CS272792B2 - Method of 4-deoxy-13/s/-dihydro-4-iodofuricine production - Google Patents

Description

[57) Řešení se týká mikrobiologického způsobu výroby 4 '-deoxy-13(5)-dihydro-4jodrubicinu vzorce II tak, že se pěstuje za aerobních podmínek ve vodném živném prostředí obsahujícím využitelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganické soli mutanta čeledi Streptomyces peucetius, kmen M 87 F.I. (OSM 2444) za přítomnosti 4 '-deoxy-4 '-joddoxorubicinu vzorce I, ve formě hydrochloridů a výsledný 4 -deoxy-13(S)-dihydro-4’-joddoxorubicin vzorce II se isoluje ve formě hydrochloridů. Produkt má protinádorový účinek.

(11)
(13)	B 2
(51)	Int.	Cl.5
	C 07 H	15/24
	A 61 K	31/71

Vynález se týká mikrobiologického způsobu výroby 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4'-jodrubici nu. Tato látka je účinným novým protinádorovým léčivem.

Předmětem vynálezu je tedy způsob výroby 4'- deoxy-13(S)-dihydro-4^,-joddoxorubicinu vzorce II

II jakož i solí táto sloučeniny, přijatelných z farmaceutického hlediska.

Postup se provádí tak, že se pěstuje za aerobních podmínek ve vodném živném prostředí, obsahujícím využitelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganické soli mutanta čeledi Streptomyces peucetius, kmen M 87 F.I. (DSM 2444) za přítomnosti 4^,-deoxy-4'-joddoxorubicinu vzorce I

čímž dojde ke stereoselektivní redukci ketonové skupiny v poloze 13 této látky, takže vzniká pouze jeden ze dvou možných stereoisomerů 4 -deoxy-13-dihydro-4-joddoxorubicinu.

Nová sloučenina vzorce II, která byla označena FCE 24883 je použitelná jako protinádorová látka a má v případě pokusných nádorů účinek, který je srovnatelný s účinkem 4'-deoxy-4 -joddoxorubicinu vzorce I. Substrátem pro stereoselektivní redukci je semisyntetický analog doxorubicinu.

Způsob podle vynálezu je biosyntetický postup, ve kterém je mutanta čeledi Streptomyces peucetius, kmen M 87 F.I., který byl uložen ve sbírce Deutsche Sammling vom Mikroorganismem pod číslem DSM 2444 schopna stereoselektivně redukovat ketonovou funkční skupi nu v poloze 13 výchozího 4 '-deoxy-4joddoxorubicinu vzorce I. Sloučenina FCE 24883 vzorce II, která je výsledkem tohoto postupu, se hromadí v živném prostředí. Uvedenou látku je potom možno isolovat z fermentačního prostředí, koncentrovat ji a dále čistit.

4'-Deoxy-13(S)-dihydro~4joddoxorubicin vzorce II nebo jeho sůl, přijatelnou z farnaceutického hlediska je tedy možno získat tak, že se pěstuje Streptomyces peucetius kmen M 87 F.I. (DSM 2444) za přítomnosti 4'-deoxy-4'-joddoxorubicinu a potom se izoluje výsledný 4'-deoxy-13(S)-dihydro-4'-joddoxorubicin ve volné formě nebo ve formě své soli, přijatelné z farmaceutického hlediska.

Výhodná je zejména výsledná látka ve své čisté formě nebo její hydrochlorid.

Uvedenou sloučeninu je možno zpracovávat na farmaceutické prostředky, které obsahují sloučeninu vzorce II nebo její sůl, přijatelnou z farmaceutického- hlediska jako účinnou složku ve směsi s ředidlem nebo nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska.

... Mutace kmene Strepromyces peucetius subsp. aureus ATCC 31428 bylo dosaženo působením nitrosoguanidinu za vzniku laboratorního mikroorganismu, který byl označen Streptomyces peucetius kmen M 87 F.I. a který je schopen selektivně transformovat sloučeninu vzorce I na sloučeninu vzorce II. S. peucetius kmen M 87 F.I. byl uložen pod číslem DSN 2444 ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismem, NSR, a tvoří trvalou součást této sbírky.

Morfologie mutanty M 87 F.I. je nerozeznatelné od morfologie původního kmene S. peucetius ATCC 31428, avšak kultury v živném prostředí jsou jasně rozeznatelná podle svých růstových a biochemických vlastností. Mutanta M 87 F.I., nevytváří na agarových prostředích slámově žlutý až citrónově žlutý rozpustný pigment, který je charakteristickým znakem původního kmenu S. peucetius ATCC 31428.

Mimoto je mutanta M 87 F.I. schopna selektivně transformovat sloučeninu vzorce I na sloučeninu vzorce II, kdežto původní kmen S. peucetius ATCC 31428 je v tomto smyslu neselektivní. Tato vlastnost uvedené mutanty činí mutantu vysoce použitelnou ve svrchu uvedeném smyslu.

Tranformace

Stereoselektivní biologickou transformaci, která je podstatou způsobu podle vynálezu je možno uskutečnit v rostoucí kultuře S. peucetius M 87 F.I. tak, že se v průběhu inkubace přidá ke kultuře jako substrát sloučenina vzorce I.

Sloučeninu vzorce I je možno přidat ve formě hydrochloridu po jejím rozpuštění ve sterilní destilované vodě. Výhodné rozmezí koncentrace sloučeniny vzorce I v živném pro3 středí je 50 až 200 ug/1, způsob však nemá být na toto koncentrační rozmezí omezen. Uvede ný mikroorganismus se pěstuje v živném prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku, například využitelné uhlohydráty, zdroj dusíku, například využitelnou dusíkatou sloučeninu nebo bílkovinný materiál. Z využitelných výhodných zdrojů uhlíku je možno uvést glukózu, sacharózu, glycerol, škrob, kukuřičný škrob, dextrin, melasu a podobně. Výhodným zdrojem dusíku je například kukuřičný výluh, extrakt z kvasnic, sušené pivovarské kvasnice, sojová mouka, mouka z bavlníkových semen, kukuřičná mouka, kasein, rybí mouka, lihovarské výpalky, živočišný pepton, extrakt z masa, amonné soli .a podobně. S výhodou je možno užít kombinaci zdrojů uhlíku a dusíku. Není nezbytně nutné přidat k fermentačnímu prostředí stopové prvky, například zinek, hořčík, mangan, kobalt, železo a podobně, protože voda z vodovodu a nečištěné složky obsahují jako složky živného prostředí uvedené stopové prvky.

Biologickou transformaci je možno provádět 72 hodin až 8 dní. Teplota v průběhu biologické transformace se může pohybovat v rozmezí 25 až 37 °C, s výhodou se postup provádí při teplotě 29 °C. Obsah transformačních nádob se provzdušnuje protřepáváním při frekvenci otáček 250 za minutu nebo mícháním pří použití sterilizovaného vzduchu, čímž se podporuje růst použitého mikroorganismu, a tím se současně zvyšuje účinnost transformačního po stupu.

Analytické metody

Postup mikrobiologické transformace je možno sledovat tak, že se odebírají v různých časových odstupech vzorky fermentačního prostředí a tyto vzorky se potom extrahují při pH 8,0 směsí dichlormethanu a methanolu v poměru 9 : 1. V případě, že se vzorek organického extraktu podrobí chromatografii na tenké vrstvě, přičemž jako eluční činidlo se užije směs chloroformu, methanolu, kyseliny octové a vody v objemovém poměru 80 : 20 : 7 : 3, má sloučeniny FCE 24883 vzorce II střední hodnoty Rj 0,50, kdežto 4-deoxy-4'-joddoxorubicin vzorce I má R_f 0,60. Kvantitativní stanovení obou anthracyklinových derivátů je možno provést po chromatografii na tenké vrstvě při použití svrchu uvedeného elučního systému tak, že se odpovídající červeně zbarvené úseky vyjmou a vymyjí methanolem, potom se provádí spektrofotometrické stanovení při 496 nm.

Isolace

Výsledné živné prostředí, ve kterém byla sloučenina vzorce I přeměněna na sloučeninu vzorce II se zfiltruje při použití infusoriové hlinky. Červený myceliální koláč se extrahuje organickým rozpouštědlem, mísitelným s vodou, například methanolem nebo jiným nižším alkoholem, dioxanem, acetonitrilem, acetonem, s výhodou acetonem. Myceliální extrakty se spojí, odpaří se za sníženého tlaku a spojí se se zfiltrovaným fermentačním prostředím, upraví se na pH 8,0 a potom se extrahují organickým rozpouštědlem, nemísitelným s vodou, například π-butanolem, chloroformem, dichlormethanem, s výhodou směsí dichlormethanu a methanolu v objemovém poměru 9 : 1. Organické extrakty obsahují sloučeninu FCE 24883 vzorce II spolu se sloučeninou vzorce I a v menším některé degradační produkty.

Čištění

Organický extrakt se odpaří do sucha za sníženého tlaku, odparek se rozpustí v dichtormethanu a potom se chromatografie na sloupci silikagelu s pH 7 při použití stoupajícího gradientu dichlormethanu ve směsi methanolu a vody. Sloučenina I se vymývá nejprve při ob jemovém poměru uvedených látek 95 : 5 : 0,25 a potom se vymývá sloučenina FCE 24383 vzorce II. Ve směsi uvedených složek v objemovém poměru 90 : 10 : 0,5. Frakce s obsahem této látky se slijí, promyjí se vodou, odpaří se na malý objem za přítomnosti n-propanolu, přidá se ekvivalentní množství kyseliny chlorovodíkové a přebytek π-hexanu, čímž se získá sraženina čistého hydrochloridu sloučeniny FCE 24883 vzorce II.

Chemické a fyzikální vlastnosti

Sloučenina FCE 24883 vzorce II ve volné formě je rozpustná v polárních organických rozpouštědlech a ve směsi vody a alkoholů, kdežto její hydrochlorid je rozpustný ve vodě a nižších alkoholech, avšak jen málo rozpustný v organických rozpouštědlech. Hydrochlorid sloučeniny FCE 24 883 má následující fyzikální a chemické vlastnosti:

Teplota tání : 200 °C za rozkladu n -r O

Specifická otáčivost M + 188 ⁰ (c 0,05, CH,0H) ⁰ , η 0

Absorpční spektrum v ultrafialovém světle: /\ 2 max

232, 254, 290 a 480 nm ( £ ^1% = 492, 370, 127, 163).

cm

Infračervené spektrum v bromidu draselném má maxima při: 3 400, 2 970, 2 920, 1 610, 1 580,

472, 1 440, 1 410, 1 380, 1 355, 1 320, 1 280, 1 235, 1 210, 1 110, 1 080, 1 060, 1 030, 1 O1O, . 985, 965, 940, 920, 900, 890, 870, 860, 830, 810, 785, 755, 730, 710, 540, 480, 450 a 415 cm^-1.

¹H-NMR spektrum (DMSOdg, 200 MHz, 22 °C):

14,03 (široký (dále b|s, 2H, OH-6, 0H-11, 7,6 - 7,9 (m, 3H, H-l, H.-2, H-3), 5,26 (m, 1H,

Η-Γ), 4,96 (d, 0 = 5,2 Hz, 1H, 0H-13), 4,92 (m, 1H, H-7.)_t 4,55 (m, 1H, H-4'), 4,51^(t, = 6,7 Hz, 1H, 0H-14), 4,20 (s, 1H, OH-9), 3,97 (s, 3H, 4-OCH^), 3,76 (ddd, J = 3,5, 6,7,

11,0 Hz, 1H, CH (H)-OH), 3,60 (dq, 3 = 1,0, 6,0, Hz, H-5'), 3,48 ddd, J = 7,2, 6,7, 11,0 Hz, 1H, CH(H)-OH), 3,37 (ddd, 0 = 5,2, 3,5, 7,2 Hz, 1H, H-13), 3,02 (tn, 1H, H-3'), 2,81 (m, 2H, CH₂-10), 2,15 (dd, 3 = 2,0, 15,3 Hz, 1H, H-Be), 1,97 (dd, 3 = 6,0, 15,3 Hz, 1H,

H-Bax), 1,7 - 1,9 (m, 2H, CH₂-2'), a 1,14 cf(d, 3 = 6,0 Hz, 3H, CHj-5').

Molekulový vzorec: C^H^gNlO.^. HCl hmotové spektrum v ekvivalentu k volné bázi: 656 (MH)⁺, 655 (M)⁺ a 416 (M)⁺, odpovídá aglykonu.

Při vysokotlaké kapalinové chromatografii je možno od sebe oddělit dva vrcholy s dobou retence 18,8 a 19,3 minut, tyto dva vrcholy odpovídají oběma stereoisomerním alkoholům, které jsou přítomny ve vzorku syntetického 4 -deoxy-13-dihydro-4'-joddoxorubicinu, který byl připraven redukcí sloučeniny vzorce I působením borohydridu sodíku.

Při použití vysokotlaké kapalinové chromatografie se sloučenina FCE 24883 vzorce II jeví jako jediný vrchol s dobou retence 19,3 minuty, odpovídající pomaleji se pohybující

CS 272792 02 složce syntetického 13-dihydroderivátu.

Vysokotlaká kapalinová chromatografie

Sloupce: dva sloupce inatoměničové pryskyřice RP Spherisorb. S30DS2 (C18, 3(bm, Phase Sepa ration U.K) 150 x 4,5 mm, sloupce byly za sebou zařazeny v sérii.

Teplota: 45 °C

Mobilní fáze A: 0,05 M vodný roztok dihydrogenfosforečnanu draselného, upravený na pH 3,0 přidáním směsi IM kyseliny fosforečné a methanolu v objemovém poměru 80 : 20.

Mobilní fáze B: methanol

Eluce: isokraticky po dobu 30 minut (42 MA + 58 MB)

Rychlost průtoku: 0,6 ml/min.

Detekce: při 254 nm.

Osvětlení struktury

Při hydrolýze sloučeniny vzorce II v kyselém prostředí, trvající 30 minut při teplotě 80 °C v 0,2 N vodném roztoku kyseliny chlorovodíkové se·získá červená sraženina odpovídajícího aglykonu vzorce III, kdežto cukerná složka, a to .J-ámino-2,3,4,6-tetra-deoxy-4-jod-L-lyxohexohexosa, vzorce IV, přítomná ve vodné fázi byla identifikována srovnáním s autentickým vzorkem, který byl získán hydrolýzou sloučeniny vzorce I v kyselém prostředí.

Absolutní konfigurace (S)- v poloze 13 sloučeniny III byla stanovena přímým srovnáníi H-NMR spektra, hmotového spektra a chromatografie na tenké vrstvě 9,13-0-isopropylidenCS 272792 B2

-14-0-terc.butyldifenylsilylového derivátu s odpovídajícím autentickým vzorkem 13-(S)-dihydroadriamycinonu, který byl získán způsobem podle publikace S. Penoo a další, Gazzet ta Chimica Italiana, 115, 195 (1985).

Biologická účinnost

Cytotoxická účinnost sloučeniny FCE 24883 vzorce II byla zkoumána in vitro na tvorbě kolonií HeLa buněk a 'buněk 'P 388 ve srovnání s účinností sloučeniny vzorce I a doxorubicin. Jak je dále zřejmé z údajů, uvedených v tabulce I, jeví se sloučenina vzorce II stej ně účinná jako 4'-deoxy-4'-joddoxorubicin vzorce I a doxorubicin.

Protinádorová účinnost sloučeniny FCE 24883 vzorce II in vivo byla zkoumána proti roztroušené Grossově leukémii. Myši kmene C3H byly infikovány nitrožilně množstvím 2.10⁶ buněk/myš a potom léčeny uvedenými látkami 24 hodin po infekci nádorem.

V tabulce II jsou uvedeny výsledky dvou pokusů. V optimální dávce byla sloučenina FCE 24883 vzorce II účinnější, než doxorubicin a stejně účinná jako 4'-deoxy-4'-joddoxorubicin vzorce I při menší toxicitě v účinných dávkách. Protinádorovou účinnost sloučeniny vzorce II, vyhodnocenou jako střední doba přežití ošetřených zvířat proti kontrole je možno srovnat s účinností sloučeniny vzorce I a doxorubicinu.

Tabulka I

Účinnost in vitro 13-(S)-dihydro-4'-joddoxorubicinu FCE24883 vzorce II ve srovnání s účinností 4'-deoxy-4'-joddoxorubicinu FCE 21954 vzorce I a doxorubicinu (Dx)

a) sloučenina Ιϋ^θ ng/ml

Hela⁰·¹ P388^c)

Dx

FCE 21954 (I) FCE 24883 (II)

10,8 8

10,4 2,1

3,5 dávka zajištující 50% snížení počtu buněk ve srovnání s kontrolou b^buňky epithelioidního karcinomu lidského děložního krčku c^leukemické buňky P388

Tabulka II

Účinnost 13-(S)-dihydro-4'-joddoxorubicinu FCE24883 vzorce Ilfve srovnání s účinností 4'-deoxy-4'-joddoxorubicinu FCE 21954 vzorce I a doxorubicinu (Dx) proti diseminované Rossově leukémii

CS 272792 Β2

Sloučenina-	dávka a) (mg/kg)	T/CX b) -	úmrtí pro toxicitu
Dx	10	200 (200, 200)	0/20
	13	225 (230, 220)	0/20
	16,9	250 (260, 240)	2/20
FCE 21954 (I)	' 4	240 (240, 240)	0/20
	5,2	260 (260, 260)	4/20
	6,8	145 (160, 130)	19/20
FCE 24883 (II)	4	180 (180)	0/10
	5,2	220 (220, 220)	0/20
	6,8	220 (220, 220)	0/20
	8,8	140 (140)	5/9

myším C3H bylo podáno nitrožilně 2 . 10^ leukemických buněk a potom byly myši léčeny nitrožilně den po infekcí nádorem je uvedena střední doba přežití ošetřených myší/střední doba přežití kontrol x 100 vyhodnoceno na základě pitevního nálezu na myších

Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno v následujících příkladech.

Přikladl

Kultura Streptomyces peucetius kmen M 87 F.I. OSM 2444 se pěstuje 14 dnů při teplotě 28 °C na šikmém agaru na následujícím udržovacím živném prostředí (prostředí SA): glukosa 3 %, sušené pivovarské kvasnice 1,2 %, chlorid sodný 0,1 %, dihydrogenfosforečnan draselný 0,05 X, uhličitan vápenatý 0,1 X, síran hořečnatý .0,005 X, síran železnatý .

. 7Η₂0 0,0005 X, síran zinečnatý .. 7H₂0 0,0005 X, síran měňnatý . 5H₂0 . 0,005 X, agar 2X voda z vodovodu do 100 ml, pH 6,7 . Sterilizace se pro.vádí zahříváním v autoklávu 20 minut na. teplotu 115 °C.

Spory takto pěstované kultury se isolují a uvedou do suspenze ve 3 ml sterilní dešti lované vody. Suspenze se potom užije k naočkování Erlenmayerových baněk o objemu 300 ml s obsahem 60 ml následujícího kapalného živného prostředí: sušené pivovarské kvasnice 0,3 X, pepton 0,5 X, dusičnan vápenatý . 4H₂0 0,05 X, voda z vodovodu do 100 ml. Sterilizace se provádí zahříváním v autoklávu 20 minut na teplotu 120 °C. Po sterilizaci je pHn tohoto prostředí v rozmezí 6,8 až 7,0, Naočkované baňky se protřepávají 2 dny při teplotě 28 °C na rotační třepačce při frekvenci otáček 250/min. Výkyv třepačky má průměr 7 cm.

Potom se užije 1,5 ml takto vypěstované kultury k naočkování Erlanmayerových baněk o objemu 300 ml s obsahem 50 ml následujícího biotransformačního,živného prostředí: extrakt z kvasnic 1,5X, dihydrogenfosforečnan draselný 0,25 X, glukóza 1,5 X, voda z vodovodu do 100 ml. Prostředí má pH 6,9: Toto prostředí se potom sterilizuje zahříváním v autoklávu 20 minut na teplotu 115 °C. Roztok glukózy se sterilizuje odděleně a přidá se ke každé sterilizované baňce do příslušné koncentrace.

Potom se baňky inkubují stejně jako svrchu 24 hodin při teplotě 28 °C. Potom se do každé baňky přidá 1,0 ml roztoku sloučeniny I ve sterilní destilované vodě do koncentrace 5 mg/ml. Potom se baňky inkubují ještě 2 dny za protřepávání, čímž se dosáhne 70% přeměny sloučeniny I na sloučeninu vzorce II.

Příklad 2

Kultura S. peucetius kmen M 87 F.I. se pěstuje na pevném živném prostředí stejně jato v příkladu 1. Spory ze tří kultur na šikmém agaru se isolují a shromáždí do 10 ml sterilní destilované vody a takto získaná suspenze se užije k naočkování baňky s okouhlým dnem o objemu 2 litry s obsahem 500 ml růstového prostředí z příkladu 1. Baňka se inkubuje 48 hodin na rotační třepačce při 120 otáčkách za minutu při výkyvu 7 cm v průměru a při teplotě 28 °C. Celý obsah baňky se užije k naočkování fermentoru z nerezové oceli o objemu 10 litrů s obsahem 7,5 litrů biotransformačního prostředí z příkladu 1, prostředí se sterilizuje parou 30 minut při teplotě 120 °C, roztok glukózy se sterilizuje odděleně a přidá se v příslušné koncentraci ke sterilizovanému fermentoru. Potom se kultura nechá růst za míchání při teplotě 28 °C při frekvenci otáček 230 za minutu a provzdušňuje se procházejícím vzduchem v množství 0,7 litrů na litr živného prostředí za minutu.

Po-48 hodinách se přidá substrát stejně jako v příkladu 1 a kultura se inkubuje ještě 3 dny za dosažení 60% přeměny sloučeniny I na sloučeninu II.

Příklad 3 litrů fermentačního prostředí, získaného v příkladu 2 se zfiltruje při použití 2% infusoriové hlinky jako pomocného prostředku pro filtraci. Vlhký filtrační koláč se extrahuje 3 litry acetonu. Po filtraci se provedou ještě dvě extrakce acetonu, aby bylo dosaženo úplné extrakce červených pigmentů. Acetonové extrakty se slijí, odpaří za sníženého tlaku a 1 litr koncentrátu se smísí se zfiltrovaným živným prostředím a směs se důklad ně extrahuje při pH 8 směsí dichlormethanu a methanolu v poměru 9 : 1. Organický extrakt, obsahující sloučeninu I a II a některé degradační produkty se odpaří do sucha za sníženého tlaku. Odparek se rozpustí v dichlormethanu a chromatografuje na sloupci silikagelu v M/15 fosfátovém pufru □ pH 7 při použití gradientu směsi dichlormethanu, methanolu a vody. Některé degradační produkty odcházejí jako první, potom se vymyje sloučenina I směsí uvedených látek v objemovém poměru 95 : 5 : 0,25 a potom sloučenina FCE 24883 vzorce II směsí uvedených látek v poměru 90 : 10 : 0,5.

Ze spojených frakcí se po promytí vodou, zahuštění na malý objem za přítomnosti n-propanolu a přidání ekvivalentu kyseliny chlorovodíkové a přebytku n-hexanu získá ve výtěžku 60 % celkem 0,30 g čisté sloučeniny FCE 24883 vzorce II jako hydrochlorid s teplotou tání 200 °C za rozkladu. Stejným způsobem se získá také ve výtěžku 26 % celkem 0,13 g nepřeměněné sloučeniny I ve formě hydrochloridu.

Příklad4

Vzorek 200 mg sloučeniny FCE 24883 vzorce II se rozpustí v 50 ml 0,2 N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové a roztok se zahřívá 30 minut na 100 °C. Filtrací se potom oddělí 0,12 g krystalické červené sraženiny' aglykonu vzorce III, který se promyje vodou a usuší.

Hmotové spektrum: m/e 416 (M⁺). Aglykon vzorce III byl identifikován jako 13-(S)~ dihydroadriamycinon srovnáním s‘ autentickým vzorkem.

Claims (4)

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby 4^>-deoxy-13-(S)-dihydro-4 '-jodrubícínu vzorce II mikrobiologickým postupem, vyznačující se tím, že se pěstuje za aerobních podmínek ve vodném živném prostředí, obsahujícím využitelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganické soli mutanta čeledi Streptomyces peucetíus, kmen M 87 F.I. (DSM 2444) za přítomnosti 4'-deoxy-4'-joddoxoruhicinu vzorce I

I . HC1 ve formě hydrochloridu a výsledný 4'-deoxy-13-(S)-dihydro-4joddoxorubicin vzorce II se isoluje ve formě hydrochloridu.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se kultivace provádí při teplotě 25 až . ; 37 °C, s výhodou při teplotě .29 °C po dobu 72 hodin až 8 dnů.

3. Způsob podle bodů 1 nebo 2, vyznačující se tím, že s? antracyklinový glykosid vzorce H podle bodu 1 extrahuje z myceliálního koláče acetonem a ze zfiltrovaného fermentačního prostředí směsí dichlormethanu a methanolu v objemovém poměru 9 : 1 při pH 8, extrakty se spojí a odpaří se do sucha za sníženého tlaku.

4. Způsob podle bodu 3, vyznačující se tím, že se získaný surový produkt rozpustí v dichlormethanu a roztok se chromatograficky čistí na sloupci silikagelu, pufrovaném na pH 7, přičemž sloupec se vymývá nejprve směsí dichlormethanu, methanolu a vody v objemovém poměru 95 : 5 : 0,25 k odstranění nezreagované výchozí látky vzorce I a potom směsí dichlormethanu, methanolu a vody v objemovém poměru 90 : 10 : 0,5, získané frakce se odpaří za přítomnosti n-propanolu a požadovaný 4'-deoxy-13-(S)-dihydro-4'-joddoxorubicin vzorce II se isoluje ve formě hydrochloridu v čisté formě přidáním ekvivalentního množství kyseliny chlorovodíkové a přebytku n-hexanu.