RU2537128C1 - Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов - Google Patents

Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов Download PDF

Info

Publication number
RU2537128C1
RU2537128C1 RU2013118536/15A RU2013118536A RU2537128C1 RU 2537128 C1 RU2537128 C1 RU 2537128C1 RU 2013118536/15 A RU2013118536/15 A RU 2013118536/15A RU 2013118536 A RU2013118536 A RU 2013118536A RU 2537128 C1 RU2537128 C1 RU 2537128C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
wells
adhesion
ligand
microorganism
suspension
Prior art date
Application number
RU2013118536/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013118536A (ru
Inventor
Сергей Николаевич Куликов
Дмитрий Александрович Долбин
Ренат Марсович Хайруллин
Рустэм Салахович Фассахов
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Сергей Николаевич Куликов
Рустэм Салахович Фассахов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Сергей Николаевич Куликов, Рустэм Салахович Фассахов filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2013118536/15A priority Critical patent/RU2537128C1/ru
Publication of RU2013118536A publication Critical patent/RU2013118536A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2537128C1 publication Critical patent/RU2537128C1/ru

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской бактериологии и медицинской микологии, и описывает способ количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды. Способ включает предварительную сорбцию в лунках полистиролового планшета специфического лиганда, выбранного из ряда: гемоглобин, миоглобин, коллаген, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А, добавление в лунки планшета с сорбированным лигандом суспензии клеток микроорганизма, инкубирование суспензии клеток в лунках планшета в течение 15 минут, отбор аликвоты суспензии из лунки и добавление ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия, при этом оценку уровня адгезии клеток бактерий проводят путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм при сравнении их с контрольными вариантами лунок, не содержащих лиганд. Изобретение характеризуется высокой скоростью проведения определения уровня адгезии микроорганизмов к лигандам различной природы, высокой воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов и может быть использовано для in vitro характеристики вирулентных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды, по уровню их адгезии к лигандам различной природы. 7 табл., 7 пр.

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии и медицинской микологии для количественной оценки адгезивных свойств условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от человека и объектов окружающей среды, для характеристики их вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к лигандам различной природы.
Существуют различные подходы в количественном определении уровня адгезии клеток микроорганизмов (бактерий и дрожжеподобных грибов) к лигандам различной природы.
Известен способ количественного определения адгезии клеток микроорганизмов к коллагену и фибронектину, основанный на окрашивании специфически адгезированных клеток красителем - кристаллическим фиолетовым, однако, такой способ требует дофиксации клеток с помощью глутарового альдегида, использования дополнительной процедуры для разрушения клеток с использованием детергента Triton Х-100 [1].
Более простым представляется подход с использованием мембран, в которых заключен соответствующий лиганд (например, гемоглобин) [2]. В этом случае клетки микроорганизмов связываются с мембраной, несущей лиганды, с помощью специфических адгезинов, расположенных на поверхности их клеточных стенок. Количественный уровень адгезии в этом случае определяется при подсчете количества клеток микроорганизмов, адгезированных на мембране с лигандами, либо по уменьшению оптической плотности суспензии клеток микроорганизма после взаимодействия с мембраной. Однако такой подход требует отработанного подхода в изготовлении мембран с использованием специфических компонентов - нитроцеллюлозы, органических растворителей. На практике требуется использование сравнительно большого количества мембран (для достижения большой площади рабочей поверхности - нескольких квадратных сантиметров), а также большого объема (несколько миллилитров) суспензии микроорганизмов, что не всегда позволяет использовать этот метод при малом количестве биоматериала, например при наличии одной небольшой колонии микроорганизма, выросшей на твердой (агаризованной) питательной среде.
Наиболее близким к нашему изобретению можно отнести способ определения адгезии микроорганизмов к лигандам, сорбированных на полистироловую поверхность 96-луночных планшет [3]. Этот подход позволяет избавиться от применения различных, в том числе небезопасных, веществ, а также свести работу к использованию микрообъемов (порядка 100 мкл), не требующих большого количества исходного биоматериала. Однако описанное изобретение обладает рядом недостатков. Во-первых, для количественной оценки адгезии клеток микроорганизмов предлагается либо добавление в лунки планшета (содержащие адгезированные клетки) жидкой питательной среды, либо отбор аликвоты суспензии микроорганизмов из лунок планшета в жидкую (или посев на твердую) питательную среду с последующей инкубацией и оценкой роста (подсчета образовавшихся колоний) культуры микроорганизмов, что позволяет получить результаты только по прошествии существенного количества времени (от 6 до 48 ч в зависимости от условий инкубации и вида микроорганизма). Кроме того, в этом случае не учитывается возможность различия в скорости роста у разных штаммов одного и того же вида микроорганизма, что может искусственно увеличивать или нивелировать реальное различие в адгезивном потенциале конкретных штаммов. Во-вторых, использование для количественной оценки адгезированных клеток микроорганизмов определения активности бактериальных ферментов у адгезированных клеток является практически непригодным в силу вариации самой активности (количества) ферментов у различных штаммов одного и того же вида микроорганизма [4] и, соответственно, отсутствия абсолютной корреляции между уровнем ферментативной активности и уровнем адгезивного потенциала. Этот подход также может увеличивать или нивелировать реальное различие в адгезивном потенциале сравниваемых штаммов.
В связи с этим задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющая быстро, менее чем за 1 час, с использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, в микрообъемах, без дополнительного использования химических реагентов, количественно определять уровень адгезии клеток микроорганизмов (бактерий и дрожжеподобных грибов) к лигандам различной природы.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает предварительное сорбирование в лунках полистиролового планшета специфического лиганда, добавление в лунки планшета суспензии клеток микроорганизмов, непродолжительную инкубацию суспензии клеток в лунках планшета, последующий отбор аликвоты суспензии из лунки и добавление ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли (например, 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия), с последующей оценкой уровня адгезии клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм. На основании полученных данных по оптической плотности определяют индекс адгезии. Индекс адгезии (в процентах) высчитывают по формуле:
ИА=100-100×(ОП600опыт/ОП600контроль),
где
ОП600опыт - значение оптической плотности суспензии при 600 нм, отобранной из лунки, содержащей лиганд;
ОП600контроль - значение оптической плотности суспензии при 600 нм, отобранной из лунки не содержащей лиганд.
Чем выше индекс адгезии, тем выше уровень адгезии штамма микроорганизма к выбранному лиганду.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка быстрого способа определения уровня адгезии микроорганизмов к лигандам различной природы, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, использованием минимального количества биомассы микроорганизмов, в микрообъемах, отсутствием необходимости использования опасных химических реагентов.
Пример 1. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus к гемоглобину. В лунки планшета предварительно сорбируют лиганд - человеческий гемоглобин. Для этого гемоглобин растворяют в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 из расчета 20 мкг/мл. Приготовленный раствор в объеме 50 мкл вносят в лунки планшета, инкубируют в течение 24 ч при 4°C. После этого лунки планшета трижды промывают 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,05% твин-20, заливая по 100 мкл в каждую лунку, затем планшет осушаем путем вытряхивания остатка жидкости. Подготовленные таким образом планшеты можно хранить в течение года при 4°C в сухих условиях. В готовые лунки планшета вносим по 200 мкл суспензии Staphylococcus aureus в 0,2 М натрий-фосфатном буферном растворе с рН 7,4 с оптической плотностью при 600 нм в диапазоне от 0,500 до 0,600. Инкубируем в течение 15 минут, после этого отбираем 100 мкл суспензии из лунки и переносим ее в другую лунку, содержащую 100 мкл 0,2 М натрий-фосфатный буферный раствор с рН 7,4, перемешиваем разведенную суспензию и далее измеряем оптическую плотность полученных разведенных суспензий при 600 нм. В качестве контрольных вариантов используются лунки, не содержащие гемоглобин. Результаты представлены в таблице 1.
Пример 2. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют миоглобин. Результаты представлены в таблице 2.
Пример 3. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют коллаген. Результаты представлены в таблице 3.
Пример 4. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют фибронектин. Результаты представлены в таблице 4.
Пример 5. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют фибриногену. Результаты представлены в таблице 5.
Пример 6. Определение уровня адгезии штаммов Staphylococcus aureus проводят аналогично примеру 1, но в качестве специфического лиганда, сорбированного на планшете, используют иммуноглобулин A (IgA). Результаты представлены в таблице 6.
Пример 7. Определение уровня адгезии проводят аналогично примеру 1, но в качестве микроорганизма используют дрожжеподобный гриб Candida albicans. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 1
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к гемоглобину
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S.aureus АТСС 25923
контроль гемоглобин контроль гемоглобин контроль гемоглобин
значение ОП 600 нм
0,300 0,280 0,310 0,285 0,315 0,269
Индекс адгезии, %
6,7 8,0 14,6
Таблица 2
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к миоглобину
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль миоглобин контроль миоглобин контроль миоглобин
значение ОП 600 нм
0,300 0,283 0,310 0,288 0,315 0,270
Индекс адгезии, %
5,6 7,0 14,2
Таблица 3
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к коллагену
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль коллаген контроль коллаген контроль коллаген
значение ОП 600 нм
0,300 0,285 0,310 0,290 0,315 0,279
Индекс адгезии, %
5,0 6,4 11,4
Таблица 4
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к фибронектину
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль фибронектин контроль фибронектин контроль фибронектин
значение ОП 600 нм
0,300 0,288 0,310 0,295 0,315 0,287
Индекс адгезии, %
4,0 4,8 8,8
Таблица 5
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к фибриногену
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus АТСС 25923
контроль фибриноген контроль фибриноген контроль фибриноген
значение ОП 600 нм
0,300 0,285 0,310 0,288 0,315 0,285
Индекс адгезии, %
5,0 7,0 9,5
Таблица 6
Определение уровня адгезии клеток Staphylococcus aureus к IgA
Штамм S. aureus с кожи здорового человека Штамм S. aureus с кожи человека с атопическим дерматитом
S. aureus ATCC 25923
контроль IgA контроль IgA контроль IgA
значение ОП 600 нм
0,300 0,291 0,310 0,297 0,315 0,295
Индекс адгезии, %
3,0 4,1 6,3
Таблица 7
Определение уровня адгезии клеток Candida albicans к гемоглобину
Штамм С.albicans с кожи здорового человека Штамм С.albicans с кожи человека с атопическим дерматитом
Candida albicans музейный штамм №4
контроль гемоглобин контроль гемоглобин контроль гемоглобин
значение ОП 600 нм
0,300 0,275 0,310 0,280 0,315 0,273
Индекс адгезии, %
8,3 9,6 13,3
ЛИТЕРАТУРА
1. Pynnonen M., Stephenson R.E., Schwartz K., Hemandez M., Boles B.R. / Hemoglobin promotes Staphylococcus aureus nasal colonization // PLoS Pathogens, 2011.
2. Лисовская С.А. / Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук «Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans» // Казань, 2008. 25 с.
3. Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Мустафин И.Г. / Способ определения адгезии Staphylococcus spp.к гемопротеинам // Патент RU №2393229.
4. Баязитова Л.Т., Тюрин Ю.А., Куликов С.Н., Долбин Д.А., Фассахов Р.С. / Исследование антибактериальной активности препарата «Скин-кап» в отношении Staphylococcus aureus при местной терапии атопического дерматита // Практическая Медицина, 2009, №3 (35), с.89-91.

Claims (1)

  1. Способ определения адгезивного потенциала микроорганизмов, характеризующийся тем, что в лунках полистиролового планшета сорбируют специфический лиганд, выбранный из ряда: гемоглобин, миоглобин, коллаген, фибриноген, фибронектин, иммуноглобулин А, добавляют в лунки планшета с сорбированным лигандом суспензию клеток микроорганизма, проводят инкубацию суспензии клеток в лунках планшета в течение 15 минут, отбирают аликвоту суспензии из лунки и добавляют ее в лунки другого или этого же планшета, содержащие водный раствор соли 0,5% натрия хлористого или 0,2 М фосфата натрия и оценивают уровень адгезии клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности полученных разбавленных суспензий при длине волны 600 нм при сравнении их с контрольными вариантами лунок, не содержащих лиганд.
RU2013118536/15A 2013-04-22 2013-04-22 Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов RU2537128C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013118536/15A RU2537128C1 (ru) 2013-04-22 2013-04-22 Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013118536/15A RU2537128C1 (ru) 2013-04-22 2013-04-22 Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013118536A RU2013118536A (ru) 2014-11-10
RU2537128C1 true RU2537128C1 (ru) 2014-12-27

Family

ID=53287582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013118536/15A RU2537128C1 (ru) 2013-04-22 2013-04-22 Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2537128C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2630060C1 (ru) * 2016-03-29 2017-09-05 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Тверской ГМУ Минздрава России) Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2360969C1 (ru) * 2007-11-06 2009-07-10 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Вятская государственная сельскохозяйственная академия (ФГОУ ВПО ВГСХА) Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов
RU2393229C1 (ru) * 2008-12-29 2010-06-27 Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам
RU2490329C1 (ru) * 2012-02-22 2013-08-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2360969C1 (ru) * 2007-11-06 2009-07-10 Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Вятская государственная сельскохозяйственная академия (ФГОУ ВПО ВГСХА) Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов
RU2393229C1 (ru) * 2008-12-29 2010-06-27 Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам
RU2490329C1 (ru) * 2012-02-22 2013-08-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Благонравова А.С., Афонин А.Н., Воробьева О.Н., Широкова И.Ю. Сравнительный анализ адгезивности микроорганизмов, выделенных от больных и с объектов внешней среды лечебно-профилактических учреждений. Медицинский Альманах N 5 (18), "Эпидемиология", сентябрь 2011, с.215-218. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2630060C1 (ru) * 2016-03-29 2017-09-05 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Тверской ГМУ Минздрава России) Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2

Also Published As

Publication number Publication date
RU2013118536A (ru) 2014-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sayin et al. Antibacterial and antibiofilm effects of boron on different bacteria
Eloff Avoiding pitfalls in determining antimicrobial activity of plant extracts and publishing the results
Pitts et al. A microtiter-plate screening method for biofilm disinfection and removal
Mihai et al. Identification and phenotypic characterization of the most frequent bacterial etiologies in chronic skin ulcers
Sachivkina et al. The evaluation of intensity of formation of biomembrane by microscopic fungi of the Candida genus
Ueda et al. Characterization of the ability to form biofilms by plant-associated Pseudomonas species
Slade et al. An in vitro collagen perfusion wound biofilm model; with applications for antimicrobial studies and microbial metabolomics
Azevedo et al. Interaction between atypical microorganisms and E. coli in catheter-associated urinary tract biofilms
Afonso et al. In vitro assessment of inter-kingdom biofilm formation by bacteria and filamentous fungi isolated from a drinking water distribution system
Paleczny et al. The high impact of Staphylococcus aureus biofilm culture medium on in vitro outcomes of antimicrobial activity of wound antiseptics and antibiotic
Albayaty et al. Penetration of topically used antimicrobials through Staphylococcus aureus biofilms: a comparative study using different models
Xu et al. Regulatory network controls microbial biofilm development, with Candida albicans as a representative: From adhesion to dispersal
Dadawala et al. Assessment of Escherichia coli isolates for in vitro biofilm production
Eze et al. Combined effects of low incubation temperature, minimal growth medium, and low hydrodynamics optimize Acinetobacter baumannii biofilm formation
RU2537128C1 (ru) Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов
Araniciu et al. EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL AND ANTI-BIOFILM ACTIVITY OF SOME 4, 2 AND 5, 2 BISTHIAZOLES DERIVATIVES.
RU2393229C1 (ru) Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам
RU2296163C2 (ru) Способ оценки специфической активности бактериофагов
Ghafourian et al. Comparative analysis of biofilm development among MRSA and MSSA strains
Oja et al. Revisiting an agar-based plate method: What the static biofilm method can offer for biofilm research
Sebaa et al. Ex vivo decontamination of yeast-colonized dentures by iodine–thiocyanate complexes
CN101271117A (zh) 浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法
Spink et al. Para-aminobenzoic acid production by staphylococci
Shivaji et al. Differential Susceptibility of Mixed Polymicrobial Biofilms Involving Ocular Coccoid Bacteria (Staphylococcus aureus and S. epidermidis) and a Filamentous Fungus (Fusarium solani) on Ex Vivo Human Corneas
Xiong Spatial Structure Modulates Persister Formation in a Synthetic Cross-Feeding Bacterial Community

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150423