CS277547B6

CS277547B6 - Způsob výroby makrotetrolidových insekticidů

Info

Publication number: CS277547B6
Application number: CS912198A
Authority: CS
Inventors: Josef Ing Csc Jizba; Irena Ing Skibova; Margita Rndr Csc Blumauerova
Original assignee: Mikrobiologicky Ustav Csav
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1993-03-17
Also published as: CZ219891A3

Abstract

Makrotetrolidy obecného vzorce I kde R1.R2.R3 a R4jsou methylové nebo ethylové skupiny, jsou přírodní pesticidy s insekticidním, akaricidním, kokcidiostatickým a anthelmintickým účinkem, produkované různými druhy streptomycet.Jejich účinnost se zvyšuje s počtem ethylových skupin v molekule. Streptomyces griseus, použitý pro vypracování postupu výroby podle předloženého vynálezu, produkuje při submersní kultivaci na půdě se škrobem, lihovarskými výpalky a sušenými kvasnicemi směs nonaktinu, monaktinu, dinaktinu a tetranaktinu v poměru 8 : 27 : 57 ; 8. Při kultivaci na půdě stejného složení, ke které byl přidán propionan sodný a hydrogenfosforečnan draselný, je produkován dlnaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 2 : 26 : 72. Chemickou isolací tohoto komplexu z mycelia produkčních kultur byla získána směs trinaktinu a tetranaktinu v poměru 1 : 3, obsahující Jen stopové množství dinaktinu.

Description

Vynález se týká způsobu výroby makrotetrolidových insekticidů trinaktinu'a tetranaktinu biosyntetickou cestou.

Ztráty, způsobené škodlivým hmyzem a roztoči při pěstování a skladování zemědělských plodin, představují každoročně až 30 % světové produkce. Účinná ochrana rostlin proti škůdcům je tedy jedním z hlavních faktorů, určujících výši a kvalitu sklizně, a tím i jednou z nejsnáze dostupných reserv v zemědělství. Dlouhodobá aplikace syntetických agrochemikálií má však negativní ekologické důsledky (nahromadění nerozložitelných toxických látek v půdě nebo plodinách, vývoj odolných forem škůdců, uhynutí neškodných organismů, a podobně), a proto je věnována zvýšená pozornost výzkumu a vývoji přírodních insekticidů, především produktů mikroorganismů. V minulých letech byla objevena celá řada mikrobních metabolitů s pesticidními účinky, jen několik z nich však mělo vlastnosti vhodné pro praktickou aplikaci (Misato a sp., Adv. Appl. Microbiol. 21, 53 až 88, 1977; Mistato, J. Pesticide Sci. 7, 301 až 305, 1982; Deshpande a sp., Enzyme Microb. Technol. 10, 455 až 473, 1988). Mezi ně patří látky typu makrotetrolidů (Dominguez a sp., Helv. Chim. Acta 45, 129 až 138, 1962; Beck a sp., Helv. Chim. Acta 45, 620 až 630, 1962; Kellar-Schierlein a sp., Antimicrob. Agents Chemother. 1966, 644 až 650, 1967; Ando a sp., J. Antibiot. 24, 418 až 422, 1971) obecného vzorce I

(I) kde R_lz R₂, R₃ a R₄ jsou methylové nebo ethylové skupiny:

	^R1	^R2	^R3	^R4
la	Nonaktin	ch₃	ch₃	ch₃	ch₃
Ib	Monaktin	ch₃	ch₃	ch₃	ch₂ch₃
Ic	Dinaktin	ch₃	ch₃	CH₂ ^CH3	ch₂ch₃
Id	Trinaktin	ch₃	^CH2^CH3	CH₂ ^ch ₃	^CH2^CH3
le	Tetranaktin	^cH2^ch3	ch₂ch₃	^CH2^CH3	ch₂ch₃

CS 277547 B6 2

Makrotetrolidy jsou aktivní proti hmyzu a roztočům (Oishi a sp., J. Antibiot. 23, 105 až 106, 1970; Ando a sp. J. Antibiot., 24, 347 až 352, 1971; Sagawa a sp. , J. Econ. Entomol. 65, 372 až 375, 1972) a mají také účinky kokcidiostatické (Sakamoto a sp., Deutsche Patentschrift DE 2802455 C2, 1978) a anthelmintické (Nippon Kayaku Co. Ltd., a Chugai Pharm. Co., Ltd., Japan Kokai Tokkyo Koho 8157, 714, 1981). Jsou neškodné pro teplokrevné živočichy (Oishi a sp., J. Antibiot. 23, 105 až 106, 1970; Sagawa a sp., J. Econ. Entomol. 65, 372 až 375, 1972) a pro rostliny (Hirano a sp., J. Econ. Entomol. 66, 349 až 352, 1973) a snadno rozložitelné půdní mikroflorou (Sasaki a sp., Appl. Environ. Microbiol·., 40, 264 až 268, 1980). Jejich aktivita se zvyšuje s počtem ethylových skupin v molekule; nejúčinnější je trinaktin (vzorec Id) a tetranaktin (vzorec le).

Nonaktin, monaktin, dinaktin a trinaktin jsou produkovány řadou druhů streptomycet, například různými kmeny Streptomyces griseus, S. chrysomallus, S. flaveolus, S. Tsusimaensis neo S. werraensis (Smith, J. Antibiot. 28, 1000 až 1003, 1975). Tetranaktin ve směsi s dinaktinem a trinaktinem bylo isolován pouze z kultur S. aureus (Ando a sp., J. Antibiot. 24, 347 až 352, 1971), kdežto S. roseochromogenes tvoří nonaktin, monaktin, dinaktin, trinaktin i tetranaktin v kvantitativním poěru 22 : 33 : 33 : 9 : 3 (Smith. J. Antibiot. 28, 1000 až 1003, 1975). Komploex makrotetrolidů (tzv. polynaktin), obsahující dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 10 : 40 : 50 (Shichi a sp., U.S. Pat. 4, 843, 092, 1989) je vyráběn japonskou firmou Chugai Pharm. Co., Ltd., fermentací s použitím S. aureus jako produkčního mikroorganismu a úspěšně aplikován v praxi buď samostatně, nebo ve směsi s chemickými pesticidy například pro velkoplošnou ochranou čajovníkových nebo pomerančovníkových plantáží (Sagawa a sp., Japan Kokai Tokkyo Koho 7406656, 1974; Chugai Pharm. Co., Ltd., a Hokko Chern. Industry Co., Ltd., Japan Kokai Tokkyo Koho 5846006 a 5846009, 1983).

Patentově chráněný kmen S. aureus ani komerční preparát polynaktinu nejsou v ČSFR dostupné. Tetranaktin lze sice připravit chemickou syntézou (Schmidt a Werner, J. Chem. Soc. Chem: Commun.-1986 (13), 996 až 997), tento postup je však velmi pracný a nákladný a dává jen malé výtěžky požadované látky. Uvedené nevýhody byly odstraněny vypracováním nového postupu podle vynálezu, jehož podstatou je, že k submersní kultuře mikroorganismu Streptomyces griseus se na začátku kultivace přidá propionan sodný a hydrogenfosforečnan draselný a po 96 hodinách fermentace se izoluje hotový produkt. Přídavkem propionanu je inhibována biosyntéza nonaktinu, monaktinu a dinaktinu za současné stimulace tvorby trinaktinu a tetranaktinu. Přídavkem hydrogenfosforečnanu je eliminován inhibiční účinek propionanu na růst produkční kultury, což vede ke značnému zvýšení obou požadovaných makrotetrolidů. Způsob výroby biosyntetickou cestou podle vynálezu je jednodušší než způsob výroby cestou chemickou, protože probíhá od začátku až do konce samovolně ve fermentační nádobě bez zásahu lidské ruky až do doby, kdy je izolován hotový produkt.

Způsob výroby podle předloženého vynálezu je zřejmý z dále uvedených příkladů:

Příklad 1

a) Příprava inokula .

Kmen Streptomyces griseus J-249 (odvozený od půdního izolátu S. griseus LKS po opakované aplikaci UV světla) byl kultivován 10 dní při teplotě 28 °C na šikmých agarech se sporulační půdou s kvasinkovým a sladovým výtažkem (Shirling a Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol. 14, 313 až 340, 1966). Dobře vysporulované kultury byly uchovávány při 4 °C a používány k přípravě vegetativního inokula po dobu nejdéle tří měsíců.

Vegetativní inokulum bylo pěstováno na rotačním třepacím stroji (2,7 Hz) při teplotě 28 °C v 500 ml varných baňkách, plněných 60 ml fermentační půdy, která obsahovala 40 g rozpustného škrobu, 7 g lihovarných výpalků a 5 g sušených kvasnic vil vodovodní vody. Výchozí pH půdy po sterilisaci bylo 6,8 (před sterilisací bylo upraveno na 6,9 až 7,0). Celkový obsah anorganického fosfátu v půdě (stanovený metodou dle Weil-Malherbea a Greena, Biochem. J. 49, 286 až 292, 1951) byl 2,5 mM. Půda byla naočkována inokulem z agarové kultury, obsahujícím přibližně 6 x 10° spor. Vegetativní inokulum bylo kultivováno 24 hodin.

b) Příprava druhé vegetativní generace

Vlastní submersní kultivace podle vynálezu probíhala ve druhé vegetativní generaci na stejné fermentační půdě a za stejných podmínek jako při přípravě inokula po dobu 96 hodin. Kultury byly očkovány 3 ml vegetativního inokula.

c) Analytické stanovení makrotetrolidů

Po skončení kutlivace bylo mycelium ze dvou paralelních kultur druhé vegetativní generace (120 ml fermentační tekutiny) odděleno centrifugací, promyto 50 ml destilované vody a extrahováno 2 x 50 ml methanolu a 1 x 50 ml směsi methanolu a chloroformu (1 : 1). Spojené extrakty (150 ml) byly po přidání 1 g křemeliny (Celit No. 545) odpařeny do sucha. Odparek byl extrahován 40 ml směsi chloroformu a methanolu (95 : 5) a extrakt přefiltrován. Zbylý sediment na filtru byl extrahován 40 ml téže směsi a extrakt přefiltrován. Oba filtráty byly spojeny a odpařeny do sucha. Odparek byl rozpuštěn v 10 ml dichlormethanu a 1 ml roztoku byl použit pro kvantitativní spektrofotometrické stanovení (při 380 nm) celkového obsahu makrotetrolidů metodou dle Suzukiho a sp. (J. Antibiot. 24, 675 až 679, 1971), založenou na tvorbě komplexu těchto látek s pikranem sodným. Zbylých 9 ml roztoku bylo odpařeno do sucha a odparek byl rozpuštěn v 1 ml směsi methanolu a chloroformu (3 : 2). Roztok (1 až 5 μΐ, v závislosti na koncentraci makrotetrolidů ve vzorku) byl použit pro tenkovrstevnou chromatografii na deskách Kieselgel₆₀ (0,25 mm, 200 x 200 mm) v systému octan ethylnatý-chloroform-dichlormethan (7 : 3 : 1). Po dvojím vyvíjení byl chromatogram postříkán koncentrovanou kyselinou sírovou a zahřát při 150 °C po dobu 10 minut. Kvantitativní poměr mezi složkami makrotetrolidového komplexu byl stanoven densitometricky na přístroji Shimadzu CS-930 při 590 nm.

Za uvedených kultivačních podmínek dosahoval kmen S. griseus J-249 průměrné produkce 626 mg makrotetrolidového komplexu v 1 L fermantační tekutiny. Tento komplex obsahoval nonaktin, monaktin, dinaktin a trinaktin v poměru 8 : 27 : 57 : 8.

d) Stanovení suché hmot, mycelia -

Pro zjištění absolutních hodnot nárůstu kultur byla stanovena suchá hmot, mycelia, promytého destilovanou vodou a zbaveného interferující přítomnosti makrotetrolidů opakovanou extrakcí podle postupu, popsaného v odstavci c). Mycelium bylo sušeno na předem zvážených papírových filtrech dva dny při laboratorní teplotě (do dosažení konstantní hmot.).

Průměrná hmot, suchého mycelia z kultury, vyrostlé za podmínek, uvedených v odstavci b), byla 6,73 mg/1 ml.

Příklad 2

Bylo použito stejného postupu jako v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že do kultur druhé vegetativní generace byl na počátku kultivace přidán sterilní vodný roztok hydrogenfosforečnanu draselného (1 ml) v koncentraci 46 mg/60 ml půdy. Celkový obsah anorganického fosfátu se tímto způsobem zvýšil (ve srovnání s údajem v přikladu 1) z 2,5 nM na 7,0 mM.

Za těchto kultivačních podmínek dosahoval kmen S. griseus J-249 průměrné produkce 732 mg makrotetrolidového komplexu vil fermentační tekutiny, tj. o 16,9 % více než za podmínek, uvedených v příkladu 1. Komplex obsahoval nonaktin, monaktin, dinaktin a trinaktin v poměru 6 : 26 : 58 : 10. Průměrná hmot, suchého mycelia byla 7,58 mg/1 ml, t.j. o 12,6 % vyšší než u kultur, pěstovaných podle postupu v příkladu 1.

Příklad 3

Bylo použito stejného postupu jako v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že do kultur druhé vegetativní generace byl na počátku kultivace přidán sterilní vodný roztok propionanu sodného (2 ml) v koncentraci 500 mg na 60 mlo půdy. Ve srovnání s údaji v příkladu 1 se za těchto podmínek sice snížil celkový výtěžek makrotetrolidů na 353 mg na 1 1 fermentační tekutiny (tj. o 43,7 %), zárověň se však výrazně změnilo složení komplexu, který obsahoval monaktin, dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 3 : 9 : 32 : 56 (spolu se stopovým množstvím nonaktinu).

Průměrná suchá hmot, mycelia byla 5,78 mg/1 ml, tj. o 14,2 % nižší než u kultur, pěstovaných podle postupu v příkladu 1.

Příklad 4

Bylo použito stejného postupu jako v příkladu 1 pouze s tím rozdílem, že do kultur druhé vegetativní generace byly na počátku kultivace přidány sterilní vodné roztoky propionanu sodného (2 ml) v koncentraci 500 mg a hydrogenfosporečnanu draselného (1 ml) v koncentraci 46 mg/60 ml fermentační půdy.

Za těchto kultivačních podmínek dosahoval kmen S. griseus J-249 průměrné produkce 577 mg makrotetrolidového komplexu vil fermentační tekutiny, tj. jen o 7,3 % méně než při postupu, uvedeném v příkladu 1, a o 35,7 % více než za podmínek, uvedených v příkladu 3. Komplex obsahoval dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 2 : 26 : 72.

Průrměrná hmot, suchého mycelia byla 6,82 mg/1 ml, tj. o 1,3 % vyšší než u kultur, pěstovaných podle příkladu 1, a o 17,9 % vyšší než u kultur, získaných za podmínek, popsaných v příkladu 3.

Příklad 5

Kultivace byla provedena postupem, popsaným v příkladu 4 pouze s tím rozdílem, že fermentační půda byla rozplněna do 130 baněk po 100 ml, a do kultur druhé vegetativní generace, naočkovaných 5 ml inokula, bylo přidáno 833 mg propionanu sodného a 76,7 mg hydrogenfosforečnanu draselného/100 ml půdy.

Po skončení kultivace byla fermentační tekutina (13 1) zcentrifugována a oddělené mycelium bylo promyto destilovanou vodou (3 1) a extrahováno methanolem (4 x 2 1) a směsí chloroformu a methanolu (1:1) (4x21). Extrakty byly spojeny a po přidání Celitu (30 g) . odpařeny do sucha. Odparek byl etrahován směsí chloroformu a methanolu (95 : 5) (3 x 300 ml). Přefiltrované extrakty byly spojeny a odpařeny do sucha. Odparek (11,6 g) byl krystalován ze směsi hexanu a acetonu při teplotě - 15 °C. Bylo získáno 1,6 g krystalické směsi makrotetrolidů. Matečný louh byl odpařen do sucha. K odparku byl přidán methanol (15 ml) a voda (200 ml). Emulsní směs byla zalkalisována hydrouhličitanem sodným a extrahována chloroformem (4 x 10 ml). Extrakt byl odpařen do sucha a odparek překrystalován z methanolu. Bylo získáno 1,8 g krystalické směsi.

Celkový obsah makrotetrolidů, stanovený postupem podle příkladu 1 v hrubém extraktu mycelia, byl 4,5 g. Výtěžek krystalického produktu po isolaci byl 3,4 g, tj. 76 %.

Stejně jako v příkladu 4 nebyl v isolovaném produktu nalezen nonaktin a monaktin. Dinaktin byl přítomen jen ve stopovém množství. Hlavními složkami byly trinaktin a tetranaktin v poměru 1:3. Jejich identita byla potvrzena hmot, a NMR-spektrometrií ve srovnání s literárními údaji.

Přesto, že Streptomyces griseus není podle publikovaných údajů producentem tetranaktinu, způsobem výroby podle předloženého vynálezu se podařilo získat tetranaktin ve vysokém výtěžku (za současného potlačení nežádoucích méně aktivních složek makrotetrolidového komplexu) i u tohoto mikroorganismu. Složení výsledného produktu (trinaktin a tetranaktin v poměru 1 : 3, se stopovým množstvím dinaktinu) je dokonce výhodnější než u komerčně vyráběného japonského preparátu polynaktinu, který obsahuje dinaktin, trinaktin a tetranaktin v poměru 1:4:5.

Obecná účinnost a využitelnost postupů, uvedených v příkladech 3a 4, byla potvrzena také u osmi jiných kmenů S. griseus, produkujících makrotetrolidy, uchovávaných v Mikrobiologickém ústavu ČSAV. .

Claims

' Způsob výroby makrotetrolidových insekticidů trinaktinu a tetranaktinu obecného vzorce I

kde R^ = CH₃ nebo CH₂CH₃ a R₂ = = R₄ = CH₂CH₃, biosyntetickou cestou vyznačující se tím, že mikroorganismus streptomyces griseus je pěstován za submersních podmínek ve fermentační půdě se škrobem, lihovarskými výpalky a sušenými kvasnicemi, ke které bylo v nulté hodině kultivace přidáno 8,33 mg propionanu sodného a 0,77 mg hydrogenfosforečnanu draselného na 1 ml půdy.