RU2490329C1 - СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ - Google Patents
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2490329C1 RU2490329C1 RU2012106638/10A RU2012106638A RU2490329C1 RU 2490329 C1 RU2490329 C1 RU 2490329C1 RU 2012106638/10 A RU2012106638/10 A RU 2012106638/10A RU 2012106638 A RU2012106638 A RU 2012106638A RU 2490329 C1 RU2490329 C1 RU 2490329C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fibrinogen
- fibronectin
- medium
- adhesion
- strains
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен способ количественного определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену, в ходе которого исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками фибронектином, фибриногеном в жидкой среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют количество адгезированных стафилококков или путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды, или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Благодаря хорошей воспроизводимости результатов, высокой чувствительности, удобству проведения реакции непосредственно в лунках планшета и возможности определения показателя специфической адгезии штаммов к фибронектину и фибриногену изобретение может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков к белкам человека фибронектину (Fn) и фибриногену (Fb) для характеристики вирулентных свойств in vitro по уровню специфической адгезии к данным белкам. 3 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков к белкам человека фибронектину (Fn) и фибриногену (Fb), для характеристики вирулентных свойств in vitro no уровню специфической адгезии к данным белкам.
Вирулентные виды стафилококков, в частности патогенный вид S. aureus, экспрессируют на поверхности микробной клетки рецепторы к фибронектину и фибриногену.
Прототипом данного изобретения является "Способ определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам" (патент на изобретение №2393229 от 27.06.2010, приоритет от 29.12.2008 г.).
Отличительной особенностью данного способа от прототипа является определение адгезии к двум протеинам и определение уровня специфической адгезии к этим белкам в сравнении с контролем (неспецифической адгезии к полистиролу). Данный способ адгезии не требует поддержания условий и расходных реагентов, необходимых для работы с клеточными культурами тканей, на модели которых проводится оценка адгезии условно-патогенных бактерий, которые предложены в качестве подобных способов определения адгезии, например, Способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae путем контакта срезов легких мышей с пневмококком (RU, (21) 96100972 МПК C12Q 1/14, 1/20. (22) 1996.01.16. (54) Способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae и ее блокирования.
Целью заявленного изобретения является разработка стандартизуемого способа, позволяющего количественно определять показатель специфической адгезии стафилококков к белкам человека (фибронектину и фибриногену) для характеристики их вирулентного потенциала.
Сущность изобретения состоит в том, что исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками фибронектином, фибриногеном и в лунках, не содержащих иммобилизованных белков, в жидкой среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют адгезированные стафилококки:
1) путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды, или
2) путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или
3) путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа количественной оценки специфической адгезии к фибронектину и фибриногену, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, удобством проведения реакции непосредственно в лунках планшета и возможностью определения показателя специфической адгезии штаммов к фибронектину и фибриногену.
Преимущества заявленного к патентованию способа определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену является определение показателя специфической адгезии штаммов стафилококка, принадлежащих к различны вирулентным или авирулентным типам к данным белкам человека, высокая чувствительность способа за счет регистрации ферментативной активности адгезированных бактерий.
Способ осуществляется следующим образом: суспензию культуры стафилококка в концентрации 1 млн. м.т./мл инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными фибронектином и фибриногеном, а также в лунках полистиролового планшета, не содержащих иммобилизованные белки, в жидкой питательной среде 199 в течение 1 часа, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и последующим определением количества адгезированных стафилококков путем учета выросших клеток в питательной среде, или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведении, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Адгезивная активность выражается в условных единицах.
На базе лаборатории иммунологии и микробиологии ФБУН «КНИИЭМ» Роспотребнадзора проведен анализ адгезивности клинических изолятов стафилококков, выделенных со слизистой носа, кожи и из мокроты пациента с очаговой бронхопневмонией (штамма S. aureus И-78) и эталонного штамма S. aureus ATCC №25923 патентуемым способом. Было установлено, что клинические штаммы золотистого стафилококка, выделенные со слизистой носа, кожи и мокроты пациента с очаговой бронхопневмонией, характеризуются достоверно высокими показателями адгезии к данным протеинам по сравнению со штаммами, выделяемыми с поверхности кожи и слизистых в норме.
Примеры осуществления способа определения адгезии staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену:
Пример 1. Определение адгезивной способности стафилококков, выделенных со слизистых, кожи и мокроты при воспалительных процессах. Исследуемую культуру стафилококка разводили до концентрации 1 млн м.т. на 1 мл 199 средой и вносили в объеме 200 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета с иммобилизованным фибронектином (Fn), фибриногеном (Fb), и в лунки полистиролового планшета, не иммобилизованные белками (К-контроль), инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 часа, далее удаляли содержимое лунок и отмывали трехкратно 199 средой, содержащей 0,05% твин-20, и физиологическим раствором, лунки осушали и в каждую лунку вносили по 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор H2O2), через 10 минут вносили 50 мкл 4% раствора молибдата аммония и исследовали фотометрически при 414 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан», определяли показатели: ОП (Fn), ОП (Fb) и ОП (К) контроль. Параллельно трем пробам определяли фоновую оптическую плотность - ОП (Ф), для этого в лунки полистиролового планшета, не иммобилизованные белками, не вносили пробы культуры стафилококка, а добавляли 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор H2O2) и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония, фотометрировали при 414 нм. Установка на ноль фотометра проводилась по лункам, содержащим 150 мкл дистилированной воды и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония.
Расчет показателя адгезии штаммов проводили по формуле:
ПА (Fb)=(ОП (Fb)-ОП (К))-ОП (Ф) - показатель специфической адгезии к фибриногену.
ПА (Fn)=(ОП (Fn)-ОП (К))-ОП (Ф) - показатель специфической адгезии к фибронектину.
Результаты испытания адгезии клинических штаммов стафилококков и эталлоного штамма S. aureus ATCC №25923 данным способом представлены в таблице 1.
Пример 2. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации лунки фотометрировали при 595 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан». Определяли показатели оптической плотности, в исследуемых лунках: ОП (Fn), ОП (Fb) и ОП (Ф) - оптическую плотность в лунке, в которую клеточная культура не вносилась. Показатель адгезии (ПА) рассчитывали по формуле:
ПА(Fn)=(OП(Fn)-ОП(К))-ОП(Ф)
ПА(Р)=(ОП(Pb)-ОП(К))-ОП(Ф)
Результаты представлены в таблице 2.
Пример 3. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки средой 199 с твином-20 в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации в термостате из лунки отбирали по 50 мкл питательной среды, готовили десятикратные разведения на стерильном физиологическом растворе и из каждого разведения высевали методом газона на кровяной агар. Через 12 часов подсчитывают количество колоний на чашках и рассчитывают количество КОЕ/мл в соответствии с разведением. Результаты исследования адгезии изолятов стафилококка представлены в таблице 3.
| Таблица 1 | ||
| Показатели адгезии штаммов стафилококка, к примеру 1 | ||
| Вид микроорганизма | ПА(Fn), М±m | ПА(Fb), М±m |
| S. aureus (со слизистой носа носителей) | 0,81±0,07 | 0,52±0,06 |
| S. aureus (кожа пациентов с АтД) | 0,9±0,06 | 0,76±0,05 |
| S. aureus (со слизистой пациентов с CAP) | 0,73±0,05 | 0,63±0,05 |
| S. aureus И-78 | 0,87±0,09 | 0,71±0,07 |
| S. aureus ATCC N 25923 | 0,48±0,07 | 0,5±0,02 |
| S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц) | 0,28±0,07 | 0,42±0,3 |
| S. epidermidis (с кожи здоровых лиц) | 0,82±0,05 | 0,91±0,05 |
| Таблица 2 | ||
| Показатели адгезии штаммов стафилококка, к примеру 2 | ||
| Вид микроорганизма | ПА(Fn), М±m | ПА(Fb), М±m |
| S. aureus (со слизистой носа носителей) | 0,67±0,07 | 0,71±0,02 |
| S. aureus (со слизистой пациентов с CAP) | 0,54±0,05 | 0,5±0,02 |
| S. aureus И-78 | 0,88±0,09 | 0,75±0,03 |
| S. aureus ATCC N 25923 | 0,68±0,04 | 0,7±0,02 |
| S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц) | 0,35±0,07 | 0,27±0,2 |
| S. epidermidis (кожа здоровых лиц) | 0,22±0,05 | 0,31±0,03 |
| S. hominis (кожа здоровых лиц) | 0,14±0,02 | 0,15±0,02 |
| Таблица 3 | |||
| Показатели адгезии штаммов стафилококка к примеру 3 | |||
| Вид микроорганизма | ПА(Fn) (КОЕ/на мл) | ПА(Fb) (КОЕ/на мл) | ПА(Ф) (КОЕ/на мл) |
| S. aureus (со слизистой носа носителей) | 2,3×106 | 2,8×106 | 1,0×102 |
| S. aureus (кожа пациентов с АтД) | 3,3×106 | 2,1×106 | 1,2×102 |
| S. aureus (со слизистой пациентов с CAP) | 4,0×106 | 3,6×106 | 2,0×102 |
| S. aureus И-78 | 4,0×106 | 5,1×106 | 2,0×102 |
| S. aureus ATCC N 25923 | 3,8×106 | 4,0×106 | 1,0×102 |
| S. epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц) | 1,0×106 | 2,0×106 | 1,2×102 |
| S. epidermidis (кожа здоровых лиц) | 1,1×106 | 2,0×106 | 1,2×102 |
Claims (1)
- Способ количественного определения адгезии Staphylococcus spp. к фибронектину и фибриногену, в ходе которого исследуемую культуру стафилококка в концентрации 1 млн м. т. инкубируют в лунках полистиролового планшета с отдельно иммобилизованными белками - фибронектином и фибриногеном, в питательной среде 199 в течение 60±15 мин, далее удаляют не адгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют количественный показатель адгезии исследовательских штаммов стафилококков отдельно к фибриногену-ПA(Fb) и фибронектину ПА (Fn) по формулам (№1 или №2):
ПА(Fb)=(ОП(Fb)-ОП(К))-ОП(Ф) №1;
ПА(Fb)=(ОП(Fn)-ОП(К))-ОП(Ф) №2,
где ОП(Fn), ОП(Fb) - оптическая плотность в лунках планшета с иммобилизованными белками - фибронектином и фибриногеном соответственно; ОП(К) - оптическая плотность в лунках планшета с не иммобилизованными белками; ОП(Ф) - фоновая оптическая плотность, измеряемая при определении активности каталазы у адгезированных штаммов, и которая составляет оптическую плотность субстратного раствора (150 мкл 0,03% раствора Н2О2 и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония) при 414 нм; для этого проводят учёт выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды с помощью фотометра, или проводят подсчет колоний клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или определяют активность каталазы у адгезированных штаммов стафилококков.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012106638/10A RU2490329C1 (ru) | 2012-02-22 | 2012-02-22 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012106638/10A RU2490329C1 (ru) | 2012-02-22 | 2012-02-22 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2490329C1 true RU2490329C1 (ru) | 2013-08-20 |
Family
ID=49162809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012106638/10A RU2490329C1 (ru) | 2012-02-22 | 2012-02-22 | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2490329C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2537128C1 (ru) * | 2013-04-22 | 2014-12-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2393229C1 (ru) * | 2008-12-29 | 2010-06-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора | Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам |
-
2012
- 2012-02-22 RU RU2012106638/10A patent/RU2490329C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2393229C1 (ru) * | 2008-12-29 | 2010-06-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора | Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2537128C1 (ru) * | 2013-04-22 | 2014-12-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boynukara et al. | Classical enterotoxigenic characteristics of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine subclinical mastitis in Van, Turkey | |
| RU2505813C1 (ru) | Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам | |
| RU2393229C1 (ru) | Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам | |
| Nakalema et al. | Prevalence patterns of bacterial urinary tract infections among febrile children under-five years of age at Kampala International University Teaching Hospital | |
| RU2490329C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ Staphylococcus spp. К ФИБРОНЕКТИНУ И ФИБРИНОГЕНУ | |
| RU2296163C2 (ru) | Способ оценки специфической активности бактериофагов | |
| Nwankwo et al. | Evaluation of antimicrobial activity of prodigiosin produced from Serratia marcescens against some pathogenic bacteria | |
| Zomorodian et al. | Analysis of beta-hemolysis in human blood agars by Streptococcus pyogenes | |
| Windahl | Bacterial infections in dogs with special reference to urinary tract infections, surgical site infections and methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius | |
| RU2490328C2 (ru) | Способ выявления микобактерий туберкулеза из воздушной среды | |
| RU2337360C1 (ru) | Способ определения бактериостатических свойств антител к факторам вирулентности burkholderia pseudomallei | |
| Nakalema et al. | Susceptibility patterns of bacterial urinary tract infections among febrile children under-five years of age at Kampala International University Teaching Hospital | |
| RU2587636C1 (ru) | Способ количественной оценки литической активности бактериофагов | |
| Maroff | Determination of the inhibitory activity of some biological extracts agaiast multi rrsistans antibiotic Staphylococcus specis which and isolated from different sources of infechtion | |
| RU2537128C1 (ru) | Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов | |
| RAKOTONDRAOELINA et al. | Coagulase Negative Staphylococci Isolated from Blood Cultures at Anosiala University Hospital Center, Antananarivo | |
| Sismaet | Development and Optimization of Electrochemical Sensors to Detect Bacterial Pathogens for Point-Of-Care Applications | |
| RU2460802C1 (ru) | Способ идентификации yersinia enterocolitica | |
| Ionescu et al. | Frequency and phenotypic virulence features of Streptococcus pyogenes strains isolated from throat carriage in Romanian population | |
| Ionescu et al. | Biointerface Research in A | |
| US20110275114A1 (en) | Method and medium for detecting the presence or absence of methicillin resistant staphylococcus aureus (mrsa) in a test sample | |
| Lennox et al. | Carrier rate of Staphylococcus aureus among residents of calabar municipality, Nigeria | |
| Boipai et al. | Microbiological and Biochemical Analysis of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Isolated from Patients Admitted in RIMS, Ranchi | |
| Taha et al. | Bloodstream Bacterial Infections in Children Inpatients | |
| RU2595370C2 (ru) | СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150223 |