CS262168B1 - Způsob výroby kyseliny glukónové vedle fruktózy v submerzní kultuře Aspergillus niger - Google Patents

Abstract

Řeší se způsob výroby kyseliny glukónové vedle fruktózy v submerzní kultuře Aspergillus niger konverzí glukózo-fruktózového sirupu. Výhodou způsobu je, že se pomocí 'vysokoprodukčního kmene Aspergillus niger N-XI připraví z glukózo-fruktózových sirupů vysoce selektivně, s vysokou rychlostí konverze a při vyšších výtěžnostech roztoky kyseliny glukónové a fruktózy s obsahem, až 40i °/o hmot. každé z těchto složek. Kyselinu glukónovou lze po zahuštění odseparovat krystalizací, a připravit tak prakticky čisté fruktózové sirupy.

Description

Vynález se -týká z-půspbu výroby kyselíný glukónové vedle fruktózy v submerzrií kultuře Aspergillus niger konverzní glukózo-fruktózových sirupů. z.

Ob,a produkty mají široké.spektrum -použití. Fruktóza se používá především jako perspektivní; sladidlo v potravinářském průmyslu, kyselina glukónová, její soli 1 glu'kóno-ď-laktón nacházejí uplatnění ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu, při povrchové úpravě kovů, jako deinkrustační činidlo, aditívum v barvířském průmyslu, přísada do betonu a v mnoha dalších oborech.

Produkce kyseliny glukónové mikrobiální konverzí glukózového substrátu je známá již několik desítek let. Vysoký stupeň konverze glukózy i některých jiných sacharidů na kyselinu glukónovou vykazují především vláknité houby rodů Aspergillu-s a Penicilliurn (Moyer, A. J. et al, Ind. Eng. Chem. 29, 777 /1937/; Bloom, R. H. et al, Ind. Eng. Chem. 44, 435 /1952/; Ziffer, J. et al, Br. Patent 1249 347 /1971/) a také baktérie Gluconobacter suboxydans (Currie, J. .N., parter, R. H.,US Patent 1896 811 /1930/; Oosterhuls, N. M. G. et al, Biotechnol. Lett. 5, 141 /1983/).

Mezi přednosti fermentační produkce kyseliny glukónové pomocí -plísní patří jednoduché fermentační médium, selektivita i rychlost konverze, menší nároky na sterilitu celého procesu a další (Ro.hr, M. et al, In Biotechnology, (Rehm, H.· J., Reed, G. — — Eds], Verlag Chemie, Weinheim /1983/).

Na přípravu fruktózy, případně fruktózových sirupů obsahujících také glukózu (většinou ze škrobnatých surovin] se využívají většinou imobilizované enzymy, příp. mikroorganismy (Barrett, S. P. et al, US Patent 4 288 548 /1981/, Heady, R. E., US Patent 4 276 379 /1982/, US Patent 4 317 880 /1982/).

Glukózo-fruktózové sirupy lze získat výhodně i z koncentrovaných roztoků sacharózy při použití kvasničné biomasy s vysokou Invertázovou aktivitou. Takto připravené glukózo-fruktózové sirupy obsahují asi 40 až 50 % hmot. fruktózy. Oddělit fruk-tózu od glukózy běžnými separačními postupy je však, vzhledem na podobné fyzikálněchemické vlastnosti obou sacharidů, mimořádně obtížné.

Příprava fruktózových sirupů a kyseliny glukónové způsobem podle vynálezu je -velice výhodná, protože Aspergillus niger mutanta N-XI oxiduje selektivně glukózu na kyselinu glukónovou na jednoduchém minerálním médiu s vysokou rychlostí konverze, přičemž obsah fruktózy v médiu se v průběhu fermentace nemění. Vzniklou příslušnou sůl kyseliny glukónové lze odseparovat z média jednoduchou krystalizaci a -připravit tak navíc prak-ti-cky čisté koncentrované roztoky fruktózy.

Vyselektovamá mutanta N-XI vykazuje vysokou glukózaoxidázovou aktivitu, což umožňuje pracovat s nízkými koncentracemi biomasy při zachované vysoké rychlosti produkce. Spotřeba glukózy na nárůst biomasy je proto velmi nízká a výtěžky kyseliny glukónové vztažené na počáteční koncentraci glukózy v médiu dosahují 92 až 97 %. Získanou biomasu lze po odseparování z fermentačního- média opakovaně použít v dalších fe-rmentacích. Produkční kmen si zachovává vysokou aktivitu i při vyšších koncentracích glukonátových solí, což umožňuje připravit koncentrované roztoky fruktózy a kyseliny glukónové. Při přípravě fruktózových roztoků způsobem podle vynálezu odpadá i izolace a -čištění enzymů, jejich imohilizace ,na vhodný nosič apod.

Podstatou způsobu přípravy směsi fruktózy a kyseliny glukónové podle vynálezu je, že se submerzně kultivuje mutanta -plísně Aspergillus niger N-XI v roztoku glukózo-fruktózového- sirupu, který obsahuje 5 až 40 % hmot. každé z těchto složek, při teplotě 25 až 35 °C a hodnotě pH 5,0 -až 7,5.

Základní mo-rfologické a fyziologické charakteristiky mutanty Aspergillus niger N-XI, která je uložena v Československé sbírce mikroorganismů University J. E. Půrky,ně v Brně -pod označením CCM 8004, jsou podrobně uvedeny v přihlášce vynálezu čs. AO č. 262 877.

Mutanta se kultivuje na jednoduchém minerálním médiu při teplotách 25 až 35 °C a hodnotě pH v rozmezí od 5,0 do 7,5. V průběhu kultivace se hodnota pH udržuje přídavkem hydroxidu nebo- uhličitanu alkalického k-ovu na konstantní hodnotě. Je zřejmé, že kyselina glukónová bude v tomto prostředí vznikat ve formě odpovídající soli s alkalickým kovem, které spadají v tom-to textu rovněž do rozsahu výrazu „kyselina glukónová“. Fermentační médium se intenzívně míchá a vzdušní s výhodou od 1 do 1,5 objemu vzduchu na 1 objem fermentačního média. Na zabezpečení maximální koncentrace rozpuštěného kyslíku v médiu je výhodné uskutečňovat fermentace při přetlaku od 0,1 -do 0,5 MPa.

Fermentační médium obsahuje glukózo-fruktózový sirup s 5 až 40 % hmot. každé z těchto· složek. Výhodné je uskutečňovat fermentaci -při počáteční koncentraci glukózo-fruktózového sirupu, 20 % hmot. obou složek, při které dochází k intenzivnímu -růstu biomasy s vysokou glukózaoxidázovou aktivitou. V průběhu fermentace je možné přidávat koncentrovaný glukózo-fruktózový sirup, s výhodou kontinuálního přídavku tak, aby aktuální koncentrace glukózy ve fermentačním médiu se pohybovala v rozmezí od 2 do 6 % hmot., při které je konverze glukózy na kyselinu glukónovou nejrychlejší.

Pro zao-čkování fermentačních nádob je možné použít jak spóro-vého, tak i vegetativního inokula. Spórové inokulum je možné připravit spláchnutím spor používaného mikroorganismu 0,1% roztokem Tweenu 80 tak, aby počáteční koncentrace s,pór ve fermentačním médiu byla v rozmezí 1 až 3 . . 10⁶ spor v 1 ml média. Vegetativní inokulum so získá 12 až IBhodinovým naklíčením spor v podmínkách snížené aerace a dávkuje se do fermenbačního média v množství od 1 'do· li; % celkového objemu. Po· provedené feriueidaci se buněčná hmota mikroorga-ikmii! oddělí, od fermentačního média a může se použít v novém íermenlačním cyklu. Tento způsob vedení fermentace je možné použít i opakovaně.

Fermentace se provádí až do dosažení žádaného výtěžku. Např. za a) 28 až 30 ho din lze připravit 25 °/o hmot., za b) 35 až 40 hodin 35 % hmot. roztoky frukíózy a kyseliny glukónové, vzhledem on počáteční koncenlraci glukózy je výtěžnost kyseliny glukónové a) 90 cž 95 %, roso. b) 93 až 97 procent, v případě fruktózy 109 %. Koncentrace biiomosy ve formonlačním médiu nepřesahuje 1,2 jt suché hmotnosti na 1 litr média. Je trnka ovsem počítat s určitými odchylkami v roakčnícli dobách i výtěžcích v závislosti n,a použitém zařízení, ve kterém se kultivace uskutečňuje.

Vzniklou sůl kyseliny glukónové lze odseparovat od. fruktózy po zahuštění jednoduchou krystalizací samovolně, případně po přídavku malého množství rozpouštědla, ve •kterém není uvedená sůl rozpustná, a· získat 'tak fruktózový koncentrát. Kyselinu glukónovou je možné připravit z její soli působením zředěné minerální kyseliny a pak např. katexu (sulfónová pryskyřice, Dowex 50, či jinými průmyslově běžně používanými katexyj. Z roztoku kyseliny glukónové lze připravit glukóno-í-laktón krystalizací supernasyceného roztoku pří teplotách od 36 do '57 °C, jak to popisuje např. japonský patent č. 75 123 674.

Vynález ilustrují následující příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

Příklad 1

Připraví se fermentační médium, které obsahuje glukózo-fruktózový sirup s 25 % hmot. každé z těchto složek a další chemikálie (% hmot.):

•0,05 (NHdjzHPOd,

0,03 (NPHjžSOd,

0,025 KH PCM a

0,022 MgSOd . 7 H2O.

Fermentace se provádí v nerezovém tanku s centrálně umístěným mechanickým míchadlem. Jako· inokulum se použije suspenze spór plísně Aspergillus niger N-XI kultivované na šikmém sladinovém agaru -6 dní při 30 °’C, kterou připravíme tak, že spory jsou spláchnuty příslušným množstvím 0,1% roztokem povrchově aktivní látky (Tween 80). Takto připravenou spórovou suspenzí zaočkujeme 3 dm³ sterilního fermentačního média takovým množstvím spórového inokula, aby počáteční koncentrace spór ve fermentačním médiu byla od 1 do 2 .10® spór v 1 cm³.

V první fázi kultivace klíčí .spory při teplotě 30 °C, míchání 150 min.^-1, vzdušnění 0,2 objemu vzduchu na 1 objem fermentačního média, pH fermentačního média je kontinuálně upravované v průběhu celé fermentace přídavkem 30 % hmot. roztoku NaOH na hodnotu 6,2.

Po 12 až 15 hodinách začíná vlastní fermentace. Zvýší se míchání na 400 min.^-1 a vzdušnění na 1 objem vzduchu na 1 objem fermentačního média, přičemž ve fermentační nádobě je udržovaný přetlak 0,1 MPa, teplota· 30 °C a hodnota pH 6,5. Celková doba fermentace včetně klíčení spór činí 45 až 50 hodin. Výsledným produktem je směs frukíózy a kyseliny glukónové (ve formě sodné soli J, přičemž výtěžky glukonátu sodného dosahují 91 až 96 % vzhledem na vloženou glukózu, výtěžky fruktózy jsou lOOi %. Ke tvorbě dalších organických kyselin či pigmentů v průběhu fermentace nedochází. Příklad 2

Připraví se fermentační médium, jehož složení je uvedeno· v příkladě 1, ale které obsahuje glukózo-fruktózový sirup s 10 °/o hmot. každé z těchto složek. 2 dm³ tohoto média se zaočkuje suspenzí spór Aspergillus niger N-XI postupem uvedeným v příkladě 1. Kultivuje se 20 hodin při 30 °C, pH 6,0, míchání 150 min.^-1 a vzdušnění 0,7 objemu vzduchu na 1 objem fermentačního· média. Příslušný podíl takto připravené kultury, postačující k dosažení 5 až 15 % obj. inckula, se vnese.do 20 dm³ fermentačního tanku, který obsahuje 12 dm³ produkčního média, jehož složení je uvedeno, v příkladě 1. Doba fermentace .nepřesahuje 28 až 32 hodin. Všechny ostatní parametry při fermentaci i výtěžnost jsou stejné jako v příkladě 1.

P ř í k 1 a d 3

Postup přípravy inokula 1 podmínky fermentace jsou stejné jako v příkladě 1. Po skončení fermentace se buněčná hmota mikroorganismu odseparuje a vnese se do sterilního glukózo-fruktózového sirupu o obsahu 35 % hmot. každé z těchto složek. Podmínky fermentace jsou analogické jako v příkladě 1. Výtěžky glukonátu sodného, resp. fruktózy, dosahují 94 až 98 %, resp. 1-OiD %, vzhledem na vloženou glukózu, resp. fruktózu. Tento, postup je možné 5krát opakovat bez ztráty aktivity mycélia.

Příklad 4

Inokulum můžeme připravit postupem uvedeným v příkladech 1 a 2. Připraví se

282163 dm³ sterilního média, které obsahuje glukózo-fruktózový sirup s 20 % hmot. každé z těchto složek, dále Ο,θ % hmot. (NHájzSCU a ostatní chemikálie v množství, jak je uvedeno v příkladě 1. Fermentace se uskutečňuje ve fermentoru o objemu 20 -dm³ za podmínek, které jsou uvedeny v příkladě 1. Po poklesu koncentrace glukózy ve fermentačním médiu na 3 % hmot. je aktuální koncentrace glukózy udržována v rozmezí od 1 do 5 % hmot. kontinuálním přídavkem koncentrovaného roztoku glukózo-fruktózového sirupu. Tímto způsobem lze připravit za 45 až 50 hodin 35 až 45 % hmot. roztoky kyseliny glukónové a fruktózy, přičemž výtěžky kyseliny glukónové, resp. fruktózy se pohybují okolo, 94 až 98 %, resp. 100 % vztaženo na vnesenou glukózu, resp. fruktózu.

Claims (3)

1. Způsob výroby kyseliny glukónové vedle fruktózy v submerzní kultuře Aspergillus niger konverzí glukózo-fruktózového sirupu vyznačující se tím, že se spórová suspenze mutanty tohoto kmene N-XI buď zaočkuje do inokulačního tanku, v němž se připraví vegetativní inokulum, kterým se zaočkuje produkční fermentor, nebo· se použije přímo na inokulaei produkčního fermentoru a potom se mutanta kultivuje při 25 až 35 °C, hodnotě pH 5,0 až 7,5 v glukózo-fru,któzovém roztoku o koncentraci 5 až 40 % hmot. každé z těchto, složek, přičemž po skončení kultivace a separaci buněčné

VYNALEZU hmoty mikroorganismu se oddělí kyselina glukónová od fruktózy krystalizací.

2. Způsob výroby podle bodu 1 vyznačující se tím, že koncentrace glukózy se v průběhu fermentace udržuje kontinuálním přídavkem koncentrovaného glukózo-fruktózového sirupu v rozmezí od 2 do 5 % hmot.

3. Způsob výroby podle bodu 1 vyznačující se tím, že se po skončení fermentace buněčná hmota mikroorganismu odseparuje od fermentačního média a opakovaně se použije pro konverzi glukózo-fruktózového substrátu.