CS265305B1 - Hybridómy produkujúce monoklonálne protilátky rozlišujúce virusy komplexu kliešfovej encefalitidy - Google Patents

Description

265305 2

Vynález sa týká hybridómov produkujúcich monoklonálne protilátky rozlišujúce virusykomplexu kliešťovej encefalitidy.

Doposial používané Specifické polyklonálne protilátky neboli schopné navzájom rozlišitvirusy kliešťovej encefalitidy v serologických technikách. Metody afinitnej chromatografieso Specifickými polyklonálnymi protilátkami boli pre diferenciáoiu virusov kliešťovej encefa-litidy nedostačujúce. Taktiež monoklonálne protilátky z myšieho lymfocytárneho hybridómu,označeného pracovným názvom KEMA, produkované do mikrokultivačného prostredia a do ascitickýchtekutin, neboli schopné nevzájom rozlíšiť virusy kliešťovej encefalitidy.

Hybridóm KEN-10-2-1 a NEK-10-2-2 bol připravený známým spósobom, klonováním skupinyhybridómov v mSkkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azopurin (8-aza-guanin) rezistentnej myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrednej liniemyší BALB/c, imunizovaných vírusom kliešťovej encefalitidy (kmeň 4 072) , získaným od choréhočlověka v r. 1966 vo Sverdlovskej oblasti, resp. vírusom kliešťovej encefalitidy (kmeň skalica)ktorý bol získaný v ČSSR v roku 1974 z hrdziaka hórneho (Clethrionomys glareolus) £"g. Kóhler, C. Milstein: Nátuře 256, 495 (1975); G. Galfre, S. C. Howe, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 (1977); M. Grešíková, M. Mrciak, V. Brtek, M. Sekeyová: 2. Internát.Arbeitskolloquium Ober Naturherde von Infektionskrankheiten in Zentraleuropa, Graz, 105,(1976)J.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje vynález ktorého podstata spočívá v myšomlymfocytámom hybridóme KEN-10-2-1, produkujúcom monoklonálne protilátky IgG a/alebo v myšomlymfocytárnom hybridóme NEK-10-2-2 produkujúcom monoklonálne protilátky triedy IgG, ktorésú schopné rozlíšiť virusy komplexu kliešťovej encefalitidy. Tieto hybridómy sú uložené voVirologickom ústave SAC, Mlýnská dolina 1, 817 83 Bratislava. Výhodou hybridómu KEN-10-2-1 je, že produkuje idiotypovo homogénne protilátky, ktoréna rozdiel od specifických polyklonálnych a monoklonálnych protilátok produkovaných myšímlymfocytárnym hybridómom KEMA, rozlíšia virus kliešťovej encefalitidy od iných virusov tohotokomplexu. Výhodou NEK-10-2-2 je, že produkuje izotypovo homogénne protilátky, tzv. monoklonál-ne protilátky, ktoré na rozdiel od Specifických polyklonálnych protilátok a monoklonálnychprotilátok produkovaných myšim lymfocytárnym hybridómom KEMA, rozlišujú virus Powassan odostatných členov komplexu virusov kliešťovej encefalitidy. Jednobunkové lymfocytárne hybridómyKEN-10-2-1 a NEK-10-2-2 rastů in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myši za súčasnej tvorbyascites. Rastů aj in vitro v kultivačných médiach vhodných pre živočišné buňky. Taktiež pozmrazení a uložení v tekutom dusíku a po opatovnom rozmražení si zachovávajú svoju schopnostprodukovat protivírusové monoklonálne protilátky. Na rozdiel od konvenčných antisér neobsa-hujú nevhodné, balastné protilátky. Monoklonálne protilátky si pri vhodnom uskladnění,v závislosti od ich póvodu, zachovávajú aktivitu minimálně 24 mesiacov. Příklad 1 7

Pre přípravu hybridněj bunkovej linie sa použije 2.10 buniek myšej 2-amino-6-hydroxy- -8-azapurin (8-azaguanin) rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktorá sa pomocou 1 ml 50 % □ hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanéjvirusom Ruskej jarno-letnej encefalitidy (kmeň 4 072) a myši imunizovanej vírusom kliešťovejencefalitidy (kmeň Skalica,. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektivnym tlakom kyseliny 4--amino-pteroylglutámovej (aminopterínu) hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálneprotilátky proti vírusom Ruskej jarno-letnej encefalitidy a kliešťovej encefalitidy. Tietobuňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10® až 10.10® myších slezino-vých buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml-1 tetrahydrátu dusičnanu vápenatého, -1 —1 —12 000 mg.ml D-glukózy, 100 mg.ml heptahydrátu síranu horečnatého, 400 mg.ml chloridu draselného, 1 512 mg.ml-·1 hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml 1 monohydrátu dihydrogen-fosforečnanu sodného, 100 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínvalérovej (arginínu), 50 mg.ml-1kyseliny 2-aminosukcíne.move j (asparaginu) , 20 mg.ml-1 kyseliny 2-aminojantárovej (kyselinyasparágovej) , 50 mg.ml-'1' kyseliny 3' , 3'-ditiobis/2-aminopropánovej) (cystínu) , 20 mg.ml 1 3 265305 kyseliny 2-aminoglutárovej (kyseliny glutamovej), 300 mg.ml"^ kyseliny 2-aminoglutarámovej(glutamínu), 1 mg.ml kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-aminooctovej (gluta- tionu t. j. glutaminyl-cysteinyl-glycínu), 10 mg.ml kyseliny aminooctovej (glycínu), 15 mg.ml kyseliny alfa-aminol-imidazol-4-propiónovej fhistidínu), 50 mg.ml"^ kyseliny 2- -amino-3-metylvalérovej (izoleucínu), 50 mg.ml kyseliny 2-amino-4-metylvalérovej (leucínu), -1 -1 40 mg.ml kyseliny 2,6-diammohexánove j (lyzínu), 15 mg.ml kyseliny 2-amino-4-/metyltio/- -maslovej (metionínu), 15 mg.ml kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej (fenylalanínu), 20 mg.ml 1 kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej (prolinu), 30 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-3-hydroxy-propiónovej (šeřinu), 20 mg.ml 1 kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej (treonínu), 5 mg.ml-1kyseliny 2-amino-3-/3-indolyl/propiónovej (tryptofánu), 20 mg.ml kyseliny 2-amino-3-/4- -hydroxyfenyl/-propiónovej (tyrozínu), 20 mg.ml kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej (valínu), “1 Γ~ “7 — i 0,2 mg.ml kyseliny 5-/2-oxoimidazolíno ,5-cj tiol-2-yl/pentánove j (biotínu) , 0,005 mg.ml kobalt alfa£alfa-/5,6-dimetylbenzimidazolyl,/J-kobalt beta-kyanokobamid (vitamínu B.„), -1 0,250 mg.ml D-N/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-beta-2-aminopropionát vápenatý (pantotenát vápenatý), 3 mg.ml 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid (cholínchlorid), 1 mg.ml kyselinyN-/2-amino-4-hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej (kyseliny listovej), 35 mg.ml 1 /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ (myoinozitolu), 1 mg.ml pyrxdin-3-karboxyamidu (nikotinamidu), -1 -11 mg.ml kyseliny 4-aminobenzoovej (kyseliny p-amxnobenzoovej), 1 mg.ml 3-hydroxy-4,5--bis/hydroxymetyl/-2-metylpyridínchloridu (pyridoxínchloridu), 0,2 mg.ml 1 7,8-dimetyl-10-/1'--D-ribityl/izoaloxazínu (riboflavínu), 1 mg.ml 1 3-/4-amino-2-metyl-pyrimidyl-5-metyl/-5-/2--hydroxyetyl/-4-metyltiazolu (tiamínchloridu), 2 000 mg.ml hydrogenuhličitanu sodného doplne- nom s 2 ramol kyseliny 2-a-minoglutarámovej (glutamínu), 5.10 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metylamxno/-glukopyranozyl-/l—»2/-0-alfa-L-deoxy-3-C-formyl-lyxofuranozyl-/l—M/-1,3-deoxy-l,3-diaguanidoscyloinozitsulfátu (streptomycínsulfátu), 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej (penicilínu G), 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etánsulfónovej (Hepesu) sa rozpustí v trikrátredestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztokv, ktorýsa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připravenéhokultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 % agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI-5 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej (glutamínu), 5.10 mol 2-merkapto-etanolu, 100 /ug.ml-1 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/l-92/-0-alfa-L-deoxy-3--C-formyllyxofuranozyl-/l-54/-l,3-deoxy-l, 3-diguanidóscyloinozitosulfátu (streptomycínsulfátu),100 jednotiek na milimiter kyseliny 6-/N-fenylacetamido/-penicilánovej (penicilínu G), 1 mmolkyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etánsulfónovej (Hepesu) sa rozpustí v trikrát redestilo-vanej vodě a doplní redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 mlnormálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného médiaje 7,2. V 1 ml kultivačného média sa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov KEN a NEK produkujú-cich 10 až 100 jug monoklonálnej IgG protilátky. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije nepred-testované běžné telacie fetálne sirům. Do takto připraveného kultivačného prostredia přenesenébuňky po fúzii nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridóm KEN-10-2-1 a NEK-10-2-2 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Strednýgeneračný čas je 22 h, modálny počet chromózomov je 24 mesiacov po fúzii 83 (KEN-10-2-1) resp.92 (NEK-10-2-2) chromozómov. Produkované monoklonálne protilátky sú myšie imunoglobulínytriedy IgG.

Monoklonálne protilátky produkované myšími lymfocytárnymi hybridómami KEN-10-2-1 aNEK-10-2-2móžu byt využité v medicíně k bezpečnej virologickej diagnostike vírusov komplexukliešťovej encefalitidy. V tabulke 1 sa uvádza aktivita monoklonálnych protilátok KEN a NEK v reakcii nepriamej 265305 4 imunofluorescencie s vírusom klieŠťovej encefalitidy a dalšími flavivírusmi. V tabulke 2 sauvádza reakcia monoklonálnej protilátky KEN v teste nepriamej imunofluorescencie s vírusmiskupiny klieŠťovej encefalitidy,. V tabulke 3 sa uvádza reakcia monoklonálnej protilátky NEK--10-2-2 v reakcii vázby komplementu a imunofluorescencie s vírusmi komplexu klieŠťovej ence-falitidy .

Tabulkal

Aktivita monoklonálnych pr'otilátok KEN a NEK v reakcii nepriamej imunof luorescencies vírusom klieŠťovej encefalitidy a dalšími flavivírusmi

Označenie MP Titre protilátok s vírusmi KE JE YF DENGUE 1 DENGUE 2 VEE KEN-KM-1 32 Z 2 4 2 4 2 42 Z 2 KEN-KM-2 16 4 2 4 2 4 2 4 2 4 2 KEN-KM-3 64 < 2 < 2 4 2 4 2 4. 2 KEN-AT-1 10 240 410 410 410 410 Z10 KEN-AT-2 2 560 4110 410 4 10 410 4 10 KEN-AT-3 640 £ 10 410 4 10 410 4 10 NEK-KM-1 32 z 2 4 2 Z 2 4 2 4 2 NEK-KM-2 32 Z 2 2 Z 2 Z 2 4 2 NEK-KM-3 64 Z 2 Z 2 4 2 Z 2 4 2 NEK-AT-1 10 240 410 410 -<10 410 4 10 NEK-AT-2 5 120 + 10 4 10 410 4 10 4 10 NEK-AT-3 640 < 10 4 10 4 10 4 10 *—10 Kontroly IAT proti virusu KE 320 έ. 10 4 10 410 4 10 410 IAT proti virusu YF Z 10 4 10’ 160 4 10 4 10 Zlo IAT proti virusu jE Z 10 320 4 20 4 20 4 20 4 10 IAT proti vírusom DENGUE 4 10 40 40 320 320 z 10 IAT hybridómu MAK-VEE Z 10 <10 4 10 4 10 Z 10 2 560

Vysvětlivky: KM - kultivačně médium AT - ascitická tekutina IAT - imúnna ascitická tekutina MP - monoklonálna protilátka KE - virus kliešťovej encefalitidy JE - virus japonskej encefalitidy YF - virus žltej zimnice VEE - virus venezuelskej encefalitidy kóm PK - polyklonálne protilátky

Tabulka 2

Reakcia PM KEN v teste nepriamej imunofluorescencie s vírusmi skupiny klieŠťovej encefa litídy (KE).

Claims (1)

1. 5 265305 Tabulka 2 pokračování Titer MP KEN KM AT Polyklonálna AT proti virusu KE KE kmeň Sofin 32 2 560 320 KE kmeň 4 072 64 2 560 320 KE kmeň Absetarov 32 1 280 160 Omská hemoragická horúčka 8 160 320 Louping-ill 8 320 160 Powassan Z2 Z10 40 Virus choroby Kyasanúrske-ho lesa 8 160 320 Skalica έ 2 Z 10 80 Langat TR-21 Z 2 Z 10 320 Negishi Z 2 160 80 Odaje v tabulke poukazujú na to, že MP KEN plné odlišujú virus KE (kmeň Sofin, 4 072,Absetarov) od vírusov Powassan, Langat TR-21 a kmeňe Skalica. S druhými vírusmi komplexuKE - vírusom Omskej hemoragickej horúčky, vírusom Louping-ill, chroby Kyasanúrskeho lesaa Negishi reagujú MP v porovnaní s homológnymi protilátkami 4 až 8krát slabšie; MP NEK reagujso všetkými virusmi komplexu KE, okrem virusu Powassan. Vysvětlivky sú uvedené v tabulke č. 1 Tabulka 3 Reakcia MP NEK-10-2-2 v RVK a IV s vírusmi komplexu kliešťovej encefalitidy Virusy Titre protilátok v AT Kmene IF RVK specifické PHpre virus KE (RVK) KE kmeň Sofin 2 560 1 280 320 KE kmeň 4 072 2 560 2 650 320 KE kmeň Absetarov 2 560 2 560 160 Skalica 1 280 640 320 Omská hemoragická horúčka 280 160 320 Louping-ill 640 160 160 Powassan Z 10 Z.10 40 Virus choroby Kyasanúrskeho 640 320 - lesa Langat TR-21 320 320 160 Negishi 640 160 160 Vysvětlivky: IF - imunofluorescencia RVK - rakcia vazby komplementu (Ďalšie vysvětlivky sú uvedené v tabulke č. 1). PREDMET VYNÁLEZU Myšie lymfocytárne hybridómy KEN-10-2-1 a/alebo NEK 10-2-2, produkujúce monoklonálneprotilátky triedy IgG, rozlišujúce virusy komplexu kliešťovej encefalitidy.