a, 6b i 6c.

Tabela 6a

Wpływ amplifikacji indukcji cytokin w obecności indometacyny

Eksp.	Induktor	Indometacyna	Stężenie (ng/ml)	Cytokiny ((edn./ml) 1
IFN	TNF
1.a	PTT-010391	-	100	300	750
		-	10	30	250
		-	1	20	80
		+	100+5	1000	2200
		+	10+5	200	750
		+	1+5	<10	250
	LPS	-	10	200	500
	brak	-	-	<10	9
	brak	+	5	20	27
2.^b)	PTT-020391	-	1X0	60	50
		-	40	20	9
		-	20	10	9
		-	10	<10	<0
		+	100+5	600	80
		+	40+5	100	27
		+	20+5	100	9
		+	10+5	30	9
	PHA	-	5	600	50
	PHA	+	5+5	2000	80
	brak	-	-	60	<9
	brak	+	5	10	<9

a)

PBL przygotowano ze świeżej krwi heparynowej za pomocą techniki separacji Ficoll-Hypaque. Hodowle PBL zawierały 7 x 106 komórek/ml.

PBL przygotowano z kozuszków otrzymanych z Regionalnej Stacji Krwiodawstwa Komórki przetwa(Meth Enzymol. 1981, 78, 29-38). Hodowle PBL zawierały 8 x 1(r rzano według metody Cantell et al komórek/ml

170 592

Tabela 6b

Wpływ amplifikacji indukcji cytokin w obecności związku ITCL

Eksp.	Induktor	Związek ITCL	Stężenie (pg/ml)	C^/tnlrinA/ /uHn /mlA '-'J J « Uli.
IFN	TNF
1.	PTT-010391	-	100	100	18
		-	30	100	9
		+	100+10	3000	80
		+	30+10	300	80
	PHA	-	10	3000	250
	brak	-	-	10	<9
	brak	+	10	<10	<9
2.	PTT I	-	100	3000	27
		-	30	30	<9
		+	100+10	3000	250
		+	30+10	300	9
	PHA	-	10	100	18
	brak	-	-	10	<9
	brak	+	10	10	<9

Tabela 6c

Wpływ amplifikacji indukcji cytokin w obecności związków selenoorgamcznych

Eksp.	Induktor	Związek selen-rg.	Stężenie (pg/ml)	Cytokiny (ledm/ml)
IFN	TNF
1.	PTT	-	10	100	<9
	PTT	-	5	10	<9
		Zw.(1)	10+20	300	27
		Zw.(ł)	5+20	100	27
		Zw.(2)	10+20	300	50
		Zw.(2)	5+20	100	9
	PHA	-	10	100	<9
	brak	Zw.(1)	20	200	9
	brak	Zw.(2)	20	100	27
	brak	-	-	10	<9
2.	PTT II	-	50	10	<9
		-	5	10	<9
		Zw (3)	50+10	30	27
		Zw (3)	10+10	30	27
	PHA	-	-	30	<9
	brak	Zw.(3)	10	10	<9
	brak	-	-	10	<9

Hodowle PBL zawierały 8 x 10⁶ komórek PTT jest to preparat torfowy Stosunkowo niska odpowiedź TNF jest spowodowana prawdopodobnie faktem, zc kozuszki przed przygotowaniem hodowli przechowywano przez 20 godzin w temperaturze 4°C. Związki sflfnoorganlcrf są induktorami cytokin takich jak PTT

Powyższe przykłady potwierdzają przydatność sposobu i kompozycji według wynalazku w przemysłowym określaniu aktywności immunologicznej testowanych substancji

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób określania aktywności substancji immunologicznie czynnych w zakresie indukcji cytokin, w którym przygotowuje się hodowlę tkankową, poddaje się tę hodowlę działaniu roztworu badanej immunomodulacyjnej substancji aby spowodować indukcję produkcji cytokin, a następnie oznacza się znanymi metodami wytworzone cytokiny, znamienny tym, że stosuje się hodowlę tkankową zawierającą ludzkie leukocyty krwi obwodowej PBL, pobrane od dawców nieprzejawiających hyporeaktywności w odniesieniu do indukcji IFN, którą przygotowuje się stosując niemitogenną pożywkę dla hodowli tkankowych, korzystnie RPMI 1640 uzupełnioną 10% uprzednio zbadanej niemitogennej bydlęcej surowicy płodowej, L-glutaminą i antybiotykami, i której gęstość - w postaci gotowej do użycia wynosi około 8 x 10⁶ leukocytów/ml lub też stosuje się hodowlę tkankową zawierającą rezydentne komórki otrzewnowe RPC pobrane z 5-8 tygodniowych, zdrowych dziewiczych myszy BALB/C, niestymulowanych immunologicznie ani nieprzejawiających wysokiej spontanicznej produkcji cytokin, której gęstość - w postaci gotowej do użycia wynosi około 1-2 x 10⁶ komórek/ml, a spośród wytworzonych cytokin oznaczaniem obejmuje się co najmniej oznaczenie stężenia interferonu (IFN) i/lub czynnika nekrozy nowotworów TNF.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że badany roztwór stosuje się w stężeniu 0,1 - 200 gg/ml.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkcję cytokin ocenia się w porównaniu z pozytywnym i negatywnym oznaczeniem kontrolnym.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór badanej substancji immunologicznie czynnej uzupełnia się przed wprowadzeniem go do wskazanej hodowli tkankowej dodatkiem amplifikatora indukcji cytokin w postaci syntetycznego niepeptydowego środka immunomodulacyjnego, korzystnie wybranego z grupy składającej się z leków niesteroidalnych przeciwzapalnych oraz hamujących syntezę prostaglandyny, związków selenoorganicznych, pochodnych izotiazolu oraz ich analogów, homologów i metabolitów, najkorzystniej wybranego z grupy obejmującej związek ITCL, związki selenoorganiczne: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2-benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 oraz indometacynę, w ilości co najmniej od 1 do 20 gl/ml.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3 albo 4, znamienny tym, że przygotowuje się roztwór zawierający ekstrakt torfowy, otrzymany z surowca torfowego przez wyekstrahowanie substancji biologicznie czynnych wodnym roztworem ługu, a następnie - po oddzieleniu części stałych, przetworzenie hydrolizatu na drodze zakwaszenia, oddzielenia wytrąconych osadów i ponownej alkalizacji z usunięciem wytrąconych części stałych oraz ponownego zakwaszenia z wyodrębnieniem klarownego roztworu ciał czynnych z torfu, przetwarzany dalej na drodze zatężania, ekstrahowania roztworem etanolowo-wodnym, dalszego odbalastowania roztworu oraz ponownego zagęszczenia i oczyszczenia z substancji toksycznych na drodze ekstrakcji eterowej i ostatecznie: odsolenia i zagęszczenia fazy wodnej do zawartości około 10% suchej masy, a następnie przeprowadzenia w postać stałą, a zwłaszcza ekstrakt z torfu o popielności 8-30%, stopniu rozkładu 30-70% pH 3,5-7,0 lub frakcję takiego ekstraktu wyodrębnioną dowolną techniką, jako wskazaną substancję immunologicznie czynną, z dodatkiem tej samej pożywki do hodowli tkankowych, a następnie działaniu tego roztworu poddaje się wybraną hodowlę komórkową.

170 592

6. Kompozycja do prowadzenia sposobu oznaczania aktywności substancji immunologicznie czynnych, w zakresie zdolności do indukowania cytokin, który to sposób obejmuje przygotowanie hodowli ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL), poddanie tej hodowli działaniu badanej substancji immunologicznie czynnej by spowodować produkcję cytokin, a następnie oznaczenie wyindukowanej produkcji cytokin znanymi metodami, znamienna tym, że stanowi ją kompozycja otrzymana z następujących składników stanowiących zestaw do prowadzenia oznaczania:

1) dwukrotnie oczyszczana woda do kultur tkankowych,
2) pożywka z gradientem gęstości korzystnie Histopaque® lub Ficoll-Hypaque®-1077.
3) pożywka RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowana w warunkach sterylności i poddana testom na endotoksyny,
4) bydlęca surowica płodowa (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,
5) Lektyna (fitohemaglutynina, PHA)

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że stanowi ją kompozycja otrzymana z następujących składników stanowiących zestaw do przeprowadzenia 10-20 oznaczeń manualnych:

1) 100 ml dwukrotnie przerabianej wody do kultur tkankowych,

2) 100 ml pożywki z gradientem gęstości, korzystnie Histopaque® lub Ficoll-Hypaque® -1077.

3) 2 x 100 ml pożywki RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowanej w warunkach sterylności i poddanej testom na endotoksyny,

4) 20 ml bydlęcej surowicy płodowej (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

5) 0,5 mg lektyny z Phaseolus vulgaris (fitohemaglutyniny, PHA) oraz
6) ewentualnie 0,5 mg związku ITCL lub 1,0 mg jednego ze związków selenoorganicznych: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo) karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 lub 0,5 mg indometacyny.

8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że dodatkowo zawiera syntetyczny niepeptydowy amplifikator, korzystnie wybrany z grupy obejmującej związek ITCL, związki selcnoorganiczne: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 i indometacynę do oznaczeń w mikroskali.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że dodatkowo zawiera 0,5 mg ITCL, lub 1 mg jednego z selenoorganicznych związków: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2-benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 lub 0,5 mg indometacyny, do oznaczeń w mikroskali.

10. Kompozycja do prowadzenia sposobu oznaczania aktywności substancji immunologicznie czynnych w zakresie zdolności do indukowania cytokin, który to sposób obejmuje przygotowanie hodowli mysich rezydentnych komórek otrzewnowych (RPC), poddanie tej hodowli działaniu badanej substancji immunologicznie czynnej by spowodować indukcję produkcji cytokin a następnie oznaczenie wyindukowanej produkcji cytokin znanymi metodami, znamienna tym, że stanowi ją kompozycja otrzymana z następujących składników stanowiących zestaw do prowadzenia oznaczania:

1) dwukrotnie oczyszczana woda do kultur tkankowych,

2) pożywka RPMI-1640 z kwaśnym węglanem sodu i L-glutaminą, przefiltrowana w warunkach sterylności i poddana testom na endotoksyny,

3) bydlęca surowica płodowa (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

4) lipopolisacharyd (LPS)

5) ewentualnie syntetyczny niepeptydowy amplifikator, korzystnie wybrany z grupy obejmującej związek ITCL, związek selenoorganiczny: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenyl lodiselenid o wzorze 1,2-fenylo-1,2-benzoizoselenazol]-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 i indometacynę.

11. Kompozycją według zastrz. 10, znamienna tym, że stanowi ją kompozycja otrzymana z następujących składników stanowiących zestaw do prowadzenia 10-20 oznaczeń manualnych:

170 592

1) 100 ml dwukrotnie oczyszczanej wody do kultur tkankowych,

2) 2 x 100 ml pożywki RPMI-1640 z kwaśnym węglanen sodu i L-glutaminą, przefiltrowanej w warunkach sterylności i poddanej testom na endotoksyny,

3) 20 ml bydlęcej surowicy płodowej (FBS) o niskiej zawartości endotoksyn i hemoglobiny,

4) 0,5 mg lipopolisacharydu z E. coli 0128:B8,

5) ewentualnie 0,5 mg ITCL lub 1,0 mg jednego ze związków selenoorganicznych: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1,2-fenylo-1,2-benzoizoselenazol3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 lub 0,5 mg indometacyny.

12. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że dodatkowo zawiera syntetyczny niepeptydowy amplifikator, korzystnie wybrany z grupy obejmującej związek ITCL, związki selenoorganiczne: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 i indometacynę do oznaczeń w mikroskali.

13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że dodatkowo zawiera 0,5 mg ITCL, lub 1 mg jednego z selenoorganicznych związków: bis-[2-(N-fenylokarboksyamido)]-fenylodiselenid o wzorze 1, 2-fenylo-1,2-benzoizoselenazol-3(2H)-on (ebselen PZ 51) o wzorze 2, bis-2[-(N-(2-pirydylo)karboksyamido)]fenylodiselenid o wzorze 3 lub 0,5 mg indometacyny, do oznaczeń w mikroskali.