RU2595370C2 - СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ - Google Patents

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ Download PDF

Info

Publication number
RU2595370C2
RU2595370C2 RU2015117287/10A RU2015117287A RU2595370C2 RU 2595370 C2 RU2595370 C2 RU 2595370C2 RU 2015117287/10 A RU2015117287/10 A RU 2015117287/10A RU 2015117287 A RU2015117287 A RU 2015117287A RU 2595370 C2 RU2595370 C2 RU 2595370C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
albicans
women
vaginal
normal
cultures
Prior art date
Application number
RU2015117287/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015117287A (ru
Inventor
Ольга Александровна Пашинина
Ирина Николаевна Чайникова
Ольга Львовна Карташова
Мария Викторовна Сычева
Татьяна Михайловна Пашкова
Лидия Петровна Попова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук
Priority to RU2015117287/10A priority Critical patent/RU2595370C2/ru
Publication of RU2015117287A publication Critical patent/RU2015117287A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2595370C2 publication Critical patent/RU2595370C2/ru

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации грибов Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору. Способ предусматривает забор исследуемого материала. Осуществляют посев исследуемого материала на селективные питательные среды с последующим выделением и идентификациией чистых культур C. albicans. У выделенных чистых культур C. albicans определяют антииммуноглобулиновую активность в отношении секреторного иммуноглобулина А (АИгсА). При этом к нормальной вагинальной микрофлоре относят штаммы С. albicans, не обладающие АИгсА и обладающие АИгсА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,3 мкг/мл. 1 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий для дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору с целью установления их этиологической значимости и дальнейшего проведения своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.
Всех представителей дрожжеподобных грибов рода Candida относят к условно-патогенным [Онищенко Г.Г. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08. Постановление Российской Федерации, 2008. С. 20-34.] Они входят в состав нормальной микрофлоры рта, влагалища и толстой кишки большинства здоровых людей, но могут также вызывать развитие заболеваний [Мамедова Л.Р., Караев З.О. Этиологическая характеристика нозокомиальных инфекций мочевыводящих путей. Проблемы медицинской микологии. 2010. Т. 12, №3. С. 13-14; Кузьмина Д.А., Новикова В.П., Шабашова Н.В. и др. Candida spp. и микробиоценоз полости рта у детей с декомпен-сированной формой кариеса. Проблемы медицинской микологии. 2011. Т. 13, №1. С. 23-27].
Заболевание обусловлено не просто наличием грибов рода Candida, а их размножением в большом количестве, и/или попаданием более патогенных штаммов гриба.
В связи с такой двойственной природой грибов рода Candida у клиницистов нередко возникают сложности в оценке результатов обследования [Карпунина Т.И., Олина А.А., Машуров М.Г. и др. Фосфолипаза оппортунистических грибов: их возможная роль в патогенезе и диагностике микозов. Проблемы медицинской микологии. 2006. Т. 8, №4. С. 41-46; Кубась В.Г., Данилова О.П., Чайка Н.А. Кандидозная инфекция. СПб., 1996. С. 46].
Рост инфекций, вызываемых грибами рода Candida, диктует необходимость поиска новых способов дифференциации нормальной микрофлоры от этиологических агентов, способных вызывать развитие патологических процессов [Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М: «Медицина», 1999. С. 185].
В последние 20 лет значительно увеличилась концентрация грибов рода Candida в составе микрофлоры влагалища [Сергеева В.В., Сарматова Н.И. Частота обнаружения Candida albicans в биоценозе урогенитального тракта женщин. Immunopathology, Allergology, Infectology. 2010. №1. с. 168].
В видовой структуре грибов рода Candida, колонизирующих вагинальный биотоп, устойчиво доминируют представители культур С. albicans, доля которых составляет 84,3-88,9% от всех изолируемых культур [Дробкова В.А. Биологические особенности грибов рода Candida, изолируемых из вагинального биотопа женщин репродуктивного возраста. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. Пермь, 2010. С. 20].
Известен способ количественного исследования дрожжеподобных грибов, выделенных из вагинального биотопа, с подсчетом числа колониеобразующих единиц. Клинически значимый уровень культур С. albicans составляет 104 КОЕ/мл [Анкирская А.С., Муравьева В.В., Акопян Т.Э. и др. Клиническая лабораторная диагностика. 1997. №7. С. 41-45].
Однако количество культур С. albicans в 30,±5,5% случаев из смывов, полученных от молодых здоровых женщин, превышает значение 104 КОЕ/мл на фоне отсутствия клиники воспалительной реакции [Орлова B.C., Набережнев Ю.И., Будник И.В. Микробиоценоз влагалища современных практически здоровых женщин молодого репродуктивного возраста. Научные ведомости. 2008. 6 (46). С. 34].
Напротив, у 36% женщин с диагностированным кандидозным вульвовагинитом, абсолютное количество культур С. albicans в вагинальном отделяемом составляет менее 104 КОЕ/мл [Ворошилина Е.С. Совершенствование методических подходов к оценке микробиоценоза влагалища у женщин репродуктивного возраста. Автореферат дисс. … д-ра мед. наук. Челябинск, 2012. С. 22].
Известен способ дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору путем определения у выделенных штаммов следующих свойств: размер клеток, фосфолипазная активность, отношение к температуре [Трухина Е.В. Клинико-лабораторное и экспериментальное обоснование новых подходов к диагностике и лечению кандидозной инфекции влагалища. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. Пермь, 2005. С. 2].
Известен способ дифференциации культур Candida albicans различной локализации (ротовая полость, кожные покровы и слизистые влагалища), являющихся возбудителями кандидоза, от штаммов, выделенных от здоровых лиц, по уровню адгезии штаммов [Лисовская С.А. Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans. Автореф. дисс… канд. биол. наук. Казань, 2008. С. 4]. Однако способ не обладает достаточно высокой чувствительностью. Например, высокий уровень адгезии регистрируется у штаммов - представителей нормальной микрофлоры, что может затруднить дифференциацию культур С. albicans.
Известен способ дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору по сравнительной оценке уровня фосфолипазной активности изолированных культур [Трухина Е.В. Клинико-лабораторное и экспериментальное обоснование новых подходов к диагностике и лечению кандидозной инфекции влагалища. Автореф. дисс. … канд. мед. наук. Пермь, 2005. С. 2].
Обнаружены антилизоцимная и антикомплементарная активности у культур Candida albicans, выделенных из вагинального биотопа женщин больных кандидозом и вульвовагинальным кандидозом [Свиридов М.А., Долгушин И.И., Карташова О.Л. Оценка персистентных характеристик Candida albicans. Медицинская наука и образование Урала. 2008. №4. С. 104-106]; а также антилактоферриновая активность у культур С. albicans, выделенных из вагинального биотопа женщин при хронических гнойно-воспалительных заболеваниях придатков матки [Бухарин О.В., Карташова О.Л., Киргизова С.Б. и др. Антилактоферриновая активность микроорганизмов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. №5. С. 10].
При изучении антилактоферриновой активности (АЛфА) у культур С. albicans, выделенных из вагинального биотопа здоровых женщин (штаммы нормальной микрофлоры) и женщин больных хроническими воспалительными заболеваниями придатков матки в стадии ремиссии (патогенные штаммы), было установлено, что этот признак чаще с высокими значениями встречался у штаммов, изолированных от больных женщин [Бухарин О.В., Карташова О.Л., Киргизова С.Б., Валышева И.В. Антилактоферриновая активность микроорганизмов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. №5. С. 10].
Однако дифференциация грибов вагинального биотопа женщин по частоте встречаемости и уровню АЛфА не всегда объективна, поскольку лакто-феррин продуцируется нейтрофилами и моноцитами и его количество многократно увеличивается при заболевании [Rein М.F., Shih L., Miller R. et al. Use of a lactoferrin assay in the differential diagnosis of female genital tract infections and implications for the pathophysiology of bacterial vaginosis. Sex. Transm. Dis. 1996. V. 23, No 6. P. 517-521], что может существенно влиять на экспрессию генов (повышая или снижая экспрессию генов), ответственных за фенотипические проявления данного свойства у штаммов С. albicans, колонизирующих вагинальный биотоп.
Наиболее близким к заявляемому способу по назначению и совокупности существенных признаков является способ дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору путем изучения их биологических свойств (морфологическая трансформация, продукция ферментов - фосфолипаз и протеаз, способность к пленкообразованию) [Дробкова В.А. Биологические особенности грибов рода Candida, изолируемых из вагинального биотопа женщин репродуктивного возраста. Автореф. дисс. на соискание ученой степени канд. мед. наук. Пермь, 2010. С. 9-20].
Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков:
1. Трудоемок для применения в условиях клинической лаборатории и больше подходит для научно-исследовательских целей из-за необходимости определения у выделенных микроорганизмов сразу нескольких биологических свойств, таких как - морфологическая трансформация, продукция ферментов - фосфолипаз и протеаз, способность к пленкообразованию.
2. Требует использования реактивов и специальных питательных сред для определения указанных биологических свойств и, как следствие, дополнительных манипуляций для их подготовки и большего количества времени.
Заявляемое изобретение направлено на достижение технического результата, заключающего в создании точного, простого и экономически выгодного способа дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору.
Для достижения указанного технического результата в заявляемом способе дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору проводят забор исследуемого материала, посев его на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур С. albicans. Затем у выделенных штаммов С. albicans определяют антииммуноглобулиновую активность в отношении секреторного иммуноглобулина А (АИгсА) и к нормальной вагинальной микрофлоре относят штаммы С. albicans, не обладающие АИгсА и обладающие АИгсА при уровне выраженности данного признака равном или меньше 0,3 мкг/мл.
Новым в заявляемом способе является то, что у выделенной культуры Candida albicans определяют антииммуноглобулиновую активность в отношении секреторного иммуноглобулина А (АИгсА) и к нормальной вагинальной микрофлоре относят штаммы С. albicans, не обладающие АИгсА и обладающие АИгсА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,3 мкг/мл.
Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат, состоит в том, что заявляемый способ путем определения у культур Candida albicans антииммуноглобулиновой активности в отношении секреторного иммуноглобулина А, позволяет дифференцировать культуры С albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору, способную вызывать развитие инфекционно-воспалительных заболеваний, что способствует проведению своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.
Секреторный иммуноглобулин A (slgA) является основным протективным иммуноглобулином местной иммунной защиты, противостоящим микробной колонизации слизистых оболочек различных биотопов человека, он продуцируется только иммунными клетками слизистой оболочки (В-лимфоцитами), его содержание стабильно.
Для многих представителей микрофлоры, колонизирующих слизистые оболочки открытых полостей организма человека характерна способность секретировать протеолитические ферменты, расщепляющие секреторный иммуноглобулин А [Кострюкова Н.Н., Бехало В.А. Молекулярно-биологические основы патогенности гонококков и особенности иммунного ответа. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. №1. С. 105; Rao М.В., Tanskale A.M., Ghatge M.S. et al. Molecular and biotech-nological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62(3). P. 598].
Известно, что культура С. albicans способна деградировать slgA, супрессируя локальный иммунитет, а антииммуноглобулиновая активность в отношении секреторного IgA определяет способность С. albicans поддерживать воспалительный процесс и участвовать в его хронизации [Капустина О.А., Чайникова И.Н., Карташова О.Л. Видовая характеристика и факторы персистенции грибов рода Candida, выделенных из разных биотопов при ин-фекционно-воспалительных заболеваниях и дисбиозе кишечника. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012. №4. С. 37-41].
Известен способ определения антииммуноглобулиновой активности микроорганизмов [патент РФ №2236465, C12Q 1/02, G01N 33/569, 2004].
Способ осуществляется путем выращивания исследуемой культуры микроорганизмов на плотной питательной среде, приготовления из выросшей агаровой культуры микробной взвеси и смешивания ее с очищенным иммуноглобулином. Параллельно готовят контроль из забуференного физиологического раствора и очищенного иммуноглобулина. Опытную и контрольную пробы инкубируют 18-24 ч, отделяют супернатант от бактериальных клеток центрифугированием, определяют концентрацию остаточного иммуноглобулина в опытной и контрольной пробах иммуноферментным анализом. Антииммуноглобулиновую активность рассчитывают по формуле
Figure 00000001
где АИгА - антииммуноглобулиновая активность, %; Ск - концентрация остаточного иммуноглобулина в контроле, мкг/мл; Со - концентрация остаточного иммуноглобулина в опыте, мкг/мл. Антииммуноглобулиновая активность выражается в процентах (%) инактивации иммуноглобулина в опыте по сравнению с контролем.
Авторами экспериментально установлены различия в распространенности и выраженности антииммуноглобулиновой активности в отношении slgA у культур С. albicans, выделенных из влагалища у здоровых женщин и больных инфекционно-воспалительными заболеваниями.
Исследование было проведено на 64 штаммах С. albicans, выделенных от женщин, страдающих сальпингоофоритом (острое и хроническое течение); а также 34 штаммах, выделенных от клинически здоровых женщин при профилактическом осмотре.
Исследуемый материал (отделяемое из влагалища) засевали на чашки с питательной средой Сабуро (Дагестанский НИИПС, г. Махачкала) с рН 6,0-6,5 методом секторных посевов, выдерживали в условиях термостата при температуре 37°С в течение 48 часов. Выросшие колонии микроскопировали и изучали морфологию - обнаружение псевдомицелия определяло принадлежность гриба к роду Candida. Чистую культуру идентифицировали, определяя тип филаментации и наличие хламидоспор при посеве на Хламидоспорагар (Дагестанский НИИПС, г. Махачкала). Посевы инкубировали при 22°С в темном месте в течение 3-4 дней. Выявление хламидоспор позволяло идентифицировать культуру как Candida albicans.
У всех выделенных штаммов Candida albicans определяли антииммуноглобулиновую активность в отношении slgA следующим способом.
1. Исследуемую культуру Candida albicans выращивали на плотной питательной среде при 37°С в течение 24-36 часов.
2. Из выросшей агаровой культуры готовили взвесь в физиологическом растворе в концентрации 1 млрд/мл.
3. На стерильном забуференном физиологическом растворе 0,15 М, рН 7,2, готовили раствор очищенного человеческого секреторного иммуноглобулина А (набор реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ»), полученный раствор разводили в 1000 раз этим же стерильным буфером. В лунки стерильного полистиролового планшета вносили по 50 мкл микробной взвеси и раствора иммуноглобулина А.
4. Параллельно с опытной готовили контрольную пробу, содержащую вместо микробной взвеси 50 мкл забуференного физиологического раствора.
5. Пробы инкубировали не менее 18 ч при 37°С.
6. После инкубации пробы переносили в пластиковые пробирки и центрифугировали 8000 об/мин 20 мин при +5°С.
7. Отбирали необходимое количество супернатанта в пробирки, содержащие такое количество буфера, чтобы пробы были разведены в соотношении 1:50. В указанном соотношении пробы вносили в планшет набора реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ» на 30 минут, затем промывали лунки планшета промывочным раствором, вносили по 100 мкл конъюгата, инкубировали 30 минут и вновь промывали. Вносили в лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, инкубировали в течение 25 минут и вносили по 100 мкл стоп-реагента.
8. Проводили определение остаточной концентрации секреторных IgA в опытной и контрольной пробах, измеряя их оптическую плотность на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия при длине волны 492 нм), перерасчет концентрации иммуноглобулинов осуществляли путем построения калибровочных графиков. Найденные по графику значения концентрации секреторных IgA умножали на коэффициент разведения, т.е. на 50, и получали концентрацию секреторного IgA (мкг/мл) в опытной и контрольной пробах.
9. Рассчитывали антииммуноглобулиновую активность в отношении slgA по формуле
АИгсА=Ск0,
где АИгсА - антииммуноглобулиновая активность в отношении slgA, мкг/мл;
Ск - концентрация slgA в контроле, мкг/мл;
Со - концентрация slgA в опыте, мкг/мл.
Антииммуноглобулиновую активность выражали в мкг/мл (мкг инактивированного секреторного иммуноглобулина А в мл культуральной среды).
Результаты исследований представлены в таблице.
Как видно из таблицы, у культур С. albicans, выделенных из влагалища здоровых женщин, антииммуноглобулиновая активность в отношении секреторного IgA присутствует в 33% случаев с уровнем выраженности от 0,01 до 0,3 мкг/мл, а культуры С. albicans, выделенные из влагалища женщин с острым течением заболевания, характеризовались наличием признака в 100% случаев с уровнем выраженности от 0,31 мкг/мл до 0,53 мкг/мл.
Штаммы С. albicans, выделенные из влагалища женщин с обострением хронического течения заболевания, обладали антииммуноглобулиновой активностью в отношении секреторного IgA в 100% случаев с уровнем выраженности признака от 0,54 мкг/мл до 1,18 мкг/мл.
Figure 00000002
Таким образом, проведенные исследования показали, что все представители культур С. albicans, выделенные от больных женщин, в 100% случаев обладали антииммуноглобулиновой активностью в отношении slgA, при этом уровень выраженности данного признака был более 0,3 мкг/мл.
Тогда как у штаммов С. albicans, выделенных из влагалища здоровых женщин, антииммуноглобулиновая активность в отношении slgA определялась в 33% случаев с уровнем выраженности признака от 0,01 до 0,3 мкг/мл.
Авторами установлены пороговые значения способности культур С. albicans к инактивации slgA, позволяющие дифференцировать культуры Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору: к нормальной вагинальной микрофлоре относят штаммы С. albicans, не обладающие АИгсА и обладающие АИгсА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,3 мкг/мл.
Предложенный способ дифференциации культур С albicans вагинального биотопа женщин был испытан в ГБУЗ «Оренбургская районная больница».
Эффективность дифференциации, проведенной в соответствии с заявляемым способом, составила 95%.
Способ осуществляется следующим способом:
1. Исследуемый материал (отделяемое из влагалища) засевают на чашки со средой Сабуро (Дагестанский НИИПС, г. Махачкала).
2. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.
3. Выросшие колонии микроскопируют и изучают морфологию - обнаружение псевдомицелия определяет принадлежность гриба к роду Candida.
4. Чистую культуру идентифицируют до вида, определяя тип филаментации и наличие хламидоспор при посеве на Хламидоспорагар (Дагестанский НИИПС, г. Махачкала) после инкубирования посевов при 22°С в темном месте в течение 3-4 дней. Выявление хламидоспор позволяет идентифицировать культуру как С. albicans.
5. Исследуемую культуру Candida albicans выращивают на плотной питательной среде при 37°С в течение 24-36 часов.
6. Из выросшей агаровой культуры готовят взвесь в физиологическом растворе в концентрации 1 млрд/мл.
7. На стерильном забуференном физиологическом растворе 0,15 М, рН 7,2, готовят раствор очищенного человеческого секреторного IgA (набор реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ»), полученный раствор разводят в 1000 раз этим же стерильным буфером. В лунки стерильного полистиролового планшета вносят по 50 мкл микробной взвеси и раствора секреторного иммуноглобулина А.
8. Параллельно с опытной готовят контрольную пробу, содержащую вместо микробной взвеси, 50 мкл забуференного физиологического раствора.
9. Пробы инкубируют не менее 18 ч при 37°С.
10. После инкубации пробы переносят в пластиковые пробирки и центрифугируют 8000 об/мин 20 мин при +5°С.
11. Отбирают необходимое количество супернатанта в пробирки, содержащие такое количество буфера, чтобы пробы были разведены в соотношении 1:50. В указанном соотношении пробы вносят в планшет набора реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ» на 30 минут, затем промывают лунки планшета промывочным раствором, вносят по 100 мкл конъюгата, инкубируют 30 минут и вновь промывают. Вносят в лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, инкубируют в течение 25 минут и вносят по 100 мкл стоп-реагента.
12. Проводят определение остаточной концентрации slgA в опытной и контрольной пробах, измеряя их оптическую плотность на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия при длине волны 492 нм), перерасчет концентрации slgA осуществляют путем построения калибровочных графиков. Найденные по графику значения концентрации slgA умножают на коэффициент разведения, т.е. на 50, и получают концентрацию slgA (мкг/мл) в опытной и контрольной пробах.
13. Рассчитывают антииммуноглобулиновую активность в отношении slgA по формуле
АИгсА=Ск-Со,
где АИгсА - антииммуноглобулиновая активность в отношении секреторного IgA, мкг/мл;
Ск - концентрация slgA в контроле, мкг/мл;
Со - концентрация sgA в опыте, мкг/мл.
Антииммуноглобулиновая активность выражается в мкг/мл (мкг инак-тивированного секреторного иммуноглобулина А в мл культуральной среды).
14. К нормальной вагинальной микрофлоре относят штаммы С. albicans, не обладающие АИгсА и обладающие АИгсА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,3 мкг/мл.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1. Во время профилактического осмотра у пациентки Б. отделяемое из влагалища было засеяно на чашки со средой Сабуро. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов. Выросшие колонии микроскопировали и изучали морфологию - обнаружение псевдомицелия определило принадлежность гриба к роду Candida.
Чистую культуру идентифицировали до вида, определяя тип филаментации и наличие хламидоспор при посеве на Хламидоспорагар после инкубирования посевов при 22°С в темном месте в течение 3-4 дней. Выявление хламидоспор позволило идентифицировать культуру как С. albicans.
На следующем этапе у С. albicans определяли антииммуноглобулиновую активность в отношении секреторного IgA. Исследуемую культуру Candida albicans выращивали на плотной питательной среде при 37°С в течение 24-36 часов. Из выросшей агаровой культуры готовили взвесь в физиологическом растворе в концентрации 1 млрд/мл. На стерильном забуференном физиологическом растворе 0,15 М, рН 7,2, готовили раствор очищенного человеческого секреторного IgA (набор реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ»), полученный раствор разводили в 1000 раз этим же стерильным буфером. В лунки стерильного полистиролового планшета вносили по 50 мкл микробной взвеси и раствора секреторного IgA.
Параллельно с опытной готовили контрольную пробу, содержащую вместо микробной взвеси, 50 мкл забуференного физиологического раствора. Пробы инкубировали не менее 18 ч при 37°С.
После инкубации пробы переносили в пластиковые пробирки и центрифугировали 8000 об/мин 20 мин при +5°С. Отбирали необходимое количество супернатанта в пробирки, содержащие такое количество буфера, чтобы пробы были разведены в соотношении 1:50. В указанном соотношении пробы вносили в планшет набора реагентов «IgA секреторный-ИФА-БЕСТ» на 30 минут, затем промывали лунки планшета промывочным раствором, вносили по 100 мкл конъюгата, инкубировали 30 минут и вновь промывали.
Вносили в лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, инкубировали в течение 25 минут и вносили по 100 мкл стоп-реагента.
Проводили определение остаточной концентрации секреторных IgA в опытной и контрольной пробах, измеряя их оптическую плотность на фотометре Multiskan (Labsystems, Финляндия при длине волны 492 нм), перерасчет концентрации секреторных иммуноглобулинов А осуществляли путем построения калибровочных графиков. Найденные по графику значения концентрации секреторных IgA умножали на коэффициент разведения, т.е. на 50, и получали концентрацию секреторного IgA в мкг/мл в опытной и контрольной пробах: 14,84 мкг/мл и 15 мкг/мл соответственно.
АИгсА рассчитывали по формуле
АИгсА=15 мкг/мл - 14,84 мкг/мл=0,16 мкг/мл
АИгсА у выделенного штамма С. albicans составляла 0,16 мкг/мл. Согласно предлагаемому способу был сделан вывод о том, что данный штамм С. albicans относится к нормальной микрофлоре влагалища.
Пример 2. У обследуемой женщины А., часто болеющей воспалительными заболеваниями придатков матки, было взято на исследование отделяемое влагалища.
Бактериологическое исследование проведено аналогично примеру 1. На основании полученных результатов о наличии у выделенного штамма С. albicans антииммуноглобулиновой активности в отношении slgA с уровнем выраженности 1,05 мкг/мл был сделан вывод о том, что выделенный штамм может быть патогенным и в дальнейшем вызывать развитие местного инфекционно-воспалительного процесса.
В отношении женщины А. были проведены профилактические мероприятия с применением антимикотических средств, что в комплексе с патогенетическими средствами привело к положительному эффекту и предотвратило рецидив заболевания.
Пример 3. Перед проведением внутриматочного вмешательства (внутриматочная контрацепция) у пациентки У. было взято на бактериологическое исследование отделяемое влагалища. Бактериологическое исследование проведено аналогично примеру 1.
Была выделена культура С. albicans с уровнем выраженности АИгсА 0,53 мкг/мл. Согласно заявляемому способу был сделан вывод о том, что выделенный штамм является патогенным и способен вызвать воспалительные осложнения.
Проведена целенаправленная коррекция микрофлоры влагалища биопрепаратами, что позволило предотвратить воспалительные осложнения после проведенного внутриматочного вмешательства.
Таким образом, использование заявляемого способа позволяет дифференцировать культуры Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору, что способствует проведению своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.

Claims (1)

  1. Способ дифференциации культур Candida albicans вагинального биотопа женщин на нормальную и патогенную микрофлору, включающий забор исследуемого материала, посев его на селективные питательные среды, выделение и идентификацию чистых культур С. albicans, определение биологических свойств у выделенных микроорганизмов, отличающийся тем, что у выделенных штаммов С. albicans определяют антииммуноглобулиновую активность в отношении секреторного иммуноглобулина А (АИгсА) и к нормальной вагинальной микрофлоре относят штаммы С. albicans, не обладающие АИгсА и обладающие АИгсА при уровне выраженности данного признака, равном или меньше 0,3 мкг/мл.
RU2015117287/10A 2015-05-06 2015-05-06 СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ RU2595370C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015117287/10A RU2595370C2 (ru) 2015-05-06 2015-05-06 СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015117287/10A RU2595370C2 (ru) 2015-05-06 2015-05-06 СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015117287A RU2015117287A (ru) 2015-09-10
RU2595370C2 true RU2595370C2 (ru) 2016-08-27

Family

ID=54073288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015117287/10A RU2595370C2 (ru) 2015-05-06 2015-05-06 СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2595370C2 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2236465C2 (ru) * 2002-09-24 2004-09-20 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Способ определения антииммуноглобулиновой активности микроорганизмов

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2236465C2 (ru) * 2002-09-24 2004-09-20 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Способ определения антииммуноглобулиновой активности микроорганизмов

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ДРОБКОВА В.А., Биологические особенности грибов рода Candida, изолируемых из вагинального биотопа женщин репродуктивного возраста, Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, Пермь, 2010, с. 9-18. *
ЛИСОВСКАЯ С.А., Новый подход к оценке патогенного потенциала клинических штаммов Candida albicans, Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Казань, 2008, с.6-25. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015117287A (ru) 2015-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DeLong et al. Conceptual design of a universal donor screening approach for vaginal microbiota transplant
Oyaert et al. Laboratory diagnosis of urinary tract infections: Towards a BILULU consensus guideline
Kovachev Obstetric and gynecological diseases and complications resulting from vaginal dysbacteriosis
Ezeigbo et al. Incidence of urinary tract infection (UTI) among pregnant women attending antenatal clinics at some selected hospitals in Aba, southeastern Nigeria
RU2362808C1 (ru) Способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности
Abdullahi et al. Asymptomatic bacteriuria among pregnant women attending antenatal: evaluation of screening test
RU2595370C2 (ru) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ
Hameed Clinical Study of Some Bacteria and Fungi that Cause Vaginitis in Al-Khalis City.
Taura et al. Antifungal Resistance Among Candida species From Patients with Genitourinary Tract Infection at Muhammad Abdullahi Wase Specialist Hospital, Kano-Nigeria
Mohammed et al. Detection of Candida albicans in females urinary tract Infection by using microscopical and cultural methods of urine samples in Kirkuk city-Iraq
Al-Ani et al. Isolation and identification of candida albicans from children patient with candidiasis from Ramadi city, Iraq
Hagos et al. Prevalence of asymptomatic bacteriuria among pregnant women attending antenatal care at Semienawi Asmara Health Center
Nisha et al. Analysis of Nugent and Amsel criteria for the detection of female genital tract infections in a tertiary care hospital, Coastal Karnataka
RU2417048C1 (ru) Прогнозирование развития рецидивов эрозии шейки матки
Sapna et al. Outcome of routine microbiological screening for lower genital tract infections in symptomatic non-pregnant females complaining infertility
Salh et al. Evaluation of direct microscopy and culture method for detection of Trichomonas vaginalis in vaginal discharge and urine samples
RU2332671C2 (ru) Способ прогнозирования хронического течения урогенитальной гонококковой инфекции
Hermansyah et al. Analysis of The Effectiveness of Mycobacterium Tuberculosis Through Resistant Bacterial Staining and Molecular Rapid Tests
AL-Jumaa et al. Laboratory Diagnosis of Mycoplasma spp. from the Upper Respiratory Tract and Conjunctival Infections in Shelter Cats
Tannupriya et al. Antifungal drugs susceptibility towards candida albicans in female patients with UTI
Mohammad Prevalence of trichomonas vaginalis compared to bacteria and vaginal fungal
HUSEYNOVA et al. Modern Approach to Bacterial Vaginosis and Diagnosis of Vaginitis in Women with Vitamin D Deficiency
Okwelle et al. Occurrence of vaginal candidiasis among female students of Ignatius Ajuru University of Education, Rumuolumeni, Port Harcourt, Rivers State
Monther et al. Evaluation of Trichomonas vaginalis and Candida albicans alongside with pathogenic bacteria in Kirkuk females
Parveen et al. Antibiotic sensitivity of bacteria causing urinary tract infection

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180507