CS29191A3 - Covalent hybrids angiogenin/ribonuclease - Google Patents

Description

-1- fcovalentní hybridy angiogenin/RNáza

Oblast vynálezu Předložený vynález se týká modifikovaných nebo mutant-aích proteinů angiogeninu a sekvencí DNA, kódujících tytomodifikované nebo mutantní proteiny. Dále se také.týká vek-torů, hostitelských buněk a metod exprese modifikovaných ne-bo mutantních proteinů angiogeninu. Zejména jsou modifikova-né nebo mutantní angiogenní proteiny podle vynálezu gene-tickým inženýrstvím zpracované kovalentní angiogenní/ribo-nukleézové (RNázové) hybridy .l^yto hybridy jsou užitečné proidentifikaci strukturálních komponentů angiogeninu, nezbyt-ných pro charakteristickou aktivitu angiogeninu. ^ejménamohou být využity regionální mutageneze pro výrobu takovýchangiogenin/RNázových hybridních proteinů, které jsou odvo-zeny od angiogeninu a ve kterých jsou jednotlivé oblastiprimární struktury nahrazeny odpovídajícími segmenty RNázy.Příprava a charakteristika takových proteinů dovoluje identi-fikaci segmentů jako je Ň-terminální segment, který můžebýt rozhodující při charakteristické aktivitě angiogeninupodle předloženého vynálezu. Přesněji, předložený vynález sétýká nových rekombinováných hybridních proteinů se zvětšenýmangiogenním potenciálem - ARH-IXI, ve kterém je N-terminál-ní konec 8-22 zbytků angiogeninu nahrazen odpovídajícím úse-kem (zbytky 7-21) RNázJí regionální mutagenezí. lakový re-kombino váný mutantní protein angiogeninu může být produkovánv dostatečném množství pro umožnění jeho aplikace v tera-pii a diagnostice.

Dosavadní stav techniky ^ngiogeneze, proces vývoje krevního řečiště, je základempro růst solidních tumorů a je složkou normálních hojivých arůstových procesů. Také je zahrnuta v patofyziologii athero-genese, artritidy a diabetické retinopatie. ^e charakterizo-vána řízený^ růstem nových-kapilár směrem ke specifickým -2-

stimulům. Tento růst je zprostředkován migrací endotelovýchbuněk, může postupovat nezávisle na mitozéch endotelovýchbuněk·

Molekulární messengery, odpovědné za proces angiogene-ze byly dlouho vyhledávány. Greenblatt a Shubik, 1968, J.Natl.Cancer Tnst. 41: 111-124 soudí, že tumorem indukovanáneovaskularizace je zprostředkována difuzibilní substancí.Následně se uvažovalo o různých rozpustných mediátorech in-dukujících neovaskularizaci. Ayto zahrnují prostaglandiny(Auerbach, v lymphokines, Piek and Landy, eds., 69-68. Aca-demie Press, New York, 1981), lidskou urokinážu (Berman aspol., 1982, Invest. Opthalm.Vis.Sci. 22:191-199), měá (Ba-ju a spol., 1982, J.NatL.^ancer *nst. 69:1183-1188) a různé"Mngi ogenezní fakt ory"· $ůzné angiogenezní faktory byly odvozeny z tumorovýchbuněk, z moku, pocházejícího ze zranění (Banda a spol·, 1982, Proč. Nati. Acad.Sci. USA 79; 7773-7777; Banda a spol.,US patent č. 4503038) a buněk sítnice (D*Amore, 1981, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 78:3068-3072). Angiogěnezní faktory odvo-zené z tumorů byly charakterizovány v menším rozsahu. Polk-man a spol., 1971, J.Exp.Med.133:275-288, izoloval angio-genezní faktor z Walker 256 vodnatelného nádoru krysy, řak-tor byl mitogenní pro endotheliální buňky kapilár a byl in-aktivován BNézou. Tuan a spol., 1973, Biochemistry 12:3159-3165, nalezl mitogenní a angiogenní aktivitu v nehistonovýchproteinech Walket 256 tumoru. Aktivní frakcí byla směs protei-nů a karbohydrétů. božství zvířecích a lidských tumorůmůže produkovat angiogenezní faktor(y) (Phillips a Kumar, 1979, Int.J.Cancer 23:82-88, ale nebyla stanovena chemickápovaha tohoto faktoru(ů). Neproteinové komponenty o nízkémolekulové hmotnosti z Walker 256 tumůrů se mohou také pro-jevit jako angiogenní a mitogenní (Weiss a spol., 1979, Br.J.^ancer 40:493-496). Angiogenezní faktor s molekulovou -3 hmotností 400 až 800 daltonů byl vyčištěn do homogenityFenselauem a spol., 1981, J.Biol.Chem. 256:9505-9611, alenebyl dále charakterizován. Buňky lidského plicního nádo-ru vykazovaly sekreci angiogenních faktorů, zahrnujícíchnosič o vysoké molekulové hmotnosti a aktivní komponentuo nízké molekulové hmotnosti, která je patrně neproteinové-ho charakteru (Kumar a spol., 1983, Int.J.Cancer 32:461-464). Vallee a spol, 1985, Experientia 41:1-15, nalezli an-giogenní aktivitu sestávající se ze tří frakcí z Walker 256tumorů. Tolbert a spol. (US patent č. 4229531) objevil pro-dukci angiogenních faktorů z lidské linie HT-29 adenokar-cinomu, ale materiál byl pouze částečně vyčištěn a nebylchemicky charakterizován. Izolace genů, odpovídajících zaprodukci výše popsaných angiogenních faktorů, nebyly uvede-na, z části je toto způsobeno nedostatkem čistoty a charak-teristiky faktorů. £ izolaci angiogenních faktorů je využíváno množstvírůzných technik zahrnujících: vysokotlakovou kapalinovouchromatografii (Banda a spol., supra), extrakci rozpouštěd-ly (Folkman a spol, supra), chromatografii na silikagelu(Fenselau a spol., supra), DEAE celuloz< (Weiss a spol.,supra) nebo Sephadexu (Tuan a spol, supra) a afinitní chro-matografii (Weiss a spol, supra).

Vallee a spol. (US patent č. 4727137, který je zde uve-den jako odkaz) vyčistil angiogenní protein z lidské buněč-né linie adenokarcinomu.Tento proteii^yl identifikován v normální lidské plazmě (Shapiro a spol., 1987, Biochem.26:5141-5146). Vyčištěný protein známý jako angiogenin byl che-micky charakterizován a byla stanovena jeho aminokyselinovásekvence. *fyly demonstrovány dvě odlišné aktivity pro angiogenin získaný z lidských tumorů. První byla popsána jakovelmi potentní angiogenní faktor in vivo (Fett a spol., -4-

1985, Biochem. 24:5480-5486). Druhá, která byla objevenadíky vykazování charakteristické ribonukleolytické aktivitysměrem k 28S a 18S rRNA a která se prokazatelně liší od pan-kreatické RNázy ve dvou bodech: a) je třeba 10^ více angio-geninu než RNázy k dosažení stejného stupně degradace rRNA,a b)produkty jsou mnohem delší, např. ze 100 na 500 nukleo-tidů. Navíc je podstatně inaktivnějši vůči klasickým A sub-strátům RNázy (Shapiro a spol., 1986, Biochem. 25·: 3627-3532$St.Glair a spol., 1987, Proč."atl.Acad.Sci.USA 84:8330-8334). Déle Vallee a spol (US patent č. 4721672 uvedený jakoodkaz), klonovali geny (jak cDNA tak genomové) kódující angio-genní protein nárokovaný v US patentu č. 4727137 z knihov-ny lidské jaterní cDNA a knihovny lidského genomu. Gen an-giogeninu byl klonován do vektoru a rekombinované vektorykódující gen angiogeninu byly použity pro transformovánínebo trasfekci hostitelských buněk. Aakové transformovanénebo transfektované buňky produkují lidský angiogenní pro-tein.

Na základě sekvence genu pro angiogenin, objevené a náro-kované v US patentu ě. 4721672, připravovalo několik skupinsyntetické aniogeninové geny. Denefle a spol., 1987, GSne56:61-70, připravili syntetické geny, kódující lidský angio-genin, který byl potvrzen jako vhodný pro vyhledávání kodonův proteinech produkovaných E.coli. Syntetické geny byly li-govény do pBR322-odvozeného expresního vektoru konstruova-ného tak, aby obsahoval E.coli tryptofan (trp) promotor. Angio-genin produkovaný E.coli je nerozpustný, ale může být snad-něji renaturován a čištěn. Čištěný angiogenin vykazuje angio-genní a ribonukleotickou aktivitu stejnou jak popsal Valleea spol. (US patent č. 4727137) pro přirozený čištěný angio-genin z buněk lidského adenokarcinomu. Diný syntetický genpro angiogenin byl připraven Hoechstem (německá patentovápřihláška P3716722.7), kódující na 30,pozici aminokyselin -5- leucin místo methioninu v přírodním (tj. divokém typu) genuangiogeninu popsaného a chráněného v US patentu č. 4721672.Ťento syntetický Leu-30 angiogeaní gen byl ozhačen za vhodnýpro využití kodonů výhodněs produkovaných v E.coli. Gen bylvklonovón do vektoru, obsahujícího modifikovaný trp promotor(evropská patentová přihláška 0198415) a oblast iniciujícítranslaci (TIR) sekvence (Gene 41: 201-206, 1986j EMBO J.4:519-526,1985) pro zvýšení účinnosti translace. Syntetickýgen je takto pod přímou kontrolou trp promotoru a expreseje indukována doplněním indol-3-akrylové kyseliny nebo nedo-statkem tryptofanu. Leu 30 angiogeninový protein vykazuje povyčištění stejnou angiogenní a ribonukleotickou aktivitujako divoký typ (Met-30) angiogeninu. Všechny právě popsané lidské angiogeniny, at získané zplasmy, nádorových buněk nebo rekombinací DNA (cDNA, geno-mové DNA nebo syntetické DNA) vykazují angiogenní i ribo-nukleolytickou aktivitu. dedním z nejpoutavějších rysů angio-geninu je jistě jeho strukturální homologie se savčí pankrea-tickou RNézou. Tato strukturální podobnost by mohla umožnitstudium mechanismu akce angiogeninu jakož i podobnosti meziangiogeninem a enzymatickou (tj. ribonukleolytickou) aktivi-tou angiogeninu.

In vivo je angiogenin silným induktorem růstu krevníchcest, jak bylo měřeno na kuřecích choriallantoiekých membrá-nách (CAM) a králičí cornea studii (Pett a spol., Biochemis-try 24:5480-5486). In vitro angiogenin indukuje různé reakcev endoteliálních buňkách, zahrnující aktivaci fosfolipázy Ca sekreci prostaglandinů ( Bicknell and Vallee, 1988, Proč.Natl.Acad.Sci. USA 85:5961-5965, Bicknell a Vallee, 1989,Proč.Natl.Acad.Sci.USA 86:1573-1577)i inhibuje také volnoutranslaci v buňkách specifickým rozštěpením 18S RNA ve 40Sribozomální podjednotce (St.Clair a spol., 1987, Proč.Nati. -6-

Acad.Sci.USA 84:8330-8334; St.Clair a spol., 1988, Bio-chemistry 27: 7263-7268).

Angiogenin je strukturně homologní se skupinou enzymůpankreatické RNázy, mající 34 % sekvencí identických s nejvícestudovaným členem této skupiny, hovězí pankreatickou RNázouA (RNáza A((Strydom a spol., 1985, Biochemistry 24: 5486-5494; Kurachi a spol., 1985, Biochemistry 24: 5494-5499).Terciární struktura angiogeninu je podobné této RNáze Avzhledem k i) zachování tří ze čtyř disulfidových vazeb, ii)extrémně těsné vazbě k inhibitoru placentární ribonukleázy(PRI)(Shapiro a Vallee, 1987, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 84:2238-2241; Lee a spol., 1989b, Biochemistry 28: 225-230} Black-burn a spol., 1977, J.Biol.Chem. 252:5904-5910) a iii) po-čítačem vytvořené trojrozměrné struktuře (Palmer a spol., 1986,Proč.Nati.Acad.Sci.USA 83:1965-1969). Tři nezbytné katalytic-ké zbytky RNázy A (His-12, Iys-41 a His-119) jsou uchovány vangiogeninu (His-13, Lys-40 a Hís-114) stejně jako mnohodalších klíčových míst a strukturálních zbytků. Jak bylouvedeno výše, angiogenin má ribonukleolytickou aktivitu,ale typem velmi rozdílnou od jiných RNáz. Aktivita angioge-ninu vůči nejběžnějším substrátům je 5 až 6krát řádově niž-ší než aktivita RNázy A (Shapiro a spol., 1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8783.8787} Shapiro a spol., 1988, Anal.Biochem.175:450-461} Harper a Vallee, 1989, Biochemistry 28: 875-84). Navzdory strukturním podobnostem, ohromný rozdíl v ak-tivitě angiogeninu in vivo a in vitro, vztažené k aktivitěRNáz (u kterých nebyla prokázána indukce angiogeneze nebodruhé messengerové aktivity) je jasným důkazem odlišné fyzio-logické funkce angiogeninu. Výsledky studií ukázaly, Že aktivní místa histidino-vých a lysinových zbytků angiogeninu jsou potřebný pro dvojeaktivity - angiogenní a ribonukleolytickou (Shapiro a spol.,1986, Biochemistry 25:3527-3532; Shapiro a špol., 1987b, Proe. -7- i—lHilUII'11 H1I1IιΙΙΠΊ lim ιΐΐΊΐ 11 ni 1 γι.ιιί:?ι:τ.γ:..·.'.:··-·

Natl.Acad.Sci.USA 84:8783-8787} Shapiro a spol., 1988b, Bio-chem.Biophys.-Res.Commun.156: 530-536j Shapiro a spol., 1989,Biochemistry 28: 1726-32 a shapiro a Vallee, 1989, Bioche-mistry 28:7401-8). iMicméně další molekulové vlastnosti musíbýt kritické pro angiogenezi, poněvadž hovězí pankreatickáRNázy obsahuje odpovídající histidinové a lysinové zbytkypřesto, že není angiogenní. x'akové doplňující molekulárnírysy, jestliže mohou být zjištěny, by měly zahrnovat indi-viduální zbytky a/nebo oblasti sekvence, které jsou unikát-ní pro angiogenin. Harper a Vallee, 1989,Biochem. 28:1875-84,připouští, že jeden nápadný strukturní rozdíl mezi angioge-ninem a RNázou spočívá v absenci sekvence podobné oblastiRNázy, obsahující Cys-65-Cys-f2 disulfidovou vazbu. Angio-genin postrádá tyto disulfidické vazby. Vzhledem k tomu,ža tato oblast angiogeninu je identifikována (Harper a Vallee,1989, supra, byl popsán nový, genetickým inženýrstvím vyro-bený kovalentní angiogenní/RNázový hybridní protein, ARH-I,ve kterém segmenty angiogeninu zahrni^k/. aminokyselinovézbytky 58-70 byly nahrazeny odpovídajícími seg^mnty (zbytky59-73) RNázy A. Nahrazení tohoto segmentu angiogeninu genetic-kým inženýrstvím odpovídajícím segmentem z RNázy A podmiňujevznik kovalentního hybridního proteinu s charakteristikamipodobnějšími RNóze. ARH-I vykazuje enzymatickou aktivitu pře-kvapivě podobnou aktivitě RNázy, ale znatelně sníženou angio-genní biologickou aktivitu»Harper a Vallee, 1989, supra, ne-byli schopni připravit nebo identifikovat protein, ve kte-rém by byla zvýšena biologická angiogenní aktivita. Takovýhybrid by byl neočekávaný vzhledem k jejich experimentálnímuzáměru vložit unikátní oblast RNázy do angiogeninu.

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že nahrazení unikátních segmentů angio-geninu, zahrnujících N-terminální aminokyseliny při nebo od-povídající zbytkům 8-22 angiogeninu, odpovídajícími segmenty -8- (zbytky 7-21) RNázy A za vzniku nového rekombinovaného pro-teinu se zvýšenou angiogenní schopnosti· řodle předkládané-ho vynálezu N-terminální oblast angiogeninu byla identifi-kována jako možný kandidát na unikátní oblast angiogeninu atak považována za určující pro specifickou aktivitu angiogeni-nu. ^ato oblast byla 1)velmi vysoce konzervován® v aminokyse-linových sekvencích angiogeninu pro čtyři druhy (lidský,hovězí, vepřový aWjftZ) a 2)odliŠná od odpovídajících ob-lastí RNázy. Nový rekombinovaný kovalentní hybrid angio-genin/RNáza ARH-III podle předloženého vynálezu tak zahrnujemodifikovaný angiogenin, ve kterém segment blízký N-konciftbytky 8-22) angiogeninu byl vyměněn regionální mutací s od-povídajícím segmentem RNázy (zbytky 7-21). '^ento nový rekom-binantní hybrid vykazuje 10křát větší schopnost angiogenní aktivity a vzrůstá vazebná schopnost (alespoň o jeden řád) kplacentárnímu ribonukleázovému inhibitoru (PRI) ve srovnánís angiogeninem. Ribonukleolytická aktivita ARH-III bylavůči mnoha substrátům nezměněna. Kapacita ARH-III inhibovattvorbu volných proteinů v buňce byla snížena 20 až 30krátve srovnání s angiogeninem. iýto nové hybridní proteiny, obsa-hující pentadekapeptidový segment RNázy jsou biologicky ak-tivnější než samotný angiogenin a jsou tak ve skutečnostiúčinnějším angiogeninem.

Popis obrázků

Obrázky 1a a 1b jsou grafy znázorňující procentuálníshodu aminokyselinových sekvencí zbytků lidského angiogeni-nu ve srovnání s toutéž částí hovězího angiogeninu (obr.1a)a RNázy (obr.1b) za účelem stanovení unikátních segmentů an-giogeninu jak je popsáno v příkladu 1. Obr.1c je grafemukazujícím rpzdíl v procentuální shodě mezi obr.1a a 1b.

Obr.2a ukazuje N-terminélní aminokyselinoveu sekvenciRNázy lidského angiogeninu a ARH-III. Zbytky RNázy A obsaže- 9- aé v pankreatické RNáze 39 savčích druhů jsou označenyhvězdičkou. Orámované části v angiogeninu jsou obsaženy vlidských, hovězích, vepřových proteinech a proteinech lapi-nů. ubr,2b ukazuje DNA sekvence syntetického dvojřetězcové-ho oligonukleotidu kódujícího rezidua 4-23 ARH-III použité-ho jako fragmentu B v konstrukci sekvence kódující ARB^IIIpopsané v příkladu 2. •

Obr.3 je diagramem konstrukce kódující sekvence proARH-III popsaného v příkladu 2.

Obr.4 představuje vymývací profil HPLC tryptických pep-tidů ARH-III popsané v příkladu 4· Óbr.5a je graf znázorňující aktivitu angiogeninu a ARH-IIIsměrem ke kvasinkové tRNAj Obr.5b je grafem představujícímvliv pH na aktivitu ARH-III ve srovnání s RNázou a angioge-ninem jak popisuje příklad 5.

Obr.6 je autoradiografem močovino-polyakrylamidovéhogelu, představujícím vliv angiogeninu a ARH-III na intaktníribosomy jak je popsáno v příkladu 6.

Obr.7 je graf představující aktivitu ARH-III a angio-geninu v CAM zkoušce jak popisuje příklad 7.

Obr.8 je graf představující disociaci angiogeninu aARH-III z komplexu protein:PRI během 10 dnů.

Obr.9 je prostorový diagram RNézy A.

Detailní popis vynálezu Před dalším popisem vynálezu bude užitečné definovaturčité termíny a dále je používat. -1Q-

Biologické aktivita je funkcí nebo souborem funkcípůsobených molekulou v biologickém kontextu (tj. v organismunebo in vitro). ?ro angiogenin je biologická aktivita cha-rakterizována jeho angiogenní aktivitou (angiogenese)· Mů-že také zahrnovat druhotnou messengerovou a/nebo ribonukleo-lytickou aktivitu· Angiogenní aktivita je chemickou stimula-cí rozvoje krevního řečiště do tkání. Ta je obecně spojovánas produkcí difusibilních substancí různými typy buněk. Angio-genní aktivita může být charakterizována pozitivní odpovědív testu kuřecích embryonálních chorioallantoických membrán(Knighton a spol., 1977, Br.J. Cancer 35:347-356) a/nebozkoušce králičích rohovek implantací (Langer a Folkman, 1976,Nátuře 263:797-800). <

Ribonukleolytická aktivita je enzymatické štěpení RNA,zahrnující limitované katalytické štěpení rRNA a tRNA. tfutantní gen nebo zkonstruovaná DNA je molekula DNA neboklon takové molekuly, které byla lidským zásahem modifiková-na tak, aby obsahovala segmenty DNA, které jsou vyměněny,kombinovány nebo umístěny vedle sebe tímto způsobem a kteréby jinak neměly v přírodě existovat.

Mutantní (mutovaný) angiogenní protein je angiogenníprotein nebo nějaký jiný peptidický fragment tohoto proteinu,ve kterém bylo jedna nebo více aminokyselin zaměněno s jinýmiaminokyselinami a který má alternativní biologickou aktivi-tu ve srovnání s nematovanou nebo divokou formou angiogeni-nu. Výhodnou prokaryotickou buňkou používanou při prováděnípředkládaného vynálezu je kmen bakterie Escherichia coli, ač-koliv je možno také použít Bacillus a jiné rody. Technika protransformaci těchto hostitelských buněk a expresi cizorodýchgenů, klonovaných do těchto buněk je velmi známá v oboru (viz Λ7/Ζ*αΜ»ν»Λ'.»>4·»’·ΜώΛ^<’ί»·«;,ίΧ/ί»ί»ίί 11- např. Maniatis a spol., 1982, Molecular Cloning: A Laborato-ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har-bor, New York; Current Protocols in Molecular Biology, 1987(před r.1989), Ausubel a spol., vyd. Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience, New York; Perbal, 1988, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Son«,New York; Davis a spol., 1986, Basic Methods in MolecularBiology, Elsevier Science Publishing Co., New York). vektorypoužívané k expresi v bakteriálních hostitelských buňkáchbudou obvykle obsahovat oddělitelný markér, tak jako gen proantibiotickou rezistenci a promotor, který funguje v hosti-telské buňce. Do vhodných promotorů patří trp (Nichols axanofsky, 1983, Meth.in Enzymology 101:155) lac (Casadabana spol., 1980, J.Bact. 143:971-980) a fág«^\ promotorové sys-témy. Plasmidy používané pro transformaci bakterií zahrnujípBR322 (Bolivar a spol., 1977, Gene 2:95-113), pUC plasmidy(Messing, 1983, Meth.in Enzymology 101:20-77 a Vieira a Mes-sing, 1982, Gene 19:259-268), pCQV2 (Queen, 1983, J.Mol.Appl.Genet. 2:1«r10) a jejich deriváty.

Eukaryotické mikroorganismy jako je kvý síňka, Saccharo-myces cerevisiae, mohou být také použity jako hostitelskébuňky, technika pro transformaci kvasinek je také v oboruznámá (viz např. Strathern a spol., 1982, Xhe Molecular Bio-logy of the ^east Saccharomyces, 2 díl. Cold Spring Harbor^aboratory, New York; Perbal, 1988, supra; Davis a spol., 1986,supra; Beggs, 1978, Nátuře 275: 104-108). Exprimované vektorypro použití v kvasinkách zahrnují YEp13 (Broach a spol., 1979,Gene 8:121-133), YRp7 (Struhl a spol, 1979, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 76:1035-1039), PJDB248 a pJDB219 (Beggs, ibid) a jejichderiváty. Takové vektory většinou obsahují oddělitelný mar-kér, jako je nutriční markér TRP, který dovoluje selekciv hostitelském kmenu, nesoucím trpí mutaci. Výhodné promotorypro použití při expresi vektorů v kvasinkách jsou promotory zkvasinkových glykolytických genů (Hitzeman a spol., 1980, J. -12-

Biol.Chem. 255:12073-12080} Albert a Kawasaki, 1982, J.Mol.Áppl.Genet. 1:419-434) nebo alkohol-dehydrogenázových genů(Young a spol., v Genetic Engineering of Microorganisms forChemicals, Hollaender a spol.vyd., str.335, Plenům, New York,1982 a Ammerer, Meth.in Enzymology 101:192-201, 1983). K usnad-nění čištění angiogenních proteinů produkovaných kvasinkový-mi transformanty a k získání vlastní disulfidické vazebnéformace, může být signální sekvence, výhodněji z kvasinko-vého genu, kódujícího secernovaný protein, připojena ke kódu-jící sekvenci pro angiogenní protein. Zvláště výhodnou sig-nální sekvencí je pre-pro oblast MF</1 genu (Kurjan aHerskowitz, 1982, Cell 30:933-943).

Vyšší eukaryotické buňky mohou také sloužit jako hosti-telské buňky při uskutečňování předloženého vynálezu. Kul-tury savčích buněk jsou výhodné. Exprimované vekto±y|pro po-užití v savčích buňkách budou obsahovat promotor schopnýřízení transkripce cizího genu vloženého do savčí buňky. Jed-ním z výhodných promotorů je myší metallothionein-1 (MT-1)(Palmiter a spol., 1983, Science 222:809-814). Signál pro po-lyadenylaci je také obsažen v exprimovanék vektoru, je loka-lizován po směru od vloženého místa. Polyadenylační signálmůže být takový, který klonuje geny angiogenního proteinu,nebo může být odvozen od heterologního genu. Jiné genové sek-vence (např. intronové sekvence) mohou být vkládány a takzvyšována exprese.

Klonované genové sekvence qiohou pak být použity v kul-tivovaných savčích buňkách způsoby známými v oboru, např. transfekcí za pomoci fosfátu vápenatého (Wigler a spol., 1978,Cell 14:725; Coraro a Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7:603; Graham a Van der Eb, 1973, Virology 52:456). Tvoří sesraženina DNA a fosfátu vápenatého a tato sraženina se apli-kuje na buňky. Některé buňky přijmou DNA a udržují ji v buň-kách několik dní. Malé část těchto buněk /obvykle 10 začle-

TO -13- ·. '••'r. i·,:»:/.7,-: v· :*·' >»íct ;·?; ní DNA do genomu. Za účelem identifikace těchto integrantůjsou obvykle zavedeny do buňky spolu se sledovanými geny geny,které podmiňují rozdělitelný fenotyp (selektující markér)· v Výhodnými rozlišujícími markéry jsou geny podmiňující rezis- / tenči proti lékům jako je neomycin, hygromycin a methotrexát·Rozlišitelné markéry mohou být zavedeny do buněk na separát-ních plasmidech v tu samou dobu jako sledované geny nebo mo-hou být zavedeny na tomtéž plasmidu. ^ískání množství integrované genové sekvence je možnéamplifikační metodou známou v oboru, používající určitýchrozlišitelných markérů (např. dihydrofolát-reduktázy, kterápodmiňuje rezistenci k metothrexátu)· Rozlišitelný markér jezaveden do buňky spolu se sledovaným genem a je aplikována se-1 Akce lékem. Koncentrace léčiva je zvyšována stupňovitě. Se-lekcí pro rostoucí množství kopií klonovaných sekvencí můžebýt znatelně zvýšená hladina exprese.

Mutantní angiogenní proteiny produkované podle předlo-ženého vynálezu mohou být. použity k produkci farmaceutickýchkompozie pro terapii a diagnostiku kombinací se vhodnými nosiči,tyto farmaceutické kompozice obsahují účinné angiogenní množ-ství proteinu a jsou rovněž v rozsahu předloženého vynálezu·l’akové farmaceutické kompozice mohou být použity k povzbuze-ní nebo ovlivnění vývoje krevního systému u savců jako jsoukočky, psi' a lidé, například k indukci kolaterélního oběhu posrdečním záchvatu nebo jiné ischemické chorobě srdeční· Protento účel je angiogenní protein podle předloženého vynálezu po-dáván parenterálně. Výraz "parenterálně", který je zde použitzahrnuje subkutánní, intravenozní, intramuskulární nebointrasternální injekční nebo infuzní techniky. Z přijatelnýchvehikulí a rozpouštědel, která mohou být použita, patří napří-klad voda pro injekce, ^ingerův roztok a isotonický roztokchloridu sodného. "Atypickém provedení je zvolený protein roz-puštěn ve vehikulu, typicky vodě pro injekce a amísen do ί· w — 14— do parenterálních přípravků za použití známých farmaceutickýchpostupů tak, že každá dávková jednotka obsahuje účinné angio-genní množství proteinu. Účinnou dávku je potřeba individuali-zovat podle požadovaných klinických efektů, kterých má býtdosaženo. li K rozšíření terapeutického spektra mohou být tyto far-ν' maceutické kompozice podávány spolu s jinými léčiVy jako jsou antagonisté beta-adrenoreceptorů, například propranolol,blokátory kanálků vápníku například nifedipin nebo jiné koro-nární vasodilatátory.

Proteiny podle předloženého vynálezu mohou být také po-užity k podpoření poúrazového hojení, například při spojo-vání nebo jfiných lokacích, obsahujících měkké tkáně. Napří-klad jestliže dochází často ke zraněním menisku kolena neboramena; při sportovních zraněních nebo při osteoartritidě, je na časované zavedení terapeuticky účinného množství angiogen-ního proteinu výhodnou léčbou, vedoucí k uzdravení natržené-ho nebo traumatizováného fibrocartilagového materiálu, ^ro-teiny podle předloženého vynálezu mohou být rovněž zavedenytopicky na zraněné místo. Pro topickou aplikaci jsou zvolenéproteiny podle předloženého vynálezu smíchány s dermatolo-gicky přijatelným nosičem jako je petrolejový rosol, taleka podobně a volně pak aplikován na poškozené místo, techno-logie regionální mutageneze 8 rekombinací DNA poskytuje vyni-kající metodu pro produkci mutantních proteinů podle předlo-ženého vynálezu v množství potřebném pro jejich terapeutickouaplikaci.

Je dobře známo, že angiogenin a RNáza A vykazují podobnostv aminokyselinových sekvencích, trojrozměrné struktuře a ka-pacitě štěpení RNA. Přesto není RNáza angiogenní, nevyvolávádruhotnou messengerovou odpověá v endotelových buňkách (Bick-nell a Vallee, 1988, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 85:5961-5965), -15- a nevykazuje selektivní štěpení rRNA v intaktních ribozomech(St.Clair a spol., 1987, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 84:8330-8334$St.Clair a spol., 1988, Biochemistry 27: 7263-7268).Poněvadžaktivity angiogeninu in vitro a in vivó se zřetelně odlišují odaktivity RNázy, měly by být i charakteristiky molekuly, kte-ré určují základy těchtoaaktivit také odlišné. K identifi-kaci takových rysů byly analyzovány v přírodě se vyskytují-cí variace sekvencí angiogeninu z různých druhů a*byly po-psány v příkladu 1 . Oblasti angiogeninu, které jsou rozhodu-jící pro tuto jedinečnou aktivitu i)byly uchovány v druzícha ii) měly by být odlišné od odpovídajících oblastí RNázy. estli takové oblasti mohou být identifikovány v souladu spříkladem ΐ, jejich skutečná úloha může být vyzkoušena regio-nální mutagenezí jak je popsáno v příkladu 2.

Podobné diagramy byly konstruovány srovnáním sekvencílidského angiogeninu s těmito sekvencemi hovězího angiogeni-nu (obr.1a) a týmiž sekvencemi hovězí pankreatické RNázy (obr.1b). Rozdíl mezi dvěma diagramy, 1a minus 1b, byl pak vypo-čítán za účelem porovnání těchto oblastí lidského angiogeni-nu jak s vysoce shodným hovězím angiogeninem tak s málo shod-nou RNézou (obr.lc). ^odle těchto analýz jeden segment jemimoj je to segment umístěný při zbytcích 16-19» Poněvadžanalýza použila pětizbytkovéwokénko", jsou skutečné obsaženéaminokyseliny Tyr-14 až Arg-21. Ve trojrozměrné struktuřetyto zbytky( s výjimkou Tyr-14) by měly být v prodlouženékonformaci rozprostírající se od aktivního místa, vztaženo nasrovnání s RNázou (obr;9). ^alší prozkoumání těchto amino-kyselinových sekvencí (obr.2a) potvrdilo, že šest z osmi zbyt-ků v této sekvenci je uchováno do určité míry v sekvencíchsavčího angiogeninu. denom jeden z těchto 8 zbytků, Asp-15,je také přítomen v RNáze A. ^atímco tyto sekvence jsou vyso-ce zachovány v angiogeninech, odpovídající sekvence v paren-terélní RNáze jsou velmi slabě zachovány v druzích (obr.2a).

Ve skutečnosti, Hofman a spol., 1966, J.^mer.Chem.Soc.88:3633- -16- $i * 3639, se ukázalo, že zbytky 15-20 nejsou kompletně nezbytnépro aktivitu RNázy A.

Bezprostředně zbytkům 14-21 angiogeninu předchází blokaminokyselin His8 až Hisl3, který je uchován ve čtyřech sav- r čích angiogeninech (obr.2a). Zbytky 8-13 formují část «C-heli- xu, která začíná na Ser-4 a má stejnou strukturu jako RNáza-A. v vobr.9). Dva zbytky, His8 a Thr11 nahrazují aminokyseliny uchovábané ve 39 savčích pankreatických RNázách a kyselý Glu9RNézy je nahrazen hydrofobním leucinem. Proto tyto zbytky odHis8 do His13 také ukazují možné výrazné rozdíly od RNázy A.Proto, aby byla objasněna funkční úloha této celé sekce angio-geninu, zbytky 8 až 21 byly zkoumány společně se zbytkem 22(aby byla udržena originální vsádka proteinu) pomocí regio-nální mutageneze.

Regionální mutageneze se liší od místně řízené mutage-neze v tom, že segmenty nebo oblasti aminokyselin jsou nahra-zeny více než jedním zbytkem. Toto umožňuje testování mnoho-násobných zbytků jednotlivě a také^govoíuje přispět ke zkou-mání sekundární struktury. Protože/podobnost prostorové struk-tury mezi angiogeninem a RNázou,při výměně oblastí z jednohoproteinu do druhého, může být celková konformace zachována.Účinnost tohoto přiblížení byla demonstrována dříve, kdy by-ly zbytku 58-70 angiogeninu nahrazeny RNázóvými A zbytky59-73 (Hařper a Vallee, 1989, Biochemistry 28:1875-1884).Výsledný mutantní hybridní protein, označený ARH-I, složenýdo přesné konformace, formuje nejen 3 disulfidické vazby nale-zené v angiogeninu, ale i čtyři disulfidické vyzby z RNázy A.Tak N-terminélni oblast angiogeninu může také být přístupnapřemístění za zachováni celkové konformace, Částečně ve světleskutečnosti, že peptid Ang(1-21), obsahující aminokyselinové^zbytky 1-21 angiogeninu, může být takový, že netvoří kova-lentní vazbu na peptid RNázy (21-124), obsahující aminokyse-linové zbytky 21-124 RNézy s mikromolární disociační konstan-tou, rekonstituující 50 % enzymatické aktivity RNázy ifc (Har-

sxsraxxsa&amp;ra -17· per a spol., 1988, Biochemietry 27: 219-226)· To demonstruje,že zde je strukturní podobnost mezi dvěma proteiny v tétooblasti. Amino-koncová oblast RNázy A byla subjekten usilov-ných krystalografických a chemických studií, náležitě dlou-ho zpracovávána systémem S-peptid/S-protein. Termín S-peptidse vztahuje k peptidu RNázy, obsahujícímu zbytky 1-20, získa-nému limitovanou proteolýzou RNázy A. Zbytek molekuly, obsahu-jící zbytky 21-124, je označen jako S-protein (Richard a Vithay-athil, 1959, J.Bio.Chem. 234:162-166). Obr.9 představuje dia-gram RNázy A s vyznačenými pozicemi základních aktivníchmíst zbytků His-12, Lys-41 a His-119. Také jsou zvýrazněnyLys-7 a Ser-21. Jak ukazuje obr.9, zbytky 3-13 RNázy A formu-je sa^-helix, které je ohraničena rozvírajícím místem a obsa-huje katalytický His12 a substrát vázající Gln-11 zbytky;

Helix se váže nekovalentně na S-proteinovou část molekuly sesubmikromolární disociační konstantou (Richarda a Wyckoff, 1971»Enzymes (3.vyd.) 4:647-806 a v něm uvedené odkazy). Ébytky15-23 se pak rozprostírají ven z molekuly pryč od aktivníchmíst a vytvářejí spojení se druhou °\i-helix. Mnohým z těchtozbytků byla přidělena specifická funkce (shrnuto Richardsema Wyckoffem, 1971, supra; Richards a Wyckoff, 1973, Atlas ofMolecular Structures in Biology (Phillips,D,C. a Richards, P.M.,Eds.)Vol.1, Oxford University Press, Londýn; Blackburn aMoore, 1982, Enzymes (3.vyd.)15:317-433; Wlodawer a spol., J.Biol.Chem.257:1325-1335), zahrnující Glu-2 (vyzby vodíkové ved-lejšího řetězce (H-vazby) k Arg-10), Phe-8(hydrofobní inter-akce s proteinem jádra), Arg-10 (H-vazby vedlejšího řetězce keGlu-2), Gln-11 (H-vazby vedlejšího řetězce k fosfátovému sub-strátu; řetězec karbony1 H-vazeb k Asn-44), His-12 (vedlej-ší řetězec zahrnutý v katalýze; H-vazby ke karbonylu Thr-43),^et-13 ( (hydrofobní interakce s proteinem jádra) a Asp-14(vedlejší řetězec H-vazeb k Tyr-25 a/nebo Arg-33). Důleži-tost těchto zbytků se odrazí v tom, že s výjimkou Met-13 jsouvšechny uchovány v pankreatické RNáze ze 39 savčích druhů (Be-intema a spol., 1986, Mo.Biol.Ewol. 3:262-275). Oproti tomužádný ze zbytků 15-23 není uchován mezi těmito rozdílnýmiRNázami a, jak bylo uvedeno výše, zbytky 15-20 nejsou celkověpodstatné. -18- goneqvá «mino-oblast angiogeninu, ve srovnání s výšeuvedenýmVvtak usilovně studována. Nakonec byly aminokyseli-nové sekvenční analýzy angiogeninu z několika druhů zkomple-továny. Sekvence N-koncové oblasti angiogeninu jsou znázor-něny na obr 2a; zbytky, uchované ve čtyřech různých druzích jsouzarámovány. Sekvenční analýzy angiogeninu z těchto rozdíl-ných druhů odhalily, že 16 z prvních 21 zbytků angiogeninu jsoukonstantní a 12 ze 16 se liší od jejich odpovídajících zbyt-ků v RNáze A. Několik aminokyselině, které jsou uchovány vevšech pankreatických RNázách, je přemístěno do angiogeninu;jsou to Glu-2, á.ia-5—Hys-7 a Arg-10. vztaženo na srovnání sestrukturou RNázy A, zbytky 4-14 angiogeninu by měly fomovat (j^-helix s vedlejšími řetězci Gln-12 a His-13 vedenými doaktivních míst štěpení. Zbytky 15 až 24 mohou být nataženyv relativně neuspořádané konfiguraci směrem k “zadní straně"molekuly, před několika řetězci fy -listu, pro spojení sdruhou ~<-helix. Oblast vybraná pro mutaci podle předlože-ného vynálezu zahrnuje zbytky 8-22 angiogeninu a odpovídá sek-venci RNázy. Rozpětí zbytfců Iys-7 až Ser-21 je zvýrazněno naobr.9. Konstrukce DNA kódující sekvence pro tento genovýcm in-ženýrstvím sestrojený hybridní protein, označený ARH-III, jepopsána v příkladu 2. Kódující sekvence pro ARH-III jeexprimóvána v E.coli hostitelských buňkách a ARH-III proteinbyl čištěn jak je popsáno v příkladu 3. ^©dující sekvence proARH-III může být také exprimóvána v jiných než bakteriálníchhostitelských buňkách, jako jsou kvasinky nebo savčí buňky,jak je popsáno ,výše. Aminokyselinová analýza a analýza tryp-tických peptidů (příklad 4) vyčištěného ARH-III proteinu zE.coli expresního systému byla v souladu s úspěšnou náhradouzbytků 8-22 angiogeninu zbytky 7-21 RNázy A, stejně jakos přemístěním Met-(-1) z proteinu exprimovaného v E.coli.

Regionální mutace má malý vliv na aktivitu hybridníhoproteinu ARH-III směrem k většině RNA substrátů jak je popsá-no v příkladu 5. Při pH 6,8 ARH-III štěpí tRNA stejně rychle -19» jako angiogenin (obr.5a), ačkoliv je zde nevelký posun v op-timu pH (obr.5b,). Rychlosti štěpení izolovaných 18S a 28SrRNA jakož i dinukleotidových RNA substrátů (získaných odSigma Chemical Co nebo Calbiochem-Behriňg) cýtidylyl-/3*-5*)-adenosinu (CpA), cytidylyl-(3*-5*)guanosinu (CpG), uridylyl-(3*-5*)adenosinu (UpA) a uridylyl-(3*-5*)guanosinu (UpG) (Ta-bulka II) jsou také v podstatě stejné jako pro angiogenin. V souladu s tím u nahrazované oblasti nevyšlo najévo, že byhrála významnou roli v této aktivitě angiogeninu. Navíctyto výsledky naznačují, že relativní rozdíly v dinukleoti-dovém výběru, které existují mezi RNázou a angiogeninem (Sha-piro a spol., 1988, Anal.Biochem. 175:450-461$ Harper a Vallee,1989, Biochemistry 28: 1875-1884) nepocházejí z interkace subst-rátu a enzymu s některými z těchto zbytků. Nedostatečný efektv obecných RNézových aktivitách nevylučuje úlohu pro ribo-naítleolytické štěpení v akci angiogenního mechanismu, aledostatečně- naznačuje, že takové štěpení by mělo obsáhnoutspecifický substrát.

Naproti tomu, jak je popsáno v příkladu 6, regionálnímutace měly významný vliv na aktivity ARH-III v inhibici pro-teinové syntézy a angiogenezi a také ve druhé messenger-zkouš-ce. ARH-III byla přibližně 30krét méně aktivní než angiogeninv inhibici syntézy volných proteinů z buněk než angiogenin, účin-ky byly pozorovány ^a£ při inkorporaci S-methion/mu docelého proteinu (tabulka III) tak v generování specifickýchrRNA štěpných produktů z intaktních ribozomů (obr.6). V CAMangiogenezní zkoušce, jak je popsána v příkladu 8, byl ARH-IIIneočekávaně více účinný než angiogenin desetkrát(obr.7). ARH-III dosáhl plné aktivity při 0,1 ng per egg tam, kde angio-genin vyžadoval obvykle 1 ng (obr.7). Stejné výsledky bylypozorovány ve druhé messengerové zkoušce s endotelovými bum-kami-Dávka odpovídající křivce pro ARH-III indukující uvolně-ní diacylglycerolu nebo sekreci prostacyklinů byla snížena10 až lOOkrát v porovnání s angiogeninem. Nedostatečná shodamezi efektem regionální mutace na angiogenezi (10x zvyšuje -20 schopnost) a na inhibici syntézy proteinů (30x snižujeschopnost) naznačuje, že tyto dvě aktivity nejsou spojeny.

Tyto dvě aktivity mohou reprezentovat samostatné, nezávisléfunkce molekuly angiogeninu. Obráceně, shoda mezi účinkem regionální mutace na angiogenezi a na druhou messengerovou akti- „ vitu indikuje, že tyto dvě aktivity angiogeninu mohou souvi- set. Pro tyto dvě aktivity (angiogenní a druhou-messengero- * vou) dávka odpovídá křivce pro ARH-III při koncentracích 10- až 100krát nižších ve srovnání s angiogeninem. Tato data pod- » pórují hypotézu, že spojení mezi těmito dvěma aktivitami můžebýt obsaženo v aktivaci domnělého receptoru angiogeninu.

Jak je popsáno v příkladu 8, ARH-III vykazuje o jeden řádvyšší vázací schopnost k PRI ve srovnání s angiogeninem. PRItěsně vazebný inhibitor angiogeninu a RNázy. Tento 50 kDaprotein se váže na angiogenin s 0,7 fM (Lee a spol., 1989b, Biochemistry 28: 225-230). Interakce minimálně obsáhneaktivní místa a zruší oblast okolo Trp-89 (Lee a spol., 1989a, Biochemistry 28: 219-224, Lee a Vallee, 1989a, Bioche-mistry 28:3556-3561). interakce PRI s RNázou, která je 60krátslabší než s angiogeninem (Lee a spol., 1989b, Biochem.Biophys.Res.Commun. 161:121-126), je uváděna, že probíhá pouze naS-proteinové části molekuly, s nevýznamným přispěním ze zbyt-ků 1-20 (Blackburn a Jailkhani, 1979, J.Biol.Chem. 254:12488-12493). Je proto překvapující, že regionální mutace angioge-nihových zbytků 8-22, v souladu s předloženým vynálezem, aktuálně zvyšuje afinitu ARH-III k PRI jak je uvedeno v tabulce V.Rychlost asociace je více než dvojnásobná a disociační rych-lost byla snížena až k mezi detekce, tj. nejméně čtyřikrát. K± je tedy nejméně řádově nižší než pro angiogenin· Tato změ-na je neočekávaná z hlediska zvýšení angiogenní aktivity aaktivity buněčné odezvy ARH-III při nižší koncentraci. V předkládaném vynálezu zabývajícím se výzkumem mutage-neze, vyvstává otázka, jak správně složit mutantní protein. -21- Důkazy pro nezkreslené konformace pro ARH-III regionálnímutant jsou tři: 1) všechny tři disulfidické vazby jsou správ-ně vytvořeny, což vyžaduje přesné zařazení šesti cysteino-vých zbytků z různé lokalizace do sekvence, 2) rychlosti hyd-rolýzy Čtyř dinukleotidů a jiných RNA substrátů jsou nezměně-ny regionální mutaci což znamená, že poiice různých zbytkůřízeně zapojených do rozštěpené fosfordiesterové vazby,nebyly porušeny, a 3) ARH-III se extrémně těsně váže na PRI,tato interakce znovu potřebuje přesné rozmístění multipliko-vaných zbytků, které jsou zapojeny do vazby a nízká hodnotaK^(< 7 x 10 M) je neslučitelná s jakoukoliv velkou změnouv konformaci. Výsledky popsané v příkladech, které následují, ukazují,že charakteristické aktivity angiogeninvíRNézového hybridníhoproteinu ARH-III podle předloženého vynálezu byly výrazněovlivněny regionální mutagenezí, která je zde popsána. Vyná-lez je ilustrován následujícími příklady, které jsou míněnyjako přiblížení vynálezu a v žádném případě nikterak neomezu-jí rozsah předloženého vynálezu. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Selekce oblastí pro mutagenezi

Podobné diagramy byly vypočteny pro poskytnutí kvanti-tativního srovnání sekvencí lidského angiogeninu se sek-vencemi hovězího angiogeninu (obr.1A) a RNázy A (obr.1b).Diagramy ukazují procentuální shodu mezi dvěma proteiny s po-hyblivým pětizbytkovým okénkem umístěným při zbytku lidskéhoangiogeninu. Toto bylo dosaženo použitím počítačového progra-mu se svolením dr.D.J.Strydoma, Harvard Medical School. Abyse usnadnilo seřazení sekvencí, byl deletován N-koncový ala-nin hovězího angiogeninu jako i RNázové zbytky Asn-24, Arg-39, -22-

Gln-69, Thr-70, Pro-114 a Tyr-115 ( číslování RNázy A). Pro-tože hodnoty byly odhadovány nad 5 zbytků, zdůrazňují/č£§f&amp;-nální trendy spíše, než podobnosti/rozdily v jednotlivýchmístech.

První graf srovnává sekvence lidského angiogeninu sesekvencemi hovězího angiogeninu (Obr.1a). Ve většině případůbyla shoda 60 % nebo větší v saehlase s celkovou shodou 64 %(Mass a spol., 1988, FEBS Lett., 241: 41—45; Bond a Strydom,1989, Biochemistry 28: 6110-6113). wení překvapující, žeoblasti okolo tří zásadních katalytických zbytků angiogeni-nu, His-13, Lys-40 a His-114, byly mezi proteiny velmi po-dobné; fakticky se vyskytují tři nejdelší segmenty 80% nebovyšší shody na pozicích 7-19, 37-48 a 106-114· Pět rozdíl-ných oblastí vykazuje 100% shodu a nejdelší z nich je segmentz pozic 10-16.

Obr.1b porovnává lidský angiogenin s RNézou. Stupeňpodobnosti byl o mnoho nižší než uvedený výše, sestával se ze33 % podobnosti celého řetězce. V tomto případě to je skuteč-ná rozdílnost mezi těmito dvěma sekvencemi, a které je nejza-jímavější, protože mohou tvořit základ pro rozdílná biologic-ké úlohy proteinů. Krátké oblasti nejmenší podobnosti (0 %shody) se vyskytují na pozicích 4-6, 50-52, 64-65 a 100-102,nejdelší oblast je 18-22»

Obr.1c ukazuje rozdíl mezi dvěma předcházejícími obráz-ky,odečítá hodnoty z obr.1b od odpovídajících hodnot z obr. 1a. Vysoké hodnoty z obr.1c indikují oblasti lidského angio-geninu jak s vysokou shodou s hovězím angiogeninem tak s nízkoushodou s RNázou. Tyto oblasti nejpravděpodobněji obsahujíunikátní úlohu pro angiogenin. Jenom čtyři samostatné okénkadosahují 80% rozdíl ve shodě a tři z nich se vyskytují v těsné blízkosti poloh 16, 18 a 19. xyto krátké segmenty takstojí mimo jako jjejuchovanější v angiogeninech a jako nejroz-dílnější k RNáze. Zbytky obsažené v tomto segmentu ve dvou -23- koncových okénkách, jsou Tyr-14 až Arg-21.

Obrázek 2a představuje N-terminální sekvenci RN-ézy A alidského angiogeninu. Zbytky v RNáze A zachovávané v pankrea-tické RNáze ze 39 savčích druhů (Beintema a spol., 1986,Mol.Biol.Evo. 3: 262-275) jsou označeny hvězdičkou. Orámovanézbytky angiogeninu jsou zachované v lidském hovězím (Bond aStrydom, 1989, Biochemistry 28: 6110-6113; iáaes a spól.,1988,FEBS Lett. 241 :41-45), vepřových proteinech a proteinech krziít!- je pyroglatamová kyselina. Obr.2a ukazuje, že bez-prostředně předcházející zbytkům 14-21 angiogeninu je blokaminokyselin od His-8 do His-13, který je uchován ve čtyřechsavčích angiogeninech, tyto zbytky formují část 7\-helixuzačínající na Ser-4,předpokládáme-li stejnou strukturu jakomá RNáza, jak je uvedena na obr.9. Rva zbytky His-8 a Thr-lt,nahrazují aminokyseliny uchované ve 39 savčích pankreatickýchRNézách a kyseliny Glu-9 RNázy je nahrazena leucinem. Prototyto zbytky také ukazují možné signifikantní rozdíly od RNázy A.V souladu s tím, aby byla objasněna celá sekce angiogeninu,byly zbytky 8 až 21 zkoumány spolu se zbytkem 22 (s cílemudržení čisté vsédky proteinu) pomocí prostředků regionálnímutageneze· Příklad 2

Konstrukce ARH-III kódující sekvence

Celá sekce angiogeninu vybraná pro mutagenezi podle pří-kladu 1 se rozkládá od His-8 do Asp-22, Tyto zbytky bylynahrazeny zbytky 7-21 RNázy A (obr.2a). Kódující DNA sekvencepro tento hybridní protein, označený ARH-III (obr.2a,b) bylazkonstruována, jak ukazuje obr.3, následovně. Fragmenty A aC byly generovány štěpením pAng2 DNA (13 /Ug) bučí Xhol aEcoRI nebo Pvul a EcoRI s následujícím čištěním élektroforé-zou ve 3% gelu za’ použití NuSieve GTG agarozy s nízkým bodemtání (získané od FMC BioProducts). DNA z expresního plasmidu 24- pAng2 byla získána jak je popsáno Shapirem a spol., 1988,Anal.Biochem.175:450-461 a v US patentové přihlášce č. 305968,které jsou zde citovány jako odkazy, ^lasmid pAng2 obsahujemodifikovaný Trp promotor a ampi^ilikový markér pro selekci.Fragment A (2928 bp), obsahující celý nekódující region plas-midu a kódující oblast pro Met-(-l) až do Asn-3> fragmentG se sestává z kódující oblasti od Arg-24 do Pro-123 a dvoustop kodonů. Fragmenty A a C bylj/pak spojeny s fragmentem B,syntetickým a dvojřetězcovým oligonukleotidem, kódujícímzbytky 4-7 angiogeninu, 7-21 RNézy a 23 angiogeninu jak jeznázorněno na obr.2b. Konce syntetického dvouřetězcovéhooligonukleotidu jsou kompatibilní pro ligaci s místy rozště-penými restrikčními enzymy Xhol a Pvul. Tento syntetický dvoj-řetězcový oligonukleotid byl získán z Biopolymer Laboratory,Dept.of Biologica^ Chemistry and fitolecular Fharmacology, Harvard ^e-dical School. Každý řetězec byl syntetizován souhlasně skonvenčními metodami využívajícími ft-kyanoethylfosforamidito-vou automatizovanou syntézu za užiti Milligen Syntetizéru(Matteucci a Caruthers, 1981, J.Amer.Chem.Soc. 103: 3185-3191J Beaucage a Caruthers, 1981, Tet.Letters 22: 1859-1862).Duplex byl získán připojením 5* fosforylovených komplementár-ních oligomerů jak popisuje Harper a lallee, 1989, Bioche-mistry 28:1875-1884. Nejúspěšnější spojovací reakce použila24, 150 a 100 pmol fragmentů A,B a. G a 6 jednotek T4 DNA li-gázy v 60 /Ul objemu; finální agarozová koncentrace byla 1,4 %.Buňky kmene E.coli W3110 byly pak transformovány za použitíCae^ postupu (Maniatis a spol., 1982, Molecular Cloning: Alaboratory Mannual. Cold Spring Harfcor Laboratory, Cold Springuarbor, New York)s plasmidy byly detegovány rezistencí k am-picilinu. uak mapování restrikčními enzymy (HaelII nebo EcoRI aKpnI) tak nukleotidová sekvenční analýza byly použity prozjištění tohoto nového genetickým inženýrstvím vyrobenéhoplasmidu, označeného pARH-III, obsahujícího správnou kódujícísekvenci, ^ekvenování DNA bylo provedeno se soupravou Sequenase(U.S.Biochemical Corp.) se /^^S/-deoxyadenosin-5*-( </ -thio)-

-25- trifosfótem. Pro sekvenování‘byl KpnI-EcoRI fragment, obsa-hující kódující oblast izolován a klonován do M13mp18 za po-užití běžných metod. Nukleotidové sekvence, odpovídající prv-ním 60 aminokyselinám proteinu byla předpokládána pro hybridníprotein.Plasmid pARH-III byl deponován v American Type Cultu-re Collection (A.T.C.C.) pod číslem 68188. Příklad 3

Exprese a čištění angiogeninu a ARH-III A.Angiogenin

Exprese v bakteriálních buňkách a čištění angiogeninuve velkém měřítku byly provedeny jak je detailně popsáno Shapi-rem a spol., 1988, Anal.Biochem., 175__450-461 . Buňky E.coliW3110, obsahující pAng2 byly kultivovány v doplněném M9 me-diu a pak indukovány přídavkem kyseliny indol-3-akrylové. Buňkypak byly odděleny odstředěním, suspendovány v lysozymu, NaCl,EDTA roztoku po 45 minut a pak zpracovány ultrazvukem. Ne-rozpustný angiogenin byl získán odstředěním, rozpuštěn veguanidin.HCl a 2-merkaptoethanolu a pak převeden rozpuštěnímdo Tris-NaCl pufru. Po zahuštění ve tlakové filtrační jed-notce Amicon (Danvers, MA 01923), byl angiogenin čištěn následu-jící aplikací na HPLC kolony s Mono S a C18 reverzní fází.

Navíc byl angiogenin získán z genetickým inženýrstvím zpracova-ných buněk ledvin mladých křečků (BHK) jak je detailně po-psáno Kurachim a spol., 1988, Biočhemistry 27: 6557-62»Jransfektované buňky se kultivují při 37 °C v DME mediu, obsahu-jícím 80 /uM ZnSO^ a 2 ^uM CdSO^, které bylo měněno ve 2-3denních intervalech. Angiogenin byl pak čištěn od mediapostupnou chromátografií na kolonách iontovýměnné CM-celulo-zy a Mono S. ťokud není uvedeno jinak, angiogenin použitý vnásledujících příkladech byl získán z buněk BHK jak je uvedeno. —.............. -26-

B. ARH-III

Hladiny expresí 9 individuálních kolonií E.coli W3110transformovaných pARH-III jak je popsáno v příkladu 2,byly odhadnuty imunoblottingem za použití afinitně čiště-ného anti-angiogeninu jak je popsáno Shapirem a spol., 1988,supra. Buňky, vykazující nejvyšší hladinu exprese (-10 mg/1)byly selektovány pro ARH-III expresi. Výrazné exprese a čištění bylo provedeno jak je popsánodříve pro angiogenin Shapirem a spol., 1988 supra. HybridníARH-III protein byl tak exprimován v E.coli W3110, získán ačištěn za použití Mono S kationtové výměny a G18 (oktadecyl- silan) reverzní fázové HPLC jak je popsáno Shapirem a spol.,1988, supra. SEP-PAK G18 náplně byly od Milipore Corp.(Bedford, MA 01730). ARH-III hybridní protein byl eluovén dřívenež angiogenin na koloně Mono S (8 minut rozdílu v retenčnídobě, 50 minutový gradient z 0,15 na θ,55 M NaCl v 10 mMjtris,pH 8,0). Eluuje se jako ostrý, symetrický pík na C18 koloněs malým hrbem, zahrnujícím 5 % celkové plochy. Střední frakcehlavního píku byly spojeny a dialyzovány a SDS-PAGE analýzaprokázala jedinýkompaktní pruh při — 14,500. Celkový vý-těžek byl 0,4 mg/1 kultury. ^bytek Met-(-1) hybridního proteinu ARH-III, exprimované-ho v E.coli (9 /uM) byl enzymaticky odstraněn Aeromonas amino-peptidázou jak je popsáno Shapirem a spol., 1988, supra, zapodmínek vhodných pro spontánní cyklizaci dalšího zbytku,

Gln-1, na pyroglutamovou kyselinu, ^rotein byl pak čištěn HPLCs reverzní fází jak je uvedeno výše a frakce píku byly spo-jeny a dialyzovány proti vodě. Ačkoliv jakýkoliv přírodní (nemutovaný) nebo mutantní(mutovaný) angiogenin exprimovaný v E.coli za použití pAng2

-27 obsahuje Met-(-1) >r amino-konc^nebyla dosud pro tento zbyteknalezena účinná enzymatické nebo angiogenní aktivita· Nicmé-ně, vzhledem k jeho blízkosti k přemístěné oblasti v ARH-III,byl N-terminélní Met-(-1)zbytek odstraněn jak je popsáno vý-še k zajištění toho, že vazba a orientace nové oblasti budepřibližně taková, jak je to v angiogeninu, jak je to jenmožné. Aminokyselinovýé složení a peptidové mapování naznaču-jí, že odstranění Met-(-1) v ARH-III bylo větší než 95 % jakje popsáno v příkladu 4 dále· Příklad 4

Strukturní charakteristika ARH-III

Aminokyselinová analýza byla provedena jak je popsánodříve (Strydom a spol., 1985, Biochemistry 24: 5486-5494) zapoužití derivatizační metody Picotag a HPLC systému WatersAssociates (Milford, MA 01757). Bigesce trypsinem byla pro-vedena inkubací 4,1 nmol ARH-III s 95 pmol HPLC čištěným trypsi-nem v 730 /Ul 20 mM Tris, 0,35 M NaCl, pH 8,0 po dobu 24 ho-din při 37 °C. Peptidy byly odděleny HPLC s reverzní fází jakje popsáno Shapirem a spol., 1988 supra, a identifikoványeluční polohou a složením aminokyselin. ítyla použita Altexultrasférová IP C18 kolona s lineárním gradientem 0-50 %rozpouštědla B (3:2:2, 2-propanol-acetonitril:0.08% vodnátrifluoroctová kyselina (TFA) v rozpouštědle A (0,1% TFA) bě-hem 140 minut. Průtoková rychlost kolony byla 0,8 ml/minuta. SDS-PAGE byla provedena na 15% polyakryamidových gelechs 5% vrstvených gelů jak je popsáno Laemmlim, 1970, Nátuře227: 680-685. Proteiny byly vizualizovány za použití rychlévyvolávací soupravy obsahující stříbro od ICN Immunobiologi-cals (Lisle, IL,60532).

Aminokyselinové složení ARH-III jak je uvedeno v tabul-ce I obsahovala úspěšné nahrazení zbytků 8-22 angiogeninu -28 zbytky 7-21 RNázy, jakož i úspěšné odstraněni Met-(-1). Výsledky tryptického Štěpení ARH-III také podporují úspěšnénahrazení zbytků 8-22 jak je uvedeno v tabulce I a na obr.4.ώβjména obr.4 představuje HPLC elučni profil tryptickýchpeptidů ARH-III. Jednotlivé peptidy/ bbyly identifikovány složenním aminokyselin popsaným pro celou sekvenci. Označení peptidůpro angiogenin je od Strydoma a spol., 1985, Biochemistry 24:5486-5494. N-terminální sekvence angiogeninu a ARH-III jsouuvedeny na obr.4; dvojhrotové šipka ukazuje peptidy genero-vané tryptickým štěpením. Celé trojcystinové spojené pepti-dové páry, T-9B, T-10 a T-11 , byly odstraněny, v souladu svlastním převedením a oxidací proteinu. Peptidy T-1, -2, -3a, -3b, -4a, -5, -6, -8 a disulfidické spojeni T-10 a Τ-1Ίměly složení a elučni polohu v podstatě stejné jak bylo po-zorováno pro lidský angiogenin (Strydom a spol., supra; Sha-piro a spol., 1988, supra). Amino-koncový peptid T-1 bylzískán ve výtěžku >95 % , což opět indikuje nezbytné úplnéodstraněni Met-(-1).

Jak se očekávalo, jediný rozdíl mezi ARH-III a angio-geninem se vyskytuje na peptidech 7-7 a T-9*. V jejichmístech dává hybrid ARH-III vznik dvou nových tripeptidů(označených T-7a a T-7b) a rozšiřuje formu T-9*(označenouT—9tSJ jak je uvedeno na obr·.4. T-7a se eluuje še třemi jiný-mi peptidy ve dvou nebo více mírně rozdělených pících při44 ^“45 minutách; byly identifikovány složením aminokyselin,řeptid T-7b (tabulka 1) eluuje jako jednotlivý pík při 56minutách, jak je zřejmé z obrázku 4. Nehydrolyzovaný hexapeptiďtvořící T-7ab byl také získán (obr.4, tabulka I). T-9bfkterý je disulfidicky připojen k T-9", tvoří dvojitý peptidloznačený T-9b, byl detegovén ve dvou formách. První, spojenýpeptid T-9b byl eluován v podstatě čisté formě: v píku po 111minutách (obr.4, tabulka I). Druký velký pík při 109 minu-tách obsahuje směs T-8, T-9b a 1 až 2 Arg zbytky. Toto jeve shodě s neúplných rozštěpením T-13 (Arg-Arg dipeptid) -29 z karboxylového konce T-9b*, a koeluci T-9b*-13/T-9" dvo-jitého peptidu s T-8.

,JL‘abulka I

Aminokyselinové složení ARH-III a jeho tryptických peptidůa

Angiog enin ARH-III T-7b T-7ab T-9b Asp 15 1.4,0. (14) 0,14 2,19 (2) Glu 1 0 9,9 (10) 1,00 (1 ) 0,98 (1) 2,95 (3) Ser 9 12,6 (13) 0,12 6,56 (7) Gly 8 7,5 (7) 0,12 0,52 His 6 4,9 (5) 1,11 (1) Arg 13 13,3 (13) 1,00 (1 ) 1,03 (D 2,17 (2) Thr 7 7,3 (7) 1,00 (1) 2,87 (3) Ala 5 6,1 (6) 1,87 (2) Pro 8 7,5 (7) 0,18 Tyr 4 2,7 (3) 0,95 (1) 0,86 (1) Val 5 4,0 (5) 0,94 (D) Met 1 2,0 (2) • 1 ,81 (2) Ile 7 6,5 (7) 1 ,03 (O Leu 6 5,3 (5) 0,1 0,15 Phe 5 4,9 (5) 0,90 (1 ) 0,90 (1) 0,98 (1) Lys 7 7,1 (7) 1,04 (D 1,23 (1) Gys 6 6 (6) 2 (2) pmol 520 450 170 aHodnoty jsou uvedeny jako zbytky/mol; množství menší než0,1 zbytek/mol nejsou uvedena, ^očty zbytků předpokládanýchpro ARH-III sekvenci jsou uvedeny v závorkách. Složení tryp-tického peptidu je ze 200 ^ul jednotlivé kolonové frakce; pmolpeptidu na 200 yul je uvedeno dole. ARH-III Gys výsledky jsouv souladu s koeluci disulfidických spojených peptidů po tryp-tickém štěpení. -30- Příklad 5

Enzymatické zkouška a aktivita A. Enzymatické zkouška

Aktivita vůči kvasinkové tRNA (získané od Calbiochem)byla stanovena za použití sréžecí zkoušky (Shapiro* a spol., 1987, Proč.Nati.Acad.Sci. USA 84: 2238-2241) s angiogeninemnebo ARH-III v koncetracích 18 až 430 nM. Obrézkk 5a zná- zorňuje aktivitu angiogeninu a ARH-III měřenou vůči kvasin-kové tRNA. Zkouška měří vznik kyselých rozpustných fragmen-tů během 2 hodin při pH 6,8 a 37 °C. Zkoušky pro pH profilybyly provedeny za použití následujících pufrů s hodnotamipH při 37 °C: 2-(N-morfolino)ethansulfonové kyselina (Mes),pH 5,4, 5,8, 6,3} N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N'-2'-ethan-sulfonová kyselina (Hepes) pH 6,2, 6,8, 7,3, 7,8; tris(hydro-xymethyDaminomethan (tris), pH 7,5, 8,1,8,5; a 2-(N-cýklohe-xylamino)ethansulfonové kyselina (Ches), pH 8,8, 9,3 a 9,9.Hodnoty pH byly vypočteny z odečtů při 25 °C za použitípKa/°C hodnot poskytnutých Research Organics (Cleveland,

Ohio 44125). Obr.5b představuje vlivy pH na aktivity ARH-III(plné trojúhelníky), angiogenin (plné kroužky) a RNézy (plnéčtverečky), vůči kvasinkové tRNA. Pro porovnání jsou aktivi-ty normalizovány při maximu získaném pro každý protein.

Aktivita vůči dinukleotid(3*,5*)fosfátům byla stanovenaHPLC kvantitativní metodou jak je popsáno Shapirem a spol, 1988, Anal.Biochem. 175: 450-461.; Harperem a Valleem, 1989,Biochemistry 28; 1875-1884. Reakční směs (30 ^ul) obsahovala0,1 mM substrátu, 2,8 ^uM ARH-III a byla inkubována po 4 až24 hodin při 37 °C.

Ribonukleolytická aktivita vůči 18S rRNA byla vizuali-zovéna jak je popsáno Shapirem a spol, 1986, Biochemistry 25; -31- 3527-3532, s rRNA z telecích jater (Pharmacia) jeko substrá·tem. B. Enzymatická aktivita

Enzymatické aktivity ARH-III vůči tRNA, 18S a 28S rRNAa dinukleotidovým substrátů^ byly velmi podobné zkouškámpro angiogenin. Ve zkoušce tRNA oba proteiny vykazují nelineérní odezvu pao -^-^260 θΡ1*0^ enzynové koncentraci při pH 6,8(37 °C) a jejich aktivity jsou nerozlišitelné při koncentra-cích, které byly testovány, jak je uvedeno na obr.5a. ARH-IIIse poněkud lišil od angiogeninu, nicméně jeho pH otimum bylo«r/7,3 jak je uvedeno na obr.5b. Angiogenin a RNáza (získanáod Gooper Biochemicals) měly maximální aktivity po podmínekzkoušky při pH /νβ,8 a /*8,1, což je v souladu s předcházejí-cími výsledky získanými Leeem a Valleem, 1989b, Biochem. andBiophys.Bes.Commun. 161: 121-1^6. de známo, že angiogenin ka-talyzuje štěpení dinukleotidových substrátů, ale při rychlos-ti 5 až 6krát řádově nižší než bylo pozorováno pro RNázu A(Shapiro a spol., 1988, Anal.Biochem. 1755 450-461; Harpera Vallee, 1989, Biochemistry 28: 1875-1884). Jeho specifitaje rozdílná od specifity RNázy A vzhledem ke ^ca^/Km hodno-tám pro 4 rozdílné dinukleotidy.Aktivita ARH-III vůči těmtosubstrátům je velmi podobná aktivitě angiogeninu, jak je uvede-no v tabulce II. Ve všech případech hodnoty kca^/Km bylyve 30 % hodnot pozorovaných pro angiogenin a relativní spe-cifita pro substráty byla nezměněna. -32-

Tabulka II

Aktivita ARH-III vůči dinukleotidovým substrátům® substrát ARH-III . b angiogenin RNáza AC CpA 13 12 6,0 x 10δ CpG 3,4 4,0 5,1 x 105 UpA 0,8 1,1 4,0 x 10° UpG 0,4 0,4 1,8 x 105 ®Zkoušky s ARH-III a angiogeninem byly provedeny v 30 mM Mes,30 mM NaCl, pH 6,0 při 37 °C. ^Hodnoty od Shapira a spol., 1988, Anal.Biochem. 175: 450-461 a Harpera a Valleea, 1989, Biochemistry 28:1875-1884. cHodnoty od Harpera a Vallea, 1989, supra; zkouškjc provedenyspektrofotometricky ve výše uvedeném pufru při 25 °C.

Je také známo, že angiogenin štěpí nechráněnou 18S a 28SrRNA selektivním způsobem, za vzniku produktů přibližné délkjr100-500 nukleotidů, které zůstávají po nějakou dobu rezis-tentní vůči další degradaci (Shapiro a spol., Biochemistry25: 3527-3532). Aktivita ARH-III vůči takovým nechráněným18S a 28S rRNA byla nerozlišitelná od aktivity angiogeninu. V čase 60 až 90 minut dva proteiny (0,67 /UM) katalýzujítforbu produktů podobné velikosti a intenzity, jak bylo zjiš-těno elektroforézou na agarozovém gelu. -------------...------------- -33- Příklad 6

Inhibice proteinové syntézy in vitro a štěpení intaktníchribosomů

Vliv ARH-III na proteinovou translaci v lyzétu králičíchretikulocytů byl stanoven modifikovaným postupel podle St.Claira a spol., 1987, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 84:8330-8334,jak je popsáno Harperem a Valleem, 1989, Biochemistry 28:1875-1884. fteakční směsi obsahovaly 10-210 nM angiogeninunebo ARH-III. ARH-III katalyzované štěpení retikulocytové ribosomálníRNA v intaktních ribosomech bylo nkoušeno za použití metodySt.Claira a spol., 1987, supra, jak je popsáno Harperem a Va-lleem, 1989 supra.

Je známo, že angiogenin inhibuje translaci v lyzétu krá-ličích retikulocytů katalýzou vysoce specifického štěpení18S rRNA ve 40S ribosomální podjednotce, generující malémnožství diskrétních produktů jak pozoroval· St.Clair a spol.,1987, supra; St.Clair a spol, 1988, Biochemistry 27: 7263-7268. RNáza A naopak atakuje ribozomy na mnoha místech zavzniku velkého množství reakčních produktů různé velikosti· Z těchto dvou je angiogenin aktuálně účinnější při inaktiva-ci ribosomů, i když jeho rychlost s dalšími RNA substráty jeaž miliónkrát pomalejší než rychlost RNázy A. Tato pozoru-hodná specifita, je pozorována jenom s intaktními ribosomy ne-bo ribosomálními podjednotkami, ale ne s izolovanou 18S nebo28S rRNA. ARH-III je značně méně účinný než angiogenin při inhi-bici syntézy proteinů v lyzátu králičích retikulocytů jak jeuvedeno v tabulce III. Iřatímco angiogenin inhiboval transla-ci proteinů úplně při koncentraci 40-70 nM^· ARH-III při 210 -34- nM vykazuje méně než 50% inhibici, i při trojnásobně dlouhéinkubeční době.Při srovnání množství proteinu požadova- ného pro generování stejných hladin inhibice vyplynulo, žeARH-III byl 20- až 3Okřát méně aktivní než angiogenin vestejném systému zkoušek·

Tabulka III

Inhibice translace proteinu in vitro ARH-III, angiogeninema RNázou Aa vzorek__koncentrace (nM)% inhibice ARH-III 70 0 210 16 21 0b 44 angiogenin 10 15 30 86 70 100 RNéza A 30 30 70 99 aZkouŠky byly provedeny v systému lyzátu králičích retikulo-cytů. Procenta inhibice jsou vztažena na množství /^s/-zna-čeného proteinu získaného kyselým srážením^ 0 % a 100 % in-hibice odpovídá 61,000 cpm a 200 cpm. bfteakění doba ARH-III se směsí lyzátu byla 45 minut místoobvyklých 15 minut.

Pro určení, zda ARH-III Štěpí ribosomální RNA stejnýmselektivním způsobem jako angiogenin, byla izolována rRNA zvýše uvedené reakční směsi lyzátu králičích retikulocytů,radioaktivně označena a analyzována elektroforézou na močoai**no/polyakrylamidovém gelu jak je uvedeno na obr.6· Podrob-něji, lyzát králičích retikulocytů byl inkubován 15 minut -35-

HgO (dráhy 1 a 9), angiogeninem při 10 nM (dráha 2), 30 nM(dráha 3) a 70 nM (dráha 4), nebo ARH-III při 30 nM (dráha5)t 70 nM (dráha 6), 210 nM (dráha 7) a 210 nM se 45minuto-vou inkubací (dráha 8). rRNA pak byla čištěna extrakcí fenol/chloroform a vysrážena ethanolem, 5* značena za použití/ - P/-ATP. zpracována elektroforézou na polyakrylamido- vém gelu a vizualizována autoradiografií. Vzorky ve dráhách 1-4 obr.6 byly odebrány a zpracovávány elektroforézou 5 minutpřed odebráním drah 5-9. ARH-III generuje v podstatě stejnéštěpné produkty jako angiogenin, ale potřebuje k tomu výraz-ně vyšší koncentrace. 45 minut inkubace při 210 nM ARH-IIIposkytlo produkty se stejnou intenzitou jako byly generová-ny za použití 20 nM angiogeninu při 15 minutové inkubační do-bě· To odpovídá 30násobnému rozdílu v aktivitě. Příklad 7

Biologická aktivita

Angiogeneze byla stanovena za použití zkoušky kuřecíhoembrya CAM podle Knightona a spol., 1977, Br.J.Cancer 35:347-356, jak popsal Fett a spol., 1985, Biochemistra 24:5480-5486. Jednotlivé zkoušky používaly sady 10-20 vajec.Celkový počet použitých vajec byl 248 pro ARH-III, 125 proangiogenin a 20 pro HgO .Angiogenin byl z expresního systémuE.coli popsaného v příkladu 3 a obsahoval Met-(-1) zbytek,jeho potence byla nerozlišitelná od přírodního angiogeninu,obsahujícího pyroglutamovou kyselinu při amino-konei (Shapi-ro a spol., 1988, Anal.Biochem. 175:450-461). Dávka vyvolá-vající odpověá ARH-III v CAM zkoušce byla rozdílná od angio-geninu jak je uvedeno na obr. 7. Angiogenin se typicky přibli-žuje maximální aktivitě v dávce asi 1 ng, indukující pozitiv-ní odpověá u 50-60 % vajec. Jeho aktivita při 0,1 ng je obvykle -36· blízká 10 až 20% pozitivní základní hladině pozorované sesamotnou vodou· Oproti tomu ARH-III dosahuje plnou aktivitupři 0,1 ng a vzhledem k tomu je 10křát účinnější než angio-genin. To je neočekávané, nebol RNáza samotné nemá angiogen-ní aktivitu a ARH-III hybrid obsahuje segment odvozený odRNázJř, o kterém se předpokládá, že je unikátní oblastí angio-genní struktury a funkce. Při vyšších dávkách ARH-III vyvo-lává maximální odezvu pozitivní ze 41 %, která je ‘mírnějšínež u angiogeninu. Příklad 8

Vazba ARH-III na PRI ^dánlivé asiciační konstanta druhého řádu, kft, pro vaz-bu ARH-III k PRI byla stanovena zkouškami kompetitivnostimezi ARH-III a RNázou k PRI jak je popsáno Leeem a Valleem,1989a, Biochemistry 28: 3556-3561 a Leeem a spol., 1989a, Bio-chemistry 28: 219-224. PRI byl čištěn jak je popsáno Black-burnem, 1979, J.Biol.Chem. 254:12484-12487. Interakce bylamonitorována v 0,1 M Mes, 0,1 M NaCl, 1mM EDTA, pH 6,0 při25 °C. Hodnota kft získané pro ARH-III byla průměrem ze sedmisamostatných pokusů. Kft stanovená pro asociaci ARH-III a PRIbyla (4,3+0,5) x 10® lT1s~\ Tato hodnota byla více než dva-krát větší než hodnota pro angiogenin jak je zřejmé z tabul-ky IV.

Konstanta disociační rychlosti, kd, byla stanovena mo-nitorováním uvolňování ARH-III z komplexu protein:inhibitor ja-ko funkce času za přítomnosti přebytku lapače volného PRI jakpopsali Lee a Vallee, 1989a, supra, a Lee a spol., 1989b, Bio-chemistry 28: 225-230. Volný angiogenin a ARH-III byly měřenykationtovýměnnou HPLC během 10 dnů. Inkubace byla prováděna při25 °C ve výše uvedeném pufru, obsahujícím 120 ^uM DTT. Diso-ciační rychlost pro ARH-III:PRI komplex byla v podstatě nižší nnež pro angiogenin jak je uvedeno v tabulce IV. Obr.8 taképředstavuje disociáci angiogeninu a ARH-III z komplexu pro- ^ťř -37- tein:PRI v průběhu 10 dnů. osa y obr. 8 představuje frakciangiogeninu nebo ARH-III, která není vázána. *0 lOdennímobdobí, během kterého se disociovali ~8 % komplexu angio-genin:PRI, nebyla detegovatelná (<2 %} ARH-III:PRI komple-xu. Horní hranice pro k^ pro ARH-III může být pro k^ proARH-III uchovávána při 3 x 10~θ s“1. IC pro interakci ARH-III a PRI, vypočtená z kft a k^hodnot a byla <7x1 0~^ 7JI« Byla nejméně 1 0- a 600-krátnižší než hodnoty pro angiogenin a RNázu A.

Tabulka IV

Vazebné konstanty pro ARH-III s PRIa

Vzorek *a Ki (m”" I ”1 1Λ-βΛs x10 ) (s"1x107) (fM) ARH-III 4,3 10,3 lo,or . b angiogenin 1,8 1,3 0,7 RNáza Ab 3,4 150 40 aPodmínky inkubace byly 0,1 M Mes, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA,pH 6,0, 25 °C. b0d Leea a spol., 1989b, Biochemistry 28: 225-230. Z předcházejícího je zřejmé, že byla popsána speci-fická provedení vynálezu, která však slouží pouze jako jehoilustrace, mohou být uskutečněny různé změny v provedení,aniž by došlo k porušení rozsahu vynálezu. Podle t0ho nenívynález nikterak omezen jinak, než předloženými nároky.

Claims (15)

-38-

1 · Mutantní angiogenní protein, ve kterém aminokyselinyv oblasti při nebo odpovídající angiogeninovým zbytkům 8-22, byly nahrazeny jinými aminokyselinami, mající zvýšenouangiogenní aktivitu.

2. Mutantní angiogenní protein podle nároku 1, ve kte-rém oblast při nebo odpovídající angiogeninovým zbytkům8-22 byla nahrazena oblastí aminokyselin v RNáze.

3. Mutantní angiogenní protein podle nároku 2, kde odpo-vídající oblast aminokyselin v RNáze zahrnuje aminokyselinypři nebo odpovídající zbytkům 7-21 RNázy.

4. Čištěné izolované DNA sekvence obsahující DNA sekvencikódující protein podle nároku 1.

5. Čištěná izolovaná DNA sekvence obsahující DNA sekven-ci kódující protein podle nároku 2.

6. Čištěné izolované DNA sekvence obsahující DNA sekven-ci kódující protein podle bodu 3.

7. Izolovaný vektor pro expresi proteinu podle nároku 1v transformovaných hostitelských buňkách.

8. Izolovaný vektor pro expresi proteinu podle nároku 2v transformovaných hostitelských buňkách.

9. Izolovaný vektor pro expresi proteinu podle nároku 3v transformovaných hostitelských buňkách.

«Μ» 39

1 0· Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle ná-roku 7.

11. Hostitelské buňka transformovaná vektorem podle ná-roku 8.

12. Hostitelské buňka transformovaná vektorem podle ná-roku 9.

13. Farmaceutický přípravek,v yznačující se t í m , že obsahuje angiogenně účinné množství proteinu podlenároku 1 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

14. Farmaceutický přípravek, vyznačující setím, že obsahuje angiogenně účinné množství proteinu podlenároku 2 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

15. Farmaceutický přípravek, vyznačující set í m , že obsahuje angiogenně účinné množství proteinu podlenároku 3 ve farmaceuticky přijatelném nosiči. !* Anotace .277-7//7 j í ΐ í i ?&amp; wézev vynálezu: Kovalentni hybridy angiogenin/RNéza j; ř Je popisována regionální mutageneze genu pro angioge- | nin pro přípravu DNA sekvencí kódujících mutantní proteiny, 5 mající zvýšenou angiogenní aktivitu. Vektory pro expresi ob- ? sáhující tyto sekvence jsou zaváděny do hostitelské buňky a ΐ; a řídí produkci mutantních angiogenních proteinů s. výrazně ; zvýšenou angiogenní aktivitou. Přemístění aminokyselin v < oblasti při nebo odpovídajících zbytkům 8-22 angiogeninu s dalšími aminokyselinami, zejména s aminokyselinami odpo- vídajícími zbytkům 7-21 RNázy, neočekávaně vede k hybridnímuproteinu angiogenin/RNáza, který je mutantní, a má 10křátvyšší angiogenní účinnost ve zkoušce chorioallantoinové mem-brány. Další in vivo a in vitro angiogeninové aktivity jsouv mutantním hybridním proteinu změněny. Mutantní angiogenin/ i RNázové hybridní proteiny podle předloženého vynálezu jsouvhodnými terapeutickými kompozicemi k promotování vývoje hemo-vaskulárního řečiště u savců nebo při promotování hojení po-ranění, zejména, hojení roztrženého nebo traumatizovanéhochrupavčitého materiálu. ‘ i