CS267035B1 - Mezidruhový lymfocytámí hybridom produkující protilátku proti stadijně specifickému embryonálnímu antigénu TEC-5 - Google Patents

Abstract

Hybridom IMG CZAS TEC-05 sestrojený fúzí buňky myší myelomové linie^ P3-X63-Ag8.653 a krysí slezinné buňky, produkující protilátku proti membránovému antigénu TEC-5. Hybridom může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky pro identifikaci buněk nesoucích stadijně specifický embryonální antigen TEC-5 a pro biochemickou a biologickou analýzu cílové antigenní struktury.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a krysí slezinné buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu TEC-5, přítomnému na povrchu myších embryonálních a embryonálních karcinomových buněk.

Studium řady aspektů vývojové biologie, buněčné diferenciace i onkologie vyžaduje používání vysoce specifických protilátek, rozpoznávajících stadijně-specifické embryonální antigeny. Protilátky proti antigenům buněčného povrchu, které nevykazují vnitrodruhový polymorfismus, nelze připravit přímou imunizací zvířete jednoho druhu buňkami nebo jejich membránovou frakcí jiného druhu, tj. konvenční imunizací. Konvenční imunizace má neodstranitelnou nevýhodu v tom, že séra obsahují protilátky proti řadě membránových antigenů, z nichž některé jsou přítomny na řadě buněččných typů. Konvenční séra nelze proto běžně použít k jemnému rozlišení buněčných typů. Příprava čistého antigenů, vnodného pro konvenční imunizaci, je pracná a většinou neúspěšná.

Nevýhody konvenčních sér proti membránovým antigenům v principu odstraňuje použití hybridomové technologie. Produkt hybridomu - monoklonální protilátka - je namířen vždy proti jediné antigenní determinantě. Je-li připraven dostatečně velký soubor hybridomů, je pravděpodobné, že se z něj podaří vyhledat hybridom syntetizující protilátku, která rozpoznává antigen s vlastnostmi stadijně-specifického embryonálního antigenů, tj., že se vyskytuje jen na buňkách určitého stadia embryogeneze a na buněčných liniích, které mají některé vlastnosti embryonálních buněk.

Na povrchu embryonálních a embryonálních karcinomových buněk se nachází řada stadijně-specifických embryonálních antigenů. Podle publikovaných výsledků (souborně: Feizi, T.: Demonstration by monoclonal antibodies that carbohydrate structures of glycoproteins and glycolipids are oncodevelopmental antigens. Nature 314, 53-57, 1985; Muramatsu, T.: Cell surface glycoproteins as markers in monitoring in vitro differentiation of embryonal carcincma cells. Cell Differ. 15, 101-108, 1984) se dá soudit, že lze připravit monoklonální protilátky, které specificky reagují pouze s určitým stadiem embryogeneze.

Podstatného pokroku v analýze myší embryogeneze, buněčné diferenciace i při řešení problémů onkologie, projevujícího se v rozšíření spektra používaných signálních znaků, se dosáhne, je-li k dispozici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti nově zjištěné antigenní determinantě embryonálních a embryonálních karcinomových buněk, uložený ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1083, pod označením IMG CZAS TEC-05·

Uvedený hybridom byl získán postupem známým z odborné literatury (Kohler, G., Milstein, C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256, 495-497, 1975; Kennett, R. H., Me Kearn, T. J., Bechtol, Κ. B. (eds.) Monoclonal antibodies, hybridomas: A new dimension in biological analysis, Plenum Press, New York, London, 1980).

Pro fúzi byly použity buňky myší myelomevé linie P3-X63-Ag8.653 a buňky získané ze sleziny potkana kmene Lewis, imunizovaného buňkami embryonální karcinomové linie P19S18C1A1. Hybridom TEC-05 je možno kultivovat in vitro v médiích určených pro sevčí buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině bezthymových nu/nu myší. Z konzerv, uchovávaných v kapalném dusíku, je možno zahájit produkci protilátky, aniž by bylo nutné provádět imunizace a náročná testování na specificitu protilátek.

CS 267 035 Bl

Vý-.odou uvedeného hybridomu je, že produkuje homogenní (monoklonální) protilátku, která specificky reaguje s pozdějšími vývojovými stadii myších zárodků, počínaje csmibuněčnými zárodky a s dalšími stadii preimplantačního vývoje (lóbuněčnými zárodky, morulami, časnými a pozdními blastocystami) a nereaguje s žádnými mladšími vývojovými stadii ani s vajíčky.

Příklaž

Aby bylo možno pomnožit hybridomové buňky in vivo, bylo aplikováno 5x 10⁶ hybridomovýc.h buněk do peritoneální dutiny bezthymových nu/nu myší. Aby došlo k větší produkci ascitické tekutiny, byla myš 14 dní před aplikací hybridomových buněk ovlivněna olejem 2,6,10,14-tetramethylpentadecanem (0,5 ml intraperitoneélně). Po 14 dnech růstu hybridomu v peritoneální dutině byly z myši odebrány 4 ml ascitické tekutiny, která obsahovala přibližně 8 mg/ml imunoglobulinu.

V nepřímém imunofluorescenčním testu reagovala monoklonální protilátka s osmibuněčnými myšími zárodky a se všemi dalšími stupni preimplantačního vývoje.

Absorbční analýza ukázala, že TEC-5 antigen je přítomen pouze na omezeném počtu dospělých myších tkání (mozek, ledviny, plíce, žaludek) a na některých liniích myších emryonálnich karcinomových buněk (tabulka 1). ’

V průběhu diferenciace těchto buněk (indukované kyselinou retinovou) mizí TEC-5 antigen z jejich povrchu. Bylo zjištěno, že monoklonální protilátka TEC-05 se váže na embryoglykan; antigenní determinanta, definovaná touto protilátkou se liší od všech dosud popsaných embryoglykan-specifických monoklonálních protilátek.

Vazbu TEC-05 protilátky na embryonální karcinomové buňky (EC) je možno inhibovat 3mM laktosou a 47 mM galaktosou, ale nelze ji inhibovat řadou dalších cukrů, včetně fruktosy, N-acetylglukosaminu a N-acetylgalaktosaminu.

TEC-05 protilátka je obzvlášť vhodná pro studium struktury a funkce vývojově regulovaných struktur buněčného povrchu, protože odhaluje jemné rozdíly v cukerných komponentácn embryonálních karcinomových buněk.

Tabulka 1

Reaktivita TEC-05 protilátky s buněčnými liniemi^·

1 ................... • Buněčná linie	Charakteristika (původ)	2 * % radioaktivity vázané na buňky
Myší, odvoz, od teratokarcinomových buněk
P19X1	EC (od P19)	6,9 (5,3-8,6)
P19XT.1.1	EC (od P19X1)	< 0,2
P19S1801A1	EC (od PÍ9)	4,9 (4,1-6,4)
F9	EC (129/Sv)	8,8 (8,1-10,0)
0TF9-63	EC (od F9)	18,3 (13,3-24,3)
PYS-2	Parientální endoderm (129/Sv)	0,2
Myší transformované C13OC/E7	Neuroblastom	<0,2
BW5147	Thymom (AKR)	<0,2
X63-Ag8.653	Myelom (BALB/c)	<0,2

CS 267 035 Bl ^Původ a kultivační podmínky a exprese jiných etadijně-specifických embryonálních antigen! jsou uvedeny v práci Dráber P., Pokorná Z.: Differentiation antigens of mouse teratocarcinoma stem cells defined by monoclonal antibodies. Cell. Differ. 15, 109-113,

1984.

· 125

Byl použit přímý radioimunologický test, ve kterém I-značená monoklonální protilátka (ICO 000 cpm) byla inkubována s 0,25 x 10$ buněk a bylo stanoveno % radioaktivity vázané na buňky jak popsáno dříve (Dráber P., Stanley P.: Cytotoxicity of plent lectins for mouse embryonal carcinoma cells. Somat. Cell Genetics 10, 435-443, 1984).

Monoklonální protilátka rozpoznává antigenní determinantu, která byla označena TEC-5 a liSí se od všech doposud ve světové literatuře popsaných antigenních determinant stalijně specifických embryonálních antigenů. K vymezení unikátnosti antigenní determinanty TEC-5 bylo použito těchto přístupů:

1) Monoklonální protilátka reagovala v přímém radioimunologickém a nepřímém imunofluorescenčním testu s panelem linií embryonálních a karcinomových buněk a nereagovala s buněčnými liniemi odvozenými od diferencovaných buněk. Protilátka reagovala a osmia šestnáctibuněčnými embryi, morulami, časnými a pozdními blastocystami a nereagovala s vajíčky, ani s dvou- a čtyřbuněčnými embryi.

2) V absorbčních testech s tkáněmi z dospělých zvířat reagovala monoklonální protilátka pouze s homogenátem z mozku, ledvin, plic a žaludku a velmi slabě s homogenátem z testes a z epididymis; nereagovala s homogenáty ze svalů, srdce, jater, sleziny a thymu.

3) Při indukci diferenciace embryonálních karcinomových buněk 10^-^ kyselinou retinovou doSlc k poklesu vazby protilátky na buňky s morfologickými projevy diferenciace.

4) Monoklonální protilátka precipitovala řadu glykoproteinů buněčného povrchu o molekulové hmotnosti >· 100 000. Antigenní determinanta se nachází na vysokomolekulárním glykanu, zvaném embryoglykan. Tato protilátka nereaguje s buňkami, které jsou defektní v expresi embryoglykanu.

Buňky hybridomu TEC-05 mají morfologické znaky typické pro myelomové buňky. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. Základním kultivačním médiem je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí, doplněné o neesenciální aminokyseliny, 1-glutamin (3 mM) a pyruvát sodný (1 mM). Toto médium (označované H-MEMD, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivaci hybridomu TEC-05 doplněno penicilinem, streptomycinem a teplotně (56°, 30 min.) inaktivovaným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané), 10Ϊ. Hybridom je kultivován při 37 °C. Střední generační doba je 17 hodin. Čtyři měsíce po sestrojení byl modální počet chromozomů 75. Produkovaná monoklonální protilátka je krysí imunoglobulin třídy IgM.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem TEC-05 reaguje specificky s pozdními preimplantačními stadii myších embryí a s embryonálními karcinomovými buňkami.

Hybridom může být průmyslově využíván jako zdroj monoklonální protilátky pro identifikaci buněk nesoucích stadijně specifický embryonální antigen TEC-5 a pro biochemickou a biologickou analýzu cílové antigenní struktury.

Claims (1)

1. Mezidruhový lymfocytérní hybridem IMG CZAS TEC-05 sestrojený fúzi buňky myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a krysí slezinné buňky, produkující protilátku proti membránovému antigenu TEC-5.