CS267937B1 - Živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze, psinke, infekčnej laryngotracheit1de, infekčnej hepatitide a parainfluenze 2, a sp<?sob jej pripravy - Google Patents

Description

CS 267937 B1 1

Vynález sa týká živej atenuovanej vakclny proti parvoviróze, psinke, infekčnejlaryngotracheitide, infekčnej hepatitide a parainfluenze 2, a spásobu jej pripravy nabuňkových kulturách.

Popři všeobecne známých povodcoch virusových ochoreni psov ako sú běsnota, psin-ka a infekčná hepatitida, spolahlivo kontrolovaných efektivnymi atenuovanými vakcinamiexistuje celý rad rusov, ktoré sú p"ovodcami častých ochoreni zažívacích a dýchacích or-gánov. K týmto v prvom radě patria: parvovirus psov, povodca akútneho črevného ochore-nia postihujúceho prevažne mláďatá, virus infekčnej laryngotrachei tidy a virus parain-fluenzy 2 psov, ktoré samostatné, alebo v súčinnosti s bakteriálnym zárodkom BordetellaBronchiseptica vyvolávajú hromadné ochorenia dýchacích orgánov /Kennel cough syndrome/.Appel v roku 1978 definoval patogenitu parvovirusu psov /CPV 2/ a označil ho ako povod-ců epizoocie črevného ochorenia, ktoré sa objavilo prvýkrát v roku 1978 v USA. Ochore-nie vyvolané týmto virusom sa klinicky prejavuje nechutenstvom, malátnostou, zvracanima hnačkou, ktorá máže byt krvavá. Zvieratá majú horúčku a pri hernatologickom vyšetřenisa spravidla zistuje zničený počet leukocytov. Srdcová forma ochorenia postihuje výh-radně šteňatá a je charakterizovaná rýchlym a velmi krátkým priebehom a následné úhy-nom. Ochorenie spůsobuje výrazné straty v chovoch psov, pričom úhyn představuje 20 až40% z celkového počtu zvierat. Ochorenie postihuje všetky věkové kategorie zvierat,ale najmS šteňatá, pričom nástup je prudký a priebeh velmi rýchly.

Psi adenovirus sérotypu 2 /CAOV-2/, izolovaný a identifikovaný DITSCHFIELDOM, 1962je sérologicky, antlgénne, svojim tropizmom a klinickým prejavom ochorenia odlišný odvirusu infekčnej hepatitidy psov /ICH/.

Hemaglutinujúci virus parainfluenzy 2 /CPIV-2/, postihujúci respiratórny traktizoloval BINN v roku 1967. Pre svoju antigénnu podobnost s opičím virusom SV5 dostaloznačenie SV5- like canine parainfluenza virus.

Ochorenia vyvolané týmito virusmi majú charakter infekčnej laryngotracheitidy,tracheobronchitidy, zápalu nosofaryngu a pluc s klinickými prejavmi nádchy, spontánne-ho kašla zapříčiněného zúžením priechodnosti priedušiek a plucnej hyperventilácie do-prevádzanej zv3čšenim bronchyálnych lymfatických uzlin. Patologicko-anatomický obrazcharakterizuje infiltrácia submokózy lymfocytami, plazmatickými buňkami a neutrofilmi,proliferativna intersticiálna pneumónia, nekrotizácia bronchov a bronchioli tis. Pri in-fekcii virusom CAOV-2 sa zisíujú vnútrojádrové inklúzie lokalizované v epitel iá lnychbuňkách nosovej a faryngeálnej sliznice.

Specifická profylaxia uvedených virusových ochoreni, ktoré predstavujú v chovochpsov vážný zdravotný problém, je založená na pasivnej imunizácii podanim hyperimúnnychsér alebo imúnnych sérových globulinov, ale najčastejšie sa využiva aktivna impnizácia.Vo svete boli vyvinuté inaktivované a živé monovalentné a kombinované vakciny /CANDUR --P, HULTIHUNR7, N0BIR VAC-8H, ENDURACELLR7 - tiSR, GALAXYR-VI - USA/. First live canineparvovirus vaccine, Vet.Rec. 17, 1984, 114 No. 11, p.255> Stettner,W. - Schutzimpfungenbeim Kund, Wiener. TierSrztliche Nonatsschrift, 72, 1985, Heft 5, s.178-182., Langzei-tuntersuchung zur ImmunogenitSt eines Kombinationimpfstoffes fOr Hunde, Zygraich,N. -- Charlier,?. - Florent,G. - Gill,M.A. - a spol. Kleintierpraxis 30 1985, 45-49.

Aj keď v zastúpeni jednotlivých virusových kmeňov vo vakcinach je značná různoro-dost, všeobecne sa požaduje, aby jedna vakcinačná dávka obsahovala minimálně 10^'3 aj103/θΤΚΧ05θ z každého virusu.

Blízku antigénnu příbuznost virusov infekčnej laryngrotacheitidy /CADV 2/ a infek-čnej hepatitidy /CADV 1 Rubarttova choroba/ potvrdil Fa irchild,G. A. - Cohen,D., Sérolo-gie study of a Canine Adenovirus /Toronta MblbZI infection 1n dogs, Am.J .Vet.Res., 2 CS 267937 81

Vol.30 No. 6, 1968 p. 923-928, a ΑρρβΙ,Η. - Bistner,S.I. - Menegus,M. - a spol. Patho-genicity of low virulence strainsoof two canine adenovirus types, Am.J.Res., 34 1973,p.543-550. Preto očkovanie vnímavých zvlerat atenuovanými kmeňmi virusu infekčnej la-ryngotracheitidy vyvolává cestou sérových protllátok spolahlivú ochranu proti prirod-zenej alebo experimentálnej infekcii kmeňmi CAffV-1. Emmery,J.B. - House,J.A. - Brown,W.R. - Cross-protective Immunity to canine adenovirus type 2 by canine adenovirus type1 vyccination, Am. J.Vet. Res., Vol.39 No.11 1978 p.1778-1783. Marusyk už v roku 1972poukázal na skutečnost, že očkovanie virusom infekčnej laryngotracheit1dy spolahlivochrání proti infekcii virusom Infekčnej hepatitidy, ale naopak, očkovanie virusom in-fekčnej hepatitldy nechrání zvieratá před ochorenlm vyvolaný» virusom infekčnej laryn-gotracheitldy Harusyk,R,G., Comparison of the immunological properties of two canineadenoviruses, Canadian J.Hicrobiol, Vol.18 1972 p-817-823.

Vzhladom na všeobecný výskyt parovirózy psov a narastajúci počet respiratornýchochorenl, pri vylůčeni účinku vlrusov psinkového komplexu, postavili sme si za cietzískat alebo izolovat odpovedajúce virusové kmene s perspektivou použit ich na přípra-vu očkovacích látok. Jednotlivé izoláty virusov parainfluenzy 2, infekčnej laryngotra-cheitldy a parvovirusu sme cestou chemických, sérologických a v iro log ických metod iden-tifikovali, klonovali, potvrdili ich puritu a elektrónopticky znázornili. Po ukončeniatenuácle jednotlivých vlrusov na r3znych druhoch buňkových kultúr, uvereni ich neškod-nosti na vnímavých zvieratáeh a na základe llterárnych ůdajov Lynna,R,C., How to con-trol canine infectious trachobronchitis through vaccination, Vet.Med., June 1986 p.544--550, a i. sue pristúpili k vývojů živej atenuovanej vakclny proti parvoviróze, psin-ke, infekčnej laryngotracheitlde, infekčnej hepatitide a parainfluenze 2.

Na vysoké riziko vzniku postvakcinačných reakcii charakterizovaných uveitldou,intersticiálnou pneumóniou, připadne ložiskovou intersticiálnou nefritldou po očkovániatenuovanými vakdnami s kmeňmi CADV virusu infekčnej hepatitldy upozornili ΑρρβΙ,Μ.--Carmichael,L.E. - Rcbson,D.S., Canine adenovirus type 2 induced immunity to two cani-ne adenoviruses in pups with maternal antibody, Am.J.Vet.Res., 36 1975 p.1199-1202, a?owell,K.W., Use of canine adenovirus type 2 vaccine to control kennel cough syndrome.Vet.Med.Srnall Anim. Clin., 74, 1979, p.801-804.

Bola připravená živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze, psinke, infekčnej la-ryngotracheitlde, infekčnej hepatitide a parainfluenze 2, lyof1 lizovaná, ktorá obsahu- 2/5 je 2 ml najmenej 10J ΤΚΙΒ^θ častíc virusu psinky, kmen CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289; 10TKXPrQ častíc virusu Infekčnej laryngotracheitidy, kmeň CADV 2 H-5/85 MDCK40 CAMP v-320a 10 '5 častíc virusu parainfluenzy 2 psov, kmeň CPIV-2 BN4/85/32 CAMP V-321.

Virusový kmen parvovirusu psov s označením CPVA-BN 80/82 a zbierk. č. CAPM V-290bol adaptovaný na kultúry buniek stabilnej mačacej Unie FE. Ako rastové médium bolopoužité minimálně esendálne médium podlá Eaglea obohatená o bovinné sérum, v ktoromsa virus pomnožoval pri teplote 36 až 38 °C po dobu 4 až 8 dni. Po vytvořeni zřetelnýchcytopatických zmien sa virusový materiál zmiešal s lyofi 11začným médiom tak, aby obsa-hoval minimálně 10* ΤΚΙΟ^θ·,ml~^. Uvedený virusový kmeň sme získali z povodně v1rulent-ného visusu izolovaného z infekčných materiálov cestou sériových pasáži na mačacej li-nii označenej FE. Homogenita virusovej populácle a stabilita imunoblologických vlast-nosti sa doslahla Izolováním linie metodou hraničných riedenl so šeslnásobným opaková-ním. Výrusový kmen psinky s označením CPV-F-BN 10/83 a zbierkovým č. CAPM V-289 boladaptovaný na primárné, alebo sekundárné kultúry připravené z kuracich zárodkov a nakultúry stabilnej bunkovej I1n1e opičích ladvin VĚRO. Ako rastové médium bolo použitéminimálně esendálne médium podlá Eaglea obohatené o bovinné sérum, v ktorom sa virus CS 267937 B1 3 pomnožoval při teplote 36 až 38 °C po dobu 24 až 48 h, t.j. do vytvorenia monovrstvyna kultivačnom povrchu. Potom sa rastové médium vyměnilo za udržovacie minimálně esen-ciálně médium podlá Eaglea, v ktorom sa vakcinačný virus produkoval pri teplote 36 až 38 °C po dobu 5 až 9 dni. Po vytvořeni zřetelných cytopatických zmien sa virusový mate-4 -1 riál zmiešal s lyofili zaíným médiom tak, aby obsahoval minimálně 10 ΤΚΙΟ^θ .ml

Vakcinačný kmen virusu psinky bol vyštachtený z virusu psinkyz kmeňa Onderstepoort,atenuovaného cestou sériových pasáži na chorioalantoických blanách kuracich zárodkov,jeho adaptovanim na buňkové kultury připravené z kuracich embryi a na buňkové kulturystabilnej linie opičích tadvin VEROZ s následnou selekciou linie virusu vyznačujúcejsa vysokou irounizačnou účinnostou velmi dobrými rastovými vlastnostmi na uvedených dru-hoch tkaniva s vývojom výrazných cytopatických zmien doprevád zajúcich virusové množe-ni e.

Virusový kmen infekčnej laryngotracheitidy s označenim CADV-2 H-5/85-HDCK40 szbierkovým čislom CAPH V-320 bol adaptovaný na kultury stabilnej linie psich ledvi-nových buniek MDCK. Pri pomnožovani virusu infekčnej laryngotracheitidy sa buňkové kul-túry linie MĎCK zbavené rastového média infikovali uvedeným vakcinačným kmeňomz primultiplicite infekcie 0z1 až 0,01 a po adsorbcii virusu na buňky zaliali minimálnymesenciálnym médiom podlá Eagla. Infikované kultúry sa infikovali pri 36 až 38 °C po- čas 3 až 5 dni. Po vytvořeni zřetelných cytopatických zmien sa virusový materiál zmie-2 5 -1 šal s lyofilizačným médiom tak, aby obsahoval minimálně 10 ' ΤΚίΟ^θ . ml

Virus infekčnej laryngotracheitidy oredstavuje virulentný kmen zahraničnej prove-niencie získaný vo formě lyofilizátu infekčných tkaninových tekutin v 5. pasáži na buň-kových kul tůrách. Atenuácia virusu, homogeni ta virusovej populácie a stabilita imunobi-ologických vlastnosti sa dosiahla v 35. pasáži na b.1. HDCK. K priprave vakciny bol po-užitý virus v 40. pasáži na uvedenom druhu tkaniva atenuovaný a definovaný na našompracovisku.

Virusový kmen paranfluenzy 2 psov s označením CPIV-2 BN4/85/32 a zbierkovým čis-lom CAPH V-321 bol adaptovaný na kultúry stabilnej linie psich tadvinových buniek HDCKa na kultúry stabilnej mačacej linie FE. Ako rastové médium bolo použité minimálně esen-ciálně médium podlá Eagla obohatené o bovinné sérum, v ktorom sa virus pomnožoval priteplote 36 až 38 °C po dobu 4 až 7 dni. Rast virusu na 1 . FE je doprevádzaný zřetel-ných cytopatických zmien buňkového raonolayeru. Získané infekčně tkanivové tekutiny ob-sahujů 16 až 128 hemaglu11 načných jednotiek v 0,05 ml a infekčný titer představuje 10^ až 107'5 TKIDcn . ml-1. Po ukončeni inkubácie sa virusový materiál zmiešal s tyofilizač- 3U 45-1 ným médiom tak, aby obsahoval minimálně 10 ' ΤΚΙΟ^θ .ml . Primoizolát pomnožený vamniových dutinách 10 dňových kuracich zárodkov z vajec SPF, sme adaptovali na kultú-ry embryonálnych buniek s stabilně buňkové linie FE a HDCK. Homogenita virusovej popu-lácie a stabilita imunobio log 1ckých vlastnosti atenuovaného kmeňa sa dosiahla metodouhraničných riedeni v 32. tkaninovej pasáži.

Virusové kmene parvovirusu psov CPVA-BN 80/82 CAPH V-290, psinky CDV-F-BN 10/83CAPH V-289, infekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85 HDCK40 CAPM V-320 a parainflu-enzy 2 CPIV-2 BN4/85/32 CAPM V-321 sů uložené v Českos lovenskej zbierke mikroorganiz-mov na Výskumnom ústave veterinárneho lekárstva v Brně, Hudcova 60.

Postup výroby vakciny:

Sposob výroby vakciny je založený na tom, že uvedené vakcinačné kmene, neškodnépre všetky věkové kategorie psov a masožravých kožušinových zvierat pri lubovolnej ap-likácii, sa pomnožujú na definovaných buňkových substrátoch narastených na skle, plas-tickej hmotě, kultivovaných stacionárnym spósobom alebo v otáčaných ftašiach /rolleroch/. CS 267937 B1 připadne na mikronoslčoch.

SpSsob Infekcie bunlek FE vakcinačným virusom parvovlrózy psov:

Suspenzia bunlek o hustotě 5 až 10.10 bunlek . ml v rastovom médiu sa zmiešas vakcinačným virusom pri multiplicite infekcie od 0.0001 do 0.001. Zmes virusu a bu-niek sa inkubuje pri 36 až-38 °C -potaš 30 až 60 minút. Potom sa zmes virusu a bunieknariedi v rastovom médiu, ktoré představuje minimálně esenciálně médium podlá Eagla ssH 6,8 až 7,3 a pripravkom piatich až deviatich hmotnostných percent bovinného séra svyznačenou kvalitou.

Rovnako je možné do bunkovej suspenzie v rastovom médiu přidat inokulum vakcinač-néhc virusu o multiplicite infekcie 0,0001 až 0,001 a zmes virusu a buniek vyliat dokultivaínej nádoby.

Takto připravená suspenzia buniek za účelom pripravy vakciny sa kultivuje na skleplastickej hmotě, štaclonárnym spSsobom alebo v otáčaných ftašiach /rolleroch/, případne na mlkronosičoch, pri 36 až 38 °C počas 4 až 8 dni.

Možná je tiež infekcia prichytených buniek na kultivačnom povrchu - po štvor ažšeslhodlnovej 1nkubác1i bunlek linie FE pri 36 až 38 °C. Do rastového média sa přidáinokulum vakcinačného virusu pr1 multiplicite infekcie 0,0001 až 0,001. Inkubácia pok-račuje pr1 36 až 38 °C počas 4 až 8 dni. Množenie virusu je rovnako ako v bode A a Bsprevádzané výraznými cytopatickými změnami.

SpSsob infekcie buniek kuracich embryonálnych fibroblastov KEB a buniek linie VĚRO vi-rusem psinky:

Buňkové kultúry KEB alebo VĚRO sa inflkujú vakcinačným kmeňom virusu psinky primultiplicite infekcie najmenej 0,005. Infikujů sa 24 až S8 hodin buňky narastené nakultivačnom povrchu tak, že sa vymění rastové médium za udržovacie, do kterého je při-dané infekčné inokulum. Udržovacie médium je pre jednotlivý druh bunlek rovnakého zlo-ženia ako rastové, ale neobsahuje sérum a má upravený obsah hydrouhločitanu sodného na0,1 až.0,2 hmotnostných percent.

Alebo sa zmes virusu a buniek nechá inkubovat počas 60 až 120 minút pri 37 °C,potom sa suspenzia buniek nariedi v rastovom médiu tak, aby obsahovala 4 až 8 . 106. »1 buniek v rastovom médiu.

Rovnako je možné infekčné Inokulum přidal do suspenzie buniek v rastovom médiu abez predchádzajůce inkubácie nalial do kultivačnej nádoby. Za 24 až 48 hodin sa rasto-vé médium vymeni, bez oplachu jednovrstvý bunlek za udržovacie a inkubácia pokračujeza rovnakých podmienok. Po zisteni prvých cytopatických zraien /obvykle za 72 až 96 h/sa médium vymleňa v 24 hodinových Intervalech, přidá doň lyofitizačné médium a uchová-vá v zmrazenom stave až do pripravy kombinovanej vakciny před lyof111záciou, alebo sakultivácla nechá prebiehal tak dlho, dokial viac ako 50 percent jednovrstvý bunlek jepostihnuté virusšpeclfickými změnami a virusová suspenzia sa zbiera len jednorázovo.Sposob infekcie buniek MDCK vakcinačným virusom infekčnej laryngotracheitidy:

Buňkové kultúry sa inflkujú vakcinačným kmeňom virusu infekčnej laryngotracheiti-dy pri multiplicite infekcie 0,1 až 0,001. Inflkujú sa 24 až 48 hodinové buňkové kul-túry narastené na kultivačnom povrchu tak, že sa odstráni rastové médium a po 30 až 60minútovej adsorbcii virusu na buňky pri 36 až 38 °C sa přidá udržovacie médium. Udržo-vacie médium je rovnakého zloženia ako rastové, ale neobsahuje sérum. Inkubácia pokra-čuje pri 36 až 38 °C počas 3 až 5 dni.

Rovnako je možné infekčné inokulum přidat do suspenzie buniek v rastovom médiu a CS 267937 31 5 bez predchádzajúcej inkubácie naliat do kultivačnej nádoby. 2a 24 až 48 hodin sa ras-tové médium vymeni, bez oplachu jednovrstvý buniek za udržovacie a inkubácia pokraču-je za rovnakých podmienok počas 3 až 5 dni. Kultivácia sa v obidvoch prlpadoch necháprebiehat tak dlho, dokial viac ako 80 percent jednovrstvý buniek je postihnuté virus-špecifickými změnami.

Sposob infekcie buniek FE alebo buniek MDCK vakcinačným virusom parainf luenzy 2 psov:

Suspenzia buniek FE alebo buniek MDCK o hustotě 5 až ,10.106.ml“1 v rastovom médiusa zmieša s vakcinačným virusom pri multiplicite infekcie od 0,001 do 0,01. Zmes viru-su a buniek sa inkubuje pri 36 až 38 °C počas 30 až 60 minut, potom sa nariedi v ras-tovom médiu, ktoré pri obidvoch buňkových liniách představuje minimálně médium podláEaglea s pH 6,8 až 7,3 a pridavkom piatich až desiatich hmotnostných percent bovinné-ho séra.

Rovnako je možné do bunkovej suspenzie v rastovom médiu přidat inokulum vakcinač-ného virusu o multiplicite infekcie 0,001 až 0,01 a tuto ihned vyliat do kultivačnej nádoby. Inkubácia pokračuje pri 36 až 38 °C počas 4 až 7 dni. Rast virusu na linii FE jedoprevádzaný vývojom zřetelných cytopatických zmien buňkového monolayeru. ?o ukončeni kultivácie sa infekčné tekutiny jednotlivých vlrusov zmiešajú s lyo- filizačným médiom v pomere 50 až 75 hmotnostných percent virusu k 50 až 25 hmotnostných percent lyofi lizačného média a uchovávajú pri -15 až -20 °C až do lyofi 11zácie. Lyofi- lizačné médium je možné pri zachovaní rovnakých hmotnostných pomerov přidávat až těsna před kotnpletlzáciou a lyofilizáciou vakclny. Na přípravu lyofi lizovanej vakciny sa po-4 -1 užljú infekčné tekutiny s obsahom minimálně 10 ΤΚΙΟ^θ . ml částic virusu CPVA-BN80/82 CAMP V-290, 104 ΤΚΙΰ^θ častiv virusu CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289, 103 ΤΚΙΟ^θ čas-tiv Virusu CADV-2 H-5/85 MDCK40 CAMP V-320 a 105 ΤΚΙΟ^θ částic virusu CPIV-2 BN4/85/32CAMP V-321, bakteriologicky sterilné. Takto připravené virusové suspenzie zmiešané vpomere 0,5 dielu parvovirusu + 1 diel virusu psinky + 1 diel virusu infekčnej la ryn-gotracheit1dy + 1 dlel virusu parainfluenzy 2 s lyofili začným médiom, ktoré obsahujesacharózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodný alebo draselný, bovinný albumin ale-bo iný zdroj bielkovin, dextrán alebo želatinu /BOVARNICK,M.R. - MILLER,J.C. - SNYDER,J.C., The influence of certain salts, amonoacids, sugaes, and proteins on the stabili-ty of rickettsiae. J.Bacteriol., 59, 1950,: 509-522/ sa formě homogenizátu rozplňujúdo ampuliek alebo liekoviek, lyofilizujú, vzduchotěsně uzatvorla a uchovávajú pri chladničkovej teplote. Vakclna připravená podlá uvedeného postupu obsahuje v jednej aplikač-nej dávke najmenej 103 ΤΚΙΟ^θ virusu psinky, 102'3 ΤΚΙΰ,-θ virusu infekčnej laryngotra-eheitidy a 104'3 ΤΚΙΟ^θ virusu parainfluenzy 2, čo představuje jednu imunizačnú dávku.Pri klad 1

Sposob. kultivácie:

Suspenzie buniek FE, MDCK, VĚRO, připravené pomocou proteolytických fermentov asuspenzia buniek kuracich embryonálnych buniek /KEB/, připravená pomocou proteolytic-kých fermentov z 11 dňových kuracich zárodkov v rastových médiách, ktoré obsahujú de-finované množstvo aminokyselin a vytaminov s pridavkom 5 hmotnostných percent séra prikulturách KEB a VĚRO a 10 hmotnostných percent séra určeného pre tkaninové kultury prikulturách FE a MDCK sa kultivujú na skle ájtacionárnym spbsobom a v suspenzii. Přiklad 2

Sposob infekcie buňkových kultur vakcinačným virusom parvovirusu psov:

Buňkové kultúry připravené a pěstované podlá bodu 1. sa infikujú vakcinačným v1-rusom CPVA-BN 80/82 při multiplicite infekcie najmenej 0,001 nesledovými spířsobmi: 6 CS 267937 B1 aZ Suspenzia buniek linie FE o hustotě 10.106 buniek . ml”1 v rastovom médiu sa zmie-ša s vakcinačným virusom při multiplicite infekcie 0,001. Zmes virusu a buniek sainkubuje pri 37 °C počas 30 minút. Potom sa zmes virusu a buniek nariedi v rasto-vom médiu, ktoré představuje minimálně esenciálně médium podta Eaglea s pH 7,1 apridavkom 10 hmotnostných percent bovinného séra. 5 -1 bZ Do suspenzle buniek linie FE o hustotě 5.10 , ml v rastovom médiu sa přidá ino-kulum vakcinačného virusu o multiplicite infekcie 0,001 a infikovaná suspenzia saihned vyleje do kultivačnej nádoby. Takto připravená suspenzia buniek za účelompřípravy virusu do «akciny sa kultivuje v Rouxových flašiach pri teplote 37 °C po-čas 6 dni. cZ Infekcia prichytených buniek na kultivačnom povrchu po šesthodinovej kultiváciibuniek FE pri 37 °C sa do rastového média přidá inokulum vakcinačného virusu primultiplicite infekcie 0,001. Inkubácia pokračuje pri 37 °C počas 6 dni. Množenievirusu je rovnako ako v bode a/ a bZ sprevádzané výraznými cytopatickými změnami.

Vakcinačný virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kulturách FE pěsto-vaných podlá bodu 1 a infikovaných podlá bodu 2. Po vytvořeni rozsiahlych cjitopatic-kých zmien stanovených mikroskopicky sa kultivácia ukonči a do kultivačného média spomnoženým virusom sa přidá priamo do kultivačných nádob lyofilizačné médium v pomě-re 50 hmotnostných percent virusovej suspenzie a 50 hmotnostných percent lyofilizač-ného média. Zmes sa uchovává v kultivačných nádobách v zmrazenom stave. Přiklad 3

Sposob infekcie buňkových kultOr vakcinačným virusom psinky:

Inokulum vakcinačného virusu, v ktorom je virus stabilizovaný pridavkom 10 hmot-nostných percent dimetylsulfoxidu sa uchovává v zmrazenom stave pri -70 °C.

Buňkové kultúry připravené a pěstované podlá bodu 1 sa infikujů najmenej 0,005nasledovnými spísobmi: a/ Infekcia narastenej jednovrstvý buniek KEB: Z monovrstvy buniek sa po 24 hodinovom raste odstráni rastové médium a buňková kultú-ra sa infikuje inokulom přidaným do udržovacieho média, ktorým sa nahradí rastoizé mé-dium. 7 -1 bZ Suspenzia buniek v rastovom médiu s hustotou 10 .10 buniek sa zmieša s inokulom vakcinačného virusu a zmes inkubuje pr1 37 °C počas 30 minút, po ukončeni infekcie sa5 “1 infikovaná suspenzia buniik nariedi v rastovom médiu tak, aby obsahovala 4.10 . mlbuniek v 1 ml a kultivuje sa pri 37 °C 48 hodin, t.j. až do vytvorenia upínej jedno-vrstvý buniek na kultivačnom povrchu. Potom následuje výměna rastového média za udr-žovacie. 5 -1 cZ Do bunkovej suspenzie KEB v rastovom médiu a hustotou 4.10 . ml sa přidá inoku- lum vakcinačného virusu. Suspenzia sa ihneá vleje do kultivačnej nádoby a inkubuje sapri 37 °C počas 24 hod. t.j. až do vytvorenia jednovrstvý buniek. Potom následuje vý-měna rastového média za udržovacie.

Vakcinačný virus sa produkuje v udržovacom médiu, ktoré je svojlm základným zlo-ženim rovnaké ako rastové minimálně esenciálně médium podlá Eaglea s tým rozdielom,že neobsahuje sérum a koncentrácla hydrouhličitanu sokného sa pohybuje do 0,30 hmot-nostných percent. Virus z buňkových kultúr pěstovaných podlá bodu 1. a infikovaný podla bodu 3, sa získá nasledovnými spcsobmi: CS 267937 B1 7 e,l Udržovacie médium sa ponechá bez výměny na kulturách až do vytvorenia rozsiah-lych cytopatických zmien stanovených mikroskopicky. Do udržovacieho média s virusom sapřidá priamo do kultivažných nádob lyofilizačné médium v pomere 2 diely virusovej sus-penzie a jeden diel lyofilizačného média. Zmes sa ďalej uchovává v kultivažných nádo-bách v zmrszenom stave. b/ Po objaveni sa prvých priznakov Specifických cytopatických zmien sa udržovaciemédium zleje a do kultivažných nádob naleje rovnaké množstvo udržovacieho média. Pos-tup sa opakuje v 24 hodinových intervaloch až do vytvorenia rozsiahleho cytopatickéhoefektu, kedy sa konečné ošetrenie vykoná podta bodu a/. Do virusovej suspenzie ziska-nej pri opakovaných výměnách udržovacieho média sa bezprostredne po zliati přidá lyo-filizačné médium a ďalej sa uchovává v zmrazenom stave. Přiklad 4

Sposob infekcie buňkových kultur vakcinačným virusom infekčnej laryngotracheitidy:

Buňkové kultúry připravené a pěstované podta bodu 1. sa infikujú vakcinačným vi-rusom CADV-2 H-5/85 MDCK40 pri multiplicite infekcie najmenej 0,01 nasledovnými spo-sobmi: a/ Infekcia narastenej jednovrstvý buniek MDCK: Z monovrstvy buniek sa po 48 ho-dinovom raste pri 37 °C odstráni rastové médium, ktoré představuje minimálně esenciál-ně médium podta Eaglea a buňková kultůra sa infikuje adsorbéiou virusu na buňky po do-bu 60 «inút pri 37 °C. Potom sa přidá udržovacie médium, ktoré je rovnakého zloženiaako rastové, ale neobsahuje sérum. 5 -1 b/ Do bunkovej suspenzie v rastovom médiu s hustotou 4.10 . ml sa přidá inoku-lum vakcinačného virusu. Suspenzia sa ihned vleje do kultivačnej nádoby a inkubuje sapri 37 °C počas 48 hodin, t.j. až do vytvorenia jednovrstvý buniek. Potom následujevýměna rastového média za udržovacie a inkubácia pokračuje pri 37 °C počas 2 dni. Mno-ženie virusu je v obidvoch pripadoch sprevádzané výraznými cytopatickými změnami bun-kovej jednovrstvý. Vakcinačný virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kultu-rách MDCK pěstovaných podta bodu 1. a infikovaných podta bodu 4. Po vytvořeni rozsiah-lych cytopatických zmien sa kultivácia ukonči a do kultivačného média s pomnoženým vi-rusom sa přidá priamo do kultivažných nádob lyofilizačné médium v pomere 2 diely v1ru-sovej suspenzie a jeden diel lyofilizačného média. Zmes sa ďalej uchovává v kultivač-ných nádobách v zmrazenom stave. Přiklad 5

Sposob infekcie buniek FE a MDCK vakcinačným virusom parainfluenzy 2:

Buňkové kultúry připravené a pěstované podta bodu 1 sa infikujú vakcinačným viru-sem CPIV-2 BN4/85/32 pri multiplicite infekcie najmenej 0,001 nasledovnými spásobmi: 6 "* 1 a/ Suspenzia buniek linie FE o hustotě 10.10 . ml v rastovom médiu sa zmieša svakcinačným virusom pri multiplicite infekcie 0,01. Zmes virusu a buniek sa inkubujepri 37 °C počas 30 minút. Potom sa zmes virusu a buniek nariedi v rastovom médiu, kto-ré představuje minimálně esenciálně médium podta Eaglea a 5 hmotnostných percent bo-vinného séra. 5-1 b/ Do suspenzie buniek MDCK o hustotě 5.10 . ml v rastovom médiu sa přidá ino-kulum vakcinačného virusu o multiplicite infekcie 0,01 a infikovaná suspenzia sa ihneďvyleje do kultivačnej nádoby. Takto připravená suspenzia buniek za účelom pripravy vi-rusu sa kultivuje pri teplote 37 °C počas 5 dni. Množením virusu na buňkách FE je sprevádzané zřetelnými cytopatickými změnami bunkovej jednovrstvý. 8 CS 267937 B1 málne 10 TKID θ.f.nu m/»t 1 n3

Valsoinačný virus sa produkuje v rastovom médiu na buňkových kultúrach FE a MDCK pěs-tovaných pódia bodu 1. a Infikovaných podlá bodu 5. Po ukončeni kultivácie sa do kul-tivačného média s pomnožným virusem přidá priamo do kultivačných nádob lyofilizačnémédium v pomere 2 diety virusovej suspenzie a jeden diet lyofilizačného média. Zmessa ďalej uchovává, v kultivačných nádobách v zmrazenom stave. Přiklad 6

Priprava kombinovanej vakciny:

Na pripravu tyofilizovanej vakciny sa použijú infekčně tekutiny s obsahom mini- . ml-1 částic virusu CPVA-BN80/82, 10^ TKID,.n. ml-'' častíc virusu CDV-3 u 5 -1 TKIDjq částic virusu CADV-2 H-5/85 MDCK4O a 10 TKID50. ml částic virusu CPIV-2 BN4/85/32; bakteriologicky sterilně. Takto připravené virusové suspenziesa zmiešajú v pomere 0,5 dietu parvovirusu a 1 diel virusu psinky a 1 diel virusu in-fekčnej taryngotracheitidy a 1 diel virusu para influenzy 2. Homogenizovaný virusovýmateriál s požadovaným obsahom infekčných jednotiek sa adjustuje, lyofilizuje, vzducho-těsně uzatvori a uchovává pri chladničkovej teplote.

Vakcina připravená podta uvedeného postupu obsahuje v jednej aplikačnej dávke najmenej103 TKIĎjg parvovirusu psov, 103 ΤΚΙ05θ virusu psinky, 102'3 TKID virusu infekčnej la-ryngotracheitidy a 10^'5 ΤΚΙΟ^θ virusu parainfluenzy 2 v jednej vakcinačnej dávke.

Dokaž účinnosti kombinovanej vakciny:

Porovnanie účinnosti živej atenuovanej vakciny proti parvoviróze, psinke, infekč-nej laryngotracheitide, Infekčnej hepatitide a parainfluenze 2 s účinnostou monovalent-nej vakciny proti parvoviróze, bivalentnej vakciny proti parvoviróze a psinke a bivalen-tnej vakciny proti infekčnej laryngotracheitide a parainfluenze 2 ukončené na vnímavýchštěňatách vyjadřuji! obrazy 1 a 2. Uvedené hodnoty, zobrazené graficky predstavujú prie-merné tltre hemaglutinačne-inhibičných /HX/ protilátek proti parvovirusu, virusu infek-čnej taryngotracheitidy a virusu parainfluenzy 2, a vírus-neutralizačných protilátok/VN7 proti virusu psinky. Z předložených výsledkov je zřejmé, že po očkováni polyvalen-tnou vakcinou boli proti očakávaniu zistované hodnoty Specifických pootilátok na rovna-kej úrovni, alebo vyššie ako po aplikácii mono. resp. bivalentných vakcin. Navodenietakejte imunitnej odpovede sa nepředpokládalo a nebolo doposial zistené. Z výsledkov tabulky 1 vidiet, že vakcinované ani kontrolně zvieratá nereagovalina infekciu terénnym kmeňom parvovirusu psov zaznamenatelnou poruchou zdravotného sta-vu. Tieto nálezy sú v súlade s údajmi autorov McAdaragh,J.P. - Eustis,S.t. - Nelson, D.Tí - a spol., Experimente l infection of conventlonal doge with vanine parvovirs. A. J . Vet ,Res.,Vol 43 No.4, 1982 p.693-696; Pollock, R.V.H. - Carmichael,L.E., Dog respon-se to inactivated eanlne parvovirus and feline panleukopenia virus vaccines. Corne(,lVet.1982, 72, 16-35 a i., že infekcia vnímavých zvierat terénnymi kmeňmi psieho parvo-virusu ostane bez preukazného klinického prejavu. Po infekcii virulentným virusom psin-ky ostali zdravé všetky vakcinované zvieratá, &amp;ým z dvoch kontrolných zvierat jedno u-hynolo a druhé vykazovalo charakteristické příznaky psinkového ochorenia. Výsledok če-lenže vakcinovaných zvierat virusom parainfluenzy 2 je charakteristický pre Infekciukonvenčných zvierat týmto virusom, ktorého patogenita je determinovaná účastou dalšíchinfekčných činitelov na vzniku choroby.

Pri upínej chránenosti vakcinovaných zvierat na infekciu virusom infekčnej laryngotra-cheitidy, reagovali obidve kontroly predchodným ale zjavným ochorenim dýchacích ciest.

Rovnako ostali klinicky zdravé všetky vakcinované zvieratá infikované virusom infekčnejhepatitidy, čo je prejavom blízkých antigénnych vztahov obidvoch virusov a križovejchránenosti zvierat očkovaných virusom infekčnej laryngotracheitidy proti infekcii vi -

Claims (5)

1. CS 267937 B1 9 rusom infekčnej hepatitidy. Obidve nevakcinované kontroly reagovali na infekciu vývo-j om klinických přizná kov charakteristických pre Rubatthovu chorobu /infekčnú hepatiti-du psov/. ZVIERATÁ INFEKCIA VÍRUSOM POÍET ZVIERAT VÝSLEDKY bez klín. pri znakov klinicky choré úhyn CPV 3 3 0 0 CDV 3 3 0 0 Va kc i no- CPIV-2 3 3 0 0 váné CADV-2 3 3 0 0 CADV-1 3 3 0 0 CPV 2 2 0 0 CDV 2 e 1 1 Kontroly CPIV-2 2 1 1 0 CADV-2 2 0 2 0 - CADV-1 2 0 2 0 Tab. č. 1 P R E D Μ E T VYNÁLEZU

   1. Živá atenuovaná vakcina proti parvoviróze s obsahom kmeňa CPVA-BN 80/82 V-290 v množštve Í03 TKIDj-g, psinke s obsahom kmeňa CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289 v množstve 103ΤΚΙΟ,-θ, infekčnej laryngotracheitide, infekčnej hepatitide a parainfluenze 2 vyzna-čujúca sa tým, že obsahuje v 2 ml kmen parvovirusu psov CPVA-BN 80/82 CAPM V-290 vmnožstve najmenej 103 TKIDSO, kmen virusu psinky CDV-F-BN 10/83 CAPM v-289 v množ-stve najmenej 103 ΤΚΙΟ^θ, kmen virusu infekčnej laryngotracheitidy CADV-2 H-5/85MDCK 40 CAPM V-320 v množstve nejmenej ΙΟ^'® ΤΚΙΟ^θ a kmen parainfluenzy 2 CPIV-2BN4/85/32 CAPM V-321 v množstve najmenej 10^'4 5 TKIO^g částic virusu a lyofilizačnémédium.
2. 2. Živá atenuovaná vakcina podlá bodu 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje lyofilizačnémédium v množstve 25 až 50 hmotnostných percent vztiahnuté na hmotnost celej vakci-ny.
3. 3. Živá atenuovaná vakcina podlá bodu 1 a 2 vyznačijúca sa tým, že lyofilizačné médiumobsahuje sacharózu, fosforečnanový pufor, glutamát sodný, alebo draselný, bovinnýalbumin alebo iný zdroj bielkovin a želatinu alebo dextrán.
4. 4. Sposob výroby vakciny podlá bodu 1 kultlvációu parvovirusu CPVA-BN 80/82 CAPM V-290a virusu psinky CDV-F BN 10/83 CAPM V-289 známým spíJsobom vyznačujúci sa tým, že sakultiváty parvovirusu a virusu psinky zmiešajů s kultivátom virusu infekčnej laryn- gotrachei tidy CADV-2 H 5/85 MDCK40 CAPM V-320 získaným pomnožením na stabilnej li-nii buniek MDCK po 30 až 60 minútovej infekcii 24 až 48 hodinovej monovrstvy v mi- 10 CS 267937 B1 nlmálnom esenclálnom médiu podta Eaglea při teplote 36 až 38 °C po dobu 3 až 6 dni,až do vytvorenla cytopatických zmlen, zmlešaným s lyof1l1začným médiom na obsah mi-nimálně 103 TKIDjg. ml-1 a s kultlvátom virusu paralnfluenzy 2 psov CP1V-2 BN4/85/32CApM V-321 získaným pomnožením na stabllných Hnlách FE a MOCK v mlnimálnom esenclálnom médiu podta Eaglea a pH 6,8 až 7,3 obohatenom o bovinné sérum pri teplote od 36do 38 °C po dobu 4 až 8 dni doplněným lyof11i začným médiom na minimálně 103 TKIDjg. . ml~^ a táto zmes vlrusov sa lyofiHzuje
5. 5. Sposob výroby vakdny podta bodu 4 vyznačujúci sa tým, že sa lyofilizačné médiumpřidává k virusovým suspenzlám bezprostredne po 1ch získaní a zmes sa uchovává aždo lyoflHzáde v zmrazenom stave, alebo sa lyofilizuje okamžité. 2 výkresy