CS261056B1 - Kmen mikroorganizmu Trichoderma reesei CCM F-806 - Google Patents

Description

2 íi 1 O 5 6 3

Vynález sa týká nového kmeňa imper-fektnej mikroskopickej huby Trichodermaréesei CCII produkujúceho při submerznejkultivácii zvýšené množstva celulolytickýchenzýmov, pričom produkcia celuláz je čias-točne rezistentná voči katabolickej represiil'ahko utilizovatělnými cukrami.

Mikroskopické vláknité huby rodu Tri-choderma sú dobrými producentami celulo-lytických enzýmov {celuláz], ak sa ako sub-strát i ako induktor používá prášková celu-lóza, alebo rožne celulózu obsahujúce lát-ky. Maximálně dosahované celulázové akti-vity s celulázou ako substrátom sa pohybu-jú pri vsádkovej kultivácii od 70 do 200nkat/ml FPA {A. W. Khan, K. A. Lamb, Bio-technol. Lett. 6, 633 (1984); T. G. Watson,I. Nelligan, 5, 25 (1983); H. Matanič et ál.Prehramb. Technol. Rev. 18, 3 (1980)]. Ne-výhodou použitia celulózy a iných vodone-rozpustných celulózových substrátov všakje, že produkčně mikroorganizmy v takých-to médiách rastů a produkujú celulózy po-měrně pomaly — jeden produkčný cykluspři’ vsádkovej submerznej kultivácii trvá 10až 14 dní. Ďalšou nevýhodou použitia neroz-pustných substrátov je, že svojou prítom-nosťou zvyšujú viskozitu živného média, čozvyšuje požiadavky na energiu potřebná namiešanie a zhoršuje transfer kyslíka v kul-tivačnej zmesi. Okrem toho, použitie neroz-pustných celulózových substrátov kompli-kuje spósob ich dávkovania v priebehu kon-tinuálnej, resp. fed-batch kultivácie. Použi-tie rozpustných zdrojov uhlíka—glukózy,resp. oligosacharidov, tieto problémy siceodstraňuje, avšak v důsledku katabolickejrepresie je produkcia celuláz silné potlače-ná. Hladajú sa preto také kmene producen-tov, v ktorých je mutáciami odstránená ka-tabolická represia tvorby celuláz. Miera od-stránenia katabolickej represie je určenámaximálnou koncentráciou cukru (glukózy,laktózy a pod.), při ktorej je huba ešteschopná celulázy produkovať.

Uvedené nedostatky odstraňuje přihlašo-vaný vynález, ktorým je nový kmeň Tricho-derma reesei, mutant CCII, uložený v Čs.zbierke mikroorganizmov Univerzity J. E.Purkyně v Brně, Třída Obránců míru 10pod označením CCM F-806. Nový kmeň vy-kazuje zvýšená produktivitu celuláz a mámutáciou čiastočne odstránená katabolickárepresiu tvorby celuláz pri raste na l'ahkoutilizovatelných sacharidických substrátoch.

Uvedený nový kmeň sa získal známýmpostupom, kombinovanou fyzikálnou a che-mickou mutagenázou spojenou s dvojstup-ňovým obohacováním mutagenizovanýchspor podl'a I. Labudovej a V. Farkaša FEMSMicrobiol. Lett. 20, 211 (1983) z východzie-ho kmeňa Trichoderma reesei CCM F-560.

Hlavnou výhodou nového kmeňa oprotipůvodnému kmeňu je zhruba 8x zvýšenátvorba celuláz pri kultivácii na l-% celu-lóze ako substráte, kde sa dosahuje v závis-losti na podmienkach kultivácie aktivita FPA 50 až 180 nkat/ml na 5. deň kultivácie.Ďalšou výhodou nového kmeňa je čiastočneodstránená katabolická represia tvorby ce-luláz, čo sa prejavuje jeho schopnosťou pro-dukovat celulázy aj v přítomnosti 0,05 %glukózy, resp. 0,2 °/o laktózy v médiu, zatial'čo póvodný kmeň T. reesei F-560 pri týchtopodmienkach neprodukuje žiadnu celulázu. Příklad 1

Popis nového kmeňa

Morfológia: pri raste na agarovom glukó-zovom médiu mycélium vláknité, hutso vět-vené, zriedkavo septované. Priemer hýf 3,5až 5 μΐη. Konídiónosiče kratšie a rozvětve-né, fialídy zvyčajne jednotlivé, alebo proti-stojace. Konídie hojné, spočiatku biele, po-tom žité v stave zrelosti zelené až zeleno-hnedo pigmentované,, eliptickoovoidné, prie-mer 2 až 3 /tm. Prf submerznej kultiváciipri dobrom prevzdušňovaní a v médiu chu-dobnou na uhlík a dusík dochádza ku ko-nidiácii. Pri kultivácii na povrchu tuhýchpod je konidiácia stimulovaná svetlom. Prisubmerznej kultivácii niekedy vznikajá sfé-rické chlamydospóry o priemere 8 až 10 μΐη.Pri kultivácii na glukóze, resp. fruktóze vy-lučuje do média žitý pigment. Oproti po-vodnému kmeňu sa morfologicky líši váčšouhustotou vetvenia mycélia a o 50 až 100 °/ovačšou hrubkou hýf.

Mikroorganizmus rastie na celom raděcukorných substrátov: celulóze, xylane, D--glukóze, D-galaktóze, D-manóze, D-fruktóze,D-xylóze, L-arabinóze, D-ribóze, celobióze,trehalóze, škrobe, laminaríne, maltóze, D--glycerole, etanole. Slabo rastie na: sacha-róze, rafinóze, acetáte, laktáte, tartaráte,malonáte, inulíne a chitíne. Optimálna tep-lota rastu je 28 až 32 °C, optimálně pH 3až 5, nerastie pri 50 °C. Příklad 2 Příprava nového kmeňa

Konídie Trichoderma reesei OM 6a sa sus-pendujá v koncentrácii 108/ml v 10 ml ň-stojného roztoku 0,05 mól/1 Tris(hydroxy-metyl)amínometán — kyselina chlorovodí-ková (Tris-HCl) pH 9,6, obsahujáceho 0,02proč. polyoxyetylénsorbitanu kyseliny tri-steárovej (Tween 80) a 0,05 % N-metyl-N‘--nitro-N-nitrózoguanidínu a suspenzia saožaruje na Petriho miske pod 40 W UV--lampou zo vzdialenosti 20 cm počas 5 min.Po skončení ožarovania sa suspenzia inku-buje 6 hodin pri 37 CC a konídie sa potomzaočkujá do 40 ml minimálneho média ob-sahujáceho v 1 litri vody 5 g síranu amon-ného, 1 g dihydrogénfosforečnanu drasel-ného, 0,5 g síranu horečnatého heptahydrá-tu, zmes vitamínov podl'a L. J. Wickerehama[U.S. Dept. Agric. Bul. No. 1029, 56 (1951)],

Claims (1)

1. 261056 S okrem toho, do média sa přidá 2 % celo-biózy a 0,5 % 2-deoxy-D-glukózy. Zmes sainkubuje na rotačnej trepačke při 30 °Cpočas 4 až 5 dní, pokial' sa neobjevia prvéklíčiace konídie. Tieto sa potom odseparujúod nevyklíčených spor filtráciou cez skle-nenú fritu S 1 a vysejú sa na sporulačnýagar obsahujúci minimálně médium plus2 % glukózy a nechajú sa rásť na svetlepri izbovej teplote počas 5 dní. Vytvořenékonídie sa zmyjú z povrchu agaru steril-nou vodou a zaočkujú sa do minimálnehomédia obsahujúceho 0,5 % Na-karboxyme-tylcelulózu a 0,5 % 2-deoxy-D-glukózu ainkubujú sa niekoíko dní pri 30 °C na tre-pačke. Vyklíčené konídie sa odseparujúfiltráciou cez fritu S 1 a vysejú sa na de-tekčný agar obsahujúci minimálně médiumplus 0,5 až 1 % amorfnú celulózu, 5 %hmotnostných fruktózy, resp. glukózy, aleboglycerolu a 50 /zg/ml dvojsodnej soli tetra-jodotetrachlóro-f luoresceínu (bengálskej červenej. Misky so selekčným agarom sainkubujú 2 dni pri 30 °C a 1 deň pri 50 °C.Izolujú sa kolonie, ktoré na selekčnom aga-re vytvárajú okolo seba číře zóny. Vyizolo-vané kolonie sa prečisťujú opakovanou ko-nidiáciou a pasážovaním a jednotlivé klony 6 sa testujú na schopnost produkovat celulo-lytické enzymy v přítomnosti celulózy a lak-tózy ako substrátov. Příklad 3 Médium obsahujúce v 1 1 20 g laktózy,1,5 g dihydrogénfosforečnanu draselného,5 g síranu amonného, 0,3 g síranu horečna-tého, 0,2 g chloridu vápenatého a 2,5 gkvasničného autolyzátu vo vodě, sa zaočkuje105 konídiami/ml Trichoderma reesei CCIIa kultivuje sa pri pH 4,0 až 5,0 vo fermen-tačnom tanku pri teplote 30 °C, miešaní 6 Hza prevzdušňovaní. 1 objem (objem) min podobu 5 až 7 dní, V priebehu fermentáciesa získá v médiu celulózová aktivita FPA60 až 80 nkatalov/ml, stanovená podl'a do-poručení IUPAC (Measurement of cellulaseactivities, Commision on Biotechnology,IUPAC. New Delhi, 1985). Kmen Trichoderma reesei F-806 sa móževyužit pri priemyslovej produkcii celuláz naroznych sacharidických substrátoch, s vý-hodou na substrátoch obsahujúcich fahkoutilizovatelné sacharidy. PREDMET VYNALEZU Kmeň mikroorganizmu Trichoderma reesei F-806 s čiastočne katabolicky derepri-movanou produkciou celuláz.