CS273071B1 - Method of extracellular polysacharide and cellular biomassa preparation by means of "rhodella grisea" alga's culture - Google Patents

Description

jř 1 CS 273 071 B1

Vynález sa týká sposobu, přípravy extracelulárneho polyaacharidu a buňkové;) bio-raasy synchrónnou kulturou riasy Rhodella grisea (Geitler) Billard et al.

Doteraz známe postupy produkoie extracelulárneho polysaoharidu, ktorý sa podobáagaru a karageenanu mořských stielkatých červených rias, používali jednobuňková červe-ná riasy Porphyridium. Kultivačný postup s nepřetržitou produkciou extracelárneho po-lysacharidu pri použití slanomilného druhu Porphyridium purpureum opísali C. Gudin aD. Thomas. Buňky sa imobilizovali pevným nosičom z polyuretanu. K buňkám sa privádzalživný roztok s nízkým obsahom dusičnanov, do ktorého buňky kontinuálně produkovaliviskózny extracelulárny polysacharid. Při tomto spísobe kultivácie netřeba mechanickyseparoval; buňky zo živného roztoku {C. Gudin, D. Thomas: C.R. Acad. Sci. Paris Ser.III,293, 35 (1981)]. Nevýhodou tohto sposobu je nízká produkcia extraoelulárneho polysa-charidu a vysoká zasolenosi; suspenzie. Pre sladkovodný druh Porphyridium aerugineumnavrhol J. Rámus kontinuálny sposob kultivácie, pri ktorom sa strieda kultivácia buniekv živnom roztoku obsahujúcim všetky potřebné živiny s kultiváciou v živnom roztoku bezdusičnanov, v ktorom buňky přestanu rási a dělit' sa, ale zvyšujú produkciu extracelu-lárneho polysaoharidu. Po istom čase třeba do živného roztoku doplnit’ dusičnany, abysa predislo nenávratnému poškodeniu fotosyntetického aparátu buniek jí. Rámus: NovaHeďwigia 83, 51 (1986)^. Nevýhodou tohto sposobu je dlhšia kultivácia a práce s dvornákoncentráciami živného roztoku.

Mikroskopická červená riasa Rhodella grisea bola pSvodne nájdená v Neziderskomjazere a opísaná Geitlerom r. 1970 pod menom Porphyrideum griseum. Billard et al. r.1988 ju previedli do rodu Rhodella ako R. grisea. Druhý nález tejto riasy pochádzaz Československa, a to z termálneho bazéna v Piešíanoch. Izolovaný kmen sa označil HK1983/1. Veími riedka suspenzia tejto riasy sa naočkovala do Petriho misky s 1,5 hmot. %agaru oto hamán živným roztokom. Z jednotlivých buniek riasy narástli na svetle klonovékolonie, na ktoré nebolo posobené mutagennými vplyvmi. Testovalo sa 20 klonov, z kto-rých mal najvyššiu produkciu extracelulárneho polysaoharidu klon HK 1983/1/7. Kulturariasy Rhodella grisea bola uchovávaná v anorganickom živnom roztoku po 100 ml suspenziev Erlenmeyerových bankách o objeme 250 ml. Zásobná kultura nebola prebublávaná vzduchema ani nebola tretaná, bola udržiavaná pri teplote 18 až 25 °C a pri intenzitě světla20 až 30 W.m“2 PAR (fotosynteticky aktívneho žiarenia).

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje spósob přípravy extracelulárnehopolysaoharidu a buňkovéj biomasy synchrónnou kultúrou riasy Rhodella grisea, ktoréhopodstata spočívá v tom, že produkčná synchrónna kultúra riasy Rhodella grisea a husto-tou suspenzie 0,3 až 1,1 g.l“1 suchéj hmotnosti buniek sa kultivuje pri teplote 15 až35 °C v aspoň 3 cykloch 7 až 9 h na svetle o intenzitě aspoň 70 ff.m"2 fotosyntetickyaktívneho žiarenia a 15 až 17 h v tme, pričom sa nepěstovaná biomasa zberá po tme. 8 výhodou sa kultivuje klon riasy Rhodella grisea HK 1983/1/7. Výhodou navrhovaného spásobu přípravy extracelulárneho polysaoharidu a bunkovejbiomasy synchrónnou kulturou riasy Rhodella grisea oproti doterajším sposobora je, žeumožňuje rýchlejšiu produkciu obidvoch týchto komponentov a umožňuje použil; kultivá-tory s íubovoíným objemom a tvarom pri kultiváoiách v laboratóriách alebo pod holýmnebom s využitím 3lnečného žiarenia ako zdroja svetelnej energie. Ďalšou výhodou je,že buňky použitého klonu riasy takmer nesedimentujú, nalepia sa na steny kultivátoraa netvoria zhluky. Příklad 1

Anorganický živný roztok o pH 7,5 až 8, ktorý obsahuje 500 mg.I“1 dusičnanu dra-selného, 500 mg.l"1 dusičnanu sodného, 500 mg.l"1 hydrofosforečnanu draselného, 420 mg.l hydrouhlicitanu sodného, 250 mg.l heptahydrátu síranu horečnatého, 18,5 mg.l“1 hydrátu železito-sodnej soli kyseliny etyléndiamintetraoctovej (hydrát CS 273 071 B1 2 —1 —1chelatonátu železito-sodného), 11 mg.l hexahydrátu chloridu vápenatého, 3,1 mg.lkyseliny boritej. 1,8 mg.l-1 tetrahydrátu heptamolybdénanu hexaamonného, 1,4 mg.l“1heptahydrátu síranu kobaltnatého, 1,4 mg.l“1 heptahydrátu síranu zinočnatého, 1,2 mg.l“1tetrahydrátu síranu manganatého, 1,2 mg.l“1 pentahydrátu síranu mežnatého a stopovémnožstvo kyanokobalamínu (vitamínu B^), sa inokuluje nesynchrónnou zásobnou kulturou.na hustotu 0,3 g suchej hmotnosti buniek v 1 litri suspenzie. Hustota sa stanoví pomo-oou optickéj hustoty suspenzie meranej na fotometri pri vlnovej dížke 750 nm, s použi-tím predtým zisteného koeficientu přepočtu optickej hustoty suspenzie na přibližnáhodnotu jej suchej hmotnosti.

Suspenzia sa naleje do kultivátoru temperovaného neustále na teplotu 30 °C a za-temní sa. V kultivátoři sa suspenzia stále prebubláva zmesou vzduchu s prídavkom 2 obj.% oxidu uhličitého. Počas 16 h tmy sa časť buniek připravených na delenie rozdělí, kaž-dá na dve rovnaké dcérske buňky. V prvej svetelnej perióde cyklu sa kultúra vystavína biele světlo o intenzitě 70 W.m PAR (fotosynteticky aktívneho žiarenia). Po 8 hsa kultura zatemní na 16 h. Druhá světelná perioda prebieha pri svetle 90 W.m . Trváopat' 8 h a následuje temná perioda 16 h. Suchá hmotnost’ buniek sa po prvých dvoch cy-kloch zvýši na 0,8 g.l”1. Následuje 5 cyklov, v ktorých sa automaticky riadi trvaniesvětla a tmy v intervaloch 8 : 16 h a hustota suspenzie - na kultivátoři je umiestnenýsnímač, ktorý udržuje hustotu suspenzie v rozmedzí 0,9 až 1 g.l“1 suchej hmotnosti bu-niek. Pri vyšsej hustotě suspenzie spustí snímač čerpadlo, ktore dopraví do kultiváto-ra také množstvo anorganického roztoku, že suspenzia sa zriedi na hustotu v rozmedzí0,9 až 1 g.l“1 suchej hmotnosti buniek. Rovnaký objem nadbytočnej suspenzie odtečieitrubicou z kultivátora. Svetelné periody týchto automaticky riadených cyklov prebieha-,,jú pri intenzitě světla 120 W.m PAR ("biele" evetlo). Počas 3 h po zatmění sa naras-itené materské buňky v synchronnej kultuře rozdelia na dve dcérske buňky. Přibližné 95 % buniek v synchronnej kultuře po 16 h tmy sú mladé dcérske buňky.Takáto kultúra sa nariedi na hustotu 0,45 až 0,5 g.l“1 suchej hmotnosti buniek a kulti-vuje sa pri teplotě 30 °G a intenzitě světla 100 W.m“^ PAR na čas 8 h. V priebehu sve-telnej periody sa suchá hmotnost' buniek zdvojnásobí. Následuje 16 h periody tmy, počasktorej buňky vylúčia do živného roztoku vsetok polysacharid, syntetizovaný počas sve-telnej periody. Před žalšou periodou světla sa z kultivátora odoberie polovica suspen-zie o hustotě 0,9 až 1 g.l“1 suchej hmotnosti buniek. Zvyšok suspenzie v kultivátořisa zriedi anorganickým živným roztokom na polovičnú hustotu. Nepěstovaná suspenzia sacentrifuguje 15 minát pri 6 až 8.10·1 otáčkách za minutu. Sedimentované buňky sa roz-miešajú v čerstvom živnom roztoku a po 30 minútach miešania sa centrifugácia opakuje. V čerstvom živnom roztoku sa rozpustí extraoelulárny polysacharid z vorikajsích vrstievbuňkových obalov. Obidva supernatanty sa zlejú. Suchá hmotnost' polysacharidu rozpuště-ného v živnom roztoku představuje až 55 % suchej hmotnosti celkovéj produkovanéj bio-masy, t. j. súčtu suchých hmotností buniek a polysacharidu. Suspenzia o hustotě 1 g.l“1suchej hmotnosti buniek obsahuje až 1,2 g polysacharidu v 1 litri. Uvedené hustoty sapoužijú v kultivátoroch, v ktorých vrstva suspenzie nie je vačšia ako 2 cm. Čistý extraoelulárny polysacharid sa zo živného roztoku získá vo formě bielej,vo vodě rozpustnej látky dialýzou a nasledovnou lyofilizáoiou, alebo ako biela vlákni-tá, vo vodě nerozpustná látka vyzrážaním acetónom, etylakoholom alebo 2-propanolom.Chemicky je polysacharid tvořený saoharidami (glukóza, galaktóza, xyloza, uronové ky-seliny), žalej obsahuje menšie množstvo proteinov a sulfátových skupin. Viskozita roz-puštěného polysacharidu sa nemení pri změnách pH; nepatrné sa zvyšuje při zahriatiroztoku na 100 °C.

Claims (2)

1. 3 CS 273 071 B1 it Příklad 2 Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že snímač reguluje hustotu suspen-zie v synchronizačných cykloch na hodnotu 0,4 až 0,5 g»l~1 suchéj hmotnosti huniek priintenzitě světla 80 W.m PAK a produkčně suspenzie rastu pri rovnakej intenzitě světlav rozmedzí hustot 0,3 až 0,6 g.l-1 suchéj hmotnosti huniek. Suohá hmotnost polysachari-du rozpuštěného v živnom roztoku představuje až 60 % suchej hmotnosti celkovej hiomasy,t.j. suspenzia o hustotě 0,6 g.l“1 suchej hmotnosti huniek obsahuje až 0,9 g polysacha-ridu v 1 litri. Tieto hustoty suspenzie sa použijú v kultivátoroch s vrstvou suspenzie2 až 4 cm. Příklad 3 Postupuje sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že sa použije kultivátor, v ktoromsú buňky počas svetelnej periody stále na dennorn 3vetle. Do kultivátora sa neleje syn-chronně kultura připravená v lahoratóriu. Světelná perioda končí, kež sa suchá hmot-nost huniek zdvojnásobí (kontrola fotometricky aleho gravimetricky),- čo závisí od in-tenzity slnečného žiarenia. Teplota suspenzie sa udržiava na 30 °C. Suchá hmotnost po-lysacharidu rozpuštěného v živnom roztoku je obdobná ako v příklade 2. Sposob přípravy extraoelulárneho polysacharidu a bunkovej biomasy synchrónnou kul-turou riasou Rhódella grisea móže nájst použitie v poínohospodárstve, vo farmaceutickoma kozmetickom priemysle; polysacharid sa mfiže uplatnit napr. ako prostriedok redukujúciturbulenciu v kvapalinách, stabilizátor koloidov, spojivová alebo výplňová látka, súčastkozmetických prípravkov, kréraov ap. Vediajší produkt kultivácie je buňková biomasa, ktorá obsahuje asi 50 hmotnostných% proteinov, 20 % florideového škrobu a 20 % lipidov, je tiež zdrojom hydrofilných pig-mentov (červeného fykoerytrínu a modrého fykocyanínu), lipofilných karotenoidov a chlo-rofylu, ktoré sa takisto dajú použit' vo farmatickom, kozmetickom a potravinárskom prie-mysle. PRE DMEI VYNÁLEZU

   1. Sposob přípravy extraoelulárneho polysacharidu a bunkovej biomasy synchronnou kultá-rou riasy:Rhódella grisea v amoganiokom živnom médiu, vyznačujúoi sa tým, že pro-dukčná synchrónna kultura riasy Rhódella grisea s hustotou suspenzi 0,3 až 1,1 g.l-1suchej hmotnosti buniek sa kultivuje pri teplote 15 až 35 °C v aspoň 3 cykloch w· 7 az 9 h světla o intenzitě aspoň 70 W.m fotosyntetického aktívneho žiarenia a15 až 17 h tmy, pričom sa napestovaná biomasa zberá po tme.
2. 2. Sp3sob přípravy extraoelulárneho polysacharidu a bunkovej biomasy podía bodu 1, vy-značujúci sa tým, že sa kultivuje klon riasy Rhódella grisea HK 1982/1/7.