CS265540B1 - Spósob izolácie alfa-amylázy z biologických materiálov - Google Patents

Description

265540 2

Vynález sa týká spósobu izolácie a čistenia enzýmu alfa - amylázy (EC 3.2.1.1.) v prie-myselnej výrobě, ktorý využiv# existenciu izoelektrického bodu tohoto enzýmu ako kritériajeho čistoty.

Podlá doterajších postupov sa alfa - amyláza vyrábala niekolkými pochodmi, zahrnujúcimizrážanie síranom amonným, etanolom,acetónom, dalej róznymi systémami gélovej a iontomeničovejchromatografie či elektroforézou v rozličných usporiadaniach. Ich spoločnou nevýhodou bolaprácnosť, náročnost na technické vybavenie pričom dosiahnutiu vyššej čistoty bránila tá skutočnost, že v konečnom stádiu izolácie bola zmes bielkovín přibližné rovnakej molekulovéj hmotnosti, kde podstatná část tvořil enzým, ale obsah příměsí bol + 5 až 10 %. Tieto balastné bielko-viny znižujú mernú aktivitu a spósobujá aj iné vedlajšie efekty, ako postupná degradáciuizolátu. V našich vynálezoch CS AO 211 856 a 234 801 sa chráni principiálně nový spósob samo-činného izoelektrického fokusovania pósobením jednosměrného prádu v rovnorodom roztoku delenejlátky, ktorý je mechanicky stabilizovaný, ako aj jednoduché zariadenie na uskutočňovaniespósobu.

Vyššie opísané nedostatky izolácie a čistenia enzýmu v podstatnej miere odstraňuje vyná-lez, ktorého podstata spočívá v tom, že dialýzou, alebo ultrafiltráciou sa upraví vodivostroztoku biologického materiálu obsahujáceho alfa - amylázová aktivitu na hodnoty 100 až800 pS.cm 1 a obsah bielkovín sa upraví na 1 až 30 g.l \ roztok sa autofokusuje jednosměrnýmelektrickým prádom pri napatí 200 až 1 000 V, roztok tvoriaci frakciu s najvyššou enzymatic-kou aktivitou, s výhodou pri pH 5,82 až 6,18 sa izoluje a podrobí deliacej technike využíva-jácej rozdielnu molekulová hmotnost dělených látok, s výhodou gélová chromatografiu, pričomv závislosti na požadovanej čistotě sa jedna alebo obe deliace techniky opakujá aspoň jeden-krát.

Vynález je vhodný pre získavanie superčistej alfa - amylázy v technologickom meradlepri výrobě tohoto enzýmu pre potřeby viacerých odvětví priemyslu. Přikladl

Bakteriálna kultura kmeňa Bacill.us subtilis sa odstředí a získaný supernatant sa zahustívo vákuovej odparke. Vodivost zahuštěného supernatantu sa dialýzou alebo ultrafiltráciouupraví na 100 až 800 p.S.cm za pridávania Mcllvariovho tlmivého roztoku 0,01 mol.l pH 6,0s obsahom citrátových iontov, ktoré stabilizujá alfa - amylázová aktivitu. Obsah bielkovínsa upraví na 10 až 30 g.l 1 riedením tlmivým roztokom. Takto upraveným roztokom sa naplníautofokusačná aparatára s počtom komórok 20 a po uzatvorení sa aplikuje jednosměrný elektrickýregulovaný prád o napStí 200 až 1 000 V regulovanom tak, aby sáčin prádu a napátia nepřekročil3 W. Autofokusácia prebieha pri chlade do +4 °C. Proces autofokusácie je ukončený, keS prinapatí 1 000 V klesne prád na nulu. Delená zmes si samočinné vytvára vzostupný gradient pH,pozdlž ktorého sa jednotlivé frakcie bielkovín formujá do vrcholov podlá svojich izoelektric-kých bodov. Alfa - amyláza sa nachádza vo frakciách s najvyššou enzymatickou aktivitou, hlavněv komórkach s pH medzi 5,82 až 6,18 pričom enzymatická aktivita sa stanovuje na základenarastajácej"Oxidačnej aktivity enzýmom štiepeného škrobu. Bielkoviny z tohoto rozmedzia sazjednotia a nanesá na kolonu rozmerov 80x50 cm naplněná molekulárnym sitom Spheron P-40,ekvilibrovaná Mcllvainovým tlmivým roztokom. Chromatografia prebieha pri 4 °C pri prietoku120 ml/h a zhromaždujá sa frakcie po 30 ml. Po ukončení gélovej filtrácie sa vo všetkýchfrakciách stanoví obsah bielkovín podlá Lawryho a alfa - amylázová aktivita ako bolo opísanévyššie. Gólovou filtráciou sa autofokusaciou izolované bielkoviny rozdelia do štyroch vrcholovkde čistá alfa -- amyláza sa nachádza v treť.om vrchole od počiatku zhromaždovania frakcií.Jednotlivé kroky možno opakovat podlá potřebného stupňa čistoty, ktorá je definovaná jednakelektroforeticky prítomnosťou jedinej linie ale tiež měrnou aktivitou, ktorá má dosiahnuťaspoň 3 U.mg podlá medzinárodného hodnotenia. Tak sa dosahuje až 99,99 %-nej čistoty enzýmu.

Claims (1)

1. 3 265540 Příklad 2 Technická alfa - amyláza, ktorá obsahuje priemerne 60 % čistého enzýmu sa rozpustív destilovanej vodě tak, aby obsah bielkovín bol 10 až 30 g.l”^. Potom sa roztok podrobíultrafiltrácii v takom usporiadaní (napr. systém AMICON) aby sa z něho eliminovali všetkymolekuly s molekulovou hmotnostou do 40 000. Výsledný roztok je zbavený solida podstatnéjčasti bielkovín a ako taký sa aplikuje do autofokusačnej aparatúry a dělí ako bolo opísanév příklade č. 1. Po zjednotení aktívnych frakcií sa získaný roztok alfa - amylázy znova pod-robí ultrafiltrácii ale tak, aby sa eliminovali všetky molekuly s molekulovou hmotnostoupod 60 000. Vo filtráte sa nachádza alfa - amyláza, ktorej molekulová hmotnost je okolo 54až 56 000. Filtrát sa aplikuje do autofokusačnej aparatúry menšieho obsahu a znova sa fokusujv podmienkach opísaných v příklade č. 1. Po ukončení fokusácie sa v komórkach s pH medzi5,82 až 6,18 nachádza superčistá alfa - amyláza, ktorá zodpovedá vyššieuvedeným kritériámčistoty. Okrem uvedených deliacich technik využívájúcich rozdielnu molekulovú hmotnost dělenýchlátok, možno autofokusáciu kombinovat tiež s elektroforézou alebo s vysolovaním. PREDMET VYNALEZU Spósob izolácie alfa - amylázy z biologických materiálov, vyznačujúci sa tým, že sadialýzou, alebo ultrafiltráciou upraví vodivost roztoku biologického materiálu na 100 až800 pS.cm 1 a obsah bielkovín sa upraví na 1 až 30 g.l a roztok sa autofokusuje jednosměr-ným elektrickým prúdom pri napatí 200 až 1 000 V, pokial prúd neklesne na nulu a roztoktvoriaci frakciu s najvyššou enzymatickou aktivitou, s výhodou pri pH 5,82 až 6,18 sa izolujea podrobí deliacej technike využívajúcej rozdielnu molekulovú hmotnost dělených látok, s výhodou gélovú chromatografiu, pričom v závislosti na požadovanéj čistotě sa jedna alebo obedeliace techniky opakujú aspoň jedenkrát.