CS250799B1 - Živá atenurvaná vakcína proti psinke a spňsob jej přípravy - Google Patents

Abstract

Vynález sa týká živé] atenuovanej vakcí- ny proti psinke a sposObu jej přípravy na buňkových kutlúrach. Psinka je virusové ochorenie psov a masožravých kožušinových zvierať, ktoré sa prejavuje katarálnym zápalom slizníc dý­ chacích a tráviacich ústrojov a častými změnami na centrálnom nervovom systéme. Ochorenie spósobuje značné straty, keďže mortalita dosahuje priemerne až 50 %. Psinka je obávanou chorobou predovšetkým vo vačších chovných staniciach psov a veťkochovov masožravých kožušinových zvierat, pretože pri jej výskyte hromadné hynú najma mláďata.

Description

ČESKOSLOVENSKÁ SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA (19) POPIS VYNALEZU K AUTORSKÉMU OSVEDÉENIU 250799 (11) (PÍ) XS, (51) Int. Cl.4 A 61 K 39/175 /☆X (22) Přihlášené 31 07 85 (21) (PV 5592-85) ÚftAD PRO VYNÁLEZY (40) Zverejnené 18 09 8S (45) Vydané 15 07 88 A OBJEVY (75)

Autor vynálezu

SALAJ JURAJ MVDr,, ŽUFFA TOMÁŠ MVDr., ZAJAC JÁN MVDr., NITRA (54) Živá atenurvaná vakcína proti psinke a spňsob jej přípravy 1

Vynález sa týká žívej atenuovanej vakcí-ny proti psinke a sposobu jej přípravy nabuňkových kutlúrach.

Psinka je virusové ochorenie psov a ma-sožravých kožušinových zvierať, ktoré saprejavuje kafcarálnym zápalom slizníc dý-chacích a tráviacich ústrojov a častýmizmenaimi na centrálnom nervovom systéme.Ochorenie spósobuje značné straty, keďžemortalita dosahuje priemerne až 50 %. Psin-ka je obávanou chorobou predovšetkým vovačších chovných staniciach psov a vefko-chovov masožravých kožušinových zvierat,pretože pri jej výskyte hromadné hynú naj-ma mláďata.

Ochorenie vyvolává ‘virus patriaci do sku-piny nehemaglutinujúcich paramyxovíru-sov, ktorý obsahuje ribonukleová kyselinu,je pH-labilný, éter-senzitívny, s helickousymetriou a obalom. Odolný je voči vysch-nutiu a voči mrazu, znáša lyofilizáciu. Vi-rus psinky sa vylučuje z infikovaného orga-nizmu prakticky všetkými výlučkami, naj-ma výtokmi z očí a nosa, monom a výkalmi.Prirodzená infekcia vnímavého organizmunastáva cez horné dýchacie cesty, cez ústnudutinu a mandle. Málo vnímavé voči in-fekcii sú mláďata, ktoré sú chráněné speci-fickými protilátkami získanými od matky.

Specifická profylaxia je založená na pa- 2 sívnej imunizácii podáním hyperimúnnehoséra alebo imúnnych sérových globulínov,ale najčastejšie sa využívá aktívna imuni-zácia. Spočiatku to boli inaktivované vakcí-ny připravované zo suspenzii orgánov ex-perimentálně infikovaných psov, pričom vi-rus bol inaktiivováný formaldehydom. Nazvýšenie účinku sa k inaktivovanému anti-génu přidával gél hydroxidu hlinitého. In-aiktivované valkcíny vyvolajú len ,krátkodo-bá imunitu a na jej prehíbenie je potřebnéopakované očkovanie, připadne aj s použi-tím živého virulentného virusu (TAMOGLIA,T. W.: Inactivated canine distíemipor viruisvacclne. J. Amer. Vet. Med. Assoc., 149,1966, 5: 640 alž 647 J. Najvačšie uplatneniedosiahli pri aktívťnej imunizácii vakcíny bb-sahujúce živý atenuovaný virus psinky. A-tenuacia sa dosiahla, pasážovanim povodněvirulentných kimeňov na fretkách (kmenGreen) alebo kuřácích embryách (kmeneOnder-sfcepoort, Lederle, Wisconsin a pod.),ktoré bolí neskor adaptované na buňkovýchkulturách z 1'advín fretiek a psov, resp. zkuřácích embryí. Tieto vakclny sú -neškod-né, účinné, ich příprava je poměrně jedno-duchá a v lyofilizovanoím stave sú dob-reskladovatelné (CROGHAN, D. L.: Attemua-ted live-,virus cani-ne distemper ivaccines. 250799 4 250799 3 J. Amer. Vet. Med. Assoc., 149, 196'6, 5 : 622až 665]. V dostupnej literatuře popísali adaptáciua kultiváciu atenuovaného virusu psinky vbuňkových kultúrach z kuřácích embryínásledovní autoři (KARZON, D. T. — BUS-SEL, R. W.: Cytopathic effect of canine dis-temper virus in tissue culture. Science, 130,1959, 1708—1709; JIRAN, E.: Kultivace vi-rus psinky na tkáňových kulturách. Vet.Med., Praha, 10, 1965, 2: 87—92; PRYDIE,J.: Studieis with an attenuated canine di-temper vaccine derived from chick embryocultures. Res. Vet. Sci., 9, 1968, :443—452;GÓRSKA, C.: Namnaženia wirusa nasówkiw hodowli komónek. Med. Wet., 24, 1968,9:565—569).

Citovanými autormi použité postupy súvhodné na přípravu laboratórnych vzoriekvakcíny, nakolko vyžadujú příliš vela ope-rách. Napr, pri infekci! narasitenej jedno-vrstvý buniek sa vyžaduje cpilach, adsorpciavirusu počas 1 až 2 hod, odstraňovanie in-fefcčného inckula, pričom výsledok kultivá-cie je získanie virusových suspenzií s po-měrně nízkým mnoastvom infekčného viru-su.

Velkovýrobna technológia si však vyža-duje minimálně množstvo operácií s dosa-hováním vysokej výťažnosti. To možno do-siahnúť uplatněním novších sposobov kulti-vácie s používáním kuřácích embryípochádzajúcich z chovov hydiny prostýchspecifikovaných patogénnych zárodkov(SPF), pričom připravené vakcíny musiavykazovat následovně parametre: 1. Pri dodržaní definovaných kultivač-ných podimienok je rast virusu v buňko-vých kultúrach dcpreyádzaný charakteris-tickými cytopatickými změnami, ktoré u-možňujú aj kvantitativné stanovenie obsahuvirusu. 2. Obsah virusu v lyofilizovanej vakcínenesmíe lbyť nižší aiko 103’° TKIDso. ml-1. 3. Vaikcína je neškodná pre všetky věkovékategorie psov a masožravých kožušinovýchzvierat, pričom mláďatá bez materskýchprotilátok možno úspěšně imunizovat po-čnúc vekom šest týždňoiv. 4. Vakcinačný virus sa nevylučuje z or-ganizmu očkovaných zvierat a .neprenášasa na spoluuistajnené vnímavé zvieratá. 5. Očkovanie vnímavých zvierat vyvoláčiastočnú chránenosť proti ochoreniu po-čnúc 4. až 5. dňom a úplnú chránenosť protiochoreniu aj infekcii za 2 až 3 týždne poočkovaní. 6. Imunita vyvolaná jednorázovým očko-.vaním trvá najmenej jeden rok a je dopre-vádzaná prítomnosťou sérových protilátok. 7. Potomstvo imunizovaných matiek jepasivné chráněné materskými protilátkamiaž do obdobia, v ktorom móže byť aktivněimunizované. 8. Vakcinačný virus dostatočne imunizu-je aj v kombinácii s dalšími virusovými,připadne bakteriálnyími či parazitárnymi antigénmi, a tak dovoluje přípravu viac-valenitných kombinovaných živých aj inak-tlvovaných vakcín. Táto úloha bola .vyriešená následovně:

Bola připravená živá atenuovaná vaikcínaproti psinke, lyofilizovaná, ktorá obsahujev 1 ml najmenej 103 TKIDso častíc virusupsinky, kmeň CDV-F-BN 10/83 CAPM V-289.

Uvedený virusový kmeň bol adaptovanýna primárné alebo sekundárné hutníkovéikultúry připravené z kuřácích zárodtoov.Ako rastové médium bolo použité médiumpodlá Parkera obohatené o bovínne sérum,v ktorom sa virus pomnožoval pri teplote36 až 38 °C pot dobu 24 až 48 hodin, t. j. dovytvcrenia mcnovrstvy na kultivačnom po-vrchu. Potom sa rastové médium vyměniloza udržovacie médium podlá Parkera, vktorom sa vakcinačný virus produkoval priteplote 36 až 38 °C po dobu 5 až 9 dní. Povytvoření zřetelných cytopatických zmiensa virusový materiál zmiešal s lyofilizačnýmmédiolm tak, aby obsahoval minimálně 104TKIDso . ml“1.

Vakcinačný kmeň virusu psinky s ozna-čením CDV-F-BN-10/83, uvedený v Česiko-slovenskej zbienke mikroorganizmov naVýskumnom ústave veterinárneho lekárstvav Brně, Hudcova 60 pod označením CAPMV-289 bol vyšlechtěný z virusu psinky,kmeňa Onderstepoort, atenuovaného cestousériových pasáží na chorioalantoických bla-nách kuřácích zárodlkov (HAIG, 1956, cit.ŽUFFA, A. — ŠKODA, R.: Příprava aviani-zovanej vakcíny proti psinke. Závěrečnáspráva, Bioveta, n. p., Nitra, 1959, s. 38),jeho adaptováním na buňkové kultúry.připravené z kuřácích zárodkov pochádzajú-cich z chovov prostých Specifikovaných pa-togénnych zárodkov (SPF) s následnou se-letkciou linie vyznačujúcej sa vysokou imu-nizačnou účinnosťou a velmi dobrými ras-tovými vlastnosťami na uvedenom druhutkaniva s vývojom výrazných 'cytopatickýchzmien doprevádzajúcioh virusové množenie.

Spósob výroby vakcíny je založený natom, že vakcinačný kmeň virusu psiniky,neškodný pre všetky věkové kategorie psova masožravých kožušinových zvierat priiuhovolinej aplikácii, sa pommožuje na pri-márných alebo sekundárných kultúrach ku-řácích embryonálnych buniek narastenýchna skle, plastickej hmotě, kultivovanýchštacionárnym sposobom alebo v otáčenýchflasiach („rolieroch“), připadne na mikro-nosičoch.

Kultúry kuřácích embryonálnych bunieksa pripravujú výhradně z embryí násado-vých vajec pochádzajúcich z chovov kúradolmáceho prostých Specifikovaných pato-génnych zárodkov. Na kultiváciu buniekpoužitých na pomnoženie vakcinačného vi-rusu psinky sa použijú vhodné živné média,najma tle, ktoré obsahujú definované množ-stvo aminokyselin a vitamínov, obohatenéo vhodné kultivačně sérum. 250799 5 6

Buňkové kultury sa infikujú vakcinačnýmktaeňom virusu psinky pri multiplicite in-fekcie .najmenej 0,005. Infikujú sa 24 až 48hod. buňky narastené na kultivačnom po-vrchu tak, že sa vymění pastové médiumza udržovacie, do ktorého je přidané in-fekčně inokuluim.

Udržovacie médium je rovnakého zloženiaako rastové, ale neobsahuje séruim a máupravený obsah hydrouhličitanu sodnéhona 0,2 hmot. %. Alebo sa zmes virusu a bu-niek nechá inkulboivať počas 60 až 120 min.pri 37 °C. POtom sa suspenzia buniek narie-di v rastovoim médiu tak, aby obsahovala400 000 až 800 000 buniek v 1 ml. Rovmakoje možné infekčné inokuluim přidat do sus-penzie buniek v rastovom médiu a bez pred-chádzajúcej inkubácie naliať do kultivačnejnádoby. Za 24 až 48 hod. sa rastové médiumvymění, bez oplachu jednovrstvý buniek, zaudržovacie a inkubácia pokračuje za rov-nakých podmienoik.

Po zistení prvých cytopatických zmien(Obvykle za 72 až 96 hod.) sa médium vy-mieňa v 24 hodinových intervaloch přidádoň ily.ofilizačné médium a uchovává vzmrazenom stave až do lyofilizácie, alebosa kultivácia nechá prebiehať tak dlho, do-kial' viac ako 50 % jednovrstvý buniek jepostihnutá ivírusšpecifickými změnami a vi-rusová suspenzia sa zbiera len jednorázové.

Hoímogemizovaný virusový materiál, s po-žadovaným obsahom infekčných jednotiek,ktorý neobsahuje kontaminujúce mikroor-ganizmy, sa rozplňuje do ampuliek aleboliekoviek, lyolfilizuje, vzduchotěsně uzatvořía uchovává pri chladničkovej teplote.

Uvedené příklady predmet vynálezu nijakneobmedzujú, ani nevyčerpávajú: 1. Spósob kultivácie:

Suspenzia buniek, připravená pctmocouproteolyticlkých fermentav z liánových ku-řácích zárodkov pochád,zajúcich výhradínez chovov kúra domáceho prostých specifi-kovaných patogénnych zárodkov (SPFj vrastovom médiu, ktoré obsahuje definovanémnožstvo aminokyselin a vitamínov s prí-davkom 5 hmot. °/o séra určeného pre tka-nivové ikultúry sa kultivuje na skle, plas-tickej hmotě, štacionárnym sposobom alebov otáčaných ffašiach („rolleroch“), připad-ne v suspenzii na mikronosičoch. 2. Spósob infekcie buňkových kultúr vak-cinačným vírusom:

Iinokulum valkcinačného virusu, v ktcrcimje virus stabilizovaný prídavkom 10 hmot.% dimethylsuilfoxidu; uchovává sa v zmra-zenom stave. Použitie uvedeného stabilizá-tora umožňuje uchovávat virusové inoku-lum v arorazenom stave aj pri vyšších tep-lotách ako — 70 °C. Koncentrácia dimethyl-sulfoxidu po zmiešani tookuila s pastovýmmédiom nie je toxická pre buňkové kultúry a ipreto nie je potřebné ho odstraňovat.Buňkové kultúry připravené a pěstovanépodl’a bodu 1 sa infikujú vakcinačným ví-rusom pri multiplicite infekcie najmenej0,005 nasledovnými sposobmi: a) Infekcia narastenej jednovrstvý bu-niek: Z monovrstvy buniek sa po 24hodino-vom raste odstráni rastové médium, a buň-ková kultura infikuje inokulom přida-ným do udržovacieho média, kítorým sa na-hradí rastové médium. íb) Buňková suspenzia v rastovom médius hustotou asi 10z. ml-1 buniek sa zmiešas inokulom vakcinačného virusu, a zmesinkubuje pri 37 °C počas 30 imin. Po ukon-čení adsorpcie sa infikovaná suspenzia bu-niek nariedi v rastovom médiu tak, aby ob-sahovala 400 000 buniek v 1 ml a kultivujesa pri teplote 37 aC 24 hod., t. j. až do> vy-tvoř enia úplnéj jednovrstvý buniek na kul-tivačnom ipovrchu. Potom následuje výměnarastového média za udržovacie. cj Do buňkovéj suspenzie v rastovom mé-diu s hustotou 400 000 v 1 mil sa přidá ino-kulum vakcinačného virusu. Suspenzia s-aihned vleje do knltivačnej nádoby a inku-buje sa pri 37 °C počas 24 hod., t. j. až dovytvorenia jednovrstvý buniek na kultivač-nom povrchu. Potom následuje výměna ras-tového média za udržovacie. 3. Zber vakcinačného virusu:

Vakcinačný virus sa produkuje v udržo-vacom médiu, ktoré je svojim základnýmzložením rovnaké ako udržovacie s týmrozdielom, že neobsahuje sérum a koncent-rácia hydrouhličitanu sodného sa pohybujedo 0,30 hmot. %. Virus z buňkových kultúrpěstovaných podlá bodu 1 a infikovanýchpodl'a bodu 2, sa získává nasledovnými spo-sobmi: a) Udržovacie médium sa ponechá bezvýměny na kultúrach až do vytvorenia roz-siahlych cytopatických zmien stanovenýchmikrcskppiícky. Do udržovacieho média svírusom sa přidá priamo do kultivačnýchnádob vhodné lyofilizačné médium v po-měre 2 diely vírusovej suspenzie a jedendiel lyofilizačného média. Zmes sa ďalejuchovává v kultivačných nádobách v zmra-zenom stave až do lyofilizácie. b] Po objavení sa prvých príznakov spe-cifických cytopatických zmien sa udržova-cie médium zleje a do kultivačných nádobnaleje rovnaké množstvo udržovacieho mé-dia. Postup sa opakuje v 24 hod. intervalochaž do vytvorenia rozsiahleho cytbpaitickéhoefektu po celej jednovrstvé buniek, kedysa konečné ošetrenie vykoná poďla bodu a).Do vírusovej suspenzie získanej pri opako-vaných výměnách udržovacieho média sabezprostředné po zliatí přidá lyofilizačnémédiulm a ďalej sa uchovává v zmrazenomstave.

Claims (7)

250799 7 Homogenizovaný virusový materiál s po-žadovaným obsahom infekčných jednotiek(najmenej 104 TKIDso. mto1), ktorý neobsa-huje ikontaminujúce mikroorganizmy sa roz-plňuje do amipuliek alebo liekoviek, lyofi-lizuje, vzduchotěsně uzatvorí a uchovávápri chladni,čkovej teplete. Vakcína připra-vená ,padla uvedeného postupu obsahujonajmenej ID1,0 TKÍDso.uil'1 vakcinačnéhovirusu. Podlá tohoto postupu je možné úspěšněkultivovat aj iná vakcinačné kmene virusupsinky adaptované ,na buňkové ikultúry zkuřácích embryí.

1. Živá atenuovaná vakcína proti psinkolyofilizovaná, vyznačujúca sa tým, že ob-sahuje v 1 ml najmenej 10·5 TKkkii častícvirusu psinky, kmen CDV-F-BN 10/81 CAPMV-289 adaptovaný na buňkové kultňry.

2. Živá atenuovaná vakcína proti psinkopodlá bodu 1, vyznačujúca sa iým, ke ob-sahuje lyofilizačné médium v množstvo 25až 50 hmot. % vztiahnuté na hmotnost ce lej vakcíny.

3. Sposoh výroby vakcíny podlá bedov 1a 2, vyznačujúci sa tým, že atenuovanýkmen virusu psinky, adaptovaný na buňko-vé kultury, sa ipomnožuje na primárnýchalebo sekundárných buňkových kulturáchpřipravených z kuřácích zárodkov v rasto-vom médiu pod fa Parkera ohohstenom obovínne séruim pri teplote od 36 do 38 ?Cpo dobu 24 až 48 hodin až do vytvoreniamonovrstvy na kultivačnom povrchu a po-tom sa vakcinacný virus produkuje v uidr-žiavacom médiu podlá Parker a pri teploto•od 38 do 38 °C po dobu 5 až 9 dní, až do·vytvorenia cytopatických zmien a potom savirusový materiál zimieša s lyofilizačnýmmédiam tak, aby obsahoval minimálně 10'1TKÍD50 . ml-1.

4. Sposoh výroby vakcíny podlá hodu 3,vyznačujúci sa tým, že virusové inokulumurčené na Infekciu buňkových kultů? jo sta-bilizované přídavkem 10 až 20 hmot. % di- methylsulf oxidu.

4. Příprava kombinovanej vakcíny: Lyofilizačné médium, ktoré obsahuje sa- charózu, fosforečnanový pufor, glutamáitsodný alebo draselný, bovínny albumin ale-bo iný zdroj 'bielkovín a želatinu alebo dex-tran (BJOVARNICK, M. R. — MILLER, J. C.— SNYDER, J. C.: The influence of certalnsalts, aminoacids, sugars and proteins onítbe stability of rickettsiae. ]. Bacteriol., 59,1950, : 509—552] a vyhovuje pre lyofilizáciuaj iných druhov vakcinačných vírusov. Pře-lo ak sa přidá do infekčnej suspenzie ob-sah ujúcej iný druh vakcinačného virusu,napr. kmene parvovírusov psov alebo no-riek, je možné tieto suspenzie navzájemrniešac v fubovofnom polmere a lyofilizovaf. r r E D m e τ

5. Sposoh výroby vakcíny podlá bodov 3a 4, vyznačujúci sa tým, že infekcia buniek V Y N Á L E Z U na pr idukciu virusu sa robí tak, že z naras-ienej jednovrstvý buniek sa odstráni mé-dium a virusové inokulum sa přidá do udr-žovaciebo média, buňková suspenzia s hus-totou až liV.mto1 v rastovom médiu sazmieša s virusovým inokulom, inkubuje sapri 33 až 38 nC počas 60 až 120 min., potomsa 10 až 20-krát nariedi rastovým imédiomc kultivuje pri uvedenej teplote až do vy-tvorenia jednovrstvý na kultivačnom povr-chu, do bunkovej suspenzie v rastovom mé-diu s hustotou 400 000 až 800 000 buniek v1 ml sa přidá virusové inokulum a zanes savleje do kultivačně] nádoby za uvedenýchpodmienok.

6. Sposoh výroby vakcíny pódia bodov 1cž 5, vyznačujúci sa tým, že virus na pří-pravu vakcíny sa produkuje v udržiavacommédiu až do vytvorenia rozsiahlych cyto-patických zmien a potom sa jednorázovozlieva, aleho po objavení sa prvých prízna-kov specifických zmien sa uďržiavacie mé-dium zlieva v jedmodňových intervalech aždo úplného rozrušenla jednovrstvý buniek.

7, Sposoh výroby vakcíny padla bodov 1až 0, vyznačujúci sa tým, že sa k virusové]suspenze ibezprostredne po jej získáni při-dává lyofilné médium, ktoré obsahuje sa-cherózu, fosforečnanový pufor, glutamáitsolný alebo draselný, bovínny albumin ale-bo iný zdroj bielkovín a želatinu alebodaxtran a zmes sa uchovává až do ilyoďili-zácie v zmrazenou! stave. Soverografia, n. p., závod 7, Most Cena 2,40 Kčs