CS244333B1 - Method of c-cephalosporine fermentation production with utilization of fats as limitating carbonaceous substrate by means of acromonium chrysogenum strain - Google Patents

Description

244333

Vynález sa týká sposobu fermentačnej vý-roby cefalosporínu C využívajúceho tuky,ako limitujúceho uhlíkatého substrátu po-mocou kmeňa Acremonium chrysogenum.

Cefalosporín C — medziprodukt pre pří-pravu širokospektrových vysokoúčinných po-losyntetických antibiotik sa připravuje sub-merznou aerobnou fermentáciou použitímvhodných kultur a vhodných sterilných živ-ných pod. Schopnost produkovat cefalospo-rín C bola zistená u viacerýcli mikroorga-nizmov, napr. Cephalosporium polyaleurum,Arachnomyces minimus, Anixiopsis peravia-na, Spiroidium fuscumm (Kitano K., Kinta-ka K., Suzuki S., Katamoto K., Nara K., Na-kao Y.: Biol. Chem. 38, 1974, s. 1761).

Vo výrobnej praxi sa vačšinou používajúna biosyntetickú výrobu cefalosporínu Ckmene Acremonium chrysogenum (GamsW.:Cephalosporium — artige Schimmelpilze —Hyplomycetes, Stuttgart 1971), predtým kla-sifikovaný ako Cephalosporium acremoni-um.

Kmene Acremonium chrysogenum využí-vajú pre svoj rast a produkciu cefalosporí-nu C ako zdroj uhlíka rožne monosachari-dy, disacharidy a polysacharidy, ktoré bý-vajú dodávané do živných pod v množstveod 2 — 10 %. Vhodným uhlíkatým substrá-tom pre fermentáciu cefalosporínu C sú tležtuky a ich hydrolyzáty, resp. destilačné frak-cie, připadne tuky stabilizované antioxadan-tami, napr. AO — 185 858. Hubert a spol.(Hubert F. M., Tietz A. J.: Delined meriastrategies for the biosynthesis of cephalo-sporin C, Biotechnology Letters, 6, 1983, s.385 až 390), porovnávali možnosti fermen-tácie cefalosporínu C na pode, kde hlavnýuhlíkatý substrát bol sacharid — glukózas pódou, kde zdroj uhlíka bol zabezpečova-ný tukmi — sójovým olejom alebo destilá-tom bravčovej masti. V obidvoch prípadochbol zdroj uhlíka použitý ako limitujúci sub-strát. Použitie tukov vo fermentácii cefalo-sporínu C sa ukázalo operativně lepšie achod fermentácie bol stabilnější ako pri po-užití dávkovanej glykózy. Tuky vo fermen-tácii cefalosporínu C zároveň plnia úlohuprotipenidiel.

Organický dusík v podach pre fermentá-ciu cefalosporínu C móže byť zabezpečova-ný róznymi rastlinnými alebo živočišnýmiproteínami, ako sú sójová, arašídová, ba-vlníková a rybia múka, připadne kukuřič-ný extrakt a iné. Z poznatkov, ktoré sú známe o biosynté-ze cefalosporínu C vyplývá kfúčový významštyroch základných zložiek pre stavbu mo-lekuly cefalosporínu C: kyselina alfa amíno-adipová, valín, acetát, cystein (Loder P. B.,Abraham E. P,: Biochem. J. 123, 1971, s. 471až 477). Prvé tri zložky si produkčný mik-roorganizmus — Acremonium chrysogenumdokáže zabezpečovat už z predtým uvádza-ných uhlíkatých a dusíkatých živin, kým a-mínokyselina - cystein, představovala pre 4 fermentáciu cefalosporínu C vždy špeciálnyproblém.

Pri šlachtení a selekcii produkčných kul-túr Acremonium chrysogenum sa získali au-xotrofné mutanty s genetickým blokom nadráhe redukcie sulfátu na sulfid a zo súčas-ne zvýšenou schopnosťou produkovat cefa-losporín C. Tieto kmene pre potřebu inkor-porácie cysteinu do molekuly cefalosporínuC utilizovali DL-metionín, ktorý sa dodávaldo živných pód v množstvách 1,0 — 2,2 %(Demain A. L., Drew S. W.: Antimicrob. Age-nts Chemother., 8, 1975, s. 5). Pódy, kde hlavný uhlíkatý substrát je sa-charid a obsahujúce DL-metionín v množ-stve vačšom ako 0,5 % sú chráněné v pa-tentoch: US — patent č. 381 257 z 11. 5.1974,US — patent č. 3 082 155 z 19. 10. 1963, NSR— patent č. 2 239 321 z 22. 2. 1973 a čs. AOčíslo 198 425 z 30. 8. 1982. Použitie DL-me-tionínu vo fermentačných podach značnézvyšovalo surovinové náklady na fermentá-ciu cefalosporínu C a sposobovalo tiež nie-ktoré manipulačně problémy, napr. pri dáv-kovaní DL-metionínu v priebehu fermentá-cie a komplikovalo purifikáciu finálnehoproduktu. Hfadali sa preto mutanty, ktorésú schopné na biosyntézu medziproduktucysteinu utilizovať sulfát pri vysokých vý-ťažkoch cefalosporínu C. Takéto kmene súaj predmetom čs. AO č. 243 785. O odskúšavaní mutantov utilizujúcich sul-fát na cefalosporín C sa zmieňuje Komatsua spol. (Komatsu K., Kohaira R.: J. Antibiot.30, 1977, s, 226) a Niss (Niss H. F.: Antimi-crob. Agents Chemother., 4, 1973, s. 474).Martin (Martin F.: Trends Antibiot. Res. Ge-net. Biosynth. Actions New Subs., Proč. Int.Conf. 1982, s. 258 až 268, ins. CA 100 /19/1 535 73/1984) uvádza význam koncentráciefosfátov pre fermentáciu cefalosporínu C.Optimálna koncentrácia fosfátov je podl'atejto publikácie 30 až 50 mM. Námi navrhovaný spósob fermentačnej vý-roby cefalosporínu C využívajúci tuky akolimitujúceho uhlíkatého substrátu pomocoukmeňa Acremonium chrysogenum utilizujú-ceho sulfát sa vyznačuje tým, že na rast kul-túry a produkciu cefalosporínu C sa použí-vá fermentačná podá, ktorá obsahuje sójovýolej alebo iné vhodné dávkovatefné rastlin-né alebo živočišné tuky ako hlavný zdrojuhlíka doplněný malým množstvom sachari-dov pre rastovú fázu. Tým sa zaistí optimál-ny přísun C zdroja do buňky pri minimál-nom nebezpečí inhibíce produkcie katabo-lickou represiou. Ako zdroj organického du-síka sa používá kukuřičný výluh (csl.) ale-bo podobné dostupné suroviny, napr. hyd-rolyzáty sójovej, resp. arašidovej múky. Sí-ran amonný a čpavková voda ako zdroje uti-lizovatefného dusíka a síry a ďalšie anorga-nické zlúčeniny CaCO3, KH2PO4, MgSCU. Vcelom priebehu kultivácie je fermentačnýproces regulovaný dávkováním substrátov aúpravou parametrov fermentácie (teploty, 2 4 1 3 3 3 5 prietoku vzduchu, otáčok miešadla a přetla-ku vzduchu vo fermentore) pódia končen-trácie rozpuštěného kyslíka v pode, pH akoncentrácie substrátov. Detailný přínos jed-notlivých zložiek pody je nasledujúci: sójo-vý olej ako základný uhlíkatý substrát vmnožstve 1 až 2 %. V priebehu fermentáciesa dávkuje sójový olej tak, aby jeho kon-centrácia bola udržiavaná v rozmedzí 0,1až 1,5 °/o. Celková jeho spotřeba je 14 až 20percent, vztahované na základná pódu. Rých-lost dávkovania oleja je 0,5 až 2,6 litra. . h_1. m3"1 půdy. Doplňkovým uhlíkatýmzdrojom sú sacharidy, ktoré sú v, pode pří-tomné v množstvách: kukuřičný škrob 0,6a, 3,5 °/o, dextrín 0,35 až 6,0 °/o, sacharóza0,2 až 0,7 %. Je možné použit aj fermentač-nú půdu, v ktorej v základnom zložení niesú přítomné hoře uvedené sacharidy. Přítom-nost sacharidov však umožňuje plynulejšípřechod metabolizmu producenta z inoku-lačnej sacharidickej půdy na produkční! —tým sa zlepší adaptácia kultury a zaistí sarýchlejší nárast a tým aj nástup produkč-nej fázy. Kukuřičný výluh sa přidává do pů-dy v množstve 8 až 14 %, přepočítané na100 %-ný a okrem toho, že poskytuje preprodukčný mikroorganizmus organický du-sík, je aj zdrojom fosfátových iónov. Hladi-na fosforečnanov je upravená ešte prídav-kom KH2PO4 v množstve 0,5 až 1,0 %.

Zvýšený energetický metabolizmus před-kládaného spůsobu fermentačnej přípravycefalosporínu C okrem zvýšenej koncentrá-cie fosforečnanov vyžaduje aj vyššiu hladi-nu horečnatých iónov, ktorá je v půdě za-bezpečená z MgSO4.7H2O v· koncentráciach0,35 až 1,1 %. Do produkčnej půdy nie jenutné dodávat metionín v čistej formě. Nut-né množstvo metionínu 0,1 až 0,2 % je za-bezpečené kukuřičným výluhom. Toto množ-stvo je potřebné pre rast producenta a před-pokládá sa aj vplyv tejto aminokyseliny nafrakcionáciu hýf na arthrospóry, ktoré súsprievodným znakom maximálnej produkčnejaktivity. Základná stavebná jednotka mole-kuly cefalosporínu C cystein je zabezpečo-vána z (NH4)2SO4, ktorý je dodávaný do pů-dy v množstve 0,5 až 1,8 %. Redukcia sul-fátu na sulfid a jeho následná konverzia soserínom na cystein je základom racionálnejdráhy na zabudovanie síry do molekuly an-tibiotika. Uhličitan vápenatý sa dodává doživných půd v množstve 0,6 až 1,2 %. Prenavrhovaný postup je vhodnejšie používatchemicky zrážaný uhličitan a nie prírodnýmletý — minerálny.

Inokulum pre fermentáciu cefalosporínuC sa připravuje propagáciou kultury Acre-monium chrysogenum na inokulačnej půděobsahujúcej kukuřičný výluh, sacharózu,octan amónny, metionín a sójový olej. pHpůdy sa upravuje na hodnotu 7,0 + 0,1. Kul-tivuje sa pri teplote 28°'C, so vzdušněním 1objem vzduchu/1 objem půdy a přetlaku vofermentore 70 kPa. Objem inokulačnej půdya počet propagačných stupňov sa volí podl'a 0 objemu produkčnej půdy tak, aby objem ino-kula, ktorým sa očkuje, bol aspoň 10 % ob-jemu produkčnej půdy. Parametre inokulavhodného na očkovanie sú pri tejto půdě u-dané sedimentom minimálně 15 % (sedimen-tácia pri 300 ot/min. 10 minútj a hodnotoupH 6,6 až 6,8. Trvanie jedného inokulačné-ho stupňa je 48 až 72 hodin.

Teplota v produkčnom tanku je udržiava-ná vo fáze náběhu (počiatočného rastu bio-masy) na 28 °C. Medzi 30 až 48 hodinou kul-tivácie sa kultivačná teplota znižuje na 25stupňov Celsia podl'a intenzity nárastu bio-masy charakterizovanej spotřebou O2 mera-nej manometrickou metodou, ktorá má byťminimálně 35 ^mol. ml’1. h"1. Keď koncen-trácia O2 vo fermentačnej půdě poklesnepod hodnotu 6 mg/1 znižuje sa teplota fer-mentačnej půdy na 24 °C. Prietok sterilnéhovzduchu sa v priebehu fermentácie udržia-va v rozmedzí 0,6 až 1,8 objemu vzduchu//min. na objem fermentačnej půdy. Tlak nadfermentačným médiom (přetlak vo fermen-tore) je udržiavaný v rozmedzí 70 až 80 kPa.Pri poklese koncentrácie rozpuštěného O2pod 6 mg/1 sa zvyšuje na 90 až 95 kPa.

Fermeníácia cefalosporínu C má vysokénároky na přestup hmoty a predovšetkýmna přestup kyslíka; miešanie fermentačnejpůdy zabezpečuje v prevážnej miere tietonároky pomocou turbínových miešadiel s de-liacim kotúčom a 6 rovnými lopatkami (ON691021). Pcmer priemeru fermentora k prie-meru miešadla D/d = 3. Intenzitu mieša-nia zvyšujú 4 radiálně narážky so šířkoub = D/10.

Optimálny počet otáčok sa musí určiť predané zariadenie experimentálně, vzhfadomna přenos hmoty, střižné sily a příkon mo-tora miešadla.

Vhodné pH pre produkčnú fázu fermen-tácie cefalosporínu C je v rozmedzí 5,5 až 6,3. Vzhfadom na stabilitu fermentačnéhoprocesu je potřebné pH udržiavať v rozme-dzí 0,1 pH, pričom toto sa udržuje přidává-ním čpavkovej vody (20 až 25 %-ný obsahNHs) automatickou reguláciou.

Obsah amoniakálneho dusíka po poklesejeho koncentrácie z počiatočných hodnůt(2,0 až 4,5 mg/ml, ktoré závisia na výcho-dzom zložení půdy) sa udržuje v rozmedzí0,75 až 1,0 mg/ml dávkováním roztoku síra-nu amonného s koncentráciou 200 kg/m3.

Koncentrácia rozpuštěného O2 po poklesez počiatočnej koncentrácie 13 až 15 mg/ml(podlá tlaku vo fermentore) sa udržuje nahodnotách 4 až 5 mg/ml jednak změnou pa-rametrov fermentácie — teploty, vzdušne-nia, přetlaku, připadne otáčok miešadla, ahlavně režimom dávkovania oleja. Pri kon-centrácii rozpuštěného kyslíka v půdě 5 až6 mg/1 a pri spotřebo kyslíka kultúrou nahodnoty minimálně 65 ^mol/ml. h je nárastbiomasy optimálny. Koncentrácia oleja je u-držiavaná v tejto fáze na hodnotách 0,1 až0,2 % vo vazbě na koncentráciu rozpuštěné- 244333 ho kyslíka vo fernientačnej pode, aby sa u-držala už uvedená dostatočná koncentrácia4 až 5 mg/1 kyslíka.

Takto upraveným režimom dávkovania só-jového oleja sa reguluje nárast biomasy (za-bráni sa prebytočnému rastu mycélia a týmzníženiu spracovateíného filtrátu) a nežia-dúcemu zníženiu koncentrácle rozpuštěnéhoO2 na podoptimálne hodnoty (1 až 3 mg/1),pri ktorých sa už výrazné znižuje produkčnárýchlosť fermentácie cefalosporínu C.

Nasledujúce příklady lepšie osvetlujú vy-nález bez toho, aby ho obmedzovali. Příklad 1

Ako produkčný mikroorganizmus bol po-užitý kmen Acremonium chrysogenum CCMF-750. Fermentácia bola robená v 30 litro-vom tančíku. Vegetativně inokulum bolo při-pravené submerznou kultiváciou v 2-litro-vých tančíkoch (kultivačná doba 72 hodin)pri teplote 28 °C na pode: sacharóza 2 %,kukuřičný výluh (100 %-ný) 1 %, octan a-mónny 0,5 %, DL-metionín 0,05 %, sójovýolej 0,3 %, pričom inokulačné tančíky boliočkované 100 ml inokula připraveného natrepacom stroji.

Fermentačný tank — produkčný — obsa-hoval pódu tohoto zloženia: Kukuřičný vý-luh (100 %-ný) 8,7 %, kukuřičný škrob 2,0percenta, dextrín biely — zemiakový 1,5 %,sacharóza 0,7 % CaCCb zrážaný 1,1 %,(NH4)2SO4 1,4 %, MgSOá. 7H2O 0,35 %,KH2PO4 0,5 %, sójový olej 2,0 %. Póda sa sterilizovala 45 minut pri teplote120 °C, pH pódy sa upravilo před sterilizá-ciou na hodnotu 6,5. Sterilná póda, schlade-ná na 28 °C sa naočkovala 10 % obj. inoku-la. Tank bol vybavený 3 turbínkovými mie-šadlami so 6 rovnými lopatkami s deliacimkotúčom a 4 narážkami. Otáčky miešadla sav priebehu fermentácie měnili plynule po-dlá potřeby od 600 do 650 ot./min. a prietokvzduchu od 6 do 20 litrov/min. Teplota pódysa udržiavala na hodnotě 28 °C až dovtedy,kým manometricky meraná spotřeba kyslíkanedosiahla hodnotu 35 μΐηοΐ. ml-1. h^1 apotom sa znížila (v 32 h. kultivácie) na 25stupňov. Celsia. Koncentráciu rozpuštěnéhokyslíka v pode, klesajúcu z počiatočnej hod-noty (14,4 mg/1 pri přetlaku 70 kPa) sme vpriebehu produkčnej fázy (48 až 140 hodinkultivácie) udržiavali v rozmedzí 4 až 6 mg//liter změnou prietoku vzduchu v rozmedzí6 až 20 1/min., změnou prietoku vzduchu vrozmedzí 6 až 20 1/min., změnou přetlaku vrozmedzí 70 až 90 kPa, změnou otáčok mie-šadla v rozmedzí 600—650 ot./min. a změ-nou rýchlosti dávkovania sójového oleja.Koncentrácia oleja sa do 92 h. fermentácieudržiavala změnou dávkovania oleja v roz-medzí 0,5—1,0 %. Potom už dávkovanie ole-ja sa riadilo koncentráciou rozpuštěnéhokyslíka, pričom ostatně parametre vplýva-júce na jeho koncentráciu boli už konstant-ně.

Pri udržiavaní koncentrácie rozpuštěnéhokyslíka 4—6 mg/1 sa koncentrácia sójovéhooleja pohybovala v rozmedzí 0,1-0,5 %.Rýchlosť pridávania oleja v priebehu fer-mentácie sa měnila v rozmedzí 10—35ml. h-1. pH sa regulovalo automaticky při-dáváním čpavkovej vody (25 %-nej) v roz-medzí 6,1-6,2. Koncentrácia amoniakálne-ho dusíka v priebehu kultivácie nepokles-la pod 0,80 mg/ml. Za 140 h. fermentácie sadosiahla produkčná aktivita cefalosporínuC 23.400 (Ug/ml. Příklad 2

Fermentácia bola riadená spósobom vy-užívajúcim tuky ako limitujúceho uhlíkaté-ho substrátu tak, ako to bolo popísané vpříklade 1 s tým rozdielom, že fermentačnápóda obsahovala nie 8,7 % ale 10 % kuku-řičného výluhu. Celkove však priebeh fer-mentácie bol rýchlejší a niektoré změny pa-rametrov sa robili skór ako je uvedené vpříklade 1, ale podlá rovnakých kritérií. Od72 h. kultivácie sa znížila teplota na 24 °C.Za 116 h. kultivácie sa dosiahla produkciacefalosporínu C 25.680 jug/ml. Příklad 3

Podmienky pokusu a režim fermentácieako v příklade 1 s tým rozdielom, že změnyboli len v nasledujúcich živinách: kukuřič-ný výluh (100 %-ný) 10 %, kukuřičný škrob0,6 %, dextrín 0,35 %, sacharóza 0,2 %. Za140 h. fermentácie sa dosiahla produkčnáaktivita cefalosporínu C 26.150 ^g/ml. Příklad 4

Fermentácia bola robená v 5000 litrovomfermentore vybavenom miešaním s jednouturbínou so 6 rovnými lopatkami s delia-cim kotúčom a 2 turbínami so 6 ohnutýmilopatkami a 4 narážkami. Otáčky miešadlasa měnili plynule v rozmedzí 147—210 ot.//min., prietok vzduchu sa měnil v rozmedzí 2— 5 m3/min., pričom přetlak bol regulova-ný automaticky. Na pokus sa použil pro-dukčný kmeň a zloženie pódy ako je uve-dené v příklade 3, Sterilná póda schladenána 28 °C sa naočkovala 300 1 inokula, ktorésa připravilo dvojstupňovou kultiváciou,pričom prvý stupeň sa realizoval v dvoch 3- litrových Erlenmayerových bankách so750 ml inokulačnej pódy pri teplote 28 °C za72 hodin. Druhý stupeň sa robil v 500 litro-vom fermentore plnenom 300 litrami inoku-lačnej pódy 72 hodin pri teplote 28 °C, prie-toku vzduchu 300 litrov/min. a přetlaku vofermentore 70 kPa. Pri fermentácii sa teplo-ta v produkčnom tanku udržiavala na hod-notě 28 °C až dovtedy, kým manometrickymeraná spotřeba kyslíka nedosiahla hodno-tu 35 ^mol. ml-1. h-1 a potom sa znížila v38 h. na 25 °C. Koncentráciu rozpuštěného

Claims (1)

1. 244333 9 10 kyslíka v póde po poklese z počiatočnejkoncentrácie 14,8 mg/1 sme v priebehu pro-dukčnej fázy (48—142 h. fermentácie) udr-žiavali v rozmedzí 4—6 mg/1 směnou prie-toku vzduchu v rozmedzí 2000—5000 litrov//min., změnou otáčok miešania 147—210 ot.//min., změnou přetlaku vzduchu v rozmed-zí 70—90 kPa, znížením kultivačně] teplotyna 24 °C, a hlavně změnou rýchlosti dávko-vania sójového oleja. Koncentrácia oleja do62 h. fermentácie sa udržiavala změnou dáv-kovania v rozmedzí 0,5-1,0 % sójového o-leja. Potom už dávkovanie oleja sa riadi- lo koncentráciou rozpuštěného kyslíka vpóde. Ostatně parametre vplývajúce na kon-centráciu kyslíka boli už v tejto fáze kon-stantně. Pri udržiavaní koncentrácie rozpuš-těného kyslíka 4—6 mg/1 sa koncentráciasójového oleja pohybovala v rozmedzí 0,1až 0,5 %. Rýchlosť pridávania oleja v prie-behu fermentácie sa měnila v rozmedzí 1,6až 8 1/h., pH sa regulovalo automaticky při-dáváním čpavkovej vody v rozmedzí 0,6 až 6,1 1. Za 142 h. fermentácie sa dosiahla prc-dukčná aktivita cefalosporínu C 23.600 μξ//ml. P R E D Μ E T Spósob fermentačnej výroby cefalosporí-nu C využívajúci tuky ako limitujúceho uhlí-katého substrátu pomocou kmeňa Acremo-nium chrysogenum, ktorý utilizuje sulfátovúsíru a amoniakálny dusík na tvorbu cefalo-sporínu C na pódach obsahujúcich ako hlav-ný uhlíkatý zdroj rastlinné alebo živočišnétuky s výhodou sójový olej připadne doplně-ný škrobom, dextrínom a sacharózou, akodusíkatý substrát kukuřičný výluh a síranamónny a ostatně zlúčeniny KH2PO-1, MgSOá..7H2O a CaCO3 vyznačujúci sa tým, že fer-mentačný proces je regulovaný dávkovánímsubstrátov a úpravou parametrov fermentá-cie a to teploty v rozmedzí 24—28 °C, prie-toku vzduchu v rozmedzí 0,6-1,8 objemuvzduchu na objem fermentačnej pódy, otá-čok miešadla podlá typu fermentora, přetla-ku vo fermentore v rozmedzí 70—95 kPapodl'a koncentrácie rozpuštěného kyslíka vpóde, pH a koncentrácie substrátov tak, že YNÁLEZU pH sa udržiava dávkováním čpavkovej vodyv rozmedzí 5,6—6,3 s výhodou v intervale6,0-6,1, že obsah amoniakálneho dusíka popoklese jeho koncentrácie z počiatočnýchhodnot 2,0-4,5 mg/ml sa udržuje v rozmed-zí 0,75—1,0 mg/ml dávkováním roztoku sí-ranu amonného, že sójový olej sa v priebehufermentácie dávkuje tak, aby jeho koncen-trácia sa udržiavala v rozmedzí 0,5-1,5 %až dovtedy, kým sa neskončí rastová fáza,ktorá je charakterizována spotřebou kyslí-ka meranou manometrickou metodou 65 μg .. mol. ml-1. h“1 a poklesom koncentrácierozpuštěného kyslíka pod 6 mg/1 a potomsa sójový olej dávkuje tak, aby koncentrá-cia rozpuštěného kyslíka sa udržiavala nahodnotách 4—5 mg/1 čomu odpovedá kon-centrácia sójového oleja v póde 0,1-0,2 %,pričom ostatně parametre vplývajúce nakoncentráciu rozpuštěného kyslíka v pódenie je potřebné regulovat.