RU2630060C1 - Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 - Google Patents
Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2630060C1 RU2630060C1 RU2016111680A RU2016111680A RU2630060C1 RU 2630060 C1 RU2630060 C1 RU 2630060C1 RU 2016111680 A RU2016111680 A RU 2016111680A RU 2016111680 A RU2016111680 A RU 2016111680A RU 2630060 C1 RU2630060 C1 RU 2630060C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- adhesion
- adhesive
- epithelial cells
- microorganisms
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 27
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 16
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract 3
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 6
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 3
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000379194 Abies sibirica Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008878 abisib Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии. Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 заключается в том, что осуществляют забор материала, получают из указанного материала суспензию клеток с концентрацией 2×106 кл/мл, определенной на денситометре, смешивают 0,1 мл полученной суспензии клеток с 0,1 мл суспензии бактерий с концентрацией 2×109 кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, после инкубирования смесь трехкратно отмывают забуференным физраствором при 600 об/мин по 10 мин, далее удаляют супернатант из осадка и делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму, под микроскопом подсчитывают в 10 полях зрения среднее количество адсорбированных микроорганизмов - средний показатель адгезии, проведя не менее трех опытов, и считают степень адгезии от 0 до 1,9 - низкоадгезивной, от 2 до 4,9 - среднеадгезивной, свыше 5 - высокоадгезивной, при условии, что в случае забора эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта его осуществляют медицинским ершиком после предварительного полоскания раствором антисептика хитозана на Абисибе. 2 пр., 2 табл.
Description
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии бактерий на модели эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта и клеточной линии HEp 2.
Известны способы определения среднего показателя адгезии по методу Брилис В.И. (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ [1]. При постановке опыта на предметное стекло наносили одну каплю буферного раствора (0,1 М раствор фосфата натрия на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3), в котором суспендировали по одной петле взвесь эритроцитов, предварительно дважды отмытых буферным раствором путем центрифугирования (300-1000 об/мин), концентрацией 100 млн/мл и одну петлю густой суточной суспензии культуры микроорганизмов (№6 по Mc Earland), выращенных в оптимальной жидкой питательной среде. На одно стекло наносили 3 капли суспензии разных микроорганизмов. Предметное стекло с эритроцитами и микробами помещали во влажную камеру на 30 минут при температуре 37°C. Затем препарат высушивали при той же температуре, фиксировали в пламени спиртовки и окрашивали по методу Грама. При микроскопии подсчитывали среднее количество микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту. Подсчитывали не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения, это средний показатель адгезии (СПА).
Адгезивность считалась нулевой при СПА от 0 до 1,0; низкой при СПА от 1,01 до 2,0; средней при СПА от 2,01 до 4,0; высокой при СПА свыше 4,0. Вариации результатов при данном методе ±15%.
Недостатком способа является то, что он определяет степень адгезии только к эритроцитам, которые несут определенные адгезины, которые отсутствуют на поверхности других клеток человека и не могут быть показателем адгезии па эпителиальных клетках.
Известен способ определения уровня адгезивной активности штаммов пробиотиков на модели эпителиальных клеток [2]. Забор эпителиальных клеток производят при проведении диагностической гистероскопии и раздельном диагностическом выскабливании стенок шейки матки и цервикального канала при различных неинфекционных заболеваниях тела матки.
В асептических условиях под внутривенной анестезией шейка матки обнажается куско- или ложкообразными зеркалами. После этого производят соскоб эпителия слизистой оболочки боковых стенок влагалища.
После забора материал помещают в транспортный контейнер с жидкой питательной средой 199. Контейнер обкладывают льдом.
Клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (pH 7,2) центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. После определения концентрации клеток с помощью камеры Горяева под световым микроскопом ее разводят до 1,5-2 × 106 кл/мл.
Далее готовят суспензию штамма с концентрацией 2×109 микробных кл/мл, 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток смешивают с 0,5 мл взвеси бактериальной культуры.
Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при 37°C в течение 30 мин, периодически встряхивая. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР от не прилипших микробов при 600 об/мин по 10 мин.
Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1-2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют смесью равных частей медицинского эфира и 96° спирта и окрашивают по Романовскому-Гимзе.
Под световым микроскопом подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 эпителиоцитам.
При оценке адгезии каждого штамма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СПА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.
Степень адгезии считают:
- неадгезивную (СПА = 0);
- слабоадгезивную (СПА = 1-5);
- среднеадгезивную (СПА = 5-10);
- высокоадгезивную (СПА = выше 10).
Недостатками способа являются специфика рецепторов клеток слизистой оболочки влагалища, особенности забора эпителиальных клеток под внутривенной анестезией, использование холода.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии HEp 2 (клетки рака гортани).
Авторы предлагают способ, характеризующийся простотой, удобством, малыми временными затратами и высокой результативностью.
Способ позволяет изучить адгезивные свойства микроорганизмов непосредственно на эпителиальных клетках, при этом клетки располагаются в виде монослоя, что позволяет определить количество адгезивных бактерий с большой точностью.
Техническим результатом заявленного изобретения является хорошая воспроизводимость результатов с использованием минимального количества биомассы микроорганизмов в микрообъемах, отсутствие необходимости использования опасных химических реагентов и анестезии.
Заявленное техническое решение осуществляется следующим образом.
Перед забором материала с целью элиминации собственных микроорганизмов полости рта испытуемому дают полоскание, состоящее их смеси пищевого хитозана на Абисибе (экстракт сибирской пихты), в течение 1-2 мин. При этом слизистая оболочка освобождается от собственной микрофлоры.
После этого медицинским стерильным ершиком производится забор эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта и вносится в пробирку с 5 мл среды 199.
Клетки дважды отмывают забуференным физраствором (ЗФР) (0,1 М раствор фосфата натрия, приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия, pH 7,2-7,3) и центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. Все манипуляции производят при комнатной температуре.
Концентрацию клеток определяют на денситометре из расчета 2×106 кл/мл.
Затем смешивают 0,1 мл взвеси эпителиальных клеток с 0,1 мл суспензии бактерий (2×109 кл/мл или №6 по Мс Farland), выращенных в оптимальной жидкой или плотной питательной среде. Далее смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин. Потом смесь трехкратно отмывают ЗФР при 600 об/мин по 10 мин. После удаления супернатанта из осадка делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму.
Под световым микроскопом считают среднее количество бактерий на поверхности не менее 25 эпителиоцитов.
В отношении клеточной линии HEp 2 концентрацию выросших клеток сразу определяют на денситометре исходя из указанного расчета, и далее определение проводится так же, как и с эпителиальными клетками.
При оценке адгезии каждого штамма (ОФС 42 - Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения) опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СНА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.
Степень адгезии считают: слабоадгезивную (СПА = 0-1,9); среднеадгезивную (СПА = 2-4,9); высокоадгезивную (СПА = выше 5).
Пример 1. У выделенных из полости рта лактобацилл определяли уровень адгезии по методу Брилис В.И. (1986) на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+ и на клетках эпителия полости рта по предложенному нами методу. Результат СПА представлен в таблице 1. Как видно из таблицы, данные по определению СПА не совпадают и изменяются в основном в большую сторону при определении СПА на эпителиальных клетках полости рта.
Пример 2. Определение СПА у других микроорганизмов полости рта показало несовпадение результатов в сторону увеличения степени адгезии на клетках эпителия полости рта (табл. 2). По-видимому, это связано с наличием большего числа сайтов адгезии на поверхности эпителия полости рта.
Список используемой литературы
1. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лабораторное дело, 1986, №4, с. 210-212.
2. ОФС 42 - Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения.
Claims (1)
- Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2, заключающийся в том, что осуществляют забор материала, получают из указанного материала суспензию клеток с концентрацией 2×106 кл/мл, определенной на денситометре, смешивают 0,1 мл полученной суспензии клеток с 0,1 мл суспензии бактерий с концентрацией 2×109 кл/мл, инкубируют 30 мин при 37°С, после инкубирования смесь трехкратно отмывают забуференным физраствором при 600 об/мин по 10 мин, далее удаляют супернатант из осадка и делают мазки на стекле, фиксируют в пламени спиртовки 2-3 с и окрашивают по Граму, под микроскопом подсчитывают в 10 полях зрения среднее количество адсорбированных микроорганизмов - средний показатель адгезии, проведя не менее трех опытов, и считают степень адгезии от 0 до 1,9 - низкоадгезивной, от 2 до 4,9 - среднеадгезивной, свыше 5 - высокоадгезивной, при условии, что в случае забора эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта его осуществляют медицинским ершиком после предварительного полоскания раствором антисептика хитозана на Абисибе.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016111680A RU2630060C1 (ru) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016111680A RU2630060C1 (ru) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2630060C1 true RU2630060C1 (ru) | 2017-09-05 |
Family
ID=59797826
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016111680A RU2630060C1 (ru) | 2016-03-29 | 2016-03-29 | Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2630060C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2393229C1 (ru) * | 2008-12-29 | 2010-06-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора | Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам |
| RU2537128C1 (ru) * | 2013-04-22 | 2014-12-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов |
-
2016
- 2016-03-29 RU RU2016111680A patent/RU2630060C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2393229C1 (ru) * | 2008-12-29 | 2010-06-27 | Федеральное государственное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Роспотребнадзора | Способ определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам |
| RU2537128C1 (ru) * | 2013-04-22 | 2014-12-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ экспресс-определения адгезивного потенциала микроорганизмов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Arjuna N.B. Ellepola et al. Investigative Methods for Studying the Adhesion and Cell Surface Hydrophobicity of Candida Species: An Overview / Microbial Ecology in Health and Disease 2001; 13, pages 46-54. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| MCCORMACK et al. | Infection with Chlamydia trachomatis in female college students | |
| Zawaneh et al. | Factors influencing adherence of group B streptococci to human vaginal epithelial cells | |
| Thygeson et al. | The virus of inclusion conjunctivitis: further observations | |
| WO2022148138A1 (zh) | 一种能够预防和/或治疗子宫颈鳞癌的卷曲乳杆菌 | |
| Moffett et al. | Centralized gonococcus culture for dispersed clinics | |
| SACKEL et al. | Orogenital contact and the isolation of Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, and Ureaplasma urealyticum from the pharynx | |
| CN101177668B (zh) | 淋球菌培养基及其制备方法 | |
| Memik | Trichomonads in pleural effusion | |
| Morton et al. | Prevalence of pleuropneumonia-like organisms and the evaluation of media and methods for their isolation from clinical material | |
| Ringvold et al. | Moraxella lacunata isolated from epidemic conjunctivitis among teen‐aged females | |
| RU2630060C1 (ru) | Способ определения адгезии микроорганизмов на эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта и клеточной линии НЕр 2 | |
| Szarka et al. | Neonatal pneumonia caused by Trichomonas vaginalis | |
| RU2310195C2 (ru) | Способ прогнозирования течения атопического дерматита | |
| CN105624109B (zh) | 一种使用生物反应器培养nkt细胞的方法 | |
| Itah et al. | Correlation studies on Widal agglutination reaction and diagnosis of typhoid fever | |
| CN109792972B (zh) | 一种囊尾蚴体外培养方法 | |
| RU2501861C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROCOCCUS С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ СаСо-2 | |
| CN112263596B (zh) | 一种双歧杆菌v9对阴道上皮细胞粘附性及抑菌能力的应用 | |
| Salaman | Non-specific genital infections: The isolation of organisms of the pleuropneumonia group from the genital tract and their relation to the gonococcus | |
| Smeltzer et al. | Accuracy of presumptive criteria for culture diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in low-prevalence populations of women | |
| Karunaratne et al. | Laboratory manual in microbiology | |
| RU2595370C2 (ru) | СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КУЛЬТУР Candida albicans ВАГИНАЛЬНОГО БИОТОПА ЖЕНЩИН НА НОРМАЛЬНУЮ И ПАТОГЕННУЮ МИКРОФЛОРУ | |
| Hotchin | The cultivation of Novikoff rat hepatoma cells in vitro | |
| RU2401862C2 (ru) | Способ выделения энтерококков из свежевзятого патологического материала | |
| Lee et al. | T-mycoplasmas from urine and vaginal specimens: decreased rates of isolation and growth in the presence of thallium acetate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190330 |