CS265558B1 - Polysfrový ester glykoseminoglykanu, respektive jeho sodná sůl a způsob výroby těchto látek - Google Patents

Abstract

Řešení se týká polysírového esteru glykosaminoglykanu, resp. jeho sodné soli, významného léčiva s antiartrotickým a chondroprotektivním účinkem. Rovněž se týká způsobu výroby tohoto léčiva, a to frakcionací tzv. S-heparinu etanolem, čímž se získá žádaná substance, charakterizovaná rozpětím molekulové hmotnosti od 7 000 do 11 000 daltonů, obsahem síry od 7 do 14 S hmot. a antikoagulační účinnosti do 90 IU/mg.

Description

(57) Řešení se týká polysírového esteru glykosaminoglykanu, resp. jeho sodné soli, významného léčiva s antiartrotickým a chondroprotektivním účinkem. Rovněž se týká způsobu výroby tohoto léčiva, a to frakcionací tzv. S-heparinu etanolem, čímž se získá žádaná substance, charakterizovaná rozpětím molekulové hmotnosti od 7 000 do 11 000 daltonů, obsahem síry od 7 do 14 S hmot. a antikoagulační účinnosti do 90 IU/mg.

CS 265 558 B1

Vynález se týká polysírového esteru glykosaminoglykanu, resp. jeho sodné soli a způsobu výroby tohoto esteru, resp. jeho sodné soli.

Tato nová látka, v dalším označovaná pro stručnost heparon, má význam jako léčivo s antiarthrotiokým a ohondroprotektivnim účinkem. Získá se z pólysacharidu, odpadajícího při výrobě heparinu z hovězích plic, který má nízký obsah síry a je dodatečně sulfatován chemickou cestou a je znám pod označením S-heparin jako účinné antikoagulans. Tento sulfatovaný polysacharid se vyznačuje širokým rozmezím molekulové hmotnosti. Etanolovou frakcíonaoí se z S-heparinového komplexu oddělí heparon, sulfatovaný polysacharid s relativně nízkou průměrnou molekulovou hmotností a žádoucí nízkou antíkoagulační účinností. Zbývající frakce S-heparinu po oddělení nízkomolekulárního heparonu se tím naopak úměrně obohatí na antíkoagulační účinnosti. Vynález tedy v důsledku prakticky bezztrátové technologie poskytuje nový typ žádaného léčiva a. tim inovuje a značnou měrou i ekonomizuje celou výrobu heparinu a S-heparinu, jak je podrobněji popsáno níže.

Jak je známo, charakterizuje E. Jorpes v monografii Heparin in the Treatment of Thrombošic, Oxford Press, 1946, přirozený heparin syntetizovaný organismem savců, jako nehomogenní směs mono- až tetrasírovýoh esterů polysacharidu (s obsahem síry 6,36 až 15,81 % hmot.), uvažuje-li se disaoharidová jednotka jako základ heparinové makromolekuly. Vedle této směsi sírových esterů existuje v organismu ještě síry prostý heparinový polysacharid, konjugát uranové kyseliny s glukosaminem. Oměrně se zvyšujícím se obsahem síry stoupá antíkoagulační účinnost, síry prostý polysacharid je antikoagulačně neúčinný. Průměrná molekulová hmotnost heparinu s převahou podílu výše sulfatovaných esterů je asi 16 000 daltonů.

Při výrobě heparinu z hovězích plic (čs. pat. spis č. 91 903) se získá jednak frakce obsahující vysoce účinný heparin a jednak frakce polysacharidů s nízkým obsahem síry a nízkou antíkoagulační účinností, která tvoří odpad. Podíl této frakce je asi 6 až 8násobek hmotnosti čistého heparinu.

Uvedenou odpadní polysacharidovou frakci se podařilo výhodně zužitkovat dodatečnou chemickou sulfatací na antikoagulačně účinný produkt (čs. AO č. 217 193). Z výchozí suroviny, tj. z odpadní frakce s obsahem síry pod 3 % hmot. se tak získal produkt s obsahem síry až 13 % hmot., analogický heparinu a s antíkoagulační a antilipemickou aktivitou srovnatelnou s čistým heparinem. Tento produkt, v dalším označovaný pro stručnost S-heparin, byl zaveden do léčebné praxe jako účinná součást externě aplikovaných přípravků k léčení tromboflebitidy, hematomů apod., popřípadě sublinguálních tablet s antilipemickým účinkem.

Výsledkem dalších výzkumů v této oblasti bylo zjištění, že S-heparin, definovaný jako polysulfát glykosaminoglykanu (GAGPS), je z hlediska molekulové hmotnosti směsí frakcí asi od 5 000 do 17 000 daltonů, přičemž stupeň sulfatace je téměř rovnoměrný bez ohledu na velikost polyméru. Tento poznatek vedl k vypracováni postupu izolace určitých frakcí s poměrně úzkým rozpětím molekulových hmotností a umožnil tak získat materiály s různými biochemickými a farmakologickými vlastnostmi. Jednou z látek takového typu je frakce S-heparinu s molekulovou hmotností pod 11 000 daltonů a s obsahem síry 8 až 14 % hmot. Způsob frakoionace S-heparinu, vedoucí k izolaci jmenované frakce, označovaná jako heparon (viz výše), jsou předmětem tohoto vynálezu.

Svými vlastnostmi patří heparon mezi antiarthrotika, resp. chondroprotektiva, která jsou používána k léčení artrozy kyčelních a koleních kloubů, ďegenerativních onemocnění páteře, bolestivé ztuhlosti kloubů apod. Přesná chemická struktura heparonu není určitelná, nebot GAGPS jsou aniónické heteropolysacharidy, složené z konjugovaných hexuronových kyselin a aminocukrů. Charakteristickými rysy jsou relativně vysoký obsah síry a definované rozpětí molekulové hmotnosti.

Při studiu vlastností a biologické účinnosti byl heparon srovnáván s komerčním přípravkem z téže indikační oblasti (IX, Europáischer Kongress fiir Rheumatologie, Wiesbaden, 1979,

Internationales Arzneimittelsymposium ARTEPARON).

Antiartrotický a chondroprotektivní účinek GAGPS je výsledkem celé řady jejich nespecifických i specifických interakcí. Příkladem nespecifického působení je ínhibice proteolytických enzymů, které jsou nejvýraznějším faktorem degradace základní hmoty kloubní chrupavky. Jde zejména o kolagenázy a neutrální proteinázy serinového a thiolového typu. Příkladem specifického působení heparonu je kompetitivní ínhibice beta-glukuronidázy, která se podílí na rozkladu polysacharidových řetězců proteoglykanů chrupavky. Specifická složka antiartrotiokého účinku heparonu se projevuje zejména přímím ovlivněním artrotických chondrocytů ve smyslu narušeného metabolismu a zvýšeni biosyntézy kolagenu a proteoglykanů.

ínhibice hydrolytických enzymů in vitro heparonem ve srovnání s komerčním přípravkem byla s pomocí příslušných substrátů prokázána u kolagenázy, elastázy, katepsinu B 1, papainu, chymotrypsiiju a beta-glukuronidázy. ínhibice všech testovaných proteináz měla u obou látek velmi podobný průběh, přičemž 50 % ínhibice proteolytických enzymů bylo dosaženo při koncentracích 10 ^molárních, které odpovídají hladinám in vivo, jakých je dosahováno v lidské artrotické chrupavce i po nitrosvalové aplikaci komerčního přípravku.

Při studiu vlivu heparonu a komerčního přípravku na metabolismus kolagenu a proteoglykanů lidské osteoartrotioké chrupavky in vitro byly jako radioaktivní prekurzory použity

3

D-l( C)-glukosamin a L-(5- H)-prolin. V kolagenní frakci byl stanoven hydroxyprolin a izolován ³H-hydroxyprolin. Z frakce proteoglykanové byly izolovány proteoglykany a stanoven

3 obsah bílkovin, hexosaminu a zjištována radioaktivita- C-glukosaminu a H-prolinu jako míra inkorporace radioaktivních prekurzorů do bílkovinné a polysacharidové složky proteoglykanů. Ze získaných výsledků vyplynulo, že v přítomnosti obou preparátů se výrazně zvýšila inkorporace radioaktivních prekurzorů do kolagenní a proteoglykanové (bílkovinné i polysacharidové) frakce osteoartrotioké chrupavky o 40 až 100 %. Tento jev byl už popsán a detailně studován řadou autorů (již citováno). Bylo prokázáno, že GAGPS obecně jednak inhibují katabolické procesy chondrocytů v chrupavce a jednak přímo stimuluji biosyntézu proteoglykanů a kolagenu těmito chondrocyty. Celkový účinek se tak projevuje normalizací metabolické aktivity chondrocytů a tento děj je jedním z nejdůležitějších předpokladů antiartrotické a chondroprotektivní účinnosti GAGPS a tedy heparonu in vivo.

Dále bylo pomocí značeného Tc-heparonu a komerčního přípravku sledováno rozdělení radioaktivity v různých tkáních krys ve 24 hodině po nitrosvalové aplikaci. Významné z terapeutického hlediska je zjištění vysokých koncentrací v kloubní tkáni v blízkém sousedství místa aplikace, přičemž rozdíly mezi oběma přípravky jsou statisticky nevýznamné.

Podle vynálezu lze tedy heparon charakterizovat jako polysírový ester glykosaminoglykanu (GAGPS), resp. jeho sodnou sůl, obsahující 8 až 14 % hmot. síry, nejvýše 3 % hmot. dusíku, s molekulovou hmotností M_r 7 000 až 11 000, s antikoagulační účinností nejvýše 90 ÍU/mg (vyšší účinnost je nežádoucí z důvodů vedlejších účinků).

Vynález se dále týká způsobu výroby polysírového esteru glykosaminoglykanu - heparonu - a jeho sodné soli. Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se vodný roztok s-heparinu o hmotnostní koncentraci 4 až 5 %, s přísadou 1 % hmot. chloridu sodného, s hodnotou pH 6 až 9, při teplotě 10 až 20 °C, sráží organickým, s vodou mísitelným rozpouštědlem, zejména etanolem, do koncentrace 27 až 32 % obj., po oddělení vyloučené sraženiny 1 frakce se supernatant při teplotě 10 až 20 °C sráží organickým, s vodou mísitelným rozpouštědlem, zejména etanolem, do koncentrace 50 až 60 % obj., vyloučená sraženina 2 frakce se po oddělení a dehydrataci rozpustí ve vodě na roztok o hmotnostní koncentraci 8 až 12 %, s přísadou 1 % hmot. chloridu sodného, jenž se po úpravě pH na hodnotu 9 až 10 při teplotě 70 až 100 °C odbarvuje působením manganistanu sodného v množství 0,5 až 1 í hmot., vztaženo na hmotnost 2 frakce, vyloučená sraženina se oddělí z filtrátu po ochlazení na teplotu 15 až 25 °C přidáním organického s vodou mísitelného rozpouštědla, zejména etanolu, nejméně ve dvojnásobném objemovém přebytku, vyloučená 2 frakce se po izolaci rozpustí ve vodě na roztok o hmotnostní koncentraci až 6 %, s přísadou 1 % hmot. chloridu sodného, s hodnotou pH 6 až 10, při teplotě 10 až 20 °C, k němuž se přidá organické, s vodou mísitelné rozpouštědlo, zejména etanol, do koncentrace 27 až 32 % obj., popřípadě vzniklá sraženina se oddělí a spojí s 1 frakcí, načež se ze supernatantu zvýšením koncentrace organického, s vodou mísitelného rozpouštědla, zejména etanolu, na 50 až 60 % obj., vyloučí žádaný produkt heparonu ve formě sraženiny, která se izoluje.

Získaná substance sodné soli heparonu, jako definovaná frakce GAGPS, je bílý amorfní prášek, rozpustný ve vodě, nerozpustný v organických rozpouštědlech, netaje, rozkládá se.

K průkazu totožnosti slouží metachromatická reakce s toluidinovou modři, která je charakteristická pro GAGPS. Obsah dusíku dle Kjeldahla je nejvýše 3 % hmot. v sušině, obsah síry dle Schónigera minimálně 8 Ϊ hmot. v sušině, antikoagulační účinnost nejvýše 90 IU/mg. Molekulová hmotnost, M_r, stanovená gelovou permeační chromatografií je 7 000 až 11 000. K léčebným účelům se heparon aplikuje Injekčně v podobě 5 % vodného roztoku (váhově) a to nitrosvalově nebo nitrokloubně v 15 individuálních dávkách po 1 ml v průběhu 8 týdnů. Léčebné kůry se mohou po 6 měsících opakovat.

Vynález je blíže ilustrován následujícím příkladem provedení, přičemž ovšem není omezen pouze na podmínky v něm uvedené.

kg S-heparinu z hovězích plic a 200 g chloridu sodného se za míchání rozpustí ve 20 litrech demineralizované vody a pH vzniklého roztoku se upraví 20% roztokem hydroxidu sodného na pH 8. Za stálého míchání se při teplotě do 20 °C přidává etanol do koncentrace 27 až 30 % obj. V míchání se pokračuje ještě 10 minut a pak se nechá v klidu 24 hodin sedimentovat. Potom se supernatant oddělí a sraženina (1 frakce) se zpracuje na antikoagulačně vysoce účinný přípravek - S-heparin se zvýšenou antikoagulační účinností.

K supernatantu po oddělení 1 frakce se za stálého míchání při teplotě do 20 °C přidává etanol do koncentrace 55 až 58 % obj. a po 10 minutách mícháni se odstaví na 48 hodin k sedimentaci. Supernatant je odpad a získaná sraženina 2.frakce se dehydratuje etanolem, filtruje a suší.

100 g 2,frakce a 10 g chloridu sodného se rozpustí v 1 litru destilované vody, pH roztoku se uprav! 20% roztokem hydroxidu sodného na 9 až 10, zahřeje se na vodní lázni na 80 °C a přidá se 1 g manganistanu sodného. Roztok se za občasného zamíchání udržuje 30 minut při 80 °C. Vylučuje se voluminezní balastní sraženina hydratovaného oxidu manganičitého, nad kterou se odděluje čirý, prakticky bezbarvý roztok. Filtrací za horka přes asbestovou filtrační vložku se sraženina oddělí a promyje na filtru malým množstvím horkého 1% roztoku chloridu sodného. Filtrát se ochladí pod 20 °C a pomalým litím do pětinásobného objemu etanolu se vysráží produkt jako bílá dobře sedimentující sraženina. Supernatant se odtáhne do odpadu a sraženina se dehydratuje etanolem, filtruje a suší.

100 g tohoto produktu se rozpustí ve 2 litrech destilované vody s 20 g chloridu sodného a pH se upraví na 8. Za stálého míchání se přidává etanol až do koncentrace 30 % obj. Pokud se tvoří nějaká sraženina, nechá se 24 hodin sedimentovat, zpracuje dehydratací a sušená se spojí s 1 frakcí. Ze supernatantu se dalším zvýšením koncentrace etanolu až na 60 % obj. vysráží heparonová frakce jako konečný produkt. Po sedimentaci asi 24 hodin se sraženina dehydratuje etanolem, filtruje a na filtru promývá absolutním etanolem, eterem a suší nejprve volně a potom v exsikátoru.

Hmotnostní výtěžek konečného produktu, tj. heparonu, je asi 10 až 20 % hmotnosti výchozí substance S-heparinu.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Polysírový ester glykosaminoglykanu, respektive jeho sodná sůl, obsahující 8 až

   14 % hmotnostních síry, nejvýše 3 % hmotnostních dusíku, s molekulovou hmotností M_r 7 000 až 11 000, s antikoagulační účinností nejvýše 90 IU/mg.
2. 2. Způsob výroby polysírového esteru glykosaminoglykanu, respektive jeho sodné soli podle bodu 1, vyznačující se tím, že se vodný roztok S-heparinu o hmotnostní koncentraci 4 až 6 8, s přísadou 1 8 hmotnostního chloridu sodného, s hodnotou pH 6 až 9, při teplotě

   10 až 20 °C, sráží organickým, s vodou mísitelným rozpouštědlem, zejména etanolem do koncentra ce 27 až 32 % objemových po oddělení vyloučené sraženiny 1 frakce se supernatant při teplotě 10 až 20 °C sráží organickým, s vodou mísitelným rozpouštědlem, zejména etanolem, do koncenttrace 50 až 60 % objemových, vyloučená sraženina 2 frakce se po oddělení a dehydrataci rozpustí ve vodě na roztok o hmotnostní koncentraci 8 až 12 %, s přísadou 1 % hmotnostního chloridu sodného, jenž se po úpravě pH na hodnotu 9 až 10 při teplotě 70 až 100 °C odbarvuje působením manganistanu sodného v množství 0,5 až 1 % hmotnostní, vztaženo na hmotnost 2 frakce, vyloučená sraženina se oddělí, z filtrátu po ochlazení na teplotu 15 až 25 °C přidáním organického, s vodou mísitelného rozpouštědla, zejména etanolu, nejméně ve dvojnásobném objemovém přebytku, vyloučená 2 frakce se po izolaci rozpustí ve vodě na roztok o hmotnostní koncentraci 4 až 6 %, s přísadou 1 % hmotnostního chloridu sodného, s hodnotou pH 6 až 10, při teplotě 10 až 20 °C, k němuž se přidává organické, s vodou mísitelné rozpouštědlo, zejména etanol, do koncentrace 27 až 32 % objemových, popřípadě vzniklá sraženina se oddělí a spojí s 1 frakcí, načež se ze supernatantu zvýšením koncentrace organického, s vodou mísitelného rozpouštědla, zejména etanolu, na 50 až 60 i objemových vyloučí žádaný produkt ve formě sraženiny, která se izoluje.