CS277248B6 - Sposob kvantitativného hodnotenia účinku antibakteriálnych látok "in vitro" - Google Patents

Description

1 CS 277248 B6

Vynález sa týká postupu na "in vitro" hodnotenie účinkuantibakteriálnych látok na základe merania kvantitativných zmienrastu a rozmnožovania baktérií pomocou spektrofotometrickej meto-dy, pri ktorej množstvo za určitý čas živými organizmami vytvoře-né farebného produktu priamo závisí od ich počtu a metabolickejaktivity.

Hodnotenie počtu, rastu a rozmnožovania baktérií "in vitro"sa v praxi často využívá pri posudzovaní účinnosti antimikrobiál-nych látok. Jednou zo základných požiadaviek kladených na takétostanovenie je popři přesnosti a jednoduchosti aj jeho rýchlosú.

Pre rýchle stanovenie počtu, rastu a rozmnožovania baktériísa doposiaí vyvinulo niekolko postupov: 1. Priame mechanické, alebo elektronické počítanie častíc (Pring-le, J.R. Mor, J.R.: Methods for monitoring the growth of yeastcultures and for dealing with the dumping problém. Methods Cell.Biol., XI, 1975, 153-168). 2. Fotometrické meranie zmien zákalu (turbidimetria), aleborozptylu světla (nefelometria) prechádzajúceho suspenziou bakté-rií (Koch, A.L.: Theory of the angular dependence of light scat-tered by bacteria and similar-sized biological objects. J. Theor.Biol., 18, 1968, 133-156). 3. Meranie zmien elektrickéj impedancie v kultúře rastúcichmikroorganizmov (Ur. A., Brown, D.F.J.: Rapid detection of bacte-rial activity using impedance measurement. J. Biomed. Eng., 9,1974, 18-20, patent US 4528270). 4. Mikrokalorické meranie v kultúře rastúcich mikroorganizmov(Binford, J.S., Binford, L.S., Adler, P.: A semiautomated mikcro-calorimetric měthod of antibiotic sensitivity testing. Am. J.Clin. Pathol., 59, 1973, 86-94). 5. Meranie změny pH spósobenej skvasovaním glukózy v nepufrovanomkultivačnom médiu (čs. patent 215861), 6. Meranie množstva živými baktériami vytvořeného ATP (Karl,D.M.: Cellular nucleotide measurements and applications in micro-bial ecology, Microbiol. Rev., 44, 1980, 739-796). 7. Radiometrické metody (De Blanc, J.J., Charache, P., Wagner, H.N.: Automatic radiometric measurement of antibiotic effect onbacterial growth. Antimicrob. Agents Chemother., 2, 1972,360—366). 8. Kvantitativné meranie množstva enzýmov uvolněných rastúcimibaktériami do kultivačného prostredia pomocou fluorogénnychsubstrátov (Philips, I., Waren, C., Waterworth, P.M. : Determina—tion of antibiotic sensitivities by Sensititre systém. J. Clin.Pathol., 31, 1978, 531-535).

Metody podlá uvedených príkladov majú viaceré nedostatky, ktoré spočívajú najma v nutnosti používal suspenziu mikroorganiz- mov o hustotě až 3 x 108/ml (postupy 2,4), zložitosti postupu a prácnosti metody (1, 4, 6), požiadavke na zložité vyhodnocova- CS 277248 B6 2 cie zariadenie (3, 4,, 6, 7, 8), nutnosti pracoval s radioaktív-nymi látkami (7) a komplikovanom rozlišeni medzi stupňom meranejaktívnej odpovede od pozadia a nešpecifických artefaktov (8).

Uvedené nedostatky odstraňuje postup kvantitativného hodno-tenia účinku antibakteriálnych látok "in vitro" podía vynálezu,ktorý spočívá v kvantitatívnom hodnotení zmien počtu, rastua rozmnožovania živých, metabolicky aktívnych baktériálnych buni-ek na základe nimi spósobenej redukcie soli tetrazóliového farbi-va. Pri reakcii, ktorá prebieha výlučné v živých buňkách, dochád-za k interakcii medzi tetrazóliovou solou a cytochrómovým systé-mom bakteriálnej buňky, pričom sa tetrazóliová sol redukuje zavzniku farebného produktu, ktorého množstvo je úměrné počtu a me—tabolickej aktivity přítomných baktériálnych buniek. K výhodám postupu podlá vynálezu v porovnaní s doterajšimiprístupmi patří vysoká citlivost (na stanovenie stačí už hustota bakteriálnej suspenzie 2 x 104/ml), reakcie prebieha výlučnév živých buňkách, minimálny potřebný reakčný čas sa podlá metabo-lickej aktivity pre váčšinu baktérií pohybuje v rozmedzí 1 až 30minút. .Metodický postup je jednoduchý a nevyžaduje žiadne sepa-račné kroky, co spolu so spektrofotometrickým spósobom vyhodnoco-vania vytvára vhodné podmienky pre jednoduchú automatizáciu.Finančně náklady na stanovenie sú nižšie než pri porovnatelnýchmetodách.

Možnosti použitia postupu podlá vynálezu sú objasněné napríkladoch rýchleho stanovenia citlivosti baktérie Escherichiacoli na rožne koncentrácie bakteriostatického antibiotika tetra-cyklinu. (A) a bakteriocídneho antibiotika s rýchlym nástupomúčinkom kolicínu (B). Příklad A. Hodnotenie antibakteriálneho účinku tetracyklínu.

Do jednotlivých jamiek mikrotestovej platničky s 96 jamkamis plochým dnom sa napipetuje 100 ul bojónu podláMueller-Hintonovej, s klesajúcimi koncentráciami tetracyklínu(256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 a 0 ug/ml). V tomto bujónesa připraví suspenzia z 18 hodinovej kultúry baktérie Escherichia coli o hustotě IxlO6 baktérií/ml. Do jamiek s antibiotikom sapřidá 100 ul bakteriálnej suspenzie, čím sá dosiahnu výslednékoncentrácie antibiotika 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 0,25a 0 ug/ml. Kontrolně jamka obsahuje namiesto bakteriálnej suspen-zie len čistý Mueller-Hintonovej bujón. Platnička sa umiestni do termostatu a inkubuje pri 35 °C 120 minút. Po inkubácii sa dovšetkých jamiek přidá; 20 ul 3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-dife-nyl tetrazolium bromidu vo fyziologickom roztoku, koncentrácia2,5 mg/ml) a inkubuje sa dalších 15 minút v termostate pri 35 ’C. Potom sa do všetkých jamiek přidá 50 ul solubilizačnéhoroztoku (20% SDS v 50% vodnom roztoku Μ,Ν-dimetylformamidu, pHupravené HC1 a kyselinou octovou na 4,7). Obsah j amiek sa premie- ša. a platničky sa inkubujú. dalších 5 minút pri 35 "C. Absorbanciav jednotlivých jamkách sa zmeria pomocou spektrofotometra (ELISA;readerj pri 550 nm (specifická absorbancia) a pri 630 nm (nešpe—

Claims (1)

1. 3 CS 277248 B6 cifická absorbancia). Namerané korigované hodnoty absorbancie^E550-E630^ sa vynesú v lineárnom zobrazení oproti koncentrácii antibiotika a zostrojí sa příslušná křivka (obr. 1). Účinnostantibiotika na testovaný bakteriálny kmeň sa posúdí z priebehuzískanéj křivky. Příklad B. Hodnotenie^ antibakteriálneho účinku kolistínu. Postupuje sa zhodne ako v příklade A, len antibiotikumtetracyklín sa nahradí antibiotikom kolistín. Hodnotenie výsled-kov je rovnaké ako v příklade A, pričom pokles absorbancie na"nulovú hodnotu (obr. 2) znamená usmrtenie baktérií vo vyšetřova-né j suspenzii. PATENTOVÉ NÁROKY Spósob kvantitativného hodnotenia účinku antibakteriálnychlátok "in vitro", pri ktorom sa za vhodných rastových podmienokparalelné porovnává rast a rozmnožovanie kontrolnej a róznymikoncentráciami antimikrobiálnej látky ovplyvnený bakteriálnychkultúr, vyznačený tým, že sa kvantitativné hodnotenie životnostia rastových vlastnosti baktérií sa do kultivačného prostrediapřidá vo vodě rozpustná sol tetrazóliového farbiva, výhodné3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid v koneč-né j koncentrácii 0,005 až 5,0 g/1, výhodné 0,25 g/1, redukciapřidaného tetrazoliového farbiva prebieha vo všetkých kultúrachparalelné a presne ohraničená dobu, výhodné 15 minút, po ktorejsa reakcia ukončí a vo vodě rozpustný farebný produkt sa solubi-lizlue přidáním zmesi detergentu a organického rozpúštadla,množstvo vytvořeného farebného produktu sa kvantitativné určíspektrofometricky, výhodné v oblasti jeho absorpčného maxima,a podía množstva vytvořeného· farebného produktu sa určí končen-trácia antimikrobiálnej látky potřebná pre dosiahnutie požadova-ného bakteriostatického, alebo bakteriocídneho účinku na vyšetro-vanú kultúru mikroorganizmov. 1 výkres