CN112280682A - 一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法 - Google Patents

一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法 Download PDF

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张富杰
叶翰扬
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Abstract

本发明提供一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法，该方法包括：将一顶丝藻置于一包含硝酸钠(NaNO3)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)和氯化铵(NH4Cl)的海水培养基中，并在一培养环境中进行培养，其中该培养环境的培养温度为18‑26℃、培养照度为60～100μE，培养光照包含蓝光或绿光；其中该海水培养基为天然海水或人工海水。

Description

一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法
技术领域
本发明涉及顶丝藻的培养技术领域，特别涉及一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法。
背景技术
藻胆蛋白(Phycobiliprotein)为存在于红藻、绿藻、蓝藻、隐藻等藻类中的水溶性荧光蛋白。藻胆蛋白可分成藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、副藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)，其中，藻红蛋白因其多种特性，已被广泛应用于各种领域的开发研究中，包含健康照护、化学药品与生物制剂、肿瘤治疗药物、体外诊断、研究试剂，尤其是用于流式细胞仪的试剂等。然而，由于藻红蛋白的生产技术门坎及成本过高，导致其价格昂贵，使得该相关应用尚无法有规模地放大于产业上，以至于藻红蛋白的市场应用尚处于待开发的成长阶段。因此，如何降低藻红蛋白的生产成本、提高藻红蛋白的供应量即成为相关产业急需解决的问题。
当前生产藻红蛋白所遇到的问题为，目前生产藻红蛋白主要是以大型红藻类如紫菜、仙菜藻等为原料进行萃取。然而，因为这些大型红藻类的藻体形态多为叶状体，造成很难对其破壁萃取。另外，这些大型红藻类虽因醣类含量高，常被用来做为洋菜胶或鹿角菜胶等来源，但也因为醣类含量高，导致在萃取藻红蛋白后的分离程序较为困难。
发明内容
本发明的发明人发现，顶丝藻(Acrochaetium sp.)虽为红藻的一种，但不同于现今用于萃取藻红蛋白的大型红藻类，顶丝藻藻体本身为丝状体且醣类含量少。使用顶丝藻作为藻红蛋白的萃取原料，具有破壁率高、萃取方便、萃取后分离较简单的优势，非常适合用于作为萃取藻红蛋白的藻类原料。因此，若能进一步提升顶丝藻藻红蛋白的含量，会对市场上长期存在的藻红蛋白供应量不足的问题有很大的帮助，本发明为了解决上述问题提供了一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法。
基于上述发现，本发明的目的在于提供一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法，该方法包括：
将一顶丝藻置于一包含营养盐的海水培养基中，并在一培养环境中进行培养；其中该营养盐包含硝酸钠(NaNO3)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)和氯化铵(NH4Cl)；其中该培养环境的培养温度为18-26℃、培养照度为60～100μE和，培养光照包含蓝光或绿光；其中该海水培养基是天然海水或人工海水。
为达到前述发明目的，所述该培养环境的培养温度为22-26℃及培养照度为60～100μE。
为达到前述发明目的，所述该培养环境的培养温度为22℃及培养照度为100μE。
为达到前述发明目的，所述营养盐包含70～80g/L硝酸钠(NaNO3)、4～6g/L磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、25～28g/L氯化铵(NH4Cl)。
为达到前述发明目的，所述该培养环境包含培养光照周期为16小时光照8小时黑暗(16L:8D)。
为达到前述发明目的，所述培养光照为给予白光并辅以蓝光或绿光的照射。
为达到前述发明目的，所述蓝光的波长为400～499nm；所述绿光的波长为500～599nm。
为达到前述发明目的，所述蓝光的波长为460nm；所述绿光的波长为509nm。
为达到前述发明目的，所述培养方法不提高顶丝藻中藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白含量。
本发明解决了现有技术中，使用大型红藻类作为藻红蛋白萃取原料所存在的破壁率低及醣类干扰问题，且本发明提供了解决顶丝藻中藻红蛋白含量问题的方法。使用本发明所提供的顶丝藻培养方法不但可增加顶丝藻藻红蛋白的含量，更可同时提高顶丝藻的生长率(量)，且本发明所提供的培养方法可避免顶丝藻藻胆蛋白中的藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白含量过高，影响后续的藻红蛋白纯化。使用本发明提供的方法所培养出的顶丝藻，不但藻红蛋白含量高，且其藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白的含量占比较低，非常适合用于作为藻红蛋白萃取原料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是顶丝藻培养环境条件评估实验流程图；
图2是温度及照度对顶丝藻生长量结果示意图；
图3是温度及照度对顶丝藻比生长率结果示意图；
图4是温度及照度对顶丝藻藻红蛋白含量的影响示意图；
图5是温度及照度对顶丝藻藻蓝蛋白含量的影响示意图；
图6是温度及照度对顶丝藻副藻蓝蛋白含量的影响示意图；
图7是光照周期对顶丝藻生长量及比生长率结果示意图；
图8是光照周期对顶丝藻藻胆蛋白含量结果示意图；
图9是光照质量对顶丝藻生长量及比生长率结果示意图；
图10是光照质量对顶丝藻藻胆蛋白含量结果示意图。
具体实施方式
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属专业人士领域可共同了解的意义，其中单数用语“一”、“一个”、“该”、“所述”，除非另有说明，皆可指涉多于一个对象，此外，用语“包含”、“包括”皆为开放式连接词；另外，除非另有说明，本发明所用的材料都是市售易于取得。
本说明书术语“营养盐”是指藻类(包含顶丝藻)生长时所需的盐类，其是包含但不限于氮盐、钙盐、碳盐、钠盐、磷盐、钾盐、硫盐或镁盐。
上述营养盐于培养藻类(包含顶丝藻)时的供应方式是包含但不限于以液体或固体形式供应；且该营养盐的具体配方可依实际需求予以调整。
本说明书术语“培养环境”是指在培养藻类(包含顶丝藻)的过程中人工给予一环境控制条件，该环境控制条件是包含但不限于温度、光源、光照质量、照度、光照周期、pH值或盐度。
“光照周期”是指给予一连续时间的光照期后，接续给予一连续时间的黑暗期，再重复循环给予该连续时间的光照期及该连续时间的黑暗期。
本发明是以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
本发明所提供的顶丝藻培养方法可搭配的培养形式是包含但不限于室内培养、室外培养、开放式培养、封闭式培养、无菌培养、非无菌培养、半连续式培养、连续式培养或批次式培养。
本发明实施例所使用的顶丝藻为Acrochaetium formosanum，其是本发明所属领域中具通常知识者可从天然海域中取得。本发明实施例是以Acrochaetium formosanum予以示范阐明，但本发明不受Acrochaetium formosanum所限制，顶丝藻属(Acrochaetium)的物种或可生产藻红蛋白的顶丝藻皆应涵盖于本发明范围内。
本发明的方法流程如图1所示，将顶丝藻置于海水培养基中培养，先设置不同培养温度及培养照度评估温度及照度对生长量及藻胆蛋白含量的影响，接着设置不同培养光照周期评估光照周期对生长量及藻红蛋白含量的影响，最后设置不同光照质量评估光照质量对生长量及藻红蛋白含量的影响，借此确立较佳及最佳的顶丝藻培养环境条件。
实施例1
顶丝藻培养
取湿重0.5g顶丝藻放入一含800mL海水培养基的培养容器中，并在一培养环境中进行培养，培养时打气使顶丝藻藻体可在培养容器内滚动。其中，该海水培养基为天然海水或人工海水，该顶丝藻与该海水培养基的比例可依实际需求进行调整；其中，该海水培养基包含1600μL营养盐，该营养盐与该海水培养基的比例可依实际需求进行调整；其中，该营养盐包含70～80g/L硝酸钠(NaNO3)、4～6g/L磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、25～28g/L氯化铵(NH4Cl)，该营养盐较佳为包含75.0g/L硝酸钠(NaNO3)、5.0g/L磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、26.8g/L氯化铵(NH4Cl)；其中，该培养容器可依据该顶丝藻藻体量及海水培养基量选择相对应容器，其是包含但不限于烧杯、PC桶、FRP桶。
实施例2
温度及照度对顶丝藻生长量及藻胆蛋白含量的影响评估
评估方式：使用实施例1所述的方法培养顶丝藻，并将该培养环境设置为固定的培养光照周期搭配不同的培养温度及培养照度，以了解温度及照度对顶丝藻生长量及藻胆蛋白含量的影响。具体地做法为，将该培养光照周期固定为12小时光照12小时黑暗(12L:12D)；该培养温度分别设置为14、18、22或26℃；该培养照度分别设置为20、60或100μE；总共分成12组(如表1所示)，每组3重复。培养时每3天换一次海水并秤重做纪录，秤重时用200目浮游生物网过滤后，以2000rpm离心5分钟将顶丝藻藻体所附带的海水滤除再进行秤重，共培养15日，并于培养结束后计算顶丝藻比生长率(Specific growth rate，SGR)及测定顶丝藻的藻胆蛋白含量。
表1、温度及照度对顶丝藻生长量及藻胆蛋白含量的影响评估的各组培养条件
组别 光照周期 温度(℃) 照度(μE)
1 12L:12D 14 20
2 12L:12D 14 60
3 12L:12D 14 100
4 12L:12D 18 20
5 12L:12D 18 60
6 12L:12D 18 100
7 12L:12D 22 20
8 12L:12D 22 60
9 12L:12D 22 100
10 12L:12D 26 20
11 12L:12D 26 60
12 12L:12D 26 100
比生长率计算：顶丝藻的比生长率是以下列公式计算：
比生长率(％day-1)＝[ln(Lt/L0)]÷t×100
其中，Lt为实验后的顶丝藻生长重量，L0为实验前的顶丝藻重量，t为实验天数。
藻胆蛋白含量的测定：参照Allen等人(1973)所提出的方法。于上述培养结束后，取湿重0.1g的顶丝藻，添加1mL的PBS，以高速均质机(MP Biomedicals，FastPrep-24 5G)进行高速均质破碎藻体，使水溶性的藻胆蛋白析出，再以酵素免疫分析仪检(ELISA)测量其于562、615及652nm的吸光值，并使用下列公式求得不同藻胆蛋白，包含藻蓝蛋白(Phycocyanin，PC)、副藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)及藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)的含量：
藻蓝蛋白(mg/mL)＝(OD615－0.474(OD652))÷5.34
副藻蓝蛋白(mg/mL)＝(OD652－0.208(OD615))÷5.09
藻红蛋白(mg/mL)＝(OD562－2.41(PC)－0.89(APC))÷9.62
温度及照度对顶丝藻生长量的影响可由图2得知，在14-26℃的温度范围内培养，顶丝藻生长量会随着温度的升高而逐渐上升；在20-100μE的照度范围下培养，顶丝藻生长量会随着照度的升高而逐渐上升。
将顶丝藻的生长量计算成比生长率(如图3)后可知，温度及照度与顶丝藻比生长率都成正比关系。在14-26℃的温度范围内，顶丝藻比生长率随着温度的升高而逐渐上升；在20-100μE的照度范围下，顶丝藻比生长率随着照度的升高而逐渐上升。
由图4得知，顶丝藻藻红蛋白含量与培养温度呈正比关系，提高培养温度可增加顶丝藻藻红蛋白含量。培养照度与顶丝藻藻红蛋白含量的关系则受到培养温度的影养，由图4可知，在14℃及18℃培养时，顶丝藻藻红蛋白含量会随照度的提高而提升，然而，在22℃及26℃时，顶丝藻藻红蛋白含量则是随照度的提高而变低。
温度及照度对顶丝藻藻蓝蛋白含量的影响可由图5得知，顶丝藻在14-22℃培养时，除了20μE的外，其藻蓝蛋白含量没有显著差异，但在26℃培养，顶丝藻藻蓝蛋白含量会明显高于其他组别。
温度及照度对顶丝藻副藻蓝蛋白含量的影响可由图6得知，以14℃或18℃培养顶丝藻时，其副藻蓝蛋白含量会随照度提高而提升，然而，在22℃及26℃环境培养的顶丝藻，其副藻蓝蛋白含量则是会随照度提高而变低。另外，值得注意的是，在26℃培养时，顶丝藻的副藻蓝蛋白含量会明显高于其他组别。而在相同照度条件下，以22℃培养，副藻蓝蛋白含量则是会低于其他组。
总结上述结果，当培养环境的培养温度为18-26℃、培养照度为20-100μE时，顶丝藻具较佳的生长量和藻红蛋白含量；其中，又以培养温度为18-26℃、培养照度为60-100μE时，顶丝藻具更佳的生长量和藻红蛋白含量；其中，又以培养温度为22-26℃、培养照度为60-100μE时，顶丝藻具最佳的生长量和藻红蛋白含量。另外，在26℃培养时，顶丝藻的藻红蛋白含量虽可被提升，然也具较高的藻蓝蛋白及副藻蓝蛋白含量，为了防止影响日后藻红蛋白纯化，所以顶丝藻培养的最佳培养环境是培养温度为22℃、培养照度为100μE。
实施例3
光照周期对顶丝藻生长量及藻红蛋白含量的影响评估
评估方式：使用实施例1所述的方法培养顶丝藻，并将该培养环境设置为固定的培养温度及培养照度搭配不同的培养光照周期，以了解光照周期对顶丝藻生长量及藻胆蛋白含量的影响。具体做法为，将该培养温度固定为22℃；将该培养照度固定为100μE；将该培养光照周期分别设置为8小时光照16小时黑暗(8L:16D)、12小时光照12小时黑暗(12L:12D)或16小时光照8小时黑暗(16L:8D)；总共分成3组(如表2所示)，每组3重复。培养时每3天换一次海水并秤重做纪录，秤重时用200目浮游生物网过滤后，以2000rpm离心5分钟将顶丝藻藻体所附带的海水滤除再进行秤重，共培养15天，并于培养结束后以实施例2所述的方法计算比生长率及测定顶丝藻的藻胆蛋白含量。
表2、光照周期对顶丝藻生长量及藻红蛋白含量的影响评估的各组培养条件。
组别 光照周期 温度(℃) 照度(μE)
1 8L:16D 22 100
2 12L:12D 22 100
3 16L:8D 22 100
光照周期对顶丝藻生长量及比生长率的影响可由图7得知，顶丝藻的比生长率随着光照期时间上升而上升。
光照周期对顶丝藻藻胆蛋白含量的影响可由图8可得知，顶丝藻藻红蛋白及副藻蓝蛋白含量不会随着光照周期改变而有所差异，而藻蓝蛋白含量则会随光照期时间上升而增加。
综合上述结果，因顶丝藻生长量会随着光照期时间的上升而上升，但藻红蛋白含量无明显差异，所以培养光照周期以16L:8D为较佳。
实施例4、光照质量对顶丝藻生长量及藻红蛋白含量的影响评估
评估方式：使用实施例1所述的方法培养顶丝藻，将该培养环境的培养温度固定为22℃、培养照度固定为100μE、培养光照周期固定为16L:8D，并进一步加入不同光照质量条件，分别为，白光(White light，W)、红光(Red light，R)、绿光(Green light，G)及蓝光(Blue light，B)，总共4组(如表3所示)，以了解光照质量对顶丝藻生长量及藻红蛋白含量的影响；其中该白光的波长为全波长；该红光的波长为428nm；该蓝光的波长为400～499nm，较佳为460nm；该绿光的波长为500～599nm，较佳为509nm。培养时每3天换一次海水并秤重做纪录，秤重时用200目浮游生物网过滤后，以2000rpm离心5分钟将顶丝藻藻体所附带的海水滤除再进行秤重，共培养15天，并于培养结束后以实施例2所述的方法进行比生长率计算及藻胆蛋白含量的测定。
表3、光照质量对顶丝藻生长量及藻红蛋白含量的影响评估的各组培养条件
组别 光照周期 温度(℃) 照度(μE) 光照质量
1 16L:8D 22 100 白光(W)
2 16L:8D 22 100 红光(R)
3 16L:8D 22 100 绿光(G)
4 16L:8D 22 100 蓝光(B)
光照质量对顶丝藻生长量及比生长率的影响可由图9得知，顶丝藻的生长量以使用白光培养为最佳，绿光及红光培养为次的，蓝光培养为最差。
光照质量对顶丝藻藻胆蛋白含量的影响可由图10得知，使用蓝光和绿光培养可增加顶丝藻藻红蛋白含量，使用红光培养则会造成顶丝藻藻红蛋白含量下降。另外，当使用红光培养时，顶丝藻藻蓝蛋白含量会显著上升；而顶丝藻在红光、蓝光及绿光培养下，其副藻蓝蛋白含量都高于使用白光培养。
综合上述结果，顶丝藻生长量在使用白光培养为最佳，但使用蓝光及绿光培养则可提升顶丝藻藻红蛋白含量，所以培养顶丝藻时可给予白光并辅以蓝光及绿光的照射使藻红蛋白含量上升。
本发明所提供的培养方法可增加顶丝藻的生长量，并提升顶丝藻中藻红蛋白的含量。为避免顶丝藻藻胆蛋白中的藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白含量过高，影响后续的藻红蛋白纯化，本发明所提供的培养方法亦可在使顶丝藻生长量及藻红蛋白含量皆有所提升的同时，不让藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白含量跟着一起增加。使用本发明所提供的方法培养出的顶丝藻，其藻红蛋白含量高，具有经济价值高的优势，且由该顶丝藻所析出的藻胆蛋白，其藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白的占比较一般藻胆蛋白低，有利于后续藻红蛋白的纯化。
于本说明书较佳实施例揭示的内容，本发明所属领域具有通常知识者可明显得知前述实施例仅为例示；具本发明所属技术领域通常知识者可藉由诸多变换、替换而实施，而不与本发明的技术特征有所差异。依据说明书实施例，本发明可有多种变换仍无碍于实施。本说明书提供的请求项界定本发明的范围，该范围涵盖前述方法与结构及与其相等的发明。
以上对本申请所提供的技术方案进行了详细介绍，本申请中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变的处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (9)

1.一种提高顶丝藻中藻红蛋白含量的培养方法，其特征在于，该方法包括：
将一顶丝藻置于一包含营养盐的海水培养基中，并在一培养环境中进行培养；
其中该培养环境的培养温度为18-26℃、培养照度为60～100μE，培养光照包含蓝光或绿光；其中该海水培养基是天然海水或人工海水；其中该营养盐包含硝酸钠(NaNO3)、磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)和氯化铵(NH4Cl)。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述该培养环境的培养温度为22-26℃及培养照度为60～100μE。
3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述该培养环境的培养温度为22℃及培养照度为100μE。
4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述营养盐包含70～80g/L硝酸钠(NaNO3)、4～6g/L磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)、25～28g/L氯化铵(NH4Cl)。
5.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述培养环境的培养光照周期为16小时光照8小时黑暗(16L:8D)。
6.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述培养光照包含给予白光并辅以蓝光或绿光的照射。
7.根据权利要求书1或6所述的方法，其特征在于，所述蓝光的波长为400～499nm；所述绿光的波长为500～599nm。
8.根据权利要求书7所述的方法，其特征在于，所述蓝光的波长为460nm；所述绿光的波长为509nm。
9.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述培养方法不提高顶丝藻中藻蓝蛋白和副藻蓝蛋白含量。
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刘涛 编: "《藻类系统学》", 31 August 2017 *

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